Summary
Detta protokoll beskriver tillämpningen av kombinerade nära infraröda fluorescerande (NIRF) avbildning och mikro datortomografi (microCT) för visualisering cerebral tromboemboli. Denna teknik medger kvantifiering av trombbördan och evolution. Den NIRF avbildningsteknik visualiserar fluorescensmärkt tromb i utskuren hjärnan, medan microCT tekniken visualiserar trombos inuti levande djur med hjälp av guldnanopartiklar.
Abstract
Direkt trombosavbildande visualiserar den grundläggande orsaken till tromboembolisk infarkt. Att kunna bild tromb direkt tillåter mycket bättre undersökning av stroke än att förlita sig på indirekta mätningar, och kommer att vara en potent och robust vaskulär forskningