Abstract
מונוציטים הם תאי מולדת חיסון מסוגלים להיות מופעלים על ידי פתוגנים דלקת הקשורים למחלות דלקתיות כרוניות מסוימות. הפעלת מונוציטים גורמת פונקציות מפעילות ומעבר במקביל מ חמצוני מטבוליזם glycolytic המלווה ביטוי נשא גלוקוז מוגברת. מטבוליזם glycolytic מוגברת זו נצפתה גם עבור חסינות מאומן של מונוציטים, סוג של זיכרון אימונולוגי מולד. למרות פרוטוקולים במבחנה בבדיקת ביטוי גלוקוז טרנספורטר ספיגת הגלוקוז על ידי מונוציטים תוארו, אף אחד מהם לא נבדקו על ידי זרימת רב פרמטריים cytometry בדם כולו. אנו מתארים פרוטוקול התזרים cytometric רב-פרמטרים למדידת הספיגה אנלוגי גלוקוז ניאון 2-NBDG בדם כולו על ידי מונוציטים הכולל לבין (CD16 CD14 ++ -) הקלסי, ביניים (CD14 ++ CD16 +) ו הלא קלסי ( CD14 + CD16 ++) מונוציטיםתת-אוכלוסיות. שיטה זו יכולה לשמש כדי לבחון ביטוי נשא גלוקוז ספיגת הגלוקוז עבור מונוציטים הכולל תת-אוכלוסיות מונוציטים במהלך הומאוסטזיס ומחלות דלקתיות, וניתן לשנות בקלות לבחון ספיגת הגלוקוז עבור לויקוציטים אחרים תת-אוכלוסיות לויקוציטים בתוך הדם.
Introduction
המונוציטים מהווים מרכיב עיקרי של המערכת האנושית המולד החיסונית כי מגויס במהירות לאתרים של זיהום ודלקת 1. הפעלת מונוציטים הוא קריטי עבור הגבלת נזק אקוטי ידי פתוגנים מרכזי גם בפתוגנזה של מחלות כרוניות שונות, כולל טרשת עורקים 2, סרטן 3, ו- HIV 4,5.
המטבוליזם של מנוחה מונוציטים מופעל שונה באופן דרמטי, עם מונוציטים נח ניצול מטבוליזם חמצוני מונוציטים מופעל ניצול מטבוליזם glycolytic (כלומר, התסיסה של גלוקוז לקטט) 6. הפעלת מונוציטים גורם ביטוי של מובילי גלוקוז המאפשר ספיגת הגלוקוז מוגבר מטבוליזם glycolytic 7. טרנספורטר 1 גלוקוז מונוציטים (GLUT1) הוא טרנספורטר אחד כזה שהוגבר במהלך ההפעלה וביטויו הוכח להוביל לייצור של ציטוקינים פרו-דלקתיים נitro ו ברקמת השומן של עכברים שמנים 8. זיהום של שורת תאים monocytic ידי הרפס הקשור סרקומה קפוסי מוביל הגברת הביטוי התאי של GLUT1 9, והראינו לאחרונה כי במהלך זיהום כרוני HIV גידול באחוז מונוציטים להביע GLUT1 נוכחים במהלך ההדבקה שטופלו בטיפול תרופתי מטופל בשילוב 10. יחדיו, מחקרים אלה מראים כי ספיגת הגלוקוז וחילוף החומרים glycolytic ידי מונוציטים הם היבטים חשובים של מחלות דלקתיות רבות. לפיכך, שיטה פשוטה למדוד ביטוי GLUT1 מונוציטים ספיג הגלוקוז במהלך הומאוסטזיס ומחלות דלקתיות עשויות להועיל במגוון רחב של חוקרים.
מונוציטים האדם הם הטרוגניים, להיות מורכב משלושה תת ברורים שיכולים להיבדק על ידי ביטוי ההפרש של CD14 סמנים פני התא CD16 11,12. מונוציטים קלסי להביע רמה גבוהה של CD14 אך אינו מבטא CD16 (CD14 ++ CD16 -), מונוציטים ביניים להביע רמה גבוהה של CD14 ו ברמה בסיסית של CD16 (CD14 ++ CD16 +), ומונוציטים הלא קלאסית להביע רמה נמוכה של CD14 ורמה גבוהה של CD16 (CD14 + CD16 ++). מונוציטים מבטאי CD16 מכונים CD16 + מונוציטים, אשר לעומת CD16 - יש מונוציטים ביטוי גבוה של ציטוקינים דלקתיים ויכולת אנטיגנים נוכחי בצורה יעילה יותר 13,14. כ -10% מונוציטים להביע CD16 במהלך הומאוסטזיס עם אחוזים גבוהים שנצפו במהלך דלקת 15. תת-אוכלוסיות מונוציטים המשויכות מצבי מחלה מסוימים יכולות להיות סמנים ביולוגיים שימושיים להתקדמות מחלה ומחלות 16.
