Summary
このプロトコルは、脳の血栓塞栓を可視化するための複合近赤外蛍光（NIRF）イメージングおよびマイクロコンピュータ断層撮影（マイクロCT）の適用を説明します。この技術は、血栓負担と進化の定量化を可能にします。 NIRFイメージング技術は、マイクロCT技術は、金ナノ粒子を用いた動物生体の内部に血栓を視覚化しながら、蛍光、切除した脳内の血栓標識可視化します。
Abstract
直接血栓イメージングは、血栓塞栓性梗塞の根本的な原因を可視化します。画像血栓にできることは、直接、間接測定に頼るのではなく、ストロークのはるかに優れた調査を可能にし、強力かつ堅牢な血管研究ツールとなります。我々は、分子イメージング血栓マーカーで血栓をラベル光イメージングアプローチを使用します - 共有結合血塊成熟のプロセス中に活性化凝固第XIIIa因子のフィブリン架橋酵素作用によって血栓のフィブリン鎖にリンクされたCy5.5、近赤外蛍光（NIRF）プローブ。フィブリン：マイクロコンピュータ断層撮影（マイクロCT）ベースのアプローチは、血餅の主要な構成要素を標的とするために、官能血栓求めて金ナノ粒子（AuNPs）を使用しています。本論文では、in vivoマイクロCT で合わせ、塞栓性脳卒中のマウスモデルにおける血栓塞栓のex vivo NIRFイメージングのための詳細なプロトコルを記述しています。我々は、in vivoであることを示します</ em>のマイクロCTおよびフィブリン標的グリコールキトサンAuNPsは（FIB-GC-AuNPs）の両方の現場での血栓や脳塞栓血栓で可視化するために使用することができます。我々はまた、直列組織プラスミノーゲン活性化因子媒介血栓溶解の治療効果をモニターするためのin vivoマイクロCTに基づく直接血栓イメージングの使用を記載しています。最後のイメージングセッションの後、我々は、ex vivoで NIRFがエクステントと脳内の残留血栓塞栓の分布を画像化することによって実証します。最後に、我々は定量的なイメージがマイクロCTとNIRFイメージングデータの分析について説明します。 ex vivoで NIRFイメージング対in vivoでの hyperdenseのマイクロCT血栓のボリューム上の血栓関連の蛍光シグナルの面積を：直接血栓イメージングを組み合わせた手法は、血栓の可視化の、2つの独立した方法を比較することができます。
Introduction
6人に1人は生涯のある時点でのストロークを持っています。虚血性脳卒中は、これまでで最も一般的なストローク型であり、すべての脳卒中症例の約80パーセントを占めています。血栓塞栓は、これらの虚血性脳卒中の大部分を引き起こすので、直接血栓イメージングへの関心が高まっています。
これは、200万人の脳細胞がスローガン「時間が脳である」につながる、中大脳動脈閉塞1の毎分の間に死亡していると推定されました。コンピュータ断層撮影（CT）の研究が急速に行われ、広く利用可能であることができます。このため、CTは、初期診断及び超急性虚血性脳卒中の治療のための選択のイメージング残ります。血栓溶解のための組織プラスミノーゲンアクチベーター（tPA）を投与すること、および/または血管内凝血塊-検索2にトリアージ：CTは重要な初期の決定を通知するための特に価値があります。現在のCTベースの血栓イメージング、しかし、シリアル大脳を追跡することはできませんin vivoでのリットルの血栓塞栓、それは間接的な方法を使用しているためには、血栓を実証するために：ヨード造影により血液プールの不透明化した後、血栓が血管内の欠陥を埋めることが証明されています。このように、血栓の繰り返しイメージングを排除ヨード造影の反復投与に関連した線量限度とリスクがあります。
したがって、より速く、より良い治療法の決定なされるようにする脳卒中患者における脳血栓の直接イメージング法のための重要な必要性があります。我々は、血栓を求めるナノ粒子、分子造影剤を使用して、CT、ストロークのために現在使用される現場の撮像モダリティの値を高めることによってこれを達成することを提案します。
我々は、マイクロコンピュータ断層撮影（マイクロCT）、迅速なデータ収集を可能にするCTの高解像度のエクスビボまたはインビボ （小動物）イメージングバージョンを使用して、この薬剤の使用を実証しています<SUP> 3,4。でも小動物マイクロCT（人間サイズのスキャナから入手できるよりはるかに悪い）ために利用可能な比較的弱い軟部組織コントラストで、造影剤は、分子によって強化された「密な血管記号 'それらCT上hyperdense行うことで、血栓を追求し、マークすることができましたイメージング。
CT技術を補完するものとして、当社グループは、以前に脳の血栓負担5を視覚化するのCy5.5、近赤外蛍光（NIRF）プローブを用いた光直接血栓イメージング技術を開発しました。これは、死後脳でのex vivoでの技術ですが、非常に敏感であり、研究の設定in vivoのデータで確認するためのものです。
CTとNIRF両方基づく血栓を求めるイメージング技術を持つことは、私たちが虚血性脳卒中の開発の過程における血栓および血栓イメージングの役割に非常に有益なデータを達成するためにこれらの技術を比較対照することができます。
HERE、我々は、in vivoマイクロCTおよびex vivo NIRFイメージングの組み合わせ技術の詳細なプロトコルは直接塞栓性脳卒中のマウスモデルにおける血栓塞栓を視覚化することについて説明します。これらのシンプルで堅牢な方法は提供していますex vivoでのデータが続き、治療中にin vivoでの迅速かつ定量的にダイナミックな血栓進化の血栓負担/分布と特性評価のin vivo評価に正確を可能にすることによって、血栓性疾患の我々の理解を進めるために有用ですin vivoイメージング所見を確認するための制御および参照標準として。
