Summary
Hier beschrijven wij onze gedetailleerde protocol voor de voorbereiding van de single-cohort bijenvolken - een nuttig instrument voor het analyseren van de role-geassocieerde werknemer fysiologie. We beschrijven ook gedetailleerde protocollen voor de behandeling van werknemers met juveniele hormoon en ecdyson de betrokkenheid van deze hormonen in de regulatie van de werknemer gedrag en / of fysiologie te evalueren.
Introduction
De Europese honingbij, Apis mellifera, is een eusocial insect met een goed georganiseerde samenleving 1. Werkbijen (arbeids kaste) worden betrokken bij verschillende taken aan kolonie activiteit te behouden en deze taken veranderen al naar gelang de leeftijd van de werknemer honingbij na eclosion, die wordt aangeduid als leeftijdsgebonden arbeidsverdeling 2-4. Jonge werknemers (<13 dagen oud) verzorgen van het broed in de korf door het afscheiden van royal jelly (verpleegkundige bijen), terwijl oudere werknemers (> 15 dagen oud) nectar en stuifmeel te verzamelen buiten de korf (verzamelaars) 2-4. De fysiologie van de arbeiders veranderingen in verband met deze rol shift. Bijvoorbeeld, de functie van de hypofarynx klieren (HPGs), gekoppeld exocriene klieren in de kop, veranderingen in samenwerking met de rol verschuiving van verpleging tot 2,5 voederen. Verpleegster bijen HPGs vooral te synthetiseren grote royal jelly eiwitten, die belangrijke bestanddelen van bee melk. Aan de andere kant, forager HPGs hoofdzakelijksynthetiseren koolhydraat metaboliserende enzymen, zoals α-glucosidase III om nectar honing verwerken door het omzetten van sucrose in glucose en fructose. Onze eerdere studies is gebleken dat de expressie van mrjp2, die een belangrijke royal jelly eiwit en Hbg3 codeert, waarbij α-glucosidase III, codeert veranderingen in de rol shift 6-9.
Om te bepalen of de fysiologische veranderingen van de werknemer weefsels, waaronder de HPGs, wordt geassocieerd met de functie shift of de leeftijd van de arbeiders, zou het nuttig zijn de populatie samenstelling van een bijenkolonies manipuleren, zodanig dat één cohort bereiden kolonies waar werknemers van bijna dezelfde leeftijd uit te voeren verschillende taken 10,11. Robinson et al. (1989) beschreven een werkwijze voor het vaststellen van een cohort-kolonie 10. Single-cohort kolonies bevatten aanvankelijk een koningin en 0-2 dagen oude werknemers. Enkele dagen na de oprichting van de kolonies, de werknemers van de almost dezelfde leeftijd aannemen verschillende taken. Sommige werknemers voeren verpleegkundige taken in de typische kolonies, terwijl andere werknemers foerageergebied taken eerder dan gebruikelijk uit te voeren en zijn dus vroegrijpe verzamelaars genoemd. Genexpressie vergelijkingen tussen verpleegkundige bijen en vroegrijpe voedermachines zou nuttige informatie over de rol bijbehorende fysiologie van werknemer weefsels 12-16 bieden. Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor het bereiden één cohort kolonies voor analyse van de rol- en / of leeftijdgebonden fysiologie van HPGs 16. Ook korte beschrijving hoe de genexpressie van mrjp2 en Hbg3 onderzocht met kwantitatieve reverse transcriptie-polymerase ketenreactie (RT-PCR) voor het HPG fysiologie evalueren.
Naast de analyse werknemer fysiologie in enkelvoudige kolonies cohort onderzoek van het endocriene systeem is belangrijk voor het analyseren van de regelgeving van rollen geassocieerde worker fysiologie. Juveniel hormoon (JH), die known als de 'status quo' hormoon in insectenlarven, versnelt de verschuiving in de rol van verpleegkundige tot foerageren in werkbijen 11. Bovendien ecdyson, die bekend staat als het vervellen hormoon tijdens metamorfose, betrokken zouden kunnen zijn in de rol shift genen die coderen ecdyson signaalmoleculen zijn uitgedrukt in de mushroom bodies, een hogere midden van de werknemer hersenen 17-19. Daarom hebben we ook beschrijven gedetailleerd protocol gebruikt in onze vorige studie 16 werknemers met 20E behandelen, die een actieve vorm van ecdyson en methopreen, een JH analoog, voor de analyse van het effect van het endocriene systeem HPG fysiologie (expressie van mrjp2 en Hbg3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Voorbereiding van de Single-cohort Colonies
- Bereid drie honingbijenkolonies twee enkele-cohort kolonies maken en een voldoende aantal nieuw ontstaan werknemers verkrijgen.
- Controleer dat sommige poppen in de bedekte perifere cellen in de raten hebben bruine ogen en een gepigmenteerde cuticula door het openen van de afgedekte kammen met een pincet. Als deze poppen aanwezig in perifere cellen kam meeste poppen in heel raten zullen ontstaan in ongeveer 1-3 dagen.
- Vervolgens, het verzamelen van de kammen die deze poppen na alle aanhangend volwassen bijen zijn verwijderd met een borstel, en meng kammen van de drie kolonies aan variatie tussen kolonies te minimaliseren.
