Получение Single-когорты Колонии и Гормональное лечение работника медоносных для анализа физиологии, связанных с ролью и / или эндокринной системы
Summary
Здесь мы опишем наш подробный протокол для подготовки одной когорты пчелиных семей – полезный инструмент для анализа роли ассоциированного работник физиологии. Мы также описали подробные протоколы для лечения работников с ювенильным гормоном и экдизона оценить участие этих гормонов в регуляции поведения работников и / или физиологии.
Abstract
Honeybee workers are engaged in various tasks related to maintaining colony activity. The tasks of the workers change according to their age (age-related division of labor). Young workers are engaged in nursing the brood (nurse bees), while older workers are engaged in foraging for nectar and pollen (foragers). The physiology of the workers changes in association with this role shift. For example, the main function of the hypopharyngeal glands (HPGs) changes from the secretion of major royal jelly proteins (MRJPs) to the secretion of carbohydrate-metabolizing enzymes. Because worker tasks change as the workers age in typical colonies, it is difficult to discriminate the physiological changes that occur with aging from those that occur with the role shift. To study the physiological changes in worker tissues, including the HPGs, in association with the role shift, it would be useful to manipulate the honeybee colony population by preparing single-cohort colonies in which workers of almost the same age perform different tasks. Here we describe a detailed protocol for preparing single-cohort colonies for this analysis. Six to eight days after single-cohort colony preparation, precocious foragers that perform foraging tasks earlier than usual appear in the colony. Representative results indicated role-associated changes in HPG gene expression, suggesting role-associated HPG function. In addition to manipulating the colony population, analysis of the endocrine system is important for investigating role-associated physiology. Here, we also describe a detailed protocol for treating workers with 20-hydroxyecdysone (20E), an active form of ecdysone, and methoprene, a juvenile hormone analogue. The survival rate of treated bees was sufficient to examine gene expression in the HPGs. Gene expression changes were observed in response to 20E- and/or methoprene-treatment, suggesting that hormone treatments induce physiological changes of the HPGs. The protocol for hormone treatment described here is appropriate for examining hormonal effects on worker physiology.
Introduction
Европейская медоносной пчелы, Apis MELLIFERA, является eusocial насекомое с высокоорганизованной общества 1. Работник медоносные (труд кастовые) занимаются различными задачами для поддержания деятельности колонии, и эти задачи меняются в зависимости от возраста трудящегося Пчелы после вылупления, который упоминается как связанных с возрастом разделения труда 2-4. Молодые рабочие (<13 дней) заботиться о выводка в улье секретируя маточное молочко (медсестра пчел), в то время как пожилые работники (> 15 дней) собирают нектар и пыльцу за пределами улья (фуражиров) 2-4. Физиология рабочих меняется в связи с этой ролью сдвига. Например, функция гипофарингеальных желез (HPGs), парные экзокринных желез , расположенных в голове, изменения в связи с переходом от роли медсестер к нагула 2,5. Медсестра пчелы HPGs в основном синтезировать основные маточное молочко белки, которые являются основными компонентами пчелиного молока. С другой стороны, фуражиры HPGs в основномсинтезировать углеводные метаболизировать ферменты, такие как альфа-глюкозидазы III, обрабатывать нектара в мед путем превращения сахарозы в глюкозу и фруктозу. Наши предыдущие исследования показали , что экспрессия mrjp2, который кодирует основную протеинами маточного молочка и Hbg3, которая кодирует альфа-глюкозидазы III, изменения во время роль сдвига 6-9.
