एक सरल प्रवाह Cytometric विधि को मापने के लिए पूरे रक्त में Monocyte उप-जनसंख्या के लिए ग्लूकोज तेज और ग्लूकोज ट्रांसपोर्टर अभिव्यक्ति
Summary
Monocytes are integral components of the human innate immune system that rely on glycolytic metabolism when activated. We describe a flow cytometry protocol to measure glucose transporter expression and glucose uptake by total monocytes and monocyte subpopulations in fresh whole blood.
Abstract
Monocytes सहज प्रतिरक्षा कोशिकाओं है कि रोगजनकों और कुछ जीर्ण सूजन रोगों के साथ जुड़े सूजन से सक्रिय किया जा सकता है। monocytes के एक्टिवेशन प्रेरक कार्यों और glycolytic चयापचय को ऑक्सीडेटिव से एक सहवर्ती बदलाव है कि बढ़ी हुई ग्लूकोज ट्रांसपोर्टर अभिव्यक्ति के साथ है लाती है। इस वृद्धि की चयापचय glycolytic भी monocytes के प्रशिक्षित प्रतिरक्षा, जन्मजात रोग प्रतिरोधक स्मृति का एक फार्म के लिए मनाया जाता है। इन विट्रो प्रोटोकॉल monocytes द्वारा ग्लूकोज ट्रांसपोर्टर अभिव्यक्ति और ग्लूकोज तेज की जांच वर्णित किया गया है हालांकि, कोई भी पूरे रक्त में मल्टी पैरामीट्रिक प्रवाह cytometry द्वारा जांच की गई है। हम कुल monocytes और शास्त्रीय (CD14 ++ CD16 -) द्वारा पूरे रक्त में ग्लूकोज फ्लोरोसेंट अनुरूप 2-NBDG तेज की माप के लिए एक बहु-पैरामीट्रिक प्रवाह cytometric प्रोटोकॉल का वर्णन है, मध्यवर्ती (CD14 ++ CD16 +) और गैर-शास्त्रीय ( CD14 + CD16 ++) एककेंद्रकश्वेतकोशिकाउप-जनसंख्या। इस विधि homeostasis और सूजन की बीमारी के दौरान कुल monocytes और monocyte उप-जनसंख्या के लिए ग्लूकोज ट्रांसपोर्टर अभिव्यक्ति और ग्लूकोज तेज की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और आसानी से रक्त के भीतर अन्य ल्यूकोसाइट्स और ल्युकोसैट उप-जनसंख्या के लिए ग्लूकोज तेज की जांच करने के लिए संशोधित किया जा सकता है।
Introduction
Monocytes मानव सहज प्रतिरक्षा प्रणाली है कि तेजी से संक्रमण और सूजन 1 की साइटों के लिए जुटाए जाते हैं का एक प्रमुख घटक हैं। Monocytes के एक्टिवेशन रोगजनकों द्वारा तीव्र नुकसान को सीमित करने के लिए महत्वपूर्ण है और यह भी atherosclerosis 2, 3 कैंसर, एचआईवी और 4,5 सहित कई पुराने रोगों के रोगजनन के लिए केंद्रीय है।
आराम और सक्रिय monocytes की चयापचय नाटकीय रूप से आराम कर monocytes ऑक्सीडेटिव चयापचय के उपयोग और सक्रिय monocytes glycolytic चयापचय (यानी, ग्लूकोज के किण्वन लैक्टेट करने के लिए) के उपयोग के साथ अलग है, 6। Monocytes के एक्टिवेशन ग्लूकोज ट्रांसपोर्टरों कि glycolytic चयापचय 7 के लिए ग्लूकोज तेज वृद्धि की अनुमति देता है की अभिव्यक्ति लाती है। Monocyte ग्लूकोज ट्रांसपोर्टर 1 (Glut1) ऐसे ही एक ट्रांसपोर्टर के सक्रियण के दौरान upregulated है और इसकी अभिव्यक्ति वी में समर्थक भड़काऊ साइटोकिन्स का उत्पादन करने के लिए नेतृत्व करने के लिए दिखाया गया हैitro और मोटापे से ग्रस्त चूहों 8 की वसा ऊतकों में। Kaposi सार्कोमा जुड़े herpesvirus द्वारा एक monocytic सेल लाइन के संक्रमण Glut1 9 के सेलुलर अपरेगुलेशन की