- Plaats de verzamelde raten in een lege korf doos en incubeer bij 33 ° C onder vochtige omstandigheden (> 60% relatieve vochtigheid). Verzamel ongeveer 6.000 nieuw opgedoken werknemers over 3 dagen (3.000 werknemers per kolonie) uit de verzamelde kammen.
- Bepaal de hoeveelheid workers gebaseerd op het gewicht van vijf nieuw opgedoken werknemers willekeurig vanuit ongemanipuleerd kolonies.
- Weeg vijf nieuw opgedoken werknemers willekeurig verzameld van ongemanipuleerde kolonies met behulp van een gewicht van machines.
Let op: Het gewicht van vijf nieuw opgedoken werknemers is over het algemeen 500-600 mg. - Schatting van de hoeveelheid verzamelde werknemers door het gewicht van de verzamelde werknemers te delen door het gemiddelde gewicht van vijf nieuw opgedoken werknemers.
- Weeg vijf nieuw opgedoken werknemers willekeurig verzameld van ongemanipuleerde kolonies met behulp van een gewicht van machines.
- Solliciteer verf markeringen aan de thoraces van ongeveer 1.800 werknemers (900 werknemers per kolonie) met behulp van watergedragen plakkaatverf markers.
Noot: wasbaar marker die wordt gebruikt om de verf aan te brengen wordt in de Tabel Materials. - Introduceer een koningin en ongeveer 3.000 van de 0-2 dagen oude werknemers naar een nieuwe bijenkorf doos die twee kammen, één kam met honing en stuifmeel als conserven en een andere lege kam voor leg door de koningin bevat. Verzamel de kam met honing en stuifmeel frOM ander ongemanipuleerde kolonie na alle aanhangend bijen worden verwijderd.
Opmerking: Het gebruik van nucleaire bijenkorf doos (klein formaat bijenkorf doos) wordt aanbevolen. - Verzamel verpleegkundige bijen en vroegrijpe voedermachines met verf markeringen 6-8 dagen na het maken van single-cohort kolonies.
- Voor het verzamelen van bijen verpleegster, halen de werknemers dat hun hoofd gestoken in kam cellen om zorg te dragen voor het broed. Gebruik een pincet om de verpleegkundige bijen te verzamelen van kammen dat veel broed en volwassen werknemers bevatten.
Let op: Als HPGs van de verzamelde werknemers worden ontwikkeld wanneer ontleed zoals beschreven in stap 1.7, zijn deze werknemers gedefinieerd als verpleegkundige bijen. Houd de thoraces door pincet wordt geadviseerd op te pikken werknemers uit de raten. - Om verzamelaars verzamelen, gebruiken een insect net voor de werknemers die terugkeren naar hun korven met stuifmeel lasten op hun achterpoten vast te leggen.
Let op: Als HPGs van gevangen werknemers verschijnen gekrompen wanneer ontleed zoals beschreven in stap 1.7, worden die werknemers gedefinieerd als verzamelaars.
- Voor het verzamelen van bijen verpleegster, halen de werknemers dat hun hoofd gestoken in kam cellen om zorg te dragen voor het broed. Gebruik een pincet om de verpleegkundige bijen te verzamelen van kammen dat veel broed en volwassen werknemers bevatten.
- CLASSify de HPG in drie groepen, 'ontwikkelde', 'Intermediate' en 'gekrompen' van de dissectie onder een stereomicroscoop.
- Verdoven 10-15 bijen in een insect kooi in een koelkast voor 10-15 minuten totdat de bijen kunnen niet vliegen of lopen. Beweeg dan bijen op ijs en vul de narcose op ijs gedurende 5 minuten.
Opmerking: Het duurt ongeveer 15-20 minuten in totaal om anesthesie te bereiken. Als de anesthesie tijd moet worden verkort, dient het aantal bijen in een kooi verlaagd tot 1-3 bijen per kooi. - Ontleden het hoofd uit het lichaam met een schaar en pincet. Bevestig het hoofd op tandheelkundige wax geplaatst op een petrischaal met pinnen. Plaats twee pennen in de bases van de antennes aan het hoofd te bevestigen. Genieten vaste koppen in insectencellen zoutoplossing (130 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl2).
- Verwijder het anteriore gedeelte van de cuticula van de kop met fijne pincet en een chirurgisch mes onder een binoculaire microscoop.
Opmerking: De HPGs kan gemakkelijk gevonden worden in de kop na verwijdering van cuticle. De HPG is een botryoid orgaan dat bestaat rond de hersenen in de weg. - Verwijder de tracheale weefsel dat is een witte membraneuze weefsel onder de nagelriem. Vervolgens ontleden de HPGs van het hoofd door ze langzaam te trekken met een pincet.
- Classificeren HPGs met grote en ronde acini als 'ontwikkelde'. Classificeren HPGs met kleine en verwrongen acini als 'gekrompen'. Classificeren HPGs overeenkomt met geen van beide 'ontwikkelde' noch 'gekrompen' als 'Intermediate'.
