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Neuroscience

Preparazione di singole colonie-coorte e trattamento ormonale di lavoratore api per analizzare Fisiologia associati con il ruolo e / o sistema endocrino

doi: 10.3791/54240 Published: September 6, 2016

Summary

Qui si descrive il nostro protocollo dettagliato per la preparazione di colonie di api singola coorte - uno strumento utile per analizzare la fisiologia dei lavoratori di ruolo associati. Descriviamo anche protocolli dettagliati per il trattamento di lavoratori con ormone giovanile e ecdysone per valutare il coinvolgimento di questi ormoni nella regolazione del comportamento dei lavoratori e / o la fisiologia.

Introduction

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L'ape europea, Apis mellifera, è un insetto eusocial con una società altamente organizzata 1. Api operaie (casta lavoro) sono impegnati in varie attività per mantenere l'attività delle colonie, e questi compiti cambiano a seconda dell'età del lavoratore api dopo eclosion, che viene indicato come divisione relativa all'età del lavoro 2-4. Lavoratori giovani (<13 giorni) si prendono cura della nidiata nell'alveare secernendo pappa reale (api nutrici), mentre i lavoratori più anziani (> 15 giorni) raccolgono il nettare e il polline di fuori dell'alveare (raccoglitori) 2-4. La fisiologia dei lavoratori cambia in associazione con questo spostamento ruolo. Ad esempio, la funzione delle ghiandole ipofaringee (HPGs), accoppiato ghiandole esocrine situati nella testa, i cambiamenti in associazione con il passaggio da ruolo infermieristico a foraggiare 2,5. HPGs infermiera ape sintetizzano principalmente principali proteine ​​pappa reale, che sono i principali componenti di latte api. D'altra parte, HPGs falciatrici principalmentesintetizzare enzimi carboidrati metabolizzare, come α-glucosidasi III, per elaborare nettare miele convertendo saccarosio in glucosio e fruttosio. I nostri studi precedenti hanno rivelato che l'espressione di mrjp2, che codifica per una proteina importante pappa reale, e Hbg3, che codifica α-glucosidasi III, i cambiamenti durante il turno ruolo di 6-9.

Per determinare se i cambiamenti fisiologici nei tessuti lavoratore, compresi i HPGs, è associato con lo spostamento ruolo o con l'età dei lavoratori, sarebbe utile per manipolare la composizione della popolazione di una colonia di api, ad esempio per preparare singolo coorte colonie in cui i lavoratori di quasi la stessa età di eseguire diversi compiti 10,11. Robinson et al. (1989) ha descritto un metodo per stabilire un singolo-coorte colonia 10. colonie singola coorte inizialmente comprendono una regina e vecchi operai 0-2 al giorno. Alcuni giorni dopo aver stabilito le colonie, i lavoratori di almost la stessa età assumere compiti diversi. Alcuni lavoratori svolgono compiti di cura, come nelle colonie tipiche, mentre altri lavoratori eseguire le attività di foraggiamento prima del solito e sono quindi chiamati raccoglitori precoci. Il confronto di espressione genica tra api nutrici e raccoglitori precoci potrebbero fornire informazioni utili sulla fisiologia di ruolo associata dei tessuti dei lavoratori 12-16. Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per la preparazione di colonie singola coorte per l'analisi della fisiologia di ruolo e / o età-associate di HPGs 16. Abbiamo anche descrivere brevemente come esaminare l'espressione genica di mrjp2 e Hbg3 da reazione a catena della polimerasi di trascrizione inversa-quantitativa (RT-PCR) per valutare HPG fisiologia.

Oltre all'analisi della fisiologia dei lavoratori nelle colonie singola coorte, l'esame del sistema endocrino è importante per analizzare i meccanismi di regolazione di ruolo associata la fisiologia dei lavoratori. ormone giovanile (JH), che viene known come l'ormone 'status quo' in larve di insetti, accelera lo spostamento nel ruolo da infermieristico per l'alimentazione delle api operaie a 11. Inoltre, ecdysone, che è conosciuto come l'ormone della muta durante la metamorfosi, potrebbe essere coinvolto nel passaggio ruolo di geni che codificano per molecole di segnalazione ecdysone sono espressi nei corpi di funghi, un più alto centro del cervello operaio 17-19. Pertanto, abbiamo anche descritto il protocollo dettagliato utilizzato nel nostro studio precedente 16 per trattare i lavoratori con 20E, che è una forma attiva di ecdysone e metoprene, un analogo JH, per l'analisi degli effetti del sistema endocrino sulla HPG fisiologia (espressione mrjp2 e Hbg3).