ओर जाता है, और हम हाल ही में पता चला है कि पुरानी एचआईवी संक्रमण के दौरान Glut1 व्यक्त monocytes का एक बढ़ा प्रतिशत इलाज और संयोजन एंटीरेट्रोवाइरल थेरेपी से इलाज संक्रमण 10 के दौरान मौजूद हैं। साथ में ले ली, इन अध्ययनों से पता चलता है कि ग्लूकोज तेज और monocytes द्वारा glycolytic चयापचय कई भड़काऊ रोगों के महत्वपूर्ण पहलू हैं। इस प्रकार, एक सरल विधि homeostasis दौरान एककेंद्रकश्वेतकोशिका Glut1 अभिव्यक्ति और ग्लूकोज तेज मापने के लिए और सूजन की बीमारी शोधकर्ताओं की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए उपयोग की जा सकती है।
मानव monocytes विषम हैं, तीन अलग सबसेट है कि कोशिका की सतह मार्कर CD14 और CD16 11,12 के अंतर अभिव्यक्ति द्वारा जांच की जा सकती है शामिल किया जा रहा। शास्त्रीय monocytes CD14 के एक उच्च स्तर का इजहार लेकिन सीडी व्यक्त नहीं करते16 (CD14 ++ CD16 -), मध्यवर्ती monocytes CD14 के एक उच्च स्तर और CD16 (CD14 ++ CD16 +) के एक मध्यवर्ती स्तर, और गैर-शास्त्रीय monocytes CD14 का स्तर कम और CD16 के एक उच्च स्तर व्यक्त (CD14 का इजहार + CD16 ++)। Monocytes कि CD16 व्यक्त करते कहा जाता है CD16 + monocytes, जो CD16 की तुलना में – monocytes भड़काऊ साइटोकिन्स के उच्च अभिव्यक्ति और अधिक प्रभावी ढंग से वर्तमान एंटीजन 13,14 करने की क्षमता है। Monocytes के लगभग 10% सूजन 15 के दौरान मनाया उच्च प्रतिशत के साथ homeostasis दौरान CD16 व्यक्त करते हैं। Monocyte उप-जनसंख्या निश्चित रोग राज्यों के साथ जुड़े रहे हैं और रोग और रोग प्रगति 16 की उपयोगी जैविक मार्कर हो सकता है।
हमारा लक्ष्य एक तरीका है कि ग्लूकोज ट्रांसपोर्टर अभिव्यक्ति और मानव monocytes और के रूप में बनावट के करीब परिस्थितियों में monocyte उप-जनसंख्या द्वारा ग्लूकोज तेज उपाय कर सकते हैं की पहचान करने के लिए थासंभव के रूप में siological की स्थिति। पिछले अध्ययनों, मापा एककेंद्रकश्वेतकोशिका ग्लूकोज ट्रांसपोर्टर अभिव्यक्ति और ग्लूकोज तेज 17,18 हालांकि इन तरीकों से अलग-थलग monocytes कि शारीरिक शर्तों के 19 की तुलना में प्रोटीन अभिव्यक्ति बदल दिया है सकते हैं की जांच की, और कोई पिछले अध्ययन मानव monocyte उप-जनसंख्या की जांच की गई। पूरे unmanipulated रक्त के भीतर (CD14 और CD16 अभिव्यक्ति के आधार पर) बहु-पैरामीट्रिक फ्लो का उपयोग करना, हम ग्लूकोज ट्रांसपोर्टर अभिव्यक्ति और फ्लोरोसेंट ग्लूकोज अनुरूप कुल monocytes और monocyte उप-जनसंख्या द्वारा 2-NBDG की तेज जांच के लिए एक विधि का वर्णन।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां वर्णित प्रोटोकॉल ग्लूकोज ट्रांसपोर्टर अभिव्यक्ति और पूरे रक्त में monocyte और monocyte उप-जनसंख्या से फ्लोरोसेंट ग्लूकोज अनुरूप तेज की जांच के लिए एक सरल विधि का विवरण। पूरे रक्त में 2-NBDG तेज का आकलन करके, इस…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस शोध एचआईवी और हेपेटाइटिस विषाणु विज्ञान अनुसंधान एड्स अनुसंधान के लिए वाशिंगटन सेंटर के विश्वविद्यालय (CFAR), पुरस्कार नंबर AI027757 के तहत एक एनआईएच वित्त पोषित कार्यक्रम के