Opmerking: Representatieve foto's die tonen deze drie klassen HPG toestanden zijn in figuur 2. - Subject 'ontwikkelde' en 'gekrompen' HPGs om RNA-extractie als 'nurse bee HPGs' en 'forager HPGs', respectievelijk, en vergelijk genexpressie in de HPGs tussen verpleegkundige bijen en voedermachines (deel 4).
- Verdoven 10-15 bijen in een insect kooi in een koelkast voor 10-15 minuten totdat de bijen kunnen niet vliegen of lopen. Beweeg dan bijen op ijs en vul de narcose op ijs gedurende 5 minuten.
2. Injectie van 20E
- Verzamel verpleegkundige bijen van de typische kolonies als descrIBED in de procedure 1.6.1.
Opmerking: HPGs kan niet in deze bijen worden onderzocht als de bijen worden gehouden. - Verdoven de bijen bij 4 ° C in de koelkast (niet op ijs).
Opmerking: Het duurt ongeveer 30 minuten naar de anesthesie te bereiken. Als de anesthesie wordt verkort, dient het aantal bijen in de kooi verlaagd tot 1-3 bijen per kooi. - Met behulp van een pincet, immobiliseren de bijen op tandheelkundige wax geplaatst op een petrischaal.
- Injecteer 1 ul van 20E-oplossing in de voorste aspect van het hoofd met behulp van een injectie tip gemaakt van een gekalibreerde capillaire micropipet met een glazen naald trekker.
- Los op in ethanol 20E-insecten zoutoplossing (130 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl2) mengsel (1: 4) bij 2,5 ug / ul.
- Sluit de injectie tip om een rubberen slang, en sluit een gele micropipet tip naar de andere kant van de buis.
- Plaats 1 pl 20E-oplossing op parafilm met behulp van een micropipet, houdt u de gele micropipet tip in de mond, eend de oplossing in de injectie tip te trekken.
- Steek de injectie tip in de basis van de antennes, en injecteer de oplossing door te blazen door de gele micropipet tip.
Opmerking: De in deze stap protocol is de representatieve injectiemethode, maar het gebruik van de injectiemachine wordt aanbevolen om veiligheidsredenen noodzakelijk 20.
- Achter de geïnjecteerde bijen in insectencellen kooien bij 33-36 ° C (de ideale temperatuur is 35 ° C) onder donkere en vochtige omstandigheden (> 60% relatieve vochtigheid) gedurende 1 of 3 dagen. Supply honing-watermengsel (1: 1) aan de bijen. Indien nodig, tel overleven bijen na de injectie.
3. De toepassing van Methoprene
- Verzamel de kammen die poppen van de typische kolonies bevatten nadat alle aanhangend volwassen bijen worden verwijderd met een borstel. Incubeer de kammen van 33-36 ° C (de ideale temperatuur is 35 ° C) in vochtige omgevingen (> 60% relatieve vochtigheid) gedurende 1 dag.
- Na 6 dagen, het verzamelen van geschilderde werknemers (6 dagen oud) uit de koloniën. Pick-up geschilderd werknemers uit de raten door die hun thoraces met een pincet.
- Verdoven de bijen bij 4 ° C in de koelkast (niet op ijs) volgens de procedure 2,2. Met een pincet, het immobiliseren bijen op dentale was geplaatst op een petrischaaltje toepassing 1-5 pl methopreen oplossing (50-250 ug / ul) opgelost in aceton om het hoofd met een micropipet. Gebruik een filter tip die bestand is tegen aceton.
Opmerking: Aceton kan de schadelijke effecten op bijen die leidt tot de dood. Als de hoge bijensterfte waargenomen, wordt de reductie van het volume aceton op 1 ul van de minimaal aanbevolen. - Achter de bijen in insectencellen kooien bij 33-36 ° C (de ideale temperature is 35 ° C) gedurende 7 dagen onder donkere en vochtige omstandigheden (> 60% relatieve vochtigheid). Supply honing-watermengsel (1: 1) aan de bijen. Indien nodig, tel overleven bijen na lokale applicatie.
Opmerking: In dit artikel overleven bijen geteld 7 dagen na het aanbrengen (tabel 3).
4. RNA-extractie en kwantitatieve RT-PCR
- Verdoven bijen en ontleden HPGs zoals beschreven in de stappen 1.7.1 tot en met 1.7.4.
- Verzamel de HPGs ontleed in een microcentrifuge buis op droogijs en bewaar bij -80 ° C tot gebruik.
- Voeg 400 ul van het serum van eiwitdenaturatie.
Opmerking: Dit reagens is in de handel verkrijgbaar (zie de tabel van de Materials). - Homogeniseer de HPG weefsels met behulp van een draagbare elektrische mixer met een homogenisatie stamper die past in een microcentrifugebuis. Gehomogeniseerd bij een rotatiesnelheid van 300 rpm gedurende ongeveer 1 min op ijs te breken en lyseren weefselcellen.
tabel van de Materials). - Voeg 80 ul chloroform en meng goed. Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Centrifugeer de microcentrifuge buizen bij 14.170 xg gedurende 15 min bij 4 ° C. Breng de waterige fase naar een nieuwe buis. Voeg een gelijk volume isopropanol en 1 ui glycogeen (5 mg / ml). Incuberen bij -20 ° C gedurende ten minste 20 min.