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Protocol
このプロトコルで実証すべての動物の手順を見直し、東国大学一山病院動物実験委員会によって承認され、ケアと動物の使用のためのNIHガイドに記載の原則及び手続に従って行われています。
蛍光マーカーで標識外因的に形成された血栓の作製（図1）
- 30％酸素（1.5 L /分の酸素100％）と混合し、3％イソフルランを用いて誘導チャンバ内でマウスを麻酔。筋肉の緊張を観察し、つま先のピンチの反射が存在しないことを確認することで、麻酔の十分な深さを確認してください。
- 腹臥位に滅菌ドレープで動物を置き、30％の酸素と混合し、吸入マスクと2％イソフルランを用いて麻酔下でそれを維持します。無菌技術および滅菌ガウン/マスク/手袋/楽器を使用して、次の手順を実行します。 Aの前に70％アルコールで実験的なエリアを清掃し、消毒することにより、無菌状態を維持ND手続き後。
- 心臓穿刺6後、約300〜千μlの動脈血を採取します。蛍光血餅をマークするために、30μlのC15プローブ5（20マイクロモル/ L濃度）、活性化された第XIII因子（活性化XIII因子）凝固酵素のフィブリン架橋活性に対して敏感Cy5.5の蛍光プローブを用いて70μlの全血を混ぜる（ 図1A ）。長さ20cmのポリエチレンチューブ（PE-50、ID 0.58ミリメートル）に3ミリリットル注射器（23ゲージの針）を用いた混合血液を注入します。 PEチューブは滅菌（またはメーカーが無菌認定）および血栓は、組織培養フード内で無菌的に準備する必要がありますする必要があります。
- 呼吸と心臓パルスの欠如を観察することにより、動物の死を確認します。
- 以前に7を報告したように、22時間、4℃で、その後、2時間室温で血液ロードチューブのままにして、次の手順を実行します。
- 1.5センチメートル長の片に血栓含むチューブをカット。リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を充填したの3mlの注射器を使用して、穏やかにチューブの各片にPBSを注入して、PBSを含有する6ウェルプレートに血栓を追い出します。 （ 図1B）をPBSで血栓3回洗浄します。
- 気泡を避けながら慎重に30で生理食塩水を充填した1mlシリンジを使用して、洗浄し、血栓を描く1.5センチ長い血栓た15センチ長PE-10チューブ（ID 0.28 mm）での先端部分をロードしますチューブの近位端に挿入されるゲージの針。
- 前大脳 - 4センチのPE-50チューブ（ID 0.58ミリメートル）で血栓ロードPE-10チューブを接続すると、中大脳動脈（MCA）に置かれる、テーパー状の端部（ID 200μm）を有するように修正しました塞栓性脳卒中のマウスモデル（ 図1C）で内頚動脈（ICA）の動脈（ACA）分岐領域。
2.血栓塞栓性脳卒中のマウスモデルのモデリング（図2）
- Anesthetiz以前に30％酸素（1.5 L /分）と混合し、3％イソフルランを使用して導入室7に報告されているようにストロークするEA異なるマウス。手術後の痛みを和らげるために、メロキシカム（5ミリグラム/ kg）を皮下に注入します。筋肉の緊張を観察し、つま先のピンチの反射が存在しないことを確認することで、麻酔の十分な深さを確認してください。
- 麻酔中の乾燥を防ぐために、それぞれの目に獣医の軟膏の少量を適用します。無菌技術および滅菌ガウン/マスク/手袋/楽器を使用して、次の外科的処置を実行します。中、および手術後、前に70％アルコールで手術領域を清掃し、消毒することにより無菌状態を維持します。
- 手術台にマウスを移動します。腹臥位に滅菌ドレープで動物を置き、吸入マスクと2％イソフルランを用いて麻酔下でそれを維持します。その後、直腸温度計からのフィードバックを恒温ブランケットを使用して、36.5℃の体温をクランプします。
- surgi後ベタジンおよび70％アルコールで準備をCAL、左耳と目の間の頭皮にメスを用いて、1センチメートル縦切開を行います。 （左1mmからブレグマから4以下mm）の露出したまま一時的な骨の表面にレーザードップラー流量計の光ファイバの先端部を接着。そして、ドップラーフローモニタリング（ 図2A）を起動します。
- 動物を下にして置きます。ピンに接続文字列を使用して上の前歯を引っ張って首をまっすぐに伸ばし、首のエリアを剃ります。そして、それは広げ、3センチメートル垂直正中切開を行い、周囲の血管軟組織を切開することにより、左頸動脈球領域を露出させます。迷走神経を傷つけないように注意してください。
- 滅菌6-0黒絹縫合糸を用いて、近位左総頚動脈（CCA）を連結し、左ICAおよび滅菌7-0黒絹縫合糸を使用して、左翼口蓋動脈（PPA）を連結します。
- 左外頸動脈USIの枝である左の上甲状腺動脈を、焼灼ngの単極電気焼灼し、左の近位外頚動脈（ECA）緩く、しっかりと滅菌7-0黒絹縫合糸を使用して、より遠位部位を連結します。
- マイクロはさみを使用して、ECAのライゲーション部位の間に小さな穴（約0.2〜0.25μmの直径）を作ります。
- 近位ECAライゲーションを緩めながら、ECAの穴に血栓を含むカテーテルを挿入します。所定の位置にカテーテルを締め付けるために、CCAにカテーテルを進めた後、再び近位ECAライゲーションを締めます。