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Protocol

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1. Preparazione di singole colonie-coorte

  1. Preparare tre colonie di api per la creazione di due colonie singola coorte e per ottenere un numero sufficiente di lavoratori nuovi emersi.
    1. Verificare che alcune pupe nelle cellule periferiche innevate nei favi ha occhi marroni e una cuticola pigmentato aprendo i pettini innevate con una pinzetta. Se sono presenti queste pupe in cellule pettine periferici, la maggior parte pupe in tutta la pettini emergerà in circa 1-3 giorni.
    2. Successivamente, raccogliere i pettini che contengono queste pupe dopo tutte le api adulte aderenti sono stati rimossi con una spazzola, e mescolare i pettini delle tre colonie di ridurre al minimo la variabilità tra le colonie.
  2. Posizionare i pettini raccolti in una scatola vuota alveare e incubare a 33 ° C in condizioni di umidità (> 60% di umidità relativa). Raccogliere circa 6.000 lavoratori nuovi emersi nel corso di 3 giorni (3.000 lavoratori per colonia) dai pettini raccolti.
  3. Determinare la quantità di workeRS sulla base del peso di cinque operai recentemente emersi raccolti in modo casuale dalle colonie non manipolata.
    1. Pesare cinque lavoratori nuovi emersi raccolti in modo casuale da colonie non manipolate con macchine di pesatura.
      Nota: Il peso di cinque operai recentemente emersi è generalmente 500-600 mg.
    2. Stima la quantità di lavoratori raccolti dividendo il peso dei lavoratori raccolti dal peso medio di cinque lavoratori nuovi emersi.
  4. Applicare segni di vernice alle thoraces di circa 1.800 lavoratori (900 operai per colonia) utilizzando marcatori vernice poster a base d'acqua.
    Nota: marcatore lavabile che viene utilizzato per applicare la vernice è elencato nella tabella dei materiali.
  5. Introdurre una regina e circa 3.000 delle vecchie lavoratori 0-2 al giorno per una nuova casella alveare che contiene due pettini, un pettine di miele e polline come conserve e un altro pettine vuoto per la deposizione delle uova dalla regina. Raccogliere il pettine di miele e polline from un'altra colonia non manipolata dopo tutte le api aderenti vengono rimossi.
    Nota: Si consiglia l'uso della scatola alveare nucleare (piccola scatola alveare dimensioni).
  6. Raccogliere api nutrici e raccoglitori precoci con vernice segna 6 a 8 giorni dopo la creazione di colonie singola coorte.
    1. Per raccogliere le api infermiere, raccogliere i lavoratori che mettono le loro teste nelle cellule pettine per prendersi cura della covata. Utilizzare le pinzette per raccogliere le api infermiere da pettini che contengono molti lavoratori covata e adulti.
      Nota: Se HPGs dei lavoratori raccolti sono sviluppate quando sezionato come descritto al punto 1.7, questi lavoratori sono definiti come api nutrici. Tenendo le thoraces di pinzette si raccomanda di raccogliere i lavoratori dai favi.
    2. Per raccogliere raccoglitori, utilizzare una rete per catturare insetti lavoratori che ritornano ai loro alveari con carichi di polline sulle zampe posteriori.
      Nota: Se HPGs dei lavoratori catturati appare rimpicciolita quando sezionato come descritto al punto 1.7, questi lavoratori sono definiti come raccoglitori.
  7. ClasSify l'HPG in tre gruppi, 'sviluppato', 'intermedi', e 'Shrunken' dalla dissezione sotto uno stereomicroscopio.
    1. Anestetizzare 10-15 api in una gabbia insetto in frigorifero per 10-15 minuti fino a quando le api non possono volare o camminare. Quindi spostare api su ghiaccio e completare l'anestesia in ghiaccio per 5 min.
      Nota: Ci vogliono circa 15-20 minuti in totale per ottenere l'anestesia. Se il tempo di anestesia deve essere ridotto, il numero di api in una gabbia deve essere ridotto a 1-3 api per gabbia.
    2. Sezionare la testa dal corpo con le forbici e pinzette. Fissare la testa sulle impronte dentarie posto su una capsula di Petri con perni. Inserire due perni nelle basi delle antenne per fissare la testa. Mettere a bagno le teste fisse in soluzione salina insetto (130 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl 2).
    3. Rimuovere la faccia anteriore della cuticola della testa con una pinzetta fini e un bisturi al microscopio binoculare.
      Nota: I HPGs possono essere facilmente trovati in testa dopo la rimozione di cuticle. L'HPG è un organo botrioide che esiste intorno al cervello nella testa.
    4. Rimuovere il tessuto tracheale che è un tessuto membranoso bianca sotto la cuticola. Poi, sezionare i HPGs dalla testa tirandole lentamente con una pinzetta.
    5. Adesso HPGs con ampia e circolare acini come 'sviluppato'. Adesso HPGs con il piccolo e distorto acini come 'Shrunken'. Adesso HPGs corrispondente a nessuno 'sviluppato' né 'Shrunken' come 'intermedio'.
      Nota: fotografie rappresentativi che mostrano queste tre classi di HPG stati sono indicati in figura 2.
    6. Soggetto 'sviluppato' e HPGs 'Shrunken' per l'estrazione di RNA come 'infermiere api HPGs' e 'HPGs falciatrici', rispettivamente, e confrontare l'espressione genica nelle HPGs tra api nutrici e raccoglitori (sezione 4).