מטרתנו הייתה לזהות שיטה שיכולה למדוד ביטוי נשא גלוקוז ספיגת הגלוקוז על ידי מונוציטים האדם subpopulations מונוציטים בתנאים קרוב PHYתנאי siological ככל האפשר. מחקרים קודמים נמדד ביטוי נשא גלוקוז מונוציטים ספיגת הגלוקוז 17,18, אם כי שיטות אלה בחן מונוציטים מבודד שיכול שינו ביטוי חלבון לעומת מצבים פיזיולוגיים 19, ולא במחקר הקודם בחן subpopulations מונוציטים האדם. באמצעות זרימה רבת פרמטריים cytometry, אנו מתארים שיטה לבחון ביטוי נשא גלוקוז ספיג של אנלוגי גלוקוז ניאון 2-NBDG ידי מונוציטים הכוללים תת-אוכלוסיות מונוציטים (מבוסס על CD14 וביטוי CD16) בתוך דם unmanipulated כולו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: החיים עם HIV ואיידס-נגוע בנושאים גויסו מיחידת למחלות זיהומיות אלפרד החולים במלבורן, VIC, אוסטרליה, ומן הקהילה המקומית, בהתאמה. הסכמה מדעת התקבלה כל המשתתפים, ואת המחקר אושר על ידי ועדת המחקר ואתיקת אלפרד החולה.
1. GLUT1 איתור שטח פני התא על תת-אוכלוסיות מונוציטים ו מונוציטים
- איסוף דם ב ציטראט ACD-B צינורות קרישה ולהתחיל בניסויים בתוך ארון בטיחות ביולוגית בתוך שעה 1 של האוסף.
- הוספת 100 μl של דם כדי צינורות פוליפרופילן. הוסף 2 מ"ל של 1x lysing פתרון (ראה לוח חומרים) כדי צינורות בעוד על הקרח, pipetting בעדינות לתערובת. דגירה במשך 15 דקות על קרח. צנטריפוגה ב 220 XG במשך 5 דקות.
- למזוג ולשטוף פעמיים על ידי הוספת כ 2-4 מ"ל של הפתרון לשטוף (BSA 0.5% ב 1x PBS) ו centrifuging ב 220 XG במשך 5 דקות.
- להשתמש בצינורטטי כדי להסיר כמה שיותר בזהירות של הפתרון לשטוף ככל האפשר. מקום צינורות על קרח מחדש להשעות ב 100 μl של פתרון לשטוף.
- כדי לזהות תת-אוכלוסיות מונוציטים ספציפיות להכתים תאים עם הנפח הבא של הנוגדנים ל -100 μl השעית תא מוכנים בשלב 1.4: 5 μl אנטי CD3-PE, 5 μl אנטי CD14-APC, 5 μl אנטי CD16-PECy7, 5 μl GLUT1 -FITC או IgG2b-FITC (שפופרת אלוטיפ).
- מניחים על קרח למשך 30 דקות בחושך. לשטוף 2 פעמים עם פתרון לשטוף. תקן עם 200-300 μl של פורמלדהיד 0.5% מתוצרת 1x PBS.
- לנתח על cytometer זרימה מסוגל לאתר 4 צבעים בתוך 24 שעות בתוך גל עירור ופליטה הבאים: FITC (488, 530), PE (488, 575), PECy7 (488, 780), APC (633, 660) 10.
2. ספיגת הגלוקוז על ידי מונוציטים
- פיפטה 90 μl של הדם שנאסף בשלב 1.1 צינורות פוליפרופילן. הוסף 10 μl של פתרון עובד 14.60 מיקרומטר 2-NBDG כדי90 μl של דם (הריכוז הסופי 1.46 מ"מ) קפיצי בעדינות לתערובת. זה קריטי כדי להגביל את החשיפה 2-NBDG לאור על ידי כיסוי צינורות עם רדיד אלומיניום.
- לדגור על 37 מעלות צלזיוס בחושך במשך 15-30 דקות ולאחר מכן מיד ומניחים על קרח. הוסף 4 מ"ל של 1x FACS lysing הפתרון צינורות בעוד על הקרח. צנטריפוגה ב 220 XG ב 4 ° צלזיוס למשך 5 דקות.
- שטפי פעם על ידי הוספת 4 מ"ל של פתרון לשטוף (0.5% BSA ב PBS 1x). צנטריפוגה ב 220 XG ב 4 ° צלזיוס למשך 5 דקות. למזוג ומניחים על קרח.
- כתם תאים עם נוגדנים: 5 μl אנטי CD3-PE, 5 μl אנטי CD14-APC ו -5 μl אנטי CD16-PECy7. מערבבים ומניחים על קרח למשך 30 דקות בחושך.
הערה: במהלך תקופה זו לוודא את הזרימה cytometer היא מוכנה לניתוח מיידי. רוכשת תאים בתוך גל עירור ופליטה הבאים: 2-NBDG (488, 530), PE (488, 575), PECy7 (488, 780), APC (633, 660). - הוסף 4 מ"ל של חיץ לשטוף קר קרח (BSA 0.5% ב 1x PBS) כדי צינורות.שטפי פעם על ידי צנטריפוגה ב 220 XG ב 4 ° צלזיוס למשך 5 דקות. למזוג ולהוסיף 200-300 μl של PBS הישן הקרח ולשמור על הקרח בחושך (מכוסה בנייר אלומיניום). לנתח על cytometer זרימה בתוך 10 דקות באמצעות עירור הגדרה אורך גל פליטה כמו בשלב 2.4.