Для того, чтобы определить, являются ли физиологические изменения в тканях рабочих, в том числе HPGs, связано с ролью сдвига или с возрастом рабочих, было бы полезно, чтобы манипулировать состав популяции медоносных пчел колонии, например, подготовить одинарной когорту колонии , в которых работники почти того же возраста выполняют разные задачи 10,11. Робинсон и др. (1989) описали метод создания одной когорты колонии 10. Single-когорты колонии изначально содержат ферзя и 0-2 суточных рабочих. Через несколько дней после установления колоний, работники УАПОСТ же возраста принимать различные задачи. Некоторые работники выполняют задачи медсестер, как в типичных колоний, в то время как другие работники выполняют фуражировать задачи раньше, чем обычно, и, таким образом, называется скороспелых фуражиров. Экспрессии генов сравнения между медсестрой пчел и скороспелых фуражиров бы дать полезную информацию о роли ассоциированных физиологии рабочих тканей 12-16. Здесь мы описываем подробный протокол для подготовки одной когорты колоний для анализа и ролевой / или возрастной физиологии из HPGs 16. Мы также кратко описать , как исследовать экспрессию генов mrjp2 и Hbg3 с помощью количественной обратной транскрипции-полимеразной цепной реакции (RT-PCR) для оценки HPG физиологии.
В дополнение к анализу рабочего физиологии в одной когорты колоний, исследование эндокринной системы имеет важное значение для анализа регуляторных механизмов роли ассоциированного работника физиологии. Ювенильного гормона (JH), который KNOшп как гормон "статус – кво" у личинок насекомых, ускоряет сдвиг в роли от медсестер к нагула в рабочих медоносных 11. Кроме того, экдизол, который известен как линьки гормона во время метаморфоза, могут быть вовлечены в ролевой сдвиг в качестве генов , кодирующих экдизол сигнальных молекул экспрессируются в грибовидных телах, более высокий центр работника головного мозга 17-19. Таким образом, мы также описываем подробный протокол , используемый в нашем предыдущем исследовании 16 для лечения работников с 20E, который является активной формой экдизон и метопрен, а JH аналог, для анализа влияния эндокринной системы на HPG физиологии (выражение mrjp2 и Hbg3).
Protocol
Representative Results
Discussion
Получение одной когорты колоний
Здесь мы описали протокол , используемый в нашем предыдущем исследовании 16 для подготовки одной когорты колонии для анализа HPG физиологии , связанной с переходом в роли рабочих пчел. Медсестра пчелы и не по годам фуражиров , которые ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by a Grant-in-Aid for Scientific Research (B) and a Grant-in Aid for Scientific Research on Innovative Areas ‘Systems Molecular Ethology’ from the Ministry of Education, Culture, Sports, Science and Technology (MEXT) of Japan. T.U. was the recipient of a Grant-Aid from the Japan Society for the Promotion of Science for Young Scientists.
Materials
| UNIPOSCA | Mitsubishi pencil | PC-5M | Marker pen for the application of marks to bees |
| 20-hydroxyecdysone | Sigma Aldrich | H5142 | |
| Methoprene | Sigma Aldrich | 33375 | |
| Breeding case insect | IRIS OHYAMA | CP-SS | |
| Electromotion mixier | ISO | 23M-R25 | homogenization of tissue |
| TRIZol Reagent | Invitrogen | 15596-026 | the reagent for total RNA extraction |
| DNase I | Takara | 2270A | |
| PrimeScript RT reagent kit | Takara | RR037A | the reagent for reverse transcription |
| SYBR Premix ExTaq II | Takara | RR820A | the reagent for real-time PCR |
| LightCycle 1.2 Instrument | Roche | 12011468001 | the instrument for real-time PCR |
| LightCycle Capillaries (20μl) | Roche | 4929292001 | the material for real-time PCR |
References
- Wilson, E. O. . The insect societies. , (1971).
- Winston, M. L. . The biology of the honey bee. , (1987).
- Lindauer, M. Ein Beitrag zur Frage der Arbeitsteilung im Bienenstaat. Zeitschrift für vergleichende Physiologie. 34 (4), 299-345 (1952).
- Sakagami, S. Untersuchungen uber die Arbeitsteilung in einen Zwergvolk der Honigbienen. Beitrage zur Biologie des Bienenvolkes, Apis mellifera L. I. Jap J Zool. 11, 117-185 (1953).
- Kubo, T., et al. Change in the expression of hypopharyngeal-gland proteins of the worker honeybees (Apis mellifera L.) with age and/or role. J Biochem. 119 (2), 291-295 (1996).
- Ohashi, K., Natori, S., Kubo, T. Change in the mode of gene expression of the hypopharyngeal gland cells with an age-dependent role change of the worker honeybee Apis mellifera L. Eur J Biochem. 249 (3), 797-802 (1997).