- 遠位の連結部位の遠位にあるECA先端部を、カットする焼灼、およびCCAからカテーテルを引き抜くながら、ICAの方向に整列させる自由近位ECAを時計回りに回転させます。すぐにICAライゲーションを緩めた後、遠位ICAのACAの分岐部 - 次に、MCAに9ミリメートル程度のカテーテルを進めます。その後、ICAライゲーションを締めます。
- 優しくによって分岐領域に血栓を置きます血栓を注入する注射器1ミリリットルを押します。血栓が正常容器（ 図2B）を閉塞した場合、ベースラインと比較して30％以下とすることによって低下されるべきであるドップラー脳血流量（CBF）の減少を確認してください。
- カテーテルを外し、すぐにしっかりとECAの近位のサイトを連結。また、CCAおよびPPAをunligate。
- 6-0絹縫合糸を用いて切開部位を閉じます。 （ここでは、血栓注入後30分）所要時間スパンでドップラーモニタリングを継続した後、麻酔を停止します。空のケージにマウスを返し、加熱ランプでそれを暖かく保ちます。それは胸骨横臥位を維持するのに十分な意識を獲得するまで、マウス無人のまま放置しないでください。
脳血栓のin vivoマイクロCTイメージング3.（図3）
- 開始後、予め指定された時間点（ここでは、1時間）で、工程2.1に記載のように2％イソフルランでマウスを再麻酔脳動脈内の血栓の配置に起因する塞栓性脳卒中の。つま先ピンチ反射が存在しないことを確認することで、麻酔の十分な深さを確認してください。麻酔中の乾燥を防ぐために、それぞれの目に獣医の軟膏の少量を適用します。
- 10 mMのPBS中に10mgのAu / mlの濃度でフィブリン標的金ナノ粒子（FIB-GC-AuNP 4）に再懸濁し、ナノ粒子の溶解及び分散を確実にするために30分間血栓造影剤を超音波処理します。 300μlのFIB-GC-AuNP（10 mg / mlで）陰茎静脈に注入します。
- マイクロCTマシンのベッドの上に動物を配置し、モーションアーチファクトを低減するために、ピンに接続されている文字列を使用して上の前歯を引いて、首をまっすぐに。
- FIB-GC-AuNPの注射後5分で、脳のマイクロCT画像を取得し始めます。ここで説明する実験のために、次の撮像パラメータを使用：65のkVp、60μA、ビューの26.7 X 26.7 X 27.9ミリメートル3フィールドを、0.053のx 0.053のx 0.054ミリメートル3ボクセルサイズ、フレームあたり100ミリ秒、1平均、360ビュー、512×512の再構成マトリクス、600スライス、64秒スキャン時間。
- 空のケージにマウスを返し、加熱ランプでそれを暖かく保ちます。それは胸骨横臥位を維持するのに十分な意識を獲得するまで、マウス無人のまま放置しないでください。
- マイクロCTスキャナにインストールされたソフトウェア・パッケージの「 復興 」パネルの「 スタート 」コマンドを使用して、医学（DICOM）フォーマットでデジタル画像と通信に生画像データを変換します。
- （ステップ6）画像の定量分析のために、製造業者の説明書に従って市販のソフトウェアパッケージを使用して、TIFF形式にDICOMデータを変換します。
- 定性的には同様に、定量的には、より簡単で迅速な方法で分析するように分析のための新しいセットを生成するためのDICOM形式でソフトウェア・パッケージと元の0.054ミリメートルの厚さの画像を使用します次のように、1または2ミリ（ここでは2 mm）の厚さを有するようにレンダリングされた軸方向及びコロナル像。
- 「 データソース 」ツリーにDICOMフォルダを選択し、マウスの右ボタンをクリックして、「MasterDB 'または' PrivateDB」にフォルダをインポートします。
- 「データソース」ツリー内の「MasterDB 'または' PrivateDB」をクリックして、インポートされたフォルダを選択します。 「読み込み中のオプション]ウィンドウがポップアップしたときに一番左のパネルに「3D」タブをクリックした後、押して「OK」は 、スタックのようにフォルダ内の画像のシーケンスをインポートします。
- 軸方向およびコロナル画像ウィンドウ内の単語「MRP」をクリックし、ポップアップメニューの「MIP」を選択することで、最大値投影（MIP）形式に画像表現を変更します。同じウィンドウで：次に、「0 [mm]でTH」をクリックした後に2ミリメートルに画像の厚さを変更します。
- NAを2mmの幅3Dを使用して画像スタックを探索し、適切な角度と位置でそれをスライスすることが可能vigatorバーは、血栓を保有ウィリス（COW）の円を完全にカバーして厚さ2mmの軸方向の断面像を準備します。 「 出力 」パネルのキャプチャボタン（カメラアイコン）をクリックします。 TIFF形式の画像を保存します。
- その後、小脳に前頭葉から連続的にカバーする5 2mm厚の冠状断面の画像を用意。
- ACAの血栓 - まず、コロナル画像は最高のMCAを視覚化することができるように慎重にアキシャル画像上のナビゲーションバーを整列させることにより、第2のスライスを準備します。
- 次に、連続的な方法で、他の4つのスライスを準備します。 「 出力 」パネルのキャプチャボタン（カメラアイコン）をクリックします。 TIFF形式で画像を保存します。
4.血栓溶解や脳血栓のin vivoマイクロCTイメージングでは （図3）