3. קליטת נתונים וניתוח
הערה: ידע של זרימת cytometry וניתוח נתוני הנחה.
- שימוש cytometer זרימה מסוגל לבצע ניתוחי 4 צבעים לפחות, להגדיר פיצוי באמצעות דגימות בלא כתם בנפרד מוכתמות.
הערה: מכתים יחיד באמצעות CD4 FITC שכותרתו CD14 יכול לשמש GLUT1 ופיצוי 2-NBDG. - הגדרת תווית חלונות מתאימים לפני רכישת דגימות. צייר שער סביב האוכלוסייה מונוציטים, ולרכוש 100,000 ל -300,000 אירועים לדגימה בקצב בינוני. 50,000 אירועים לדגימת פיצוי מספיק.
הערה: פיצוי עשוי להתנהל לפני לדגוםרכישה או תוכנת ניתוח תא בודדת, בעקבות הליכים סטנדרטיים. - יצוא ולשמור נתונים לתוך מיקום מתאים. פתח את תוכנת ניתוח תא בודד כגון FlowJo או תוכנה לניתוח אחרים (משלימה איור 1) דגימות גרור ושחרר כמפורט (משלימה איור 2).
- לחץ לחיצה כפולה כדי לפתוח את הקובץ (משלימה איור 3). צייר עיגול לשער מונוציטים מבוסס על מאפייני פיזור קדימה בצד כפי שמוצג באיור 1A ו משלימים איור 4. לחץ לחיצה כפולה על האוכלוסייה מונוציטים. הקפד לצייר תיבה מסביב CD3 - האוכלוסייה (משלימה איור 4).
- לחץ לחיצה כפולה על CD3 - אוכלוסייה. כדי לבחון את תת-אוכלוסיות מונוציטים לבחור CD14-APC על ציר 'x', ו CD16-PECy7 על 'ציר y'-, ואת התווית בהתאם (משלימה איור 5).
- איפה אין מובחןאוכלוסיות חיוביות ושליליות, למדוד את הביטוי של GLUT1 או ספיגת 2-NBDG ב subpopulations מונוציטים ספציפי. קבע את עוצמות הקרינה הממוצעת (MFI) של GLUT1 ו -2-NBDG על ידי הפחתת אלוטיפ ולא הרקע 2-NBDG (משלימה איור 6).
- איפה אוכלוסיות מוגדרות קיימות עדיין, השתמש IgG2b-FITC להגדיר את השער, ולקבוע את התאים החיוביים האחוז (איור 3).
הערה: השתמש בהליך זה כדי לנתח הכולל CD14 + מונוציטים. מאז ספיגת 2-NBDG הוא בדרך כלל בסימן שינוי הקרינה עוצמות הנתונים מיוצג על ידי מיטב MFI היסטוגרמות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
פיצוי חייב להתבצע עבור fluorochromes פרט למנוע זליגת קרינה. מונוציטים מועשרים לראשונה על ידי gating מבוסס על קדימה פיזור בצד. המגרשים שהוצגו הם נציגים של לפחות שישה ניסויים בלתי תלויים שנערכו על דם שלם שישה משתתפים או יותר כפי שדווח בעבר 10 איור 1A מציגה את gating הראשונית של מונוציטים ידי תא פיזור והדרה של תאי T על ידי gating בתוך CD3 -. האוכלוסייה. מונוציטים הם אז מגודרים עבור ביטוי CD14 לבד או בשילוב עם CD16 לזהות מונוציטים מוחלטים או תת-אוכלוסיות מונוציטים כפי שמוצגים באיור 1B ואיור 1C, בהתאמה. באשר לניתוח subpopulations מונוציטים, המינוח הבא יש להחיל כפי שתואר לעיל 12: מונוציטים קלסי (CD14 ++ CD16 -) צריך להביע כ 100-לקפל CD יותר14 MFI מאשר לשלוט אלוטיפ ו CD16 MFI צריך להיות דומה שליטה אלוטיפ; מונוציטים ביניים (CD14 ++ CD16 +) צריך להביע כ 100-לקפל MFI CD14 גבוה מערך הבקרה אלוטיפ וכ פי 10 יותר CD16 MFI לעומת שליטה אלוטיפ; מונוציטים הלא קלסיים (CD14 + CD16 ++) צריכים MFI דומה עבור CD14 ואת שליטת isotype וכ 100-לקפל MFI CD16 גבוה מערך בקרת אלוטיפ. תאים ללא הבעה של CD14 ו CD16 אינם מונוציטים נחשב ולא צריך להיכלל gating. מונוציטים מגודרים או תת-אוכלוסיות מונוציטים ניתן לבדוק ואז לביטוי נשא גלוקוז. כפי שניתן לראות בתרשים 2, אוכלוסיות נפרדות של CD14 + GLUT1 + מונוציטים אפשר לראות, בעיקר בתאים המתקבלים HIV + אנשים, שבו זיהום מאופיין במצב כרוני של דלקת. דומה אבל נדיר CD14 + GLUT1 + תאים עשויים להיות observed בתוך תת מונוציטים ספציפי HIV אנשים נגועים (איור 3 א), אלא יותר מודגשים אצל אנשי HIV + (איור 3 ב). ראוי לציון, בהעדר אוכלוסיות נפרדות, ויתכן שיהיה ראוי לייצג את התוצאות כממוצעות או בעוצמות בתפרחת החציוני, אשר לוקח בחשבון את העלייה המצטברת ביטוי פני תא GLUT1.
