Abstract
حيدات هي الخلايا المناعية الفطرية التي يمكن تفعيلها عن طريق الجراثيم والالتهابات المصاحبة لبعض الأمراض الالتهابية المزمنة. تفعيل حيدات يدفع ظائف المستجيب وتحول ما يصاحب ذلك من التأكسدي للالأيض حال السكر الذي يصحبه زيادة في التعبير الجلوكوز نقل. لوحظ هذا زيادة الأيض حال السكر أيضا للحصانة المدربين من وحيدات، وشكلا من أشكال الذاكرة المناعية الفطرية. على الرغم من أن في المختبر بروتوكولات دراسة التعبير الجلوكوز نقل وامتصاص الغلوكوز من قبل حيدات وقد وصفت، وقد تم فحص أيا من تدفق متعدد حدودي الخلوي في الدم الكامل. نحن تصف بروتوكول تدفق cytometric متعددة حدودي لقياس الفلورسنت الجلوكوز التناظرية 2-NBDG امتصاص في الدم الكامل من قبل مجموع وحيدات الكلاسيكية (CD14 + CD16 -)، وسيطة (CD14 + CD16 +) وغير التقليدية ( CD14 + CD16 + +) الوحيداتالقطعان. هذه الطريقة يمكن استخدامها لدراسة التعبير نقل الجلوكوز وامتصاص الجلوكوز لمجموع وحيدات القطعان الوحيدات خلال التوازن وأمراض التهابات، ويمكن تعديلها بسهولة لدراسة امتصاص الجلوكوز لكريات الدم البيضاء الأخرى، والقطعان الكريات البيض في الدم.
Introduction
حيدات هي مكون رئيسي من نظام المناعة الفطري البشري التي يتم تعبئتها بسرعة إلى مواقع الإصابة والتهاب 1. تفعيل حيدات أمر بالغ الأهمية للحد من الضرر الحاد عن طريق الجراثيم وأيضا المركزي إلى التسبب في العديد من الأمراض المزمنة، بما في ذلك تصلب الشرايين 2، والسرطان 3، وفيروس نقص المناعة البشرية 4،5.
عملية التمثيل الغذائي للراحة وحيدات تنشيط يختلف بشكل كبير، مع الراحة وحيدات استخدام الأيض المؤكسدة وحيدات تنشيط استخدام الأيض حال السكر (أي تخمر الجلوكوز إلى اللاكتات) 6. تفعيل حيدات يدفع التعبير عن ناقلات الجلوكوز الذي يسمح لزيادة امتصاص الجلوكوز لعملية التمثيل الغذائي حال السكر 7. الوحيدات الجلوكوز نقل 1 (GLUT1) هي واحدة من هذا القبيل نقل upregulated خلال تفعيل ولقد ثبت تعبيرها أن تؤدي إلى إنتاج السيتوكينات الموالية للالتهابات في الخامسitro وفي الأنسجة الدهنية من الفئران السمينة 8. إصابة خط خلية الوحيدات كابوسي ساركوما المرتبطة هربس يؤدي إلى upregulation الخلوي للGLUT1 9، وأظهرنا مؤخرا أنه خلال عدوى مزمنة بفيروس نقص المناعة البشرية زيادة النسبة المئوية من وحيدات، معربا عن GLUT1 موجودة أثناء غير المعالجة والجمع بين المعالجة بمضادات الفيروسات القهقرية علاج العدوى 10. أخذت معا، وتبين هذه الدراسات أن امتصاص الجلوكوز واستقلاب حال السكر حيدات جوانب مهمة من العديد من الأمراض الالتهابية. وهكذا، طريقة بسيطة لقياس التعبير GLUT1 الوحيدات وامتصاص الجلوكوز خلال التوازن ومرض التهاب من المرجح أن تكون ذات فائدة لمجموعة واسعة من الباحثين.
حيدات الإنسان غير متجانسة، التي تتألف من ثلاث مجموعات فرعية المميزة التي يمكن أن يفحصه التعبير التفاضلية من CD14 علامات سطح الخلية وCD16 11،12. حيدات الكلاسيكية تعبر عن مستوى عال من CD14 ولكن لا تعبر CD16 (CD14 + CD16 -)، وحيدات وسيطة تعبر عن مستوى عال من CD14 والمستوى المتوسط من CD16 (CD14 + CD16 +)، وغير الكلاسيكية حيدات تعبر عن مستوى منخفض من CD14 وعلى مستوى عال من CD16 (CD14 + CD16 + +). وتسمى حيدات التي تعبر عن CD16 CD16 + حيدات، والتي بالمقارنة مع CD16 - حيدات لها التعبير عالية من السيتوكينات الالتهابية والقدرة على نحو أكثر فعالية المضادات الحالية 13،14. ما يقرب من 10٪ من وحيدات تعبر عن CD16 خلال التوازن مع نسب أعلى لوحظت خلال التهاب 15. وترتبط القطعان الوحيدات مع الحالات المرضية معينة، ويمكن أن تكون علامات بيولوجية مفيدة من المرض وتطور المرض 16.