लिए जो समर्थन किया है से (ACH 2) और एक 2010 विकास अनुदान (CNIHR) के लिए ऑस्ट्रेलियाई केन्द्र द्वारा वित्त पोषित किया गया निम्नलिखित एनआईएच संस्थानों और केन्द्रों (NIAID, NCI, NiMH, Nida, NICHD, NHLBI, एनआईए) द्वारा। सीएसपी CNIHR और ACH 2 अनुदान के एक प्राप्तकर्ता है। एसएमसी ऑस्ट्रेलिया (NHMRC) प्रिंसिपल रिसर्च फैलोशिप के एक राष्ट्रीय स्वास्थ्य और चिकित्सा अनुसंधान परिषद के एक प्राप्तकर्ता है। लेखकों कृतज्ञता बर्नेट इंस्टीट्यूट द्वारा प्राप्त विक्टोरियन परिचालन बुनियादी सुविधाओं सहायता कार्यक्रम के इस काम के लिए अपने योगदान को स्वीकार करते हैं। हम प्रशिक्षण और तकनीकी सलाह प्रवाह cytometry के लिए AMREP से फ्लो कोर सुविधा से Geza Paukovic और ईवा Orlowski-ओलिवर की सहायता स्वीकार करते हैं। हम मीडिया कोचिंग और वीडियो शूट के संगठन के लिए एंगस मॉर्गन धन्यवाद। हमारे आभारजेसी मेसन और जेहाद अब्दुलअजीज लालकृष्ण Alzahrani करने के लिए वीडियो शूट के दौरान प्रयोगशाला सहायता के लिए। हम मेडिकल साइंसेज, UNSW, ऑस्ट्रेलिया जो महत्वपूर्ण पद्धति की पेशकश की सलाह के स्कूल में डॉ डेविड सिमर के प्रयासों धन्यवाद। सीएसपी को धन्यवाद देना चाहूंगा www.nice-consultants.com ग्राफिक विचार-विमर्श के लिए।
'लेखक योगदान:
सीएसपी परियोजना की कल्पना की, डिजाइन और किए गए प्रयोगों, विश्लेषण और डेटा की व्याख्या की, और पांडुलिपि लिखा था। JJA डेटा की व्याख्या की और पांडुलिपि लिखा था। TRB पांडुलिपि लिखा था। झामुमो व्याख्या डेटा, महत्वपूर्ण बौद्धिक सुझाव दिए, और पांडुलिपि की समीक्षा की। एसएमसी व्याख्या डेटा, महत्वपूर्ण सुझाव दिए बौद्धिक और पांडुलिपि की समीक्षा की।
Materials
| VACUETT Tube 9 ml ACD-B anticoagulant tubes | Greiner Bio-One GmbH | 455094 | |
| 5 ml sterile polypropylene tubes | BD Biosciences | 352063 | |
| Albumin from Bovine Serum (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| 16% formaldehyde solution | Electron Microscopy Science | 15710 | |
| BD FACS lysing solution (10X) | BD Biosciences | 349202 | Dilute BD FACS lysing solution 1/10 with deionized water for working concentration (store for up to 1 week at 4°C) |
| anti-CD3-PE | BD Biosciences | 555340 | |
| anti CD14-APC | BD Biosciences | 555399 | |
| anti-CD16-PECy7 | BD Biosciences | 557744 | |
| anti-Glut1-FITC | R & D Systems | FAB1418F | |
| IgG2b-FITC | R & D Systems | IC0041F | |
| 2-NBDG | Life technologies | N13195 | Suspend 5 mg of 2-NBDG into 1 ml of deionized water to make a 14.60 mM stock solution (keep for up to 6 months at 4°C). To make the working 2-NBDG concentration, dilute stock 1/100 with 1X DPBS. Cover with foil. (store for up to 1 week at 4°C) |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (1X) | Life technologies | 14190-144 | To make wash solution, add 0.5 g BSA per 100 ml DPBS (store for up to 2 weeks at 4°C) |
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