2. Iniezione di 20E

  1. Raccogliere api nutrici da colonie tipiche come described nella procedura 1.6.1.
    Nota: HPGs non possono essere esaminate in queste api come saranno allevate le api.
  2. Anestetizzare le api a 4 ° C in frigorifero (non su ghiaccio).
    Nota: Ci vogliono circa 30 minuti per raggiungere l'anestesia. Se il tempo di anestesia è ridotto, il numero di api nella gabbia deve essere ridotta a 1-3 api per gabbia.
  3. Usando le pinzette, immobilizzare le api su impronte dentarie posti su una piastra di Petri.
  4. Iniettare 1 ml di soluzione di 20E nella faccia anteriore della testa con una punta di iniezione a base di una micropipetta capillare calibrato con un estrattore ago di vetro.
    1. Sciogliere 20E in soluzione salina etanolo-insetto (130 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl 2) miscela (1: 4) a 2,5 mg / mL.
    2. Collegare la punta di iniezione ad un tubo di gomma, e collegare una punta micropipetta giallo al lato opposto del tubo.
    3. Mettere 1 ml di soluzione di 20E su parafilm utilizzando una micropipetta, tenere la punta micropipetta gialla in bocca, und disegnare la soluzione nella punta di iniezione.
    4. Inserire la punta di iniezione nella base delle antenne, e iniettare la soluzione soffiando attraverso la punta micropipetta gialla.
      Nota: Il protocollo mostrato in questa fase è il metodo di iniezione rappresentante, ma l'uso della macchina per iniezione automatica è raccomandato per la sicurezza se necessario 20.
  5. Posteriore le api iniettati in gabbie di insetti a 33-36 ° C (la temperatura ideale è di 35 ° C) in condizioni di buio e umido (> 60% di umidità relativa) per 1 o 3 giorni. miscela di miele-acqua di alimentazione (1: 1) per le api. Se necessario, contare sopravvivenza delle api dopo l'iniezione.

3. Applicazione di Methoprene

  1. Raccogliere i pettini che contengono pupe da tipiche colonie dopo tutte le api adulte aderenti vengono rimossi con un pennello. Incubare i pettini a 33-36 ° C (la temperatura ideale è di 35 ° C) in ambiente umido (> 60% di umidità relativa) fino a 1 giorno.
  2. Dopo 6 giorni, raccogliere i lavoratori verniciato (6 giorni di età) dalle colonie. Pick up lavoratori dipinte dai favi tenendo loro thoraces con una pinzetta.
  3. Anestetizzare le api a 4 ° C in frigorifero (non su ghiaccio) come nella procedura 2.2. Usando le pinzette, immobilizzare le api su impronte dentarie posti su una piastra di Petri e applicare 1-5 ml di soluzione di methoprene (50-250 mg / mL) disciolto in acetone per le loro teste usando una micropipetta. Utilizzare una punta filtro che è resistente alla acetone.
    Nota: Acetone può avere effetti dannosi sulle api che portano alla morte. Se si osserva l'elevata mortalità delle api, si raccomanda la riduzione del volume di acetone per 1 ml al minimo.
  4. Posteriore le api in gabbie di insetti a 33-36 ° C (la t idealeemperature è di 35 ° C) per 7 giorni in condizioni di buio e umido (> 60% di umidità relativa). miscela di miele-acqua di alimentazione (1: 1) per le api. Se necessario, contare sopravvivenza delle api dopo l'applicazione topica.
    Nota: In questo articolo, le api sopravvissute sono contati 7 giorni dopo l'applicazione (Tabella 3).