وكان لدينا هدف لتحديد الطريقة التي يمكن قياس التعبير نقل الجلوكوز وامتصاص الغلوكوز من قبل حيدات الإنسان والقطعان الوحيدات في ظروف أقرب إلى فيزشروط siological وقت ممكن. وكانت دراسات سابقة قياس التعبير نقل الوحيدات الجلوكوز وامتصاص الغلوكوز 17،18، على الرغم من هذه الأساليب فحص حيدات المعزولة التي يمكن غيرت تعبير البروتين مقارنة مع الظروف الفسيولوجية 19، وأي دراسة سابقة درست القطعان الوحيدات الإنسان. باستخدام التدفق متعدد حدودي الخلوي، نحن تصف طريقة لدراسة التعبير نقل الجلوكوز وامتصاص الجلوكوز التناظرية الفلورسنت 2-NBDG على إجمالي حيدات والقطعان الوحيدات (على أساس CD14 والتعبير CD16) في الدم unmanipulated كله.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: فيروس نقص المناعة البشرية المصابة وجندوا المواضيع بفيروس نقص المناعة البشرية المعافين من وحدة الأمراض المعدية في مستشفى ألفرد في ملبورن، VIC، أستراليا، ومن المجتمع المحلي، على التوالي. تم الحصول على الموافقة المسبقة من جميع المشاركين، وتمت الموافقة على البحث من قبل لجنة البحوث وأخلاقيات مستشفى ألفرد.
1. GLUT1 كشف خلية على سطح الخلايا وحيدة النواة والوحيدات القطعان
- جمع الدم في أنابيب مضادة للتخثر سترات ACD-B وتبدأ التجارب في خزانة السلامة البيولوجية داخل 1 ساعة من جمعها.
- إضافة 100 ميكرولتر من الدم لأنابيب البولي بروبلين. إضافة 2 مل من 1X الناشر الحل (انظر المواد الجدول) إلى أنابيب في حين على الجليد، pipetting بلطف إلى مزيج. احتضان لمدة 15 دقيقة على الجليد. أجهزة الطرد المركزي في 220 x ج لمدة 5 دقائق.
- صب ويغسل مرتين عن طريق إضافة ما يقرب من 2-4 مل من محلول الغسيل (0.5٪ BSA في برنامج تلفزيوني 1X) والطرد المركزي في 220 x ج لمدة 5 دقائق.
- استخدام الأنابيبتتي لإزالة بعناية أكبر قدر من محلول الغسيل ممكن. مكان الأنابيب على الجليد وإعادة تعليق في 100 ميكرولتر من محلول الغسيل.
- لتحديد الفئات السكانية الوحيدات محددة وصمة عار الخلايا مع حجم التالية من الأجسام المضادة لكل 100 ميكرولتر تعليق الخلية التي أعدت في الخطوة 1.4: 5 ميكرولتر مكافحة CD3-PE، 5 ميكرولتر مكافحة CD14-APC، 5 ميكرولتر مكافحة CD16-PECy7، 5 ميكرولتر GLUT1 -FITC أو IgG2b-FITC (نمط إسوي أنبوب التحكم).
- وضع على الجليد لمدة 30 دقيقة في الظلام. اغسل 2 مرات مع محلول الغسيل. إصلاح مع 200-300 ميكرولتر من 0.5٪ الفورمالديهايد المحرز في برنامج تلفزيوني 1X.
- تحليل على تدفق عداد الكريات قادرة على اكتشاف 4 ألوان خلال 24 ساعة داخل التالية الإثارة وانبعاث الطول الموجي: FITC (488، 530)، والمؤسسة العامة (488، 575)، PECy7 (488، 780)، APC (633، 660) (10).
2. امتصاص الغلوكوز من قبل وحيدات
- ماصة 90 ميكرولتر من الدم التي تم جمعها في الخطوة 1.1 في أنابيب البولي بروبلين. إضافة 10 ميكرولتر من محلول العمل 14.60 ميكرومتر 2-NBDG ل90 ميكرولتر من الدم (1.46 ملي تركيز النهائي) ونفض الغبار بلطف إلى مزيج. فمن الأهمية بمكان للحد 2-NBDG التعرض للضوء من خلال تغطية الأنابيب مع رقائق الألومنيوم.
- احتضان عند 37 درجة مئوية في الظلام لمدة 15-30 دقيقة ثم وضع على الفور على الجليد. إضافة 4 مل من 1X FACS الناشر حل لأنابيب بينما على الجليد. أجهزة الطرد المركزي في 220 x ج في 4 ° مئوية لمدة 5 دقائق.
- يغسل مرة واحدة عن طريق إضافة 4 مل من محلول الغسيل (0.5٪ BSA في برنامج تلفزيوني 1X). أجهزة الطرد المركزي في 220 x ج في 4 ° مئوية لمدة 5 دقائق. صب ومكان على الجليد.
- خلايا وصمة عار مع الأجسام المضادة: 5 ميكرولتر مكافحة CD3-PE، 5 ميكرولتر مكافحة CD14-APC و 5 ميكرولتر مكافحة CD16-PECy7. خلط ووضع على الجليد لمدة 30 دقيقة في الظلام.
ملاحظة: خلال هذه الفترة تأكد من تدفق غير الكريات استعداد لتحليل فوري. الحصول على الخلايا داخل التالية الإثارة وانبعاث الطول الموجي: 2-NBDG (488، 530)، والمؤسسة العامة (488، 575)، PECy7 (488، 780)، APC (633، 660). - إضافة 4 مل من العازلة الجليد غسل الباردة (0.5٪ BSA في برنامج تلفزيوني 1X) إلى الأنابيب.يغسل مرة واحدة عن طريق الطرد المركزي في 220 x ج في 4 ° مئوية لمدة 5 دقائق. صب وإضافة 200-300 ميكرولتر من الجليد PBS القديمة والحفاظ على الجليد في الظلام (مغطاة بورق الألومنيوم). تحليل على قياس التدفق الخلوي في غضون 10 دقيقة باستخدام الإثارة وتحديد الطول الموجي الانبعاثات كما في الخطوة 2.4.