- 100センチメートル長いPE-1を準備します一方の端に30ゲージの針ともう一方の端に1mlシリンジ0チューブ。気泡を回避しながら、生理食塩水（600μL）またはtPAの（ここでは、24ミリグラム/キログラム、600μL）のいずれかでチューブを埋めます。
- ステップ2.1で説明したように、マウスを再度麻酔。動物の陰茎静脈内針の先端を挿入します。マイクロCT機のベッドの上に慎重に動物を置きます。その後、ベッドにそれをテーピングすることにより、カテーテルシステムの静脈内注射の部分を固定化し、安定させます。
- 治療前のベースラインとしてのフォローアップイメージングセッションを行います。その後、カテーテルシステムにシリンジプランジャーを押し下げることによって60μlの通常の生理食塩水またはtPAのいずれかを注入します。ボーラス注射の後、時間（ここでは、30分）かけて残りの溶液（540μl）を注入し始めます。
- 予め指定された時点で、ステップ3.4の場合と同じパラメータを使用してマイクロCT画像を得る：ここで、ボーラス注射後の3および24時間で。次のex vivoで NIRF thromを実行するには脳のバスイメージングは、頸椎脱臼により麻酔下で動物を安楽死させます。
5. 生体外 NIRF血栓イメージングと脳組織のトリフェニルテトラゾリウムクロリド（TTC）染色（図4）
- 断頭後、頭皮を削除し、最大矢状縫合に向けて大後頭孔からハサミで頭蓋骨を切断。このようにして半球を産ん敷設、慎重に基礎となる脳に損傷を回避しながらハサミを使用して切開頭蓋骨の縁を上昇させることにより頭蓋を削除します。
- 彼らはNIRFイメージングで可視化されるべきであるウィリス動脈の円と重なる可能性があるため、脳表面にできるだけ近い脳ベースで視神経を切り取ります。そして、明らかにNIRF血栓イメージングのためにY字型」MCA / ACA /遠位ICA」を可視化するためにそっと目を公開する小脳ベースを圧縮した後、可能な限り脳表面に対して遠位ICASを切り出します電子切断点（ 図4A）。
- NIRFイメージング（励起/発光675 / 690nmで、1秒露出）を実行し、そのベースがCOWの動脈に蛍光標識された血栓塞栓を可視化する（ 図4B、C）を 、上向きと削除脳組織のを（ 図4D） 。その後、皮質血栓塞栓を可視化上向き脳の頂点に追加撮影を行います。組織に生理食塩水を数滴入れて脳の乾燥を避けてください。
- 製造元の指示に従って脳マトリックスデバイスを使用して、すぐに冠状に2mm厚の脳スライスを準備：2ミリメートルの厚さにスライス（ブレグマから2.3、0.3、-1.7、-3.7、-5.7ミリメートル）の6個を。生理食塩水を点眼使用して脳切片の乾燥を避け、およびセクションの前面と背面の両方のNIRFイメージングを行います。
- ガーゼへの暴露を回避しながら、20分間、2％トリフェニルテトラゾリウムクロライド（TTC）溶液に脳切片を置きますトン。光への暴露を回避しながら、4℃で4％のホルムアルデヒド溶液にスライスを移動します。
マイクロCT画像とImageJの（1.49d）ソフトウェアを使用した6.定量血栓エリア（図5）
- オープン画像（ 図5A）。
- 開いている画像シーケンスファイルは、「 ファイル>インポート>イメージシーケンス 」または「 ファイル>開く」を選択することで、スタックファイルを作成します。画像は「 イメージ>タイプ> 8ビット 'を使用して、8ビットグレースケールに変換します。
- インチからミリへの単位を変換する（ 図5A）。
- CT画像ファイルの1画素が0.053ミリメートルに対応する場合、使用入力する'>設定スケールを分析' '1'、 '0.053'、および' ピクセル単位の距離 」の「ミリメートル」、「 既知の距離 」、および長さの 「 単位を '、それぞれ。
- とき（のみ）スケールバーが利用可能です、「直線」ツールを使用すると、スケールバーと同等の、その長さの線を引きます。そして、ミリメートルでスケールバーの長さを入力する'>設定スケールを分析 'を使用します。
- 背景差分（ 図5B）
- 使用することにより血栓または骨関連hyperdense領域なしで脳実質の領域に関心の円形または矩形領域（ROI）の場所を「 編集>選択>を指定してください」。指定されたROIは、スタックのすべてのスライスに適用されるので、それは各スライスでhyperdense領域と重なっていない場合かどうかを確認してください。
- 「プラグイン> ROI> ROIからのBGの減算」を選択し、「平均値からの標準偏差の数」のため2.0と入力します。
- 血栓塞栓関連Hyperdense病変のセグメンテーション（ 図5C）
- '>しきい値イメージ>調整」を選択し、とLo'の値を入力します。WERの閾値レベル 'と'は、それぞれ22および255、などの上限スレッショルド・レベル」。緑の上側閾値を超えるグレースケールで青、閾値処理をピクセル単位で下限しきい値以下のピクセル、およびピクセルを表示するには、「オーバー/下」を選択します。
- 骨領域を含むことなく、血栓塞栓関連hyperdense病変を囲むのROIを描画する「フリーハンド選択ツール」を使用してください。描画時には、追加またはそれぞれ、領域を除去するために、[SHIFT]または[ALT]のいずれかを押し続けます。
注：hyperdense血栓塞栓症の病変ではなく、「フリーハンド選択ツール」で、骨構造から離れている場合は、「ワンドツールは、「安全に」許容」レベルを変更することなく使用することができます。
- セグメント化された病変の定量化（ 図5D）