ספיגת הגלוקוז ניתן להעריך על ידי השוואת כל הדם מודגרות עם 2-NBDG או שליטה ברכב עבור מונוציטים מגודר או תת-אוכלוסיות מונוציטים. הראינו בעבר כי כ 50% של מונוציטים היו 2-NBDG חיובית לאחר דגירת 15 דקות 10. רמת ספיגה זה מאפשרת זיהוי של 2-NBDG ללא רווית לכת, כאשר הבדלים מונוציטים 2-NBDG ספיג לא יכולים עוד להתקיים. ניתוח של ספיגת 2-NBDG ידי מונוציטים מ- HIV נגוע ו- HIV + אנשים חשפו ספיגת גבוה על ידי תאים מאנשים HIV +, אשרבהסכמה הוא עם נתוני התבטאות GLUT1 (איור 4 - 5). ככלל, תוצאות אלו ממחישות כי המבחנים המתוארים כאן יכולים לשמש פוטנציאל ללמוד פעילויות מטבוליות מונוציטים בהקשרים ביולוגיים לעורר מצב דלקתי כגון סוכרת, מחלות לב וכלי דם, זיהומים נגיפיים וחיידקיים.
איור 1:. Gating אסטרטגיה להשתמש כדי לנתח מונוציטים הכולל תת-אוכלוסיות מונוציטים מ ל- HIV נציג ו- HIV + דגימות דם דגימות דם כל נותחו על ידי cytometry זרימה עבור ביטוי GLUT1 פני התא מונוציטים בתוך 1 שעות של האוסף. (א) תאים היו מגודרים מבוסס על קדימה וצד המאפיינים פיזור וביטוי CD3. (ב) כדי לבחון מונוציטים הכולל, CD3 - תאים היו מגודרים אז לביטוי CD14. (C רונג>) כדי לבחון תת-אוכלוסיות מונוציטים (קלאסית, C; מתחיל, אני; ולא-קלאסית, NC) עבור אנשים HIV-נגוע ואנשים תמימים טיפול נשאי HIV, תאים CD3- היו מגודרת מכן מבוסס על ביטוי CD14 ו CD16. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2:.. ניתוח של ביטוי GLUT1 תא השטח על מונוציטים סך ל- HIV נציג ו- HIV + דגימות דם CD14 + מונוציטים מ- HIV-נגוע או החיים עם HIV טיפול אנשים תמימים הוכתמו אלוטיפ FITC שכותרתו או נוגדנים GLUT1 אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
לשמור-together.within-page = "1"> 
איור 3:. ניתוח של ביטוי GLUT1 תא השטח על תת-אוכלוסיות מונוציטים מ ל- HIV נציג ו- HIV + דגימות דם תת-אוכלוסיות מונוציטים הוכתמו אלוטיפ FITC שכותרתו או נוגדנים GLUT1 עבור (א) HIV-נגוע או (ב) HIV נגועים טיפול נאיבי דגימות דם. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4:. ספיג של 2-NBDG ידי מונוציטים הכוללים CD14 + מהנציג ל- HIV ו- HIV + דגימות דם דם מ- HIV-נגועים או HIV נגוע אנשי טיפול נאיביים הודגר עם רכב או 2-NBDG בריכוז סופי של 1.46 מיקרומטר במשך 15 דקות לפני הכביסה דוגרת עם נוגדנים פני תא כדי מונוציטים שער כמתואר באיור 1. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5:. ספיג של 2-NBDG ידי תת-אוכלוסיות מונוציטים מהנציג ל- HIV ו- HIV + דגימות דם מלאות דם מ- HIV-נגועים או HIV נגוע אנשי טיפול נאיביים הודגר עם רכב או 2-NBDG בריכוז סופי של 1.46 מ"מ עבור 15 דקות לפני הכביסה דוגרים עם נוגדנים פני התא כדי subpopulations מונוציטים השער כמתואר באיור 1. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
together.within-page = "1"> 
משלימה איור 1:. חלון סביבת עבודה עבור זרימת cytometry תוכנה לניתוח תא אנא לחץ כאן כדי לראות או להוריד את דמות משלים זה.
משלימת איור 2:. נתוני מדגם הם גררו והשליכו לתוך סביבת עבודה זו אנא לחץ כאן כדי לראות או להוריד את דמות משלים זה.