3. اكتساب وتحليل البيانات
ملاحظة: يفترض ومعرفة التدفق الخلوي وتحليل البيانات.
- باستخدام تدفق عداد الكريات قادرة على تحليل ما لا يقل عن 4 لون، مجموعة التعويض باستخدام عينات غير ملوثين وملطخة بشكل فردي.
ملاحظة: تلطيخ واحد باستخدام CD4 FITC المسمى وCD14 يمكن استخدامها لGLUT1 والتعويض 2-NBDG. - إعداد وتسمية النوافذ المناسبة قبل الحصول على عينات. رسم بوابة حول السكان الوحيدات، والحصول على 100،000 إلى 300،000 الأحداث في العينة في معدل المتوسط. 50000 الأحداث في عينة تعويضات كافية.
ويمكن إجراء التعويض المسبق لعينة: ملاحظةاكتساب أو في برامج التحليل خلية واحدة، وفقا للإجراءات القياسية. - تصدير وحفظ البيانات في الموقع المناسب. فتح احد برامج التحليل الخلية مثل FlowJo أو غيرها من برامج التحليل (التكميلي الشكل 1)، وسحب وإسقاط عينات كما هو محدد (الشكل التكميلي 2).
- انقر نقرا مزدوجا فوق لفتح ملف (التكميلي الشكل 3). رسم دائرة لبوابة حيدات استنادا إلى الأمام وخصائص مبعثر الجانب كما هو مبين في الشكل 1A والتكميلي الشكل 4. انقر نقرا مزدوجا فوق السكان الوحيدات. مراقبة ورسم مربع حول CD3 - السكان (الشكل التكميلي 4).
- انقر نقرا مزدوجا فوق CD3 - السكان. لمراقبة القطعان الوحيدات حدد CD14-APC على المحور 'س'، وCD16-PECy7 على 'محور y'-، وتسمية وفقا لذلك (الشكل التكميلي 5).
- حيث لا توجد متميزةالسكان الإيجابية والسلبية، وقياس التعبير عن GLUT1 أو امتصاص 2-NBDG في القطعان الوحيدات محددة. تحديد كثافة مضان متوسط (MFI) من GLUT1 و2-NBDG عن طريق طرح نمط إسوي ولا الخلفية 2-NBDG (التكميلي الشكل 6).
- حيث توجد أعداد محددة، استخدم IgG2b-FITC لتعيين البوابة، وتحديد الخلايا إيجابية مئوية (الشكل 3).
ملاحظة: استخدم هذا الإجراء لتحليل إجمالي CD14 + حيدات. منذ وضعت عادة 2-NBDG امتصاص تحولا في مضان كثافة البيانات هو أفضل ممثلة من قبل مؤسسات التمويل الأصغر ورسوم بيانية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يجب إجراء التعويض عن fluorochromes الفردية لمنع امتداد مضان. يتم إثراء حيدات أول مرة من قبل المحاصرة استنادا إلى الأمام والجانب مبعثر. المؤامرات المقدمة هي ممثلي لا يقل عن ستة تجارب مستقلة أجريت على الدم الكامل من ستة أو أكثر من المشاركين كما ذكرت سابقا 10 ويبين الشكل 1A للالنابضة الأولي من حيدات بواسطة مبعثر خلية والإقصاء من الخلايا T من النابضة داخل CD3 - السكان. ثم هي بوابات حيدات للتعبير عن CD14 وحدها أو بالاشتراك مع CD16 لتحديد إجمالي حيدات أو القطعان الوحيدات كما هو مبين في الشكل 1B والشكل 1C، على التوالي. لتحليل القطعان الوحيدات، ينبغي تطبيق التسميات التالية كما هو موضح سابقا 12: حيدات الكلاسيكية (CD14 + CD16 -) يجب أن يعبر عن ما يقرب من 100 أضعاف أكبر CDوينبغي أن يكون 14 مؤسسة تمويل أصغر من isotype السيطرة وCD16 مؤسسات التمويل الأصغر على غرار isotype السيطرة. يجب حيدات المتوسطة (CD14 + CD16 +) التعبير عن ما يقرب من 100 أضعاف أكبر CD14 مؤسسات التمويل الأصغر من isotype السيطرة، وحوالي 10 أضعاف أكبر CD16 مؤسسات التمويل الأصغر مقارنة isotype السيطرة. يجب أن يكون حيدات غير التقليدية (CD14 + CD16 + +) مؤسسات التمويل الأصغر مماثلة لCD14 وisotype السيطرة، وحوالي 100 أضعاف أكبر CD16 مؤسسات التمويل الأصغر من isotype السيطرة. الخلايا دون تعبير عن CD14 و CD16 هي لا تعتبر حيدات، وينبغي ألا المدرجة في النابضة. حيدات بوابات أو القطعان الوحيدات ويمكن بعد ذلك فحص للتعبير عن نقل الجلوكوز. كما هو مبين في الشكل 2، السكان متميزة من CD14 + GLUT1 + حيدات يمكن ملاحظته، وعلى الأخص في الخلايا التي تم الحصول عليها من فيروس نقص المناعة البشرية + الأفراد، حيث يتميز العدوى عن طريق حالة مزمنة من الالتهابات. مماثل ولكن نادرا CD14 + GLUT1 + الخلايا ربما تكون بمثابة التوليدerved ضمن مجموعات فرعية الوحيدات محددة في فيروس نقص المناعة البشرية الأشخاص المعافين (الشكل 3A)، ولكن أكثر وضوحا في فيروس نقص المناعة البشرية + الأفراد (الشكل 3B). الجدير بالذكر، في غياب السكان متميزة، فإنه قد يكون من المناسب لتمثيل النتائج على النحو يعني أو شدة الإزهار متوسط، والتي تأخذ بعين الاعتبار الزيادة التراكمية في GLUT1 التعبير سطح الخلية.