- 選択する「エリア''>の設定測定を分析'を使用し 、「平均グレー値」、および「統合密度（エリアXの平均）9 ;. 「しきい値の制限」と「表示ラベル」：次のオプションを確認してください。定量化されたデータを取得するために'>メジャーを分析'を使用します。そして、「.XLS」ファイルとして結果を保存します。
- TIFF形式のスタックファイルを保存します。また、関心領域を保存するには、「 分析>ツール> ROIマネージャ」を使用します。
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Representative Results
遠位内頸動脈（ 図6のACAの分岐部-塞栓性脳卒中後1時間でFIB-GC-AuNP（10 mg / mlで、300μl）を投与した後、in vivoで得られたベースラインマイクロCT画像は、明らかにMCAに脳血栓を可視化）。フォローアップマイクロCTイメージングは、生理食塩水処理した牛の血栓の変化を示しませんでした。しかし、tPAを用いた治療は、COWの血栓（ 図6中の青矢印）の漸進的な溶解を示しました。この知見は、マイクロCT血栓イメージングは血栓溶解の治療モニタリングを可能にすることができることを実証しています。 24時間での残留血栓塞栓のためのin vivoでの CT密度およびex vivo NIRF間の優れた対応があります。内因性血栓マーキングきれいに起因するNIRF信号領域と共局在したフィブリン - ターゲティングAuNPsによってへのhyperdenseのマイクロCTエリア注外因性血栓マーキング、EMBO前に行われました予め形成された血餅（ 図6）の成熟の過程における凝固因子第XIIIa媒介フィブリン架橋活性に対して敏感Cy5.5の蛍光プローブを用いて、LICストローク。 TTC染色によって測定されるようにtPAを媒介血栓溶解効果を実証するために、直接血栓イメージングを組み合わせた技術は、組織学的ストローク成果を反映しています。 TTC染色はのtPAの血栓溶解を受ける動物のための虚血性脳損傷の量の明らかな減少（ 図6の白っぽい領域）を示しました。
図1：共有結合フィブリンによって血栓のフィブリン鎖にリンクされている蛍光標識血餅の調製の概要 （A）のCy5.5近赤外線蛍光で新鮮な全血の混合（NIRF）プローブ（C15）活性化されたcoaguの酵素作用を-crosslinking血餅成熟する過程レーションの第XIIIa因子。混合した血液は、ポリエチレン（PE）-50管に注入し、血栓形成および成熟を可能にするために24時間放置します。 （B）NIRFイメージングC15プローブと血栓の光学ラベル付けを確認します。 PE管から削除された血栓を洗浄した後、永続的な蛍光を注意してください。マウスでは内頸動脈の前大脳動脈の分岐部-テーパ状の端部中大脳動脈における血栓塞栓症のための（直径200μm）を有するように修正されたPE-50チューブを有する（C）血栓-ロードPE-10チューブ。スケールバー：2ミリメートル、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：のthroのマウスモデルのモデル化の概要mboembolic脳梗塞（A）左側頭骨表面に接着レーザードップラー流量計の光ファイバの遠位端と、中大脳動脈（MCA）の閉塞の前および後の脳血流（CBF）のレーザードップラーモニタリング、 （左1ミリメートルとブレグマから以下の4ミリメートル）。ベースラインと比較して30％以下とすることによって低下されるべきであるドップラーCBFの閉塞後減少し、注意してください。 （B）外頸動脈（ECA）の穴に血栓を含むカテーテル（ 図1C中、すなわち、遠位テーパー状ポリエチレン-50チューブ）の挿入は、MCAへのカテーテルを約9mmを前進させることによって（最終的に）続きます - 遠位の内頚動脈（ICA）の大脳動脈（ACA）分岐領域を前方。 CCA、総頸動脈。 PPA、翼口蓋動脈。 ご覧になるにはこちらをクリックしてください。この図の拡大版。
図3：フィブリン標的グリコールキトサン金ナノ粒子の脳血栓塞栓を視覚化し、組織プラスミノーゲンアクチベーター（tPA）を監視するためのフィブリン標的金ナノ粒子を用いたin vivoミクロベースの直接血栓イメージングの概要は、血栓溶解作用を媒介 （A）静脈内注射血栓塞栓性脳卒中のマウスにおける（FIB-GC-AuNPs）。 （B）マウスは、マイクロCT撮像のベッド上に置かれます。 FIB-GC-AuNPsの注射後5分でマイクロCT画像を取得する（C）。マイクロCTスキャナにインストールされたソフトウェアパッケージを使用して医療におけるデジタル画像と通信（DICOM）フォーマットに生画像データを変換する（D）画像再構成。 （E）画像分析および軸/ Cの製造oronal画像は、最大強度の投影モードを使用して、2mmの厚さを有するようにレンダリングされました。マイクロCTベースの直接血栓イメージング法（C - E）を使用して監視および分析することができる（F）静脈内tPAを媒介血栓溶解、。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4：脳血栓塞栓のex vivo近赤外蛍光（NIRF）イメージングの概要 （AとB）血栓塞栓脳卒中マウスから除去された代表脳組織。中大脳動脈（MCA）で血栓塞栓（赤矢印）を紛失しないよう予防措置を講じ - 遠位内頸動脈の前大脳動脈（ACA）分岐部（ICA、青い矢印）は、脳を取り除きます。 （CとD）ex vivoでのNIRF血栓イメージング。 