4. RNA Estrazione e RT-PCR quantitativa

  1. Anestetizzare le api e sezionare HPGs come descritto nei punti 1.7.1 a 1.7.4.
  2. Raccogliere le HPGs sezionato in una provetta in ghiaccio secco e conservare a -80 ° C fino al momento dell'uso.
  3. Aggiungere 400 ml di reagente per denaturazione proteica.
    Nota: Questo reagente è disponibile in commercio (si veda la tabella dei materiali).
  4. Omogeneizzare i tessuti HPG con una mano tesa miscelatore elettrico con un pestello omogeneizzazione che si inserisce all'interno di una provetta. Omogeneizzare ad una velocità di rotazione di circa 300 rpm per 1 min in ghiaccio per rompere e cellule del tessuto Lisare.
    tabella dei materiali).
  5. Aggiungere 80 ml di cloroformio e mescolare bene. Incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.
  6. Centrifugare le provette da microcentrifuga a 14.170 xg per 15 min a 4 ° C. Trasferire la fase acquosa in una nuova provetta. Aggiungere un volume uguale di isopropanolo e 1 ml di glicogeno (5 mg / ml). Incubare a -20 ° C per almeno 20 min.
  7. Centrifugare le provette da microcentrifuga a 14.170 xg per 10 min a 4 ° C e rimuovere il surnatante.
  8. Aggiungere 400 ml di etanolo al 75% per il pellet e mescolare bene, centrifugare le provette da microcentrifuga a 14.170 xg per 15 min a 4 ° C, e rimuovere il surnatante. Ripetere queste procedure ancora una volta.
  9. Far asciugare il pellet per 5-10 minuti e poi si dissolvono in 10 acqua priva di RNasi microlitri.
    Nota: essiccazione completa del pellet può causare insolubilizzazione del pellet di RNA in acqua. Così, il pellet che è leggermente surf è appropriato perdissoluzione.
  10. Misurare la concentrazione di RNA utilizzando uno spettrofotometro come NanoDrop o simili.
  11. Trattare 500 ng di RNA totale con 2.0 U di DNasi I incubando a 37 ° C per 30 min a degradare qualsiasi DNA genomico contaminante.
  12. Reverse-trascrivere 200 ng di RNA DNasi I trattati ed eseguire real time PCR utilizzando kit disponibili in commercio (si veda l'elenco nella tabella dei materiali e reagenti) e primer gene-specifici (mrjp2; 5'-AAATGGTCGCTCAAAATGACAGA-3 'e 5 '-ATTCATCCTTTACAGGTTTGTTGC-3', Hbg3; 5'-TACCTGGCTTCGTGTCAAC-3 'e 5'-ATCTTCGGTTTCCCTAGAGAATG-3'). Eseguire la PCR come segue: [95 ° C x 30 sec + (95 ° C x 5 sec + 60 ° C x 15 sec + 72 ° C x 20 sec) x 45-55 cicli].
  13. Normalizzare la quantità di trascrizione con quella del fattore di allungamento 1α-F2 (EF1α˗F2) o ribosomiale proteina 49 (rp49) 9,16,21,22. Questi geni sono un controllo affidabile gEnes per l'analisi dell'espressione genica nelle HPGs con qRT-PCR.
  14. Eseguire due code t-test per rilevare le differenze significative tra due gruppi sperimentali (api nutrici contro raccoglitori precoci, api 20E-trattati contro le api di controllo, e le api Methoprene trattati vs. api di controllo) utilizzando il software statistico.
    Nota: Se F-test assume l'omogeneità della varianza, test t può essere utilizzato. Se no, t-test di Welch può essere utilizzato.