امتصاص الجلوكوز يمكن تقييم بمقارنة الدم الكامل حضنت مع 2-NBDG أو السيطرة على السيارة لحيدات بوابات أو القطعان الوحيدات. أظهرنا سابقا أن ما يقرب من 50٪ من وحيدات كانت 2-NBDG إيجابية بعد حضانة 15 دقيقة 10. يسمح هذا المستوى امتصاص للكشف عن 2-NBDG دون التوصل إلى التشبع، مع وجود اختلافات في الوحيدات 2-NBDG امتصاص ربما لم تعد موجودة. وكشف تحليل 2-NBDG امتصاص حيدات من فيروس نقص المناعة البشرية غير مصاب بفيروس نقص المناعة البشرية و+ الأشخاص امتصاص أعلى من الخلايا من فيروس نقص المناعة البشرية + الأشخاص، التيويتفق ذلك مع البيانات التعبير GLUT1 (الشكل 4-5). وعموما، توضح هذه النتائج أن المقايسات الموصوفة هنا يمكن أن تستخدم لدراسة يحتمل أن تكون الأنشطة الوحيدات التمثيل الغذائي في سياقات البيولوجية التي تثير حالة التهابية مثل السكري وأمراض القلب والأوعية الدموية، والالتهابات الفيروسية والبكتيرية.
وقد تم تحليل المحاصرة الاستراتيجية المستخدمة لتحليل إجمالي حيدات والقطعان الوحيدات من بفيروس نقص المناعة البشرية ممثل وعينات فيروس نقص المناعة البشرية + الدم عينات من الدم الكامل من قبل التدفق الخلوي للتعبير GLUT1 سطح الخلية الوحيدات حدود 1 ساعة من جمع: الشكل 1. تم بوابات (A) خلايا على أساس الخصائص إلى الأمام والجانب مبعثر والتعبير CD3. (ب) فحص مجموع حيدات، CD3 - تم خلايا ثم بوابات للتعبير عن CD14. (C رونغ>) لفحص القطعان الوحيدات (الكلاسيكية، C، متوسط، الأول؛ وغير التقليدية، NC) لغير المصابين بفيروس الأيدز الأشخاص وعلاج المصابين بفيروس نقص المناعة البشرية الأشخاص السذاجة، ثم تم بوابات الخلايا CD3- على أساس التعبير عن CD14 و CD16. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تحليل التعبير GLUT1 سطح الخلية على إجمالي حيدات من بفيروس نقص المناعة البشرية ممثل وعينات فيروس نقص المناعة البشرية + الدم CD14 + حيدات من فيروس نقص المناعة البشرية، غير مصاب أو المعاملة كانت ملطخة الأشخاص السذاجة مع isotype السيطرة FITC المسمى أو GLUT1 الأجسام المضادة بفيروس نقص المناعة البشرية المصابة الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
المحافظة على together.within الصفحات = "1"> 
الشكل 3: تحليل التعبير GLUT1 سطح الخلية على القطعان الوحيدات من بفيروس نقص المناعة البشرية ممثل وعينات + الدم فيروس نقص المناعة البشرية كانت ملطخة القطعان الوحيدات مع isotype السيطرة FITC المسمى أو GLUT1 الأجسام المضادة ل(A) بفيروس نقص المناعة البشرية غير مصاب أو (ب) علاج فيروس نقص المناعة البشرية المصابة ساذجة عينات الدم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
وقد حضنت امتصاص من 2 NBDG على إجمالي CD14 + حيدات من بفيروس نقص المناعة البشرية ممثل وفيروس نقص المناعة البشرية عينات + الدم الدم من غير المصابين بفيروس الأيدز أو المصابين بفيروس الإيدز معاملة الأشخاص السذاجة مع سيارة أو 2-NBDG بتركيز نهائي من: الرقم 4. 1.46 ميكرومتر لمدة 15 دقيقة قبل غسل واحتضان مع الأجسام المضادة سطح الخلية إلى حيدات البوابة كما هو موضح في الشكل 1. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
وقد حضنت امتصاص من 2 NBDG من القطعان الوحيدات من بفيروس نقص المناعة البشرية ممثل وفيروس نقص المناعة البشرية + عينات دم كاملة الدم من غير المصابين بفيروس الأيدز أو المصابين بفيروس الإيدز معاملة الأشخاص السذاجة مع سيارة أو 2-NBDG بتركيز نهائي من 1.46 ملم لمدة 15: الرقم 5. دقيقة قبل غسل واحتضان مع الأجسام المضادة سطح الخلية إلى مجموعات سكانية فرعية الوحيدات البوابة كما هو موضح في الشكل 1. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
together.within الصفحات = "1"> 
التكميلي الشكل 1: نافذة مساحة عمل لالتدفق الخلوي برامج التحليل خلية الرجاء انقر هنا لعرض أو تحميل هذا الرقم التكميلي.