55 / Supp_Figure_3_Double_Click_to_open_file_Small.jpg "/>
משלימה איור 3: דוגמאות בסביבת העבודה, נתונים 085 הוא לחיצה כפולה, וחלון השני הופיע מראה את שלוש אוכלוסיות התאים העיקריים (לימפוציטים, מונוציטים ו נויטרופילים) בתוך המדגם כולו דם טרי מבוסס על קדימה (FSC) ולפזר בצד (SSC) . אנא לחץ כאן כדי להציג או להוריד דמות משלים זה.
משלימת איור 4: מונוציטים הם מגודרים מבוססים על קדימה (FSC) ולפזר בצד (SSC). האוכלוסייה שלוחצת כפולה אשר שהעלתה בחלון חדש. CD3 מסומנת על ציר "x" והאוכלוסייה CD3-שלילי (gating את לימפוציטים) היה יםנבחר. אנא לחץ כאן כדי לראות או להוריד את דמות משלים זה.
משלימה איור 5: CD3 - האוכלוסייה מונוציטים שלחצו כפול אשר העלה חלון חדש שבו subpopulation מונוציטים יכול להיות מוגדר על בסיס CD16 וביטוי CD14. אנא לחץ כאן כדי לראות או להוריד את דמות משלים זה.
משלימה איור 6: Mתת-אוכלוסיות onocyte נבחרות, וביטוי פני תא GLUT1 (ממוצע עוצמת קרינה: MFI) מתקבל על ידי בחירת "סטטיסטיקה 'בחלון היסטוגרמה,' ממוצע 'מהחלון' להוסיף הנתונים ', ובחירת GLUT1 מן" הפרמטר "הנפתח תפריט. אנא לחץ כאן כדי לראות או להוריד את דמות משלים זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הפרוטוקול המתואר כאן מפרט שיטה פשוטה לבחון ביטוי נשא גלוקוז ספיג אנלוגי גלוקוז ניאון על ידי תת-אוכלוסיות מונוציטים ו מונוציטים בדם כולו. לפי הערכה ספיגה 2-NBDG בדם כולו, טכניקה זו מאפשרת בתנאים דומים לאלה in vivo. מחקר קודם בחן 6-NBDG לספיגת מונוציטים מופרדים דם כולו על ידי צנטריפוגה צפיפות 17. עם זאת, מחקר זה לא בדק subpopulations מונוציטים ופרדה של מונוציטים מהדם כולו עלול לשנות ביטוי של מולקולות פני תא מסוימים 19. קליעים נותבים גלוקוז רדיואקטיבי גם שמשו למדידת ספיגת מונוציטים של גלוקוז 20,21, אבל מונוציטים חייב להיות מבודד בעבר עבור שיטה זו ושימוש של רדיואקטיביות דורש אמצעי זהירות בטיחות משמעותית. הפרוטוקול שלנו משתמש הליכי בטיחות ביולוגיים שיגרתי הוא מינימאלי מניפולטיבי, ובכך מאפשר למדידת התזרים cytometric של 2-NBDGספיגה ידי מונוציטים ו תת-אוכלוסיות מונוציטים מחק בתנאי vivo.
2-NBDG נכנס מסלול הגליקוליזה הוכח להיות מפורק על ידי תאים למולקולות ללא ניאון 22. לכן, חשוב להגביל את חילוף החומרים לאחר 2-NBDG הדגירה על ידי שמירה על תאים מקורר על 4 מעלות צלזיוס. 6-NBDG הוא אנלוגי גלוקוז ניאון אחר שיכול לשמש אבל זה פחות שימושי כפי שהוא אינו נכנס מסלול הגליקוליזה ולכן במדויק אינו משקף את מצב bioenergetic של תאים 23.
אם fluorochromes עם חופפים ספקטרום מנוצלים, פיצוי הופך להיות קריטי כדי למנוע זליגת fluorochrome. בפרוטוקול זה אנו משתמשים מונוציטים מוכתמים בנפרד עם CD14 ו CD16 להגדיר פרמטרי פיצוי, אך פיצוי של סמנים פני התא יכול גם להתבצע באמצעות חרוזי פיצויים.
גרנולוציטים יכול להביע CD16 אבל ניתן לשלול על ידי gating אתCD15 להביע תאים. עם זאת, gating המחמיר של מונוציטים מבוססים על מאפייני פיזור אור יכול להגביל את מספר גרנולוציטים נכלל באנליזה. אם cytometer זרימה הוא זמין עם ערוצים נוספים, סמן גרנולוציט CD66b יכול לשמש גם כדי לכלול גרנולוציטים מהניתוח.
נוגדן GLUT1 השתמש במחקר זה נקשר epitope פני תא ולכן לא להיקשר GLUT1 התאי. נוגדן אשר נקשר אפיטופ GLUT1 תאי ניתן להשתמש כדי למדוד ביטוי מונוציטים GLUT1 הכולל, אבל תאים חייבים להיות permeabilized לפני מכתים 10. בנוסף מונוציטים, טכניקה זו יכולה לשמש כדי לבחון ספיגה מטבוליזם גלוקוז לויקוציטים אחרים נמצאו בתוך דם. בחנו בהרחבה ספיגת תאי T של 2-NBDG באמצעות השיטה המתוארת כאן, וגם בחנו 2-NBDG ספיגת ידי תאי NK 24. לגילוי מוצלח הביטוי GLUT1 ספיגת 2-NBDG קיים הכרח להגבילעקבות של חיץ תמוגה תאי דם האדום על ידי שטיפת תאים עם חיץ לשטוף עודף לפי הפרוטוקול, ומצאנו כי FITC או נוגדן GLUT1 APC שכותרתו לתת אותות טובים יותר conjugates PE או PerCP. אנחנו לא חקרנו את הסיבות לכך.