- Centrifugeer de microcentrifuge buizen bij 14.170 xg gedurende 10 min bij 4 ° C en de bovenstaande vloeistof.
- Voeg 400 pl 75% ethanol aan de pellet en meng gecentrifugeerd microcentrifugebuizen bij 14.170 xg gedurende 15 min bij 4 ° C en de bovenstaande vloeistof. Herhaal deze procedures nog eens.
- Air-droog de pellet gedurende 5-10 min en dan oplossen in 10 pi RNase-vrij water.
Opmerking: de volledige drogen van de pellet kan onoplosbaarheid van het RNA pellet veroorzaken in het water. Dus de pellet die enigszins vochtig is geschikt vooroplossen. - Meet de RNA-concentratie met behulp van een spectrofotometer zoals NanoDrop of dergelijke.
- Behandel 500 ng totaal RNA met 2,0 U DNase I incuberen bij 37 ° C gedurende 30 minuten om verontreinigend genomisch DNA afbreken.
- Reverse-transcriberen 200 ng DNase I behandelde RNA en voert real time PCR met behulp van commercieel verkrijgbare kits (zie de lijst in de tabel van Materialen en reagentia) en genspecifieke primers (mrjp2, 5'-AAATGGTCGCTCAAAATGACAGA-3 'en 5 '-ATTCATCCTTTACAGGTTTGTTGC-3', Hbg3, 5'-TACCTGGCTTCGTGTCAAC-3 'en 5'-ATCTTCGGTTTCCCTAGAGAATG-3'). Voer de PCR als volgt: [95 ° C x 30 seconden + (95 ° C x 5 seconden + 60 ° C x 15 seconden + 72 ° C x 20 seconden) x 45-55 cycli].
- Normaliseren van de hoeveelheid transcript met die van elongatie factor 1α-F2 (EF1α˗F2) of ribosomaal eiwit 49 (rp49) 9,16,21,22. Deze genen zijn betrouwbaar controle genes voor het analyseren van genexpressie in de HPGs behulp qRT-PCR.
- Voer tweezijdige t-test om de significante verschillen tussen de twee groepen experiment (verpleegkundige bijen vs. vroegrijpe voedermachines,-20E behandelde bijen versus controle bijen en-methopreen behandeld bijen versus controle bijen) met behulp van statistische software te detecteren.
Opmerking: Als F-toets neemt de homogeniteit van variantie, kan t-toets gebruikt. Zo niet, dan kan Welch t-test worden gebruikt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een overzicht van het protocol voor het bereiden één cohort kolonies is weergegeven in figuur 1A. Tijdsverloop van de experimenten van het voorbereiden van single-cohort kolonies aan collectie proeven is weergegeven in figuur 1B. Arbeiders die de gedragscriteria voor verzorgingsgedrag of fourageergedrag voldaan werden verzameld uit één-cohort kolonies en HPG ontwikkeling werd geschat deze werknemers Tabel 1 toont de indeling van HPG ontwikkeling in drie groepen.; 'Ontwikkelde', 'Intermediate' en 'gekrompen' volgens de grootte. Representatieve foto's die deze drie klassen HPGs zijn aangegeven in figuur 2. De resultaten geven aan dat zowel verpleegkundige bijen en vroegrijpe verzamelaars, overeenkomstig de in het protocol beschreven criteria, werden ook waargenomen in de single-cohort kolonies. Expressie van mrjp2 en Hbg3 in de HPGs was enriched in verpleegkundige bijen en vroegrijpe verzamelaars, respectievelijk, wat aangeeft dat HPG-functie wordt in verband gebracht met de rol van de werknemer (figuur 3) 16.
De procedure voor het injecteren 20E in werknemer koppen wordt getoond in figuur 4. Overlevende bijen werden geteld 1, 5 en 7 dagen na de injectie om de overleving onderzocht snelheid van bijen geïnjecteerd met insect zoutoplossing of oplosmiddel voor 20E oplossing voor de 20E experiment. Op 7 dagen na injectie en ongeveer 60-80% van de geïnjecteerde bijen leefden en overlevingspercentage van bijen geïnjecteerd met oplosmiddel voor 20E oplossing was vergelijkbaar met dat bij insecten zoutoplossing (Tabel 2). Het effect van de 20E injectie verlaagde expressie van zowel mrjp2 en Hgb3 in de HPGs (figuur 5) 16. Naast 20E, het effect van topicale applicatie op methopreen mrjp2 en Hbg3 (tabel 3). Anderzijds, maar ongeveer 20% tot 30% van de bijen geïnjecteerd met aceton / bee zoutoplossing (1: 4) oplossing overleefden 7 dagen na injectie dan overleven bijen werden geteld 1, 3, 5 en 7 dagen na de injectie (tabel 4) . Zo is de aanvraag methode voor methopreen behandeling werd genomen. Toepassing van methopreen remde de expressie van mrjp2 en verhoogde de expressie van Hbg3 (figuur 6) 16.