التكميلي الشكل 2: يتم سحب نموذج البيانات، وانخفض إلى هذه مساحة العمل الرجاء انقر هنا لعرض أو تحميل هذا الرقم التكميلي.
55 / Supp_Figure_3_Double_Click_to_open_file_Small.jpg "/>
الشكل التكميلي 3: عينات في مساحة العمل والبيانات 085 وضعف النقر، وظهر النافذة الثانية تظهر ثلاثة السكان الخلية الرئيسية (الخلايا الليمفاوية، وحيدات والعدلات) ضمن عينة الدم كله جديدة استنادا إلى الأمام (FSC) والجانب مبعثر (SSC) . الرجاء انقر هنا لعرض أو تحميل هذا الرقم التكميلي.
الشكل التكميلي 4: يتم عن طريق بوابة مقرها وحيدات في الأمام (FSC) والجانب مبعثر (SSC). تم النقر السكان المزدوج الذي ترعرعت نافذة جديدة. يتم تحديد CD3 على 'س' محور وCD3 سلبية السكان (النابضة من الخلايا الليمفاوية) والصورةالمنتخب. الرجاء انقر هنا لعرض أو تحميل هذا الرقم التكميلي.
الشكل التكميلي 5: CD3 - السكان الوحيدات والنقر المزدوج الذي ترعرعت نافذة جديدة حيث يمكن تعريف حيوانية الوحيدات على أساس CD16 والتعبير CD14. الرجاء انقر هنا لعرض أو تحميل هذا الرقم التكميلي.
الشكل التكميلي 6: Mويتم اختيار القطعان onocyte، والتعبير GLUT1 سطح الخلية (يعني مضان كثافة: MFI) يتم الحصول عن طريق تحديد "الإحصاءات" على نافذة الرسم البياني، 'يعني' من 'إضافة إحصاءات "نافذة، واختيار GLUT1 من' المعلمة 'المنسدلة القائمة. الرجاء انقر هنا لعرض أو تحميل هذا الرقم التكميلي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
بروتوكول الموصوفة هنا تفاصيل طريقة بسيطة لدراسة التعبير نقل الجلوكوز والفلورسنت امتصاص الغلوكوز التناظرية التي كتبها الوحيدات والوحيدات القطعان في الدم الكامل. من خلال تقييم 2-NBDG امتصاص في الدم الكامل، وهذا الأسلوب يسمح للظروف مماثلة لتلك الموجودة في الجسم الحي. وتناولت الدراسة السابقة 6-NBDG امتصاص في حيدات فصل من الدم الكامل من قبل الكثافة الطرد المركزي 17. ومع ذلك، فإن هذه الدراسة لم تفحص القطعان الوحيدات وفصل حيدات من الدم الكامل من المحتمل أن يغير التعبير عن بعض جزيئات سطح الخلية 19. كما استخدمت استشفاف الجلوكوز المشعة لقياس امتصاص الوحيدات من الجلوكوز 20،21، ولكن وحيدات يجب أن تكون معزولة مسبقا لهذا الأسلوب واستخدام النشاط الإشعاعي يتطلب احتياطات السلامة الهامة. يستخدم بروتوكول لدينا إجراءات روتينية للسلامة الأحيائية وهو المتلاعبة بالحد الأدنى، وبالتالي السماح لقياس تدفق cytometric من 2 NBDGامتصاص حيدات والقطعان الوحيدات محاكاة في ظروف الجسم الحي.
2-NBDG يدخل مسار حال السكر ولقد ثبت أن استقلاب الخلايا إلى جزيئات غير الفلورسنت 22. لذا، فمن الأهمية بمكان للحد من عملية الأيض بعد 2-NBDG الحضانة عن طريق الحفاظ على خلايا المبردة في 4 درجات مئوية. 6-NBDG هو التناظرية الجلوكوز الفلورسنت أخرى والتي يمكن استخدامها لكنها أقل فائدة لأنه لا يدخل في مسار حال السكر، وبالتالي لا تعكس بدقة حالة الطاقة البيولوجية للخلايا 23.
إذا استخدمت fluorochromes مع تداخل الأطياف والتعويض يصبح حاسما لمنع انتشار تألقي. في هذا البروتوكول نستخدم حيدات الملون بشكل فردي مع CD14 و CD16 لتعيين المعلمات التعويض، ولكن يمكن أيضا تعويض من علامات سطح الخلية أن يقوم باستخدام الخرز التعويض.
يمكن المحببة التعبير عن CD16 ولكن يمكن استبعاد كتبها المعزولة خارجخلايا التعبير عن CD15. ومع ذلك، النابضة صرامة وحيدات على أساس الخصائص مبعثر الخفيفة يمكن أن تحد من عدد من المحببة المدرجة في التحليل. إذا كان التدفق الكريات ويتوفر مع المزيد من القنوات، يمكن للمحببة علامة CD66b أيضا أن تستخدم لاستبعاد المحببة من التحليل.