מאחר ותאי הם מטבולית פעילה גם בטמפרטורות נמוכות, זה קריטי, כי בעקבות הדגירה 2-NBDG ב 37 מעלות צלזיוס, כי צינורות נשמרים ישירות על קרח צנטריפוגה שנערכה על 4 מעלות צלזיוס. האות 2-NBDG בהעדר חזקה, לבדוק כי בריכוז הנכון נמצא בשימוש, להפחית חשיפה לאור בחדר בטיחות ביולוגית צינורות ארון ומכסים ברדיד בעת הצורך. אופטימיזציה ייתכן שתידרש על ידי הגדרת זמן כמובן 2-NBDG ניסוי ספיג עבור 5, 15, 20, 30, 60, ו -90 דקות. בדרך כלל, זמן אופטימלי צריך להיות 10-60 דקות, תלוי סוגי תאים ומצב ההפעלה שלהם.
מגבלה עיקרית עם assay הספיגה 2-NBDG היא sens אורitivity יחד עם העובדה כי הוא מנוצל על ידי התאים. לכן חשוב להגביל את מספר דגימות על מנת להבטיח כי המדגם האחרון מנותח תוך 30 דקות של אחד הראשונים. מגבלה ביולוגית היא כי, אף על פי תדירות GLUT1 להביע מונוציטים ולא-קלאסיות, וביטוי GLUT1 על מונוציטים ולא-קלאסיות היו גדולה באופן משמעותי מאשר מונוציטים קלסי, לא נמצאו הבדלים קיימים ספיג 2-NBDG בין שני תת-האוכלוסיות 10. זה מעלה את האפשרות כי עודפים אחרים, כגון Glut3 ו GLUT4 הביעו על מונוציטים עשויים להיות מעורבים במטבוליזם הגלוקוז הגדרות מחלה שונות. אפשר גם שהפעילות של GLUT1 עשויה גם להיות מוסדר פוסט translationally.
היתרון העיקרי של פרוטוקול ספיגת הגלוקוז תזרים cytometric שלנו על תיוג רדיואיזוטופיים היא היכולת לשלב את הטכניקה עם ניתוח immunophenotypic לזהות וללמוד תת-אוכלוסיות ספציפיות של תאים חיסוניים smalנפח ליטר דם. בנוסף הנגמ"ש מצומדות אנטי GLUT1 ניתן להחיל לנתח ביטוי על פני קרום התא GLUT1 זמנית ספיגת 2-NBDG. שינוי ביטוי GLUT1 עקב 2-NBDG ספיג לא הודגם בעבר, אבל האפשרות הזאת לא ניתן לשלול.
ספיגת הגלוקוז מוגברת חילוף חומרים על ידי תאי מערכת חיסון הוא סימן היכר של תאי T מופעלים מונוציטים 25-27. תאים אלה עשויים להיות מופעלים בתגובת הפתוגן זיהום 28,29, אותות דלקתיים בתנאים כגון מחלות אוטואימוניות כמו זאבת 30-32, ו השמנת יתר וסוכרת 8,33. חילוף חומרים של הגלוקוז מוגברת נדרש גם להישרדות תא הסרטן, גידול וגרור 34. יש לציין, חוסר וויסות חילוף החומרים בתאי המערכת החיסונית התפתחה סימן ההיכר של הידבקות ב- HIV, והיא קשורה עם הפעלה חיסונית 24, דלקת 10, ו ההדבקה של תאים מסוג CD4 + T 35-37. לכן,בשיטה זו תהיה עניין לקהל מגוון כולל בעלי עניין מחלות בתיווך דלקתיות, סרטן, מחלות זיהומיות, אימונולוגיה immunometabolism 38.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
מחקר זה מומן על ידי המרכז האוסטרלי ל- HIV וצהבת מסוג וירולוגיה מחקר (ACH 2) ומענק התפתחותיים 2010 (CNIHR) מאוניברסיטת מרכז וושינגטון לאיידס מחקר (וכפר), תוכנית הממומנות על ידו תחת AI027757 מספר הפרסים אשר נתמך על ידי NIH מוסדות ומרכזים הבאים (NIAID, NCI, NIMH, NIDA, NICHD, NHLBI, NIA). CSP הוא הנמען של מענק 2 CNIHR ו ACH. SMC הוא הנמען של מועצת המחקר הלאומית לבריאות ורפואה של אוסטרליה (NHMRC) ומנהלת מחקר המלגה. המחברים בתודה להכיר בתרומת עבודה זו של תכנית תמיכת התשתית ויקטוריאני התפעולית המתקבלת במוסד ברנט. אנו מכירים את עזרתו של גזה Paukovic ואווה אורלובסקי-אוליבר ממתקן Core cytometry זרימה AMREP עבור זרימת cytometry הדרכה וייעוץ טכני. אנו מודים אנגוס מורגן לאימון התקשורת וארגון לצלם וידאו. תודתנולג'סי מאסון Jehad עבד-אלעזיז ק Alzahrani לסיוע במעבדה במהלך לצלם וידאו. אנו מודים המאמצים של ד"ר דוד Simar בבית הספר למדעי הרפואה, UNSW, אוסטרליה שהציעו ייעוץ מתודולוגי קריטי. CSP רוצה להודות www.nice-consultants.com להתייעצויות גרפיות.