Figuur 1. Overzicht van de single-cohort kolonie experiment. (A) Regeling voor het bereiden van single-cohort kolonies. (B) tijdsverloop van experiment uit preparing single-cohort kolonies aan het verzamelen verpleegkundige bijen en vroegrijpe verzamelaars. Horizontale pijl geeft het verloop van het leven van een werknemer in de single-cohort kolonies. Getallen met verticale lijnen geven worker leeftijd. Niet alleen vroegrijpe verzamelaars, maar ook te oud verpleegkundige bijen (28-32 dagen oud) gemeld te vinden in single-cohort kolonies 15. Zo kan de vergelijking van de fysiologie tussen oververouderd verpleegkundige bijen en verzamelaars worden uitgevoerd in single-cohort kolonies, hoewel dit niet in deze studie werd gedaan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Foto's die de drie klassen van HPG toestanden. Ontwikkeld (A) Tussenproduct (B) en Shrunken (C Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3.-Rol geassocieerde expressie van mrjp2 en Hbg3 in de HPGs van werknemers uit single-cohort kolonies. De grafiek toont een vergelijking van de mRNA niveaus van mrjp2 (A) en Hbg3 (B) in de HPGs tussen verpleegkundige bijen (N) en vroegtijdige verzamelaars (PF) van twee enkele-cohort colonies. Het mRNA-niveau van elk gen werd genormaliseerd met die van Ribosomaal eiwit 49 (rp49). De relatieve mRNA-niveau van elk gen in de verpleegkundige bijen HPGs werd gedefinieerd als 1. De mRNA-niveau van mrjp2 in sommige vroegrijpe voedermachines kon niet worden gekwantificeerd vanwege signaal intensiteiten lager dan de detectiegrens. Daarom is het aantal monsters verschilt genen. Relatieve mRNA niveaus worden aangeduid met standaardfout. Sterretjes geven significante verschillen tussen verpleegkundige bijen en vroegrijpe voedermachines (*, p <0,05; t-test). Dit cijfer is gereproduceerd van Ueno et al., (2015) 16. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Schema van het protocol voor 20E injectie. Procedures 2.3 en 2.4 in de sectie protocol worden geïllustreerd in deze figuur. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5. Effect van 20E injectie op mrjp2 en Hbg3 uitdrukking in het HPGs 16. De grafiek toont een vergelijking van mRNA niveaus van mrjp2 (A) en Hbg3 (B) in de HPGs tussen 20E-behandelde bijen (20E +) en controle bijen (20E-). Getallen onder de grafiek geven de dag na behandeling 20E. Het mRNA-niveau van elk gen is genormaliseerd met die van elongatie factor 1α-F2 (EF1α-F2). Relatief mRNA niveau vanelk gen in de controle bij HPGs werd gedefinieerd als 1. De relatieve mRNA niveaus worden aangeduid met een standaardfout. Een sterretje geeft een significant verschil tussen 20E-behandelde bijen bijen en controle (*, p <0,05, t-test). Dit cijfer is gereproduceerd van Ueno et al., (2015) 16. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6. Effect van methopreen applicatie op mrjp2 en Hbg3 uitdrukking in het HPGs 16. De grafiek toont de vergelijking van de mRNA niveaus van mrjp2 (A) en Hbg3 (B) in de HPGs tussen methopreen-behandelde controle bijen en bijen. DemRNA van elk gen is genormaliseerd met die van EF1α-F2. Relatieve mRNA van elk gen in de controlegroep bij HPGs werd gedefinieerd als 1. relatieve mRNA niveaus worden aangeduid met standaardfout. Sterretjes geven significante verschillen tussen behandelde methopreen bijen bijen en controle (*, p <0,05, t-test). Dit cijfer is gereproduceerd van Ueno et al., (2015) 16. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Colony No. | waargenomen gedrag | Aantal individuen in elke klasse HPG | |||
| Ontwikkelde | tussen- | Gekrompen | Totaal | ||
| 1 | verpleging | 8 | 1 | 1 | 10 |
| foerageren | 0 | 4 | 7 | 11 | |
| 2 | verpleging | 4 | 2 | 0 | 6 |
| foerageren | 0 | 0 | 5 | 5 | |
Tabel 1: Classificatie van HPGs van werknemers van wie de verpleging of foerageergedrag werd waargenomen in de single-cohort kolonies. HPG grootte in werknemers uit twee single-cohort kolonies (kolonie nrs. 1 en 2) is ingedeeld in drie klassen; 'Ontwikkeld', 'Intermediate' en 'Shrunken' van grootte.
| Dagen na de injectie | geen injectie | insect zoutoplossing | Oplosmiddel voor 20E SOLN | |
| Trial 1 | Day0 | 15/15 | 15/15 | 14/15 |
| Dag 1 | 15/15 | 14/15 | 13/15 | |
| day5 | 14/15 | 13/15 | 11/15 | |
| day7 | 14/15 | 12/15 | 9/15 | |
| Trial 2 | Day0 | 15/15 | 15/15 | 15/15 |
| Dag 1 | 15/15 | 13/15 | 15/15 | |
| day5 | 15/15 | 11/15 | 12/15 | |
| day7 | 14/15 | 10/15 | 12/15 |
Tabel 2: overleving van bijen geïnjecteerd met oplosmiddel voor 20E oplossing. Vijftien arbeiders werden bereid in elke experimentele groep.
| Dagen na het aanbrengen | Aceton | Methoprene | |
| Trial 1 | dag 0 | 7/7 | 8/8 |
| dag 7 | 7/7 | 6/8 | |
| Trial 2 | dag 0 | 7/7 | 8/8 |
| dag 7 | 7/7 | 8/8 |
Tabel 3: Survival tarief van bijen behandeld met methopreen Zeven tot acht arbeiders werden bereid in elke experimentele groep..
| Dagen na de injectie | geen injectie | Aceton / Bee zoutoplossing (1: 4) |
| dag 0 | 15/15 | 15/15 |
| Dag 1 | 15/15 | 6/15 |
| dag 3 | 15/15 | 5/15 |
| dag 5 | 15/15 | 4/15 |
| dag 7 | 15/15 | 4/15 |
Tabel 4: Overlevingspercentage bijen geïnjecteerd met aceton / bee zoutoplossing (1: 4). Vijftien oplossing arbeiders werden voor elke experimentele groep. Aceton / bij zoutoplossing (1: 4) werd geïnjecteerd in de werknemer buik. De samenstelling van bijen zoutoplossing is 130 mM NaCl, 6 mM KCl, 4 mM MgCl2, 2,5 mM CaCl2, 160 mM sucrose, 25 mM glucose en 10 mM HEPES (pH 7,0).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Voorbereiding van de single-cohort kolonies
Hier beschrijven we het protocol dat in onze vorige studie 16 enkelvoudige-cohort kolonies bereiden voor analyse van HPG fysiologie verband met de verschuiving van de rol van werkbijen. Verpleegkundige bijen en vroegrijpe verzamelaars dat de procedures 1,6-1,7 en Figuur 2 beschreven criteria voldoen werden waargenomen in de single-cohort kolonies (tabel 1). De foto in figuur 2 zou nuttig zijn in de classificatie van HPG luidt als referentie. Criteria op basis van zowel werknemer gedrag en HPG ontwikkeling zijn geldig voor het definiëren van verpleegkundige bijen of verzamelaars in de typische kolonies. Role verschuiving van verpleging tot foerageren geleidelijk verloopt in die kolonies: de hoeveelheid tijd doorgebracht in de verpleging gedrag geleidelijk af, terwijl dat in foerageergedrag geleidelijk toeneemt tijdens de rol shift 2. Zo zou het moeilijk zijn om werkers die uitsluitend verzamelenvoeren verpleging of foerageergebied door alleen gedragsmatige criteria. Het resultaat dat de expressie van mrjp2 en Hbg3 in de HPGs wordt geassocieerd met de rol van de werknemers geeft duidelijk aan dat de hier beschreven protocol kan worden vastgesteld om HPG fysiologie in verpleegkundige bijen en vroegrijp verzamelaars van single-cohort kolonies (figuur 3) te onderzoeken. Criteria op basis van zowel werknemer gedrag en HPG ontwikkeling zou ook bij het definiëren van verpleegkundige bijen en vroegrijp verzamelaars van single-cohort kolonies van toepassing zijn. Naast de HPGs andere exocriene klieren in de kop ondergaan fysiologische veranderingen in samenhang met de rol shift. Bijvoorbeeld, de functie van de onderkaak klier verandert van de synthese van vetzuren voor brood eten de synthese van feromoon 2-heptanon 2. De hier beschreven protocol kan derhalve worden aangepast om de rol-geassocieerde fysiologie van andere dan de HPGs exocriene klieren worden onderzocht.
Succesvolle collectie van nurse bijen en vroegrijp verzamelaars van single-cohort kolonies is afhankelijk van de collectie van een voldoende aantal nieuw opgedoken werknemers wanneer de kolonies worden voorbereid. Als een gering aantal nieuw opgedoken werknemers wordt verzameld, zou het moeilijk zijn genoeg verpleegkundige bijen en vroegrijpe verzamelaars verzamelen. Bovendien is de toestand van de koninginnen is een ander belangrijk punt voor een succesvolle monstername. Queens met een grote buik zijn goed voor het leggen van eieren, omdat deze queens meestal eierstokken hebben ontwikkeld. Aldus wordt de arbeid van werknemers gedacht effectief zelfs verdeeld in enkele kolonies cohort omdat het broed constant door de koningin wordt toegevoerd. Als er geen broed is geleverd, zou het moeilijk zijn om verpleegster bijen te verzamelen van de single-cohort kolonies. Tot slot, het markeren van de werknemers die met plakkaatverf is nodig om ervoor te zorgen dat werknemers worden verzameld uit single-cohort kolonies, omdat verzamelaars af en toe terug te keren naar de verkeerde kolonie. Om vroegrijpe voedermachines effectief te verzamelen, moet verf merken zijntoegepast om zo veel mogelijk werknemers (meer dan 900 nieuw opgedoken werknemers per single-cohort kolonie). Het gebruik van inkt op waterbasis voor het merken kan worden aanbevolen, omdat een op olie gebaseerde inkt, die gewoonlijk bevat vluchtige organische verbindingen, kan de chemische communicatie tussen de bijen verstoren. De op water gebaseerde inkt markeringen niet veel vervagen in de loop van het experiment.
hormoonbehandeling
We beschreef ook het protocol voor het injecteren van 20E in de hoofden van de werknemers om het effect van ecdyson op HPG fysiologie (mrjp2 en Hbg3 expressie) te onderzoeken. Het overlevingspercentage van bijen geïnjecteerd met insect zoutoplossing of het oplosmiddel voor 20E oplossing was voldoende voor de daaropvolgende analyse aangeeft dat het protocol beschreven voor injectie via een injectie tip en oplosmiddel voor 20E oplossing voor de 20E injectie experiment (tabel 2 kan worden vastgesteld ). Bovendien vergelijking van genexpressie in de HPGs20E tussen behandelde en controle bijen bijen aangegeven dat het ingebrachte 20E veranderde de expressie van mrjp2 en Hbg3, die beide verband houden met HPG-functie (figuur 5). Dit resultaat suggereert dat de hier beschreven protocol bruikbaar voor het onderzoeken van de effecten van ecdyson op HPG fysiologie zou zijn, en voor de behandeling van andere exocriene klieren in het hoofd, zoals de onderkaak klieren worden vastgesteld. Verder kan de injectiewerkwijze voor het injecteren van andere chemicaliën vastgesteld. Bijvoorbeeld, de hier beschreven protocol geschikt voor het injecteren van dubbelstrengs RNA oplossingen in de koppen voor gen knockdown experimenten.
Naast 20E beschreven we een protocol voor het aanbrengen methopreen, die een JH analoog. Methoprene wordt gewoonlijk aangebracht op de buik. Anderzijds, werd methopreen aangebracht op het hoofd van arbeiders, hier. Bijna alle bijen met plaatselijke toepassing van methopreen of aceton overleefd 7 dagen na de behandelingDit suggereert dat de toepassing van 5 ul methopreen of acetonoplossing de koppen heeft weinig effect op werknemer overleving (tabel 3). Verder vergelijkt mrjp2 en Hbg3 expressie in de HPGs tussen methoprene- en aceton behandelde bijen aangeeft dat methopreen toepassing remt mrjp2 expressie en verbetert Hbg3 expressie (figuur 6). Deze resultaten suggereren dat de hier beschreven protocol geschikt voor het analyseren van de effecten van methopreen naar de fysiologie van exocriene klieren zoals HPGs in de kop.
Succesvolle hormonale behandeling is afhankelijk van de overleving van de behandelde bijen. blootstelling aan lage temperatuur in de koelkast kan geschikt zijn voor verlamming bijen. Anesthesie op ijs wordt afgeraden, omdat de bijen nat op het ijs te krijgen, wat leidt tot een lage overlevingskans. Bovendien kan de injectiemethode ander belangrijk punt voor het houden van bijen leven. Belangrijk is make de injectie tip lang en dun, en om het vorm te geven aan een scherpe punt met behulp van het mes om schade aan de bijen door middel van injectie te minimaliseren. Echter kan de injectiemethode niet geschikt voor het onderzoeken van de effecten van methopreen op HPG fysiologie, omdat de aceton oplosmiddel voor methopreen negatief bij overleving (Tabel 4) beïnvloedt. Bovendien kan de injectie hier beschreven methode niet geschikt voor gedragsanalyse in kolonies geïnjecteerde bijen zouden buiten de kolonies wanneer ze opnieuw worden ingebracht na injectie. Werknemers met een lichte blessure zou kunnen worden uitgesloten van de kolonies. Andere werkwijzen, zoals toepassing als orale toediening van hormoon kan geschikt zijn voor gedragsanalyse zijn.
De single-cohort kolonie is gebruikt om de regulering van de verdeling van arbeid van werkbijen 10,11 te onderzoeken. Bovendien heeft de behandeling met juveniel hormoon gebruikt voor het onderzoek van het gedrag en de hersenen functiop in verband met de verdeling van arbeid 11. Echter, gedetailleerde protocollen voor zowel de bereiding van het één-cohort kolonies en de behandeling met JH niet eerder op zodanige detail. Onlangs heeft het belang van ecdyson in de verdeling van arbeid worden steeds meer erkend, en de regulering van de verdeling van arbeid door zowel JH en ecdyson wordt voorgesteld 23. De gedetailleerde protocollen voor de succesvolle voorbereiding van de single-cohort koloniën en hormoonbehandeling zoals JH en ecdyson beschreven in dit artikel kan bijdragen tot vooruitgang in de studie van de werknemer fysiologie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| UNIPOSCA | Mitsubishi pencil | PC-5M | Marker pen for the application of marks to bees |
| 20-hydroxyecdysone | Sigma Aldrich | H5142 | |
| Methoprene | Sigma Aldrich | 33375 | |
| Breeding case insect | IRIS OHYAMA | CP-SS | |
| Electromotion mixier | ISO | 23M-R25 | homogenization of tissue |
| TRIZol Reagent | Invitrogen | 15596-026 | the reagent for total RNA extraction |
| DNase I | Takara | 2270A | |
| PrimeScript RT reagent kit | Takara | RR037A | the reagent for reverse transcription |
| SYBR Premix ExTaq II | Takara | RR820A | the reagent for real-time PCR |
| LightCycle 1.2 Instrument | Roche | 12011468001 | the instrument for real-time PCR |
| LightCycle Capillaries (20μl) | Roche | 4929292001 | the material for real-time PCR |
References
- Wilson, E. O. The insect societies. , Harvard university press. (1971).
- Winston, M. L. The biology of the honey bee. , Harvard university press. (1987).
- Lindauer, M. Ein Beitrag zur Frage der Arbeitsteilung im Bienenstaat. Zeitschrift für vergleichende Physiologie. 34 (4), 299-345 (1952).
- Sakagami, S. Untersuchungen uber die Arbeitsteilung in einen Zwergvolk der Honigbienen. Beitrage zur Biologie des Bienenvolkes, Apis mellifera L. I. Jap J Zool. 11, 117-185 (1953).
- Kubo, T., et al. Change in the expression of hypopharyngeal-gland proteins of the worker honeybees (Apis mellifera L.) with age and/or role. J Biochem. 119 (2), 291-295 (1996).
- Ohashi, K., Natori, S., Kubo, T. Change in the mode of gene expression of the hypopharyngeal gland cells with an age-dependent role change of the worker honeybee Apis mellifera L. Eur J Biochem. 249 (3), 797-802 (1997).
- Ohashi, K., Natori, S., Kubo, T. Expression of amylase and glucose oxidase in the hypopharyngeal gland with an age-dependent role change of the worker honeybee (Apis mellifera L). Eur J Biochem. 265 (1), 127-133 (1999).
- Ohashi, K., Sawata, M., Takeuchi, H., Natori, S., Kubo, T. Molecular cloning of cDNA and analysis of expression of the gene for alpha-glucosidase from the hypopharyngeal gland of the honeybee Apis mellifera L. Biochem Biophys Res Commun. 221 (2), 380-385 (1996).
- Ueno, T., Nakaoka, T., Takeuchi, H., Kubo, T. Differential gene expression in the hypopharyngeal glands of worker honeybees (Apis mellifera L.) associated with an age-dependent role change. Zoolog Sci. 26 (8), 557-563 (2009).
- Robinson, G. E., Page, R. E., Strambi, C., Strambi, A. Hormonal and genetic control of behavioral integration in honey bee colonies. Science. 246 (4926), 109-112 (1989).
- Sullivan, J. P., Fahrbach, S. E., Robinson, G. E. Juvenile hormone paces behavioral development in the adult worker honey bee. Horm Behav. 37 (1), 1-14 (2000).
- Ben-Shahar, Y., Robichon, A., Sokolowski, M. B., Robinson, G. E. Influence of gene action across different time scales on behavior. Science. 296 (5568), 741-744 (2002).
- Lehman, H. K., et al. Division of labor in the honey bee (Apis mellifera): the role of tyramine beta-hydroxylase. J Exp Biol. 209 (Pt 14), 2774-2784 (2006).
- Mutti, N. S., Wang, Y., Kaftanoglu, O., Amdam, G. V. Honey bee PTEN--description, developmental knockdown, and tissue-specific expression of splice-variants correlated with alternative social phenotypes). PLoS One. 6 (7), e22195 (2011).
- Whitfield, C. W., Cziko, A. M., Robinson, G. E. Gene expression profiles in the brain predict behavior in individual honey bees. Science. 302 (5643), 296-299 (2003).
- Ueno, T., Takeuchi, H., Kawasaki, K., Kubo, T. Changes in the Gene Expression Profiles of the Hypopharyngeal Gland of Worker Honeybees in Association with Worker Behavior and Hormonal Factors. PLoS One. 10 (6), e0130206 (2015).
- Paul, R. K., Takeuchi, H., Matsuo, Y., Kubo, T. Gene expression of ecdysteroid-regulated gene E74 of the honeybee in ovary and brain. Insect Mol Biol. 14 (1), 9-15 (2005).
- Takeuchi, H., et al. Identification of a novel gene, Mblk-1, that encodes a putative transcription factor expressed preferentially in the large-type Kenyon cells of the honeybee brain. Insect Mol Biol. 10 (5), 487-494 (2001).
- Takeuchi, H., Paul, R. K., Matsuzaka, E., Kubo, T. EcR-A expression in the brain and ovary of the honeybee (Apis mellifera L). Zoolog Sci. 24 (6), 596-603 (2007).
- Yamane, T., Miyatake, T. Reduced female mating receptivity and activation of oviposition in two Callosobruchus species due to injection of biogenic amines. Journal of Insect Physiology. 56 (3), 271-276 (2010).
- Ben-Shahar, Y., Leung, H. T., Pak, W. L., Sokolowski, M. B., Robinson, G. E. cGMP-dependent changes in phototaxis: a possible role for the foraging gene in honey bee division of labor. J Exp Biol. 206 (Pt 14), 2507-2515 (2003).
- Danforth, B. N., Ji, S. Elongation factor-1 alpha occurs as two copies in bees: implications for phylogenetic analysis of EF-1 alpha sequences in insects. Mol Biol Evol. 15 (3), 225-235 (1998).
- Pandey, A., Bloch, G. Juvenile hormone and ecdysteroids as major regulators of brain and behavior in bees. Current Opinion in Insect Science. 12, 26-37 (2015).