الأجسام المضادة GLUT1 المستخدمة في هذه الدراسة بربط حاتمة سطح الخلية، وبالتالي لا ربط الخلايا GLUT1. الأجسام المضادة التي تربط لحاتمة GLUT1 الخلايا يمكن استخدامها لقياس مجموع التعبير GLUT1 الوحيدات، ولكن يجب أن permeabilized الخلايا قبل تلطيخ 10. بالإضافة إلى وحيدات، وهذه التقنية يمكن استخدامها لفحص امتصاص الجلوكوز واستقلاب في كريات الدم البيضاء الأخرى الموجودة في الدم. لقد قمنا بفحص نطاق واسع تي امتصاص الخلايا لل2-NBDG باستخدام الطريقة الموصوفة هنا، وقد درست أيضا 2-NBDG امتصاص الخلايا القاتلة الطبيعية (24). للكشف عن النجاح في التعبير GLUT1 وامتصاص 2-NBDG لا بد من الحد منعثروا على آثار للتحلل العازلة خلايا الدم الحمراء عن طريق غسل الخلايا مع غسل العازلة زائد وفقا للبروتوكول، ولنا أن FITC أو المسمى APC-الأجسام المضادة GLUT1 تعطي إشارات أفضل من PE أو PerCP تقارن. نحن لم التحقيق في أسباب ذلك.
منذ خلايا تنشط عملية الأيض حتى في درجات الحرارة المنخفضة، فمن الأهمية بمكان أن بعد حضانة 2-NBDG في 37 ° C، أن أنابيب يتم الاحتفاظ بشكل مباشر على الجليد والطرد المركزي التي أجريت في 4 درجات مئوية. في غياب قوية إشارة 2-NBDG، تأكد من أن يتم استخدام التركيز الصحيح، والحد من التعرض للضوء في غرفة والسلامة الأحيائية مجلس الوزراء وتغطية الأنابيب مع احباط عند الاقتضاء. قد تكون هناك حاجة الأمثل من خلال إقامة دورة زمنية 2-NBDG امتصاص التجربة لمدة 5، 15، 20، 30، 60، و 90 دقيقة. عادة، يجب أن يكون الوقت الأمثل 10-60 دقيقة، اعتمادا على أنواع الخلايا وحالة تفعيلها.
جود قيود كبيرة مع فحص امتصاص 2-NBDG هو السيناتور الخفيفةitivity جنبا إلى جنب مع حقيقة أن يتم استغلاله من قبل الخلايا. وبالتالي فإنه من المهم للحد من عدد من العينات للتأكد من أن يتم تحليل العينة مشاركة في غضون 30 دقيقة من أول واحد. وجود قيود البيولوجي هو أنه، على الرغم من أن وتيرة GLUT1، معربا عن حيدات غير الكلاسيكي، والتعبير GLUT1 على حيدات غير الكلاسيكي كان أكبر بكثير من وحيدات الكلاسيكية، لا توجد اختلافات في 2-NBDG امتصاص بين اثنين من القطعان 10. وهذا يثير احتمال أن التخم أخرى، مثل Glut3 وGLUT4 أعربت عن حيدات يمكن أن تشارك في عملية ايض الجلوكوز في إعدادات مرضية مختلفة. ومن الممكن أيضا أن نشاط GLUT1 يمكن أيضا تنظيم آخر translationally.
والميزة الرئيسية لبروتوكول امتصاص الغلوكوز لدينا تدفق cytometric على وضع العلامات النظائر المشعة هي القدرة على الجمع بين تقنية مع تحليل immunophenotypic لتحديد ودراسة القطعان معينة من الخلايا المناعية في األصغرحجم لتر من الدم. وبالإضافة إلى ذلك يمكن تطبيق APC مترافق مكافحة GLUT1 لتحليل في وقت واحد GLUT1 التعبير على سطح الخلية وامتصاص 2-NBDG. لم يثبت أي تغيير في التعبير GLUT1 نظرا ل2-NBDG امتصاص سابقا، ولكن هذا الاحتمال لا يمكن استبعاده.
زيادة امتصاص الجلوكوز واستقلاب الخلايا المناعية هو السمة المميزة للخلايا وحيدات 25-27 T تفعيلها. ويمكن تنشيط هذه الخلايا ردا على الممرض العدوى 28،29، وإشارات التهاب في ظروف مثل أمراض المناعة الذاتية مثل الذئبة 30-32، والسمنة ومرض السكري 8،33. مطلوب أيضا زيادة أيض الجلوكوز لبقاء الخلايا السرطانية، والنمو والانبثاث 34. والجدير بالذكر، برزت التقلبات الأيض في الخلايا المناعية باعتباره السمة المميزة لعدوى فيروس نقص المناعة البشرية، ويترافق مع تنشيط جهاز المناعة 24، التهاب 10، والعدوى من خلايا CD4 + T 35-37. وبالتالي،ستكون هذه الطريقة التي تهم جمهور متنوع بما في ذلك تلك التي لها مصلحة في الأمراض بوساطة التهابات والسرطان والأمراض المعدية والمناعة وimmunometabolism 38.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
وقد تم تمويل هذا البحث من قبل المركز الأسترالي للفيروس نقص المناعة البشرية والتهاب الكبد الفيروسات الأبحاث (ACH 2) ومنحة التنموي 2010 (CNIHR) من جامعة مركز واشنطن لأبحاث الإيدز (CFAR)، وهو برنامج تموله المعاهد الوطنية للصحة تحت رقم جائزة AI027757 الذي تدعمه من قبل المعاهد التالية المعاهد الوطنية للصحة ومراكز (المعهد المذكور، NCI، صحة العقلية، النداء، معاهد الصحة القومية، NHLBI، وكالة الاستخبارات الوطنية). CSP هي المستفيدة من منحة 2 CNIHR ومنظمة العمل ضد الجوع. SMC هي المستفيدة من مجلس صحة و طب القومي للبحوث في استراليا (NHMRC) مدير أبحاث زمالة. والكتاب الامتنان للمساهمة في هذا العمل لبرنامج دعم البنية التحتية التشغيلي الفيكتوري من قبل معهد بيرنت حصل. ونحن نعترف مساعدة جيزا Paukovic وإيفا أورلوسكي-أوليفر من مرفق AMREP التدفق الخلوي الأساسية لالتدفق الخلوي التدريب والمشورة التقنية. نشكر انجوس مورغان للتدريب وسائل الإعلام وتنظيم تبادل لاطلاق النار الفيديو. امتناننالجيسي ماسون وجهاد عبدالعزيز خالد الزهراني للمساعدة مختبر أثناء تصوير الفيديو. نشكر جهود الدكتور ديفيد SIMAR في كلية العلوم الطبية، نيو ساوث ويلز، أستراليا الذي قدم المشورة المنهجية حرجة. سوف CSP أود أن أشكر www.nice-consultants.com للتشاور الرسوم البيانية.