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Representative Results

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Una panoramica del protocollo per la preparazione di colonie singola coorte è illustrata nella Figura 1A. Time-corso di esperimenti da preparare colonie singola coorte di assaggiare collezione è mostrato in Figura 1B. I lavoratori che hanno soddisfatto i criteri di comportamento per il comportamento di cura o comportamento alimentare sono stati raccolti da colonie singola coorte, e lo sviluppo HPG è stata stimata in questi lavoratori tabella 1 mostra la classificazione di sviluppo HPG in tre gruppi.; 'Sviluppato', 'intermedio', e 'Shrunken' in base alle dimensioni. Fotografie rappresentative che mostrano queste tre classi di HPGs sono indicati nella Figura 2. I risultati indicano che entrambe le api nutrici e raccoglitori precoci, secondo i criteri descritti nel protocollo, sono stati osservati anche nelle colonie singola coorte. L'espressione di mrjp2 e Hbg3 nelle HPGs era enarricchì in api nutrici e raccoglitori precoci, rispettivamente, ad indicare che la funzione HPG è associato con il ruolo del lavoratore (Figura 3) 16.

La procedura per iniettare 20E nella testa di lavoro è illustrato nella figura 4. Api sopravvissuti sono stati contati 1, 5 e 7 giorni dopo l'iniezione di esaminare la sopravvivenza tasso di api iniettati con soluzione salina insetto o solvente per 20E soluzione prima dell'esperimento 20E. A 7 giorni dopo l'iniezione, circa il 60-80% delle api iniettati fosse vivo, e il tasso di sopravvivenza delle api iniettati con solvente per soluzione 20E era paragonabile a quella con soluzione salina insetto (Tabella 2). L'effetto dell'iniezione 20E diminuita espressione di entrambi mrjp2 e Hgb3 nelle HPGs (Figura 5) 16. Oltre a 20E, l'effetto dell'applicazione methoprene topica sulla mrjp2 e Hbg3 (Tabella 3). D'altra parte, solo circa il 20% al 30% di api iniettato con acetone / ape salina (1: 4) soluzione sopravvissuto 7 giorni dopo l'iniezione quando le api sopravvissuti sono stati contati 1, 3, 5 e 7 giorni dopo l'iniezione (tabella 4) . Così, è stato adottato il metodo di applicazione per il trattamento methoprene. Applicazione del methoprene inibito l'espressione di mrjp2 e migliorato l'espressione di Hbg3 (Figura 6) 16.

Figura 1
Figura 1. Panoramica esperimento colonia singola coorte. (A) Schema per la preparazione di colonie singola coorte. (B) Time-corso di sperimentazione da preparing colonie singola coorte per la raccolta di api nutrici e raccoglitori precoci. freccia orizzontale indica il corso della vita di un lavoratore nelle colonie singola coorte. I numeri con linee verticali indicano l'età dei lavoratori. Non solo raccoglitori precoci ma anche api nutrici troppo vecchio (28-32 giorni) sono segnalati per essere trovato in colonie singola coorte 15. Così, il confronto della fisiologia tra api nutrici troppo vecchio e raccoglitori può essere eseguita in colonie singola coorte, anche se questo non è stato fatto in questo studio. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

figura 2
Figura 2. Le fotografie che mostrano le tre classi di HPG Uniti. Sviluppato (A), intermedio (B), e Shrunken (C Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3. Ruolo associata espressione di mrjp2 e Hbg3 nelle HPGs di lavoratori provenienti da colonie singola coorte. Il grafico mostra un confronto tra i livelli di mRNA di mrjp2 (A) e Hbg3 (B) nei HPGs tra api nutrici (N) e raccoglitori precoci (PF) da due single-coorte colonies. Il livello di mRNA di ogni gene è stata normalizzata con quella della proteina ribosomale 49 (rp49). Il livello di mRNA relativo di ogni gene nei HPGs api infermiera è stata definita come 1. Il livello di mRNA di mrjp2 in alcuni raccoglitori precoci non poteva essere quantificato a causa della intensità di segnale inferiori alla soglia di rilevazione. Pertanto, il numero di campioni differisce tra geni. livelli di mRNA relativi sono indicate con errore standard. Gli asterischi indicano differenze significative tra le api infermiere e raccoglitori precoci (*, p <0.05; t-test). Questo dato è stato riprodotto da Ueno et al., (2015) 16. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4
Figura 4. Schema del protocollo per 20E INIEZzione. Procedure 2.3 e 2.4 nella sezione del protocollo sono illustrati in questa figura. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5
Figura 5. Effetto dell'iniezione 20E su mrjp2 ed espressione Hbg3 nel HPGs 16. Il grafico mostra un confronto dei livelli di mRNA di mrjp2 (A) e Hbg3 (B) nel HPGs tra api 20E-trattati (20E +) e api controllo (20E-). Numeri sotto il grafico indicano il giorno dopo il trattamento 20E. Il livello di mRNA di ogni gene è stata normalizzata con quella del fattore di allungamento 1α-F2 (EF1α-F2). livello di mRNA relativo diogni gene nei HPGs api di controllo è stato definito come 1. livelli di mRNA relativi sono indicate con un errore standard. Un asterisco indica una differenza significativa tra api 20E-trattati e api controllo (*, p <0,05; t-test). Questo dato è stato riprodotto da Ueno et al., (2015) 16. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 6
Figura 6. Effetto di applicazione methoprene su mrjp2 e l'espressione Hbg3 nei HPGs 16. Il grafico mostra il confronto dei livelli di mRNA di mrjp2 (A) e Hbg3 (B) nei HPGs tra api Methoprene trattati e le api di controllo. Illivello di mRNA di ogni gene è stata normalizzata con quella EF1α-F2. livello di mRNA relativo di ogni gene nei HPGs api di controllo è stato definito come 1. livelli di mRNA relativi sono indicate con errore standard. Gli asterischi indicano differenze significative tra le api Methoprene trattati e api di controllo (*, p <0.05; t-test). Questo dato è stato riprodotto da Ueno et al., (2015) 16. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Colony No. comportamento osservato Numero di individui in ogni classe HPG
Sviluppato Intermedio rinsecchito Totale
1 Assistenza infermieristica 8 1 1 10
foraggiamento 0 4 7 11
2 Assistenza infermieristica 4 2 0 6
foraggiamento 0 0 5 5

Tabella 1: Classificazione delle HPGs di lavoratori la cui cura o del comportamento alimentare è stato osservato in colonie singola coorte. dimensioni HPG in lavoratori di due colonie singola coorte (nn colonia 1 e 2.) è stato suddiviso in tre classi; 'Sviluppato', 'intermedio' e 'Shrunken' in base alle dimensioni.

Giorni dopo l'iniezione No iniezione salina insetti Solvente per 20E soln
Trial 1 Day0 15/15 15/15 14/15
Giorno 1 15/15 14/15 13/15
5 ° giorno 14/15 13/15 11/15
Day7 14/15 12/15 9/15
Trial 2 Day0 15/15 15/15 15/15
Giorno 1 15/15 13/15 15/15
5 ° giorno 15/15 11/15 12/15
Day7 14/15 10/15 12/15

Tabella 2: tasso di sopravvivenza delle api iniettati con solvente per 20E soluzione. Quindici operai sono stati preparati in ogni gruppo sperimentale.

Giorni dopo l'applicazione Acetone methoprene
Trial 1 giorno 0 7/7 8/8
giorno 7 7/7 6/8
Trial 2 giorno 0 7/7 8/8
giorno 7 7/7 8/8

Tabella 3: tasso di sopravvivenza delle api trattate con methoprene sette-otto lavoratori sono stati preparati in ogni gruppo sperimentale..

Giorni dopo l'iniezione No iniezione Acetone / Bee salina (1: 4)
giorno 0 15/15 15/15
Giorno 1 15/15 6/15
3 ° giorno 15/15 5/15
giorno 5 15/15 4/15
giorno 7 15/15 4/15

Tabella 4: tasso di sopravvivenza delle api iniettati con acetone / ape salina (1: 4). Soluzione quindici operai sono stati preparati per ogni gruppo sperimentale. Acetone / ape salina (1: 4) la soluzione è stata iniettata nell'addome lavoratore. La composizione di api salina è di 130 mM NaCl, 6 mM KCl, 4mm MgCl 2, 2.5 mM CaCl 2, 160 mM di saccarosio, 25 mM di glucosio, e 10 mM HEPES (pH 7,0).

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Discussion

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Preparazione delle colonie singola coorte

Qui abbiamo descritto il protocollo utilizzato nel nostro studio precedente 16 per preparare colonie singola coorte per l'analisi di HPG fisiologia associata con lo spostamento nel ruolo di api operaie. Api bottinatrici infermiere e precoci che soddisfacevano i criteri descritti nelle procedure di 1.6-1.7 e la figura 2 sono stati osservati nelle colonie singolo di coorte (Tabella 1). Le fotografie in Figura 2 sarebbero utili nella classificazione di HPG afferma come riferimento. I criteri sulla base sia il comportamento dei lavoratori e lo sviluppo HPG sono validi per la definizione di api bottinatrici infermiere o in colonie tipiche. Passaggio di ruolo da allattamento per l'alimentazione delle gradualmente procede in quelle colonie: la quantità di tempo trascorso in un comportamento di cura diminuisce gradualmente mentre quella in comportamento di foraggiamento aumenta gradualmente durante il turno di ruolo 2. Così, sarebbe difficile raccogliere addetti esclusivamenteeseguire l'allattamento o foraggiamento in base a criteri di comportamento solo. Il risultato che espressione di mrjp2 e Hbg3 nelle HPGs è associato al ruolo dei lavoratori indica chiaramente che il protocollo qui descritto può essere adottato per esaminare HPG fisiologia api nutrici e raccoglitori precoci da colonie singola coorte (Figura 3). I criteri sulla base sia il comportamento dei lavoratori e lo sviluppo HPG potrebbe essere applicabile anche nel definire le api infermiere e raccoglitori precoci dalle colonie singola coorte. Oltre alle HPGs, altre ghiandole esocrine nella testa subiscono cambiamenti fisiologici in associazione con lo spostamento ruolo. Ad esempio, la funzione dei cambiamenti mandibolari ghiandola della sintesi degli acidi grassi per l'alimentazione di covata alla sintesi di allarme feromone 2-eptanone 2. Il protocollo qui descritto può quindi essere adattata per esaminare la fisiologia ruolo associata ghiandole esocrine diversi dai HPGs.

collezione di successo di napi bottinatrici URSE e precoci da colonie singola coorte dipende dalla raccolta di un numero sufficiente di lavoratori recentemente emersi quando le colonie sono preparati. Se si raccoglie un basso numero di lavoratori recentemente emerse, sarebbe difficile raccogliere abbastanza api nutrici e raccoglitori precoci. Inoltre, la condizione delle regine è un altro punto chiave per la raccolta del campione di successo. Queens con un grande addome sono buone per la posa delle uova perché queste regine di solito sono sviluppate ovaie. Così, il lavoro dei lavoratori è pensato per essere effettivamente divisa anche in colonie singola coorte perché la covata è costantemente alimentato dalla regina. Se non viene fornito nidiata, sarebbe difficile raccogliere le api infermiere dalle colonie singola coorte. Infine, segnando i lavoratori che utilizzano vernice poster è necessario per garantire che i lavoratori sono raccolti da colonie singola coorte, perché raccoglitori di tanto in tanto tornano alla colonia sbagliato. Per raccogliere raccoglitori precoci in modo efficace, segni di vernice dovrebbero essereapplicata al maggior numero di lavoratori possibile (più di 900 lavoratori nuovi emersi per singola coorte-colonia). L'uso di inchiostro a base d'acqua per la marcatura può essere raccomandato, perché un inchiostro a base di olio, che di solito contiene composti organici volatili, potrebbero interferire con la comunicazione chimica tra le api. I segni di inchiostro a base d'acqua non sbiadiscono molto durante il corso dell'esperimento.

trattamento ormonale

Abbiamo anche descritto il protocollo per l'iniezione 20E nelle teste dei lavoratori di esaminare l'effetto di ecdysone su HPG fisiologia (mrjp2 ed espressione Hbg3). Il tasso di sopravvivenza delle api iniettati con soluzione salina insetto o solvente per 20E soluzione era sufficiente per la successiva analisi, indicando che il protocollo qui descritto per iniezione utilizzando una punta di iniezione e solvente per 20E soluzione può essere adottata per l'esperimento iniezione 20E (Tabella 2 ). Inoltre, il confronto dell'espressione genica nelle HPGstra api 20E-trattati e api controllo indica che il 20E iniettato cambiato l'espressione di mrjp2 e Hbg3, entrambi i quali sono collegati con funzione HPG (Figura 5). Questo risultato suggerisce che il protocollo descritto qui sarebbe utile per esaminare gli effetti del ecdysone su HPG fisiologia, e può essere adottato per esaminare altre ghiandole esocrine nella testa, come le ghiandole mandibolari. Inoltre, il metodo di iniezione può essere adottato per iniettare altri prodotti chimici. Ad esempio, il protocollo descritto qui sarebbe appropriato per iniettare soluzioni doppio filamento RNA nelle teste per esperimenti silenziamento genico.

Oltre a 20E, abbiamo descritto un protocollo di applicazione methoprene, che è un analogo JH. Methoprene viene solitamente applicato all'addome. D'altra parte, methoprene stata applicata alla testa di lavoratori, qui. Quasi tutte le api con applicazione topica di methoprene o acetone sopravvissuto 7 giorni dopo il trattamento, Suggerendo che l'applicazione di methoprene 5 microlitri o soluzione di acetone alle teste ha poco effetto sulla sopravvivenza lavoratore (Tabella 3). Inoltre, il confronto di mrjp2 ed espressione Hbg3 nelle HPGs tra methoprene- e api acetone trattato indica che l'applicazione methoprene inibisce l'espressione mrjp2 e aumenta l'espressione Hbg3 (Figura 6). Questi risultati suggeriscono che il protocollo qui descritto è adatto per analizzare gli effetti della methoprene sulla fisiologia delle ghiandole esocrine quali le HPGs nella testa.

trattamento ormonale Il successo dipende dal tasso di sopravvivenza delle api trattate. esposizione a bassa temperatura in frigorifero può essere adatto per anestetizzare api. Anestesia sul ghiaccio non è raccomandato perché le api si bagnino sul ghiaccio, portando ad un basso tasso di sopravvivenza. Inoltre, il metodo di iniezione potrebbe essere un altro punto chiave per mantenere in vita le api. È importante mAke la punta di iniezione lungo e sottile, e per dare forma ad una punta acuminata utilizzando il cutter per ridurre al minimo i danni alle api per iniezione. Tuttavia, il metodo di iniezione potrebbe non essere appropriato per esaminare gli effetti di methoprene su HPG fisiologia, perché l'acetone solvente per methoprene influenza negativamente la sopravvivenza delle api (Tabella 4). Inoltre, il metodo di iniezione qui descritto potrebbe non essere adatto per l'analisi del comportamento in colonie come api iniettato sarebbero esclusi dalle loro colonie quando vengono reintrodotti dopo l'iniezione. I lavoratori con lesioni lievi potrebbero essere esclusi dalle colonie. Altri metodi, come l'applicazione o la somministrazione orale di ormoni possono essere appropriati per l'analisi comportamentale.

La colonia singola coorte è stato utilizzato per esaminare la regolazione della divisione del lavoro di api operaie 10,11. Inoltre, il trattamento con ormone giovanile è stato utilizzato per l'esame del comportamento e cervello functisul relativo alla divisione del lavoro 11. Tuttavia, protocolli dettagliati sia per la preparazione delle colonie singola coorte e il trattamento con JH non è stata precedentemente fornite in dettaglio. Recentemente, l'importanza della ecdysone nella divisione del lavoro stanno diventando sempre più riconosciuta, e la regolazione della divisione del lavoro sia da JH e ecdysone è suggerito 23. I protocolli dettagliati per la preparazione di successo di colonie singola coorte e trattamento ormonale, come JH e ecdysone descritto in questo articolo potrebbero contribuire al progresso nello studio della fisiologia dei lavoratori.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
UNIPOSCA Mitsubishi pencil PC-5M Marker pen for the application of marks to bees  
20-hydroxyecdysone Sigma Aldrich H5142
Methoprene Sigma Aldrich 33375
Breeding case insect IRIS OHYAMA CP-SS
Electromotion mixier  ISO 23M-R25 homogenization of tissue
TRIZol Reagent Invitrogen 15596-026 the reagent for total RNA extraction
DNase I  Takara 2270A
PrimeScript RT reagent kit Takara RR037A the reagent for reverse transcription
SYBR Premix ExTaq II Takara RR820A the reagent for real-time PCR
LightCycle 1.2 Instrument Roche 12011468001 the instrument for real-time PCR
LightCycle Capillaries (20μl) Roche 4929292001 the material for real-time PCR

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References

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Preparazione di singole colonie-coorte e trattamento ormonale di lavoratore api per analizzare Fisiologia associati con il ruolo e / o sistema endocrino
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Ueno, T., Kawasaki, K., Kubo, T. Preparation of Single-cohort Colonies and Hormone Treatment of Worker Honeybees to Analyze Physiology Associated with Role and/or Endocrine System. J. Vis. Exp. (115), e54240, doi:10.3791/54240 (2016).More

Ueno, T., Kawasaki, K., Kubo, T. Preparation of Single-cohort Colonies and Hormone Treatment of Worker Honeybees to Analyze Physiology Associated with Role and/or Endocrine System. J. Vis. Exp. (115), e54240, doi:10.3791/54240 (2016).

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