מחברי תרומה:
CSP הגה את הפרויקט, שנועד וערך ניסויים, ניתוח ופרשנות נתונים, וכתב את כתב היד. JJA לפרש נתונים וכתב את כתב היד. TRB כתב את כתב היד. JMM לפרש נתונים, הציע הצעות רוחניות קריטיות, כותב ביקורת על כתב היד. SMC לפרש נתונים, הציע הצעות אינטלקטואליות ביקורתיות ביקורת על כתב היד.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| VACUETT Tube 9 ml ACD-B anticoagulant tubes | Greiner Bio-One GmbH | 455094 | |
| 5 ml sterile polypropylene tubes | BD Biosciences | 352063 | |
| Albumin from Bovine Serum (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| 16% formaldehyde solution | Electron Microscopy Science | 15710 | |
| BD FACS lysing solution (10x) | BD Biosciences | 349202 | Dilute BD FACS lysing solution 1/10 with deionized water for working concentration (store for up to 1 week at 4 °C) |
| anti-CD3-PE | BD Biosciences | 555340 | |
| anti CD14-APC | BD Biosciences | 555399 | |
| anti-CD16-PECy7 | BD Biosciences | 557744 | |
| anti-Glut1-FITC | R & D Systems | FAB1418F | |
| IgG2b-FITC | R & D Systems | IC0041F | |
| 2-NBDG | Life technologies | N13195 | Suspend 5 mg of 2-NBDG into 1 ml of deionized water to make a 14.60 mM stock solution (keep for up to 6 months at 4 °C). To make the working 2-NBDG concentration, dilute stock 1/100 with 1x DPBS. Cover with foil. (store for up to 1 week at 4 °C) |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (1x) | Life technologies | 14190-144 | To make wash solution, add 0.5 g BSA per 100 ml DPBS (store for up to 2 weeks at 4 °C) |
References
- Shi, C., Pamer, E. G. Monocyte recruitment during infection and inflammation. Nat Rev Immunol. 11, 762-774 (2011).
- Woollard, K. J., Geissmann, F. Monocytes in atherosclerosis: subsets and functions. Nat Rev Cardiol. 7, 77-86 (2010).
- Richards, D. M., Hettinger, J., Feuerer, M. Monocytes and macrophages in cancer: development and functions. Cancer Microenviron. 6, 179-191 (2013).
- Anzinger, J. J., Butterfield, T. R., Angelovich, T. A., Crowe, S. M., Palmer, C. S. Monocytes as regulators of inflammation and HIV-related comorbidities during cART. J Immunol Res. 2014, 569819 (2014).
- Palmer, C., Cherry, C. L., Sada-Ovalle, I. Glucose Metabolism in T Cells and Monocytes: New Perspectives in HIV Pathogenesis. EBioMedicine. , (2016).
- Cheng, S. C., et al. mTOR- and HIF-1alpha-mediated aerobic glycolysis as metabolic basis for trained immunity. Science. 345, 1250684 (2014).
- Maratou, E., et al. Glucose transporter expression on the plasma membrane of resting and activated white blood cells. Eur J Clin Invest. 37, 282-290 (2007).
- Freemerman, A. J., et al. Metabolic reprogramming of macrophages: glucose transporter 1 (GLUT1)-mediated glucose metabolism drives a proinflammatory phenotype. J Biol Chem. 289, 7884-7896 (2014).
- Gonnella, R., et al. Kaposi sarcoma associated herpesvirus (KSHV) induces AKT hyperphosphorylation, bortezomib-resistance and GLUT-1 plasma membrane exposure in THP-1 monocytic cell line. J Exp Clin Cancer Res. 32, 79 (2013).
- Palmer, C. S., et al. Glucose transporter 1-expressing proinflammatory monocytes are elevated in combination antiretroviral therapy-treated and untreated HIV+ subjects. J Immunol. 193, 5595-5603 (2014).
- Wong, K. L., et al. Gene expression profiling reveals the defining features of the classical, intermediate, and nonclassical human monocyte subsets. Blood. 118, e16-e31 (2011).
- Ziegler-Heitbrock, L., et al. Nomenclature of monocytes and dendritic cells in blood. Blood. 116, e74-e80 (2010).
- Belge, K. U., et al. The proinflammatory CD14+CD16+DR++ monocytes are a major source of TNF. J Immunol. 168, 3536-3542 (2002).