المؤلفين مساهمة:
تصور CSP المشروع وتصميم وتنفيذ التجارب وتحليلها وتفسيرها البيانات، وكتب مخطوطة. JJA تفسير البيانات وكتب مخطوطة. كتب TRB المخطوطة. JMM تفسير البيانات، قدمت اقتراحات الفكرية الهامة، واستعرض المخطوطة. SMC تفسير البيانات، قدمت اقتراحات الفكرية الهامة واستعرض المخطوطة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| VACUETT Tube 9 ml ACD-B anticoagulant tubes | Greiner Bio-One GmbH | 455094 | |
| 5 ml sterile polypropylene tubes | BD Biosciences | 352063 | |
| Albumin from Bovine Serum (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| 16% formaldehyde solution | Electron Microscopy Science | 15710 | |
| BD FACS lysing solution (10x) | BD Biosciences | 349202 | Dilute BD FACS lysing solution 1/10 with deionized water for working concentration (store for up to 1 week at 4 °C) |
| anti-CD3-PE | BD Biosciences | 555340 | |
| anti CD14-APC | BD Biosciences | 555399 | |
| anti-CD16-PECy7 | BD Biosciences | 557744 | |
| anti-Glut1-FITC | R & D Systems | FAB1418F | |
| IgG2b-FITC | R & D Systems | IC0041F | |
| 2-NBDG | Life technologies | N13195 | Suspend 5 mg of 2-NBDG into 1 ml of deionized water to make a 14.60 mM stock solution (keep for up to 6 months at 4 °C). To make the working 2-NBDG concentration, dilute stock 1/100 with 1x DPBS. Cover with foil. (store for up to 1 week at 4 °C) |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (1x) | Life technologies | 14190-144 | To make wash solution, add 0.5 g BSA per 100 ml DPBS (store for up to 2 weeks at 4 °C) |
References
- Shi, C., Pamer, E. G. Monocyte recruitment during infection and inflammation. Nat Rev Immunol. 11, 762-774 (2011).
- Woollard, K. J., Geissmann, F. Monocytes in atherosclerosis: subsets and functions. Nat Rev Cardiol. 7, 77-86 (2010).
- Richards, D. M., Hettinger, J., Feuerer, M. Monocytes and macrophages in cancer: development and functions. Cancer Microenviron. 6, 179-191 (2013).
- Anzinger, J. J., Butterfield, T. R., Angelovich, T. A., Crowe, S. M., Palmer, C. S. Monocytes as regulators of inflammation and HIV-related comorbidities during cART. J Immunol Res. 2014, 569819 (2014).
- Palmer, C., Cherry, C. L., Sada-Ovalle, I. Glucose Metabolism in T Cells and Monocytes: New Perspectives in HIV Pathogenesis. EBioMedicine. , (2016).
- Cheng, S. C., et al. mTOR- and HIF-1alpha-mediated aerobic glycolysis as metabolic basis for trained immunity. Science. 345, 1250684 (2014).
- Maratou, E., et al. Glucose transporter expression on the plasma membrane of resting and activated white blood cells. Eur J Clin Invest. 37, 282-290 (2007).
- Freemerman, A. J., et al. Metabolic reprogramming of macrophages: glucose transporter 1 (GLUT1)-mediated glucose metabolism drives a proinflammatory phenotype. J Biol Chem. 289, 7884-7896 (2014).
- Gonnella, R., et al. Kaposi sarcoma associated herpesvirus (KSHV) induces AKT hyperphosphorylation, bortezomib-resistance and GLUT-1 plasma membrane exposure in THP-1 monocytic cell line. J Exp Clin Cancer Res. 32, 79 (2013).
- Palmer, C. S., et al. Glucose transporter 1-expressing proinflammatory monocytes are elevated in combination antiretroviral therapy-treated and untreated HIV+ subjects. J Immunol. 193, 5595-5603 (2014).
- Wong, K. L., et al. Gene expression profiling reveals the defining features of the classical, intermediate, and nonclassical human monocyte subsets. Blood. 118, e16-e31 (2011).