ACAの分岐-脳組織は、血栓の可視化のためのNIRFイメージャ（C）（Dの赤い矢印）MCAの塞栓閉塞前のCy5.5蛍光マーカーC15で予め標識の光を通さない容器の内部に配置されていますエリア。 CTの外観については、 図5を比較してください。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図5：マイクロCT画像を用いて定量化血栓ボリュームの概要はImageJ（1.49d）（A）、新しいスタックファイルに画像をインポートする8ビットグレースケールにファイル形式を変換し、にユニットを変更します。ミリメートル。 （B）背景減算。 （C）骨構造を排除しながらhyperdense領域の周りに関心領域（ROI）を描画することにより、血栓塞栓性病変のセグメンテーション。 '>分析 測定を」メニューを使用して、ROIのための定量的なデータを取得する（D）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図6：代表ダイレクト脳血栓イメージングデータ買収前と組織プラスミノーゲンアクチベーター（tPA） 対生理食塩水撫でたマウスを治療した後、（A）マイクロCT（MCT）、血栓のイメージング組織プラスミノーゲンアクチベーター（tPA）の治療モニタリングは、血栓溶解を媒介できるようにします。 （Bと
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Discussion
我々は、塞栓性脳卒中の実験モデルにおいて直接血栓イメージングのための2つの相補的な分子イメージング技術の使用を実証：in vivoでのマイクロCTベースの撮像のためのフィブリン標的金ナノ粒子（FIB-GC-AuNP）を、および活性化XIII因子は、 元のための光学イメージングプローブを標的蛍光イメージングを生体内 。
FIB-GC-AuNPsの静脈内投与後、血栓は濃度gradient-後（粒子の表面上の）フィブリン標的化ペプチドの作用によって血栓中に取り込まれつつ粒子による、緻密な構造としてCTに見えるようになりました多孔質構造に依存拡散、 すなわち、血栓。このプロセスは、一方向にのみ起こるように見え、そして急速に血液中のナノ粒子の比較的低濃度の血餅で濃縮させ、検出を可能にするのに十分のCT密度を変化させます。 24時間で、最終的なin vivoでのマイクロCTイメージング素敵な蛍光大脳動脈内に配置される前に活性化XIII因子のフィブリン架橋活性を認識する光プローブで標識されていた初期の血栓の後のtPA残油を示す、ex vivoでの脳の死後のNIRFイメージングと相関しました。異なる作用機序と異なる撮像モダリティ、各レポートおよびその他のクロス確認する調査結果を使用して、このようにして、2分子イメージングプローブ、。
血栓の発生は、同じ方法を用いて追跡することができます。具体的には、TPAでの血栓溶解療法は、血栓溶解の成功の迅速かつタイムリーな読み出しがCTにより行うことができるように、in vivoで追跡することができました。これは、臨床的血栓溶解のために重大な意味を有しており、また、新しい抗血栓、または血栓溶解療法の開発のための研究の用途を有します。
以前は、私たちのグループは、脳卒中治療でrは一般的な合併症を検出することができました電子血栓症3は、多くの場合、その後の再閉塞および悪化の結果で、部分的に処理された凝血塊の周りに起こります。再血栓症は、同じ動物で異なる時間に4つの異なる場所（左遠位CCA、近位左CCA、右遠位CCAし、右近位CCA）に1ミリメートルのFeCl 3 -soaked濾紙（グレード42）を順次適用することによってモデル化しました。全ての場合において、FIB-GC-AuNP循環する血栓に蓄積実証し、そしてCTの撮像これらの可視レンダリング。この効果のこの期間は、現在不明であるFIB-GC-AuNPの生物学的半減期に限定しているようだ、とfib-の最初の注射の後に延長された時間（最大3週間）のために観察されていますGC-AuNP。ナノ物質の単回投与は、臨床治療計画の成功と失敗の両方を観察するために有効な証明するかもしれないので、これは、臨床的に非常に興味深いです。さらなる研究は、薬物動態およびbiodistriを評価するために必要とされますFIB-GC-AuNPの献。
FIB-GC-AuNPsの化学合成は、以前に詳細4に記載されています。簡潔には、EP-2104R、磁気共鳴イメージング（MRI）剤8で使用されるフィブリン標的化ペプチドは、（チロシン、D-グルタミン、システイン、ヒドロキシプロリン-L-3-chlorotyrosine -グリシン-ロイシン-システイン-チロシン-イソロイシン-グルタミン）であります標準的な固相のFmocペプチド化学によって合成し、1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドおよびN-ヒドロキシスクシンイミドを用いたGC-コーティングさAuNPsの表面にコンジュゲート。 FIB-GC-AuNPs精製し、最終生成物は、遠心分離によって収集されます。
予め形成された血栓の光学的標識のためのC15 NIRFプローブは、活性化XIII因子によって認識され、Cy5.5の蛍光色素で9,10リジン残基のεアミノ基に標識された15アミノ酸ペプチドです。光造影剤は、共有結合法の酵素作用により、血栓のフィブリン鎖に連結されていますこれは血餅成熟11,12の処理中にフィブリン鎖を架橋するとき、凝固因子をivated。 C15 NIRF血栓マーカーの化学合成は、以前に詳細4に記載されています。簡単に言えば、ALPH-2抗プラスミンのN末端に基づいて活性化XIII因子の親和性ペプチドは、（グリシン - アスパラギン - アラニン - グルタミン酸 - グルタミン - バリン - セリン - プロリン - ロイシン - スレオニン - ロイシン - ロイシン - リジン - トリプトファン）固体によって合成されますシステイン側鎖を介してのCy5.5蛍光色素で標識し、その後α相ペプチド合成および。高速液体クロマトグラフィーを使用して、生成物を精製し、最終化合物を回収します。