- Ohashi, K., Natori, S., Kubo, T. Expression of amylase and glucose oxidase in the hypopharyngeal gland with an age-dependent role change of the worker honeybee (Apis mellifera L). Eur J Biochem. 265 (1), 127-133 (1999).
- Ohashi, K., Sawata, M., Takeuchi, H., Natori, S., Kubo, T. Molecular cloning of cDNA and analysis of expression of the gene for alpha-glucosidase from the hypopharyngeal gland of the honeybee Apis mellifera L. Biochem Biophys Res Commun. 221 (2), 380-385 (1996).
- Ueno, T., Nakaoka, T., Takeuchi, H., Kubo, T. Differential gene expression in the hypopharyngeal glands of worker honeybees (Apis mellifera L.) associated with an age-dependent role change. Zoolog Sci. 26 (8), 557-563 (2009).
- Robinson, G. E., Page, R. E., Strambi, C., Strambi, A. Hormonal and genetic control of behavioral integration in honey bee colonies. Science. 246 (4926), 109-112 (1989).
- Sullivan, J. P., Fahrbach, S. E., Robinson, G. E. Juvenile hormone paces behavioral development in the adult worker honey bee. Horm Behav. 37 (1), 1-14 (2000).
- Ben-Shahar, Y., Robichon, A., Sokolowski, M. B., Robinson, G. E. Influence of gene action across different time scales on behavior. Science. 296 (5568), 741-744 (2002).
- Lehman, H. K., et al. Division of labor in the honey bee (Apis mellifera): the role of tyramine beta-hydroxylase. J Exp Biol. 209 (Pt 14), 2774-2784 (2006).
- Mutti, N. S., Wang, Y., Kaftanoglu, O., Amdam, G. V. Honey bee PTEN–description, developmental knockdown, and tissue-specific expression of splice-variants correlated with alternative social phenotypes). PLoS One. 6 (7), e22195 (2011).
- Whitfield, C. W., Cziko, A. M., Robinson, G. E. Gene expression profiles in the brain predict behavior in individual honey bees. Science. 302 (5643), 296-299 (2003).
- Ueno, T., Takeuchi, H., Kawasaki, K., Kubo, T. Changes in the Gene Expression Profiles of the Hypopharyngeal Gland of Worker Honeybees in Association with Worker Behavior and Hormonal Factors. PLoS One. 10 (6), e0130206 (2015).
- Paul, R. K., Takeuchi, H., Matsuo, Y., Kubo, T. Gene expression of ecdysteroid-regulated gene E74 of the honeybee in ovary and brain. Insect Mol Biol. 14 (1), 9-15 (2005).
- Takeuchi, H., et al. Identification of a novel gene, Mblk-1, that encodes a putative transcription factor expressed preferentially in the large-type Kenyon cells of the honeybee brain. Insect Mol Biol. 10 (5), 487-494 (2001).
- Takeuchi, H., Paul, R. K., Matsuzaka, E., Kubo, T. EcR-A expression in the brain and ovary of the honeybee (Apis mellifera L). Zoolog Sci. 24 (6), 596-603 (2007).
- Yamane, T., Miyatake, T. Reduced female mating receptivity and activation of oviposition in two Callosobruchus species due to injection of biogenic amines. Journal of Insect Physiology. 56 (3), 271-276 (2010).
- Ben-Shahar, Y., Leung, H. T., Pak, W. L., Sokolowski, M. B., Robinson, G. E. cGMP-dependent changes in phototaxis: a possible role for the foraging gene in honey bee division of labor. J Exp Biol. 206 (Pt 14), 2507-2515 (2003).
- Danforth, B. N., Ji, S. Elongation factor-1 alpha occurs as two copies in bees: implications for phylogenetic analysis of EF-1 alpha sequences in insects. Mol Biol Evol. 15 (3), 225-235 (1998).
- Pandey, A., Bloch, G. Juvenile hormone and ecdysteroids as major regulators of brain and behavior in bees. Current Opinion in Insect Science. 12, 26-37 (2015).