- Ziegler-Heitbrock, L., et al. Nomenclature of monocytes and dendritic cells in blood. Blood. 116, e74-e80 (2010).
- Belge, K. U., et al. The proinflammatory CD14+CD16+DR++ monocytes are a major source of TNF. J Immunol. 168, 3536-3542 (2002).
- Frankenberger, M., Sternsdorf, T., Pechumer, H., Pforte, A., Ziegler-Heitbrock, H. W. Differential cytokine expression in human blood monocyte subpopulations: a polymerase chain reaction analysis. Blood. 87, 373-377 (1996).
- Ziegler-Heitbrock, L. The CD14+ CD16+ blood monocytes: their role in infection and inflammation. J Leukoc Biol. 81, 584-592 (2007).
- Ziegler-Heitbrock, L. Macrophages: Biology and Role in the Pathology of Diseases. , Springer. 3-36 (2014).
- Dimitriadis, G., et al. Evaluation of glucose transport and its regulation by insulin in human monocytes using flow cytometry. Cytometry A. 64, 27-33 (2005).
- Fu, Y., Maianu, L., Melbert, B. R., Garvey, W. T. Facilitative glucose transporter gene expression in human lymphocytes, monocytes, and macrophages: a role for GLUT isoforms 1, 3, and 5 in the immune response and foam cell formation. Blood Cells Mol Dis. 32, 182-190 (2004).
- Stibenz, D., Buhrer, C. Down-regulation of L-selectin surface expression by various leukocyte isolation procedures. Scand J Immunol. 39, 59-63 (1994).
- Ahmed, N., Kansara, M., Berridge, M. V. Acute regulation of glucose transport in a monocyte-macrophage cell line: Glut-3 affinity for glucose is enhanced during the respiratory burst. Biochem J. 327 (Pt 2), 369-375 (1997).
- Cutfield, W. S., Luk, W., Skinner, S. J., Robinson, E. M. Impaired insulin-mediated glucose uptake in monocytes of short children with intrauterine growth retardation). Pediatr Diabetes. 1, 186-192 (2000).
- Yoshioka, K., et al. A novel fluorescent derivative of glucose applicable to the assessment of glucose uptake activity of Escherichia coli. Biochim Biophys Acta. 1289, 5-9 (1996).
- Speizer, L., Haugland, R., Kutchai, H. Asymmetric transport of a fluorescent glucose analogue by human erythrocytes. Biochim Biophys Acta. 815, 75-84 (1985).
- Palmer, C. S., et al. Increased glucose metabolic activity is associated with CD4+ T-cell activation and depletion during chronic HIV infection. AIDS. 28, 297-309 (2014).
- Palmer, C. S., Ostrowski, M., Balderson, B., Christian, N., Crowe, S. M. Glucose metabolism regulates T cell activation, differentiation, and functions. Frontiers in immunology. 6, (2015).
- Palmer, C. S., et al. Regulators of glucose metabolism in CD4 and CD8 T cells. International reviews of immunology. , 1-12 (2015).
- Palmer, C. S., Crowe, S. M. How does monocyte metabolism impact inflammation and aging during chronic HIV infection? AIDS research and human retroviruses. 30, 335-336 (2014).
- McFadden, K., et al. Metabolic stress is a barrier to Epstein-Barr virus-mediated B-cell immortalization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, E782-E790 (2016).
- Gamelli, R. L., Liu, H., He, L. K., Hofmann, C. A. Augmentations of glucose uptake and glucose transporter-1 in macrophages following thermal injury and sepsis in mice. Journal of leukocyte biology. 59, 639-647 (1996).
- Yin, Y., et al. Glucose Oxidation Is Critical for CD4+ T Cell Activation in a Mouse Model of Systemic Lupus Erythematosus. Journal of immunology. , 80-90 (2016).
- Yang, Z., Matteson, E. L., Goronzy, J. J., Weyand, C. M. T-cell metabolism in autoimmune disease. Arthritis research & therapy. 17, 29 (2015).
- Yin, Y., et al. Normalization of CD4+ T cell metabolism reverses lupus. Science translational medicine. 7, 274ra218 (2015).
- Barbera Betancourt, A., et al. Inhibition of Phosphoinositide 3-Kinase p110delta Does Not Affect T Cell Driven Development of Type 1 Diabetes Despite Significant Effects on Cytokine Production. PloS one. 11, e0146516 (2016).
- Barron, C. C., Bilan, P. J., Tsakiridis, T., Tsiani, E. Facilitative glucose transporters: Implications for cancer detection, prognosis and treatment. Metabolism: clinical and experimental. 65, 124-139 (2016).
- Hegedus, A., Kavanagh Williamson, M., Huthoff, H. HIV-1 pathogenicity and virion production are dependent on the metabolic phenotype of activated CD4+ T cells. Retrovirology. 11, 98 (2014).
- Taylor, H. E., et al. Phospholipase D1 Couples CD4+ T Cell Activation to c-Myc-Dependent Deoxyribonucleotide Pool Expansion and HIV-1 Replication. PLoS Pathog. 11, e1004864 (2015).
- Loisel-Meyer, S., et al. Glut1-mediated glucose transport regulates HIV infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 2549-2554 (2012).
- Palmer, C. S., et al. Emerging Role and Characterization of Immunometabolism: Relevance to HIV Pathogenesis, Serious Non-AIDS Events, and a Cure. J Immunol. 196 (11), 4437-4444 (2016).