NIRFと金ナノ粒子エージェントの両方の成功は、これらの薬剤の強力な生物学的な設計上の特徴の可能性が高いです。活性化XIII因子11は、基本的に重要トロンビン活性化四量体のトランスグルタミナーゼ、線維素溶解耐性を仲介凝固酵素です。このの活動酵素は、新たに形成された血栓の顕著な特徴とみなされています。どちらも私たちのエージェントは、この基本的な血液凝固（活性化XIII因子感知C15光学エージェントによる）酵素または（フィブリン - ターゲティングFIB-GC-AuNP CTエージェントによって）その基質と強く相互作用します。
共局在の研究は、ex vivo蛍光（外因性血栓マーカー）と期待されているフィブリン結合ナノ粒子で撮像された脳の血栓のためのin vivoでのマイクロCT-密度（内因性血栓マーカー）との間に良好な対応があるため、相互の、あったことを示しましたエージェントの両方に関連する生物学的捕捉メカニズム。
デュアルモーダル直接血栓イメージング技術を使用する際に考慮すべき点がいくつかあります。まず、集計からFIB-GC-AuNPsを防止し、生体適合性を達成するために、グリコールキトサンは、表面コーティング13のために使用されます。しかしながら、静脈内注射前に、血栓造影剤はresuspenされるべきですPBSでDED、およびナノ粒子の溶解、分散を確実にするために超音波処理しました。さらに、ナノ粒子の安定性は、約519 nmであるべきである両方ともFIB-GC-AuNPsの新鮮対古いストック、表面プラズモン共鳴ピークを比較するために紫外 - 可視（UV-Vis）で吸収分光法を用いて評価することができます。
例えば600〜1,200のスライスから「 スキャン番号」を増加させるか、1から3の「 平均」を増加させるように、しかし、完了するのに必要な時間を増加させるであろう。第二に、マイクロCT血栓画像の解像度は、走査パラメータを変更することによって改善することができますスキャン。
本研究における血栓の蛍光標識のための3 5：第三に、血液およびC15 NIRFイメージング剤は、7の割合で混合しました。比較的高い血液量は、血栓の検出を減らすことができるのに対し、我々の経験によれば、比較的低い血液量は、血栓形成を妨げる可能性が血栓から放出ex vivoでの蛍光信号の減衰に起因します。また、いくつかの異なるアプローチが血栓14の様々な構成要素の蛍光可視化するために使用することができることは注目に値します。
第四に、ターゲット動脈のみが部分的に閉塞されFeCl 3を媒介その場で血栓モデルと比較して、完全に血管を閉塞脳血栓塞栓のマイクロCTの可視化は、FIB-GC-AuNPs 4の比較的高用量を必要とします。金コロイドは、生体適合性であるとみなされ、FIB-GC-AuNPsは、以前の研究4の顕著な神経行動学的/全身毒性を示さなかったが、このように、毒性の懸念がある可能性があります。
第五に、臨床試験は、血小板は、標的またはフィブリン標的化ガドリニウム（Gdの）ベースのMRI剤は、心臓室、頸動脈内血栓のhyperintensityを高めることができ、および大動脈弓ことが示されました T1強調画像15に。 MRIは、優れた軟組織コントラスト及び高い空間分解能を有するが、MRIは、時間のかかる試験です。 CTは、比較的低い軟組織コントラストに苦しんでいる、しかし、CTスキャンを迅速に行うことができます。したがって、CTはストローク16の急性期管理で最も広く使用されている撮像技術のまま。さらに、小動物イメージングのためのマイクロCTシステムがインストールされているアーキテクチャの放射線遮蔽を必要とし、高解像度の画像を提供しません。このように、ex vivoで反射蛍光イメージングでまたはin vivo蛍光トモグラフィー17 で組み合わせマイクロCTは、小動物の研究のために非常に有用です。また、金-Feは18-20ナノ粒子使用してMRI / CTデュアルモーダルイメージングは、動物およびヒトの両方における血栓イメージングのための強力なプラットフォームであってもよいです。 MRI及びCTは、相互に補完でき、光学画像化とは異なり、それらは低い組織浸透の問題に悩まされません。
直接血栓可視化のための結論を合わせ、CTおよび蛍光イメージングでは、コンテンツは ">血栓の検出、治療のモニタリング、および治療を複雑に再血栓症の検出を改善することを約束、虚血性脳卒中の調査のための強力な研究ツールです。また、これらの技術の臨床応用のための重要な可能性があります。Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
DE.K.、JY.K、CH.A、およびKKは、フィブリン標的金ナノ粒子（10-1474063-0000、特許庁）の特許権者です。残りの著者らは、開示することは何もありません。
Acknowledgments