- Frankenberger, M., Sternsdorf, T., Pechumer, H., Pforte, A., Ziegler-Heitbrock, H. W. Differential cytokine expression in human blood monocyte subpopulations: a polymerase chain reaction analysis. Blood. 87, 373-377 (1996).
- Ziegler-Heitbrock, L. The CD14+ CD16+ blood monocytes: their role in infection and inflammation. J Leukoc Biol. 81, 584-592 (2007).
- Ziegler-Heitbrock, L. Macrophages: Biology and Role in the Pathology of Diseases. , Springer. 3-36 (2014).
- Dimitriadis, G., et al. Evaluation of glucose transport and its regulation by insulin in human monocytes using flow cytometry. Cytometry A. 64, 27-33 (2005).
- Fu, Y., Maianu, L., Melbert, B. R., Garvey, W. T. Facilitative glucose transporter gene expression in human lymphocytes, monocytes, and macrophages: a role for GLUT isoforms 1, 3, and 5 in the immune response and foam cell formation. Blood Cells Mol Dis. 32, 182-190 (2004).
- Stibenz, D., Buhrer, C. Down-regulation of L-selectin surface expression by various leukocyte isolation procedures. Scand J Immunol. 39, 59-63 (1994).
- Ahmed, N., Kansara, M., Berridge, M. V. Acute regulation of glucose transport in a monocyte-macrophage cell line: Glut-3 affinity for glucose is enhanced during the respiratory burst. Biochem J. 327 (Pt 2), 369-375 (1997).
- Cutfield, W. S., Luk, W., Skinner, S. J., Robinson, E. M. Impaired insulin-mediated glucose uptake in monocytes of short children with intrauterine growth retardation). Pediatr Diabetes. 1, 186-192 (2000).
- Yoshioka, K., et al. A novel fluorescent derivative of glucose applicable to the assessment of glucose uptake activity of Escherichia coli. Biochim Biophys Acta. 1289, 5-9 (1996).
- Speizer, L., Haugland, R., Kutchai, H. Asymmetric transport of a fluorescent glucose analogue by human erythrocytes. Biochim Biophys Acta. 815, 75-84 (1985).
- Palmer, C. S., et al. Increased glucose metabolic activity is associated with CD4+ T-cell activation and depletion during chronic HIV infection. AIDS. 28, 297-309 (2014).
- Palmer, C. S., Ostrowski, M., Balderson, B., Christian, N., Crowe, S. M. Glucose metabolism regulates T cell activation, differentiation, and functions. Frontiers in immunology. 6, (2015).
- Palmer, C. S., et al. Regulators of glucose metabolism in CD4 and CD8 T cells. International reviews of immunology. , 1-12 (2015).
- Palmer, C. S., Crowe, S. M. How does monocyte metabolism impact inflammation and aging during chronic HIV infection? AIDS research and human retroviruses. 30, 335-336 (2014).
- McFadden, K., et al. Metabolic stress is a barrier to Epstein-Barr virus-mediated B-cell immortalization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, E782-E790 (2016).
- Gamelli, R. L., Liu, H., He, L. K., Hofmann, C. A. Augmentations of glucose uptake and glucose transporter-1 in macrophages following thermal injury and sepsis in mice. Journal of leukocyte biology. 59, 639-647 (1996).
- Yin, Y., et al. Glucose Oxidation Is Critical for CD4+ T Cell Activation in a Mouse Model of Systemic Lupus Erythematosus. Journal of immunology. , 80-90 (2016).
- Yang, Z., Matteson, E. L., Goronzy, J. J., Weyand, C. M. T-cell metabolism in autoimmune disease. Arthritis research & therapy. 17, 29 (2015).
- Yin, Y., et al. Normalization of CD4+ T cell metabolism reverses lupus. Science translational medicine. 7, 274ra218 (2015).
- Barbera Betancourt, A., et al. Inhibition of Phosphoinositide 3-Kinase p110delta Does Not Affect T Cell Driven Development of Type 1 Diabetes Despite Significant Effects on Cytokine Production. PloS one. 11, e0146516 (2016).
- Barron, C. C., Bilan, P. J., Tsakiridis, T., Tsiani, E. Facilitative glucose transporters: Implications for cancer detection, prognosis and treatment. Metabolism: clinical and experimental. 65, 124-139 (2016).
- Hegedus, A., Kavanagh Williamson, M., Huthoff, H. HIV-1 pathogenicity and virion production are dependent on the metabolic phenotype of activated CD4+ T cells. Retrovirology. 11, 98 (2014).
- Taylor, H. E., et al. Phospholipase D1 Couples CD4+ T Cell Activation to c-Myc-Dependent Deoxyribonucleotide Pool Expansion and HIV-1 Replication. PLoS Pathog. 11, e1004864 (2015).
- Loisel-Meyer, S., et al. Glut1-mediated glucose transport regulates HIV infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 2549-2554 (2012).
- Palmer, C. S., et al. Emerging Role and Characterization of Immunometabolism: Relevance to HIV Pathogenesis, Serious Non-AIDS Events, and a Cure. J Immunol. 196 (11), 4437-4444 (2016).