この作品は、韓国医療技術のR＆Dプロジェクト、厚生省（HI12C1847、HI12C0066）、バイオ・医療技術開発プログラム（2010から0019862）およびグローバル・リサーチ・ラボ（GRL）プログラム（NRF-2015K1A1A2028228）によってサポートされていました韓国政府によって資金を供給国立研究財団、。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Machines | |||
| microCT | NanoFocusRay, JeonJu, Korea | NFR Polaris-G90 | |
| NIRF imaging system | Roper-scientific,Tucson, AZ | coolsnap-Ez | |
| Laser Doppler flowmeter | Perimed, Stockholm, Sweden | PeriFlux System 5000 | |
| Surgical microscope | Leica Microsystems, Seoul, Korea | EZ4HD | |
| Inhalation anesthesia machine | PerkinElmer, Massachusetts, USA | XGI-8 | |
| Software | |||
| NFR control | NanoFocusRay, JeonJu, Korea | NFR Polaris-G90 | microCT control software |
| Lucion | Infinitt, Seoul, Korea | Lucion | 3D render imaging software |
| Lab chart 7 | ADInstruments, Colorado, USA | Lab chart 7 | rCBF |
| ImageJ software | Wanye Rasband, NIH, USA | 1.49d | imaging analysis |
| Devices/Instruments | |||
| Infusion pump | Harvard, Massachusetts, USA | pump 22(55-2226) | |
| Homeothermic blanket | Panlab, Barcelona, Spain | HB101 | |
| Pocket cautery | Daejong, Seoul, Korea | DJE-39 | |
| Brain matrice | Ted pella, CA, USA | 15003 | coronal section |
| PE-50 tubing | Natsume, Tokyo, Japan | SP-45(PE-50) | I.D. 0.58 mm O.D. 0.96 mm |
| PE-10 tubing | Natsume, Tokyo, Japan | SP-10(PE-10) | I.D. 0.28 mm O.D. 0.61 mm |
| 30 gauge needle | sungshim-medical, Seoul, Korea | ||
| Syringe | CPL-medical, Ansan, Korea | 1 & 3 cc | |
| Gauze | Panamedic, Cheonan, Korea | ||
| Tape | Scotch, Seoul, Korea | 3M-810 | |
| Micro forceps | Fine Science Tools, Vancouver, Canada | 11253-27 | Dumont #L5 |
| Micro scissor | Fine Science Tools, Vancouver, Canada | 15000-03 | Vannas spring |
| Scissor | Fine Science Tools, Vancouver, Canada | 14084-08 | 8.5 cm |
| Black silk suture | Ailee, Busan, Korea | SK6071, SK728 | 6-0 and 7-0 |
| Reagents | |||
| meloxicam | Yuhan, Seoul, Korea | ||
| vet ointment | Novartis, Basel, Swiss | ||
| 10% Povidone-iodine (betadine) | Firson, Cheon-an, Korea | ||
| FeCl3 | Sigma, Missouri, United States | 157740-5G | |
| TTC | Amresco, Ohio, USA | 0765-100g | |
| Isoflurane | Hana-Pham, Gyeonggi, Korea | Ifran | 100 ml |
| PBS | Welgene, Daegu, Korea | LB001-02 | 500 ml |
| Gold nanoparticles | Synthesis | ||
| C15 optical agent | Synthesis | ||
| Tissue plasminogen activator | Boehringer Ingelheim, Biberach, Germany | rtPA(actilyse) | 20 mg |
| Normal saline | Daihan Pham, Seoul, Korea | 48N3AF3 | 20 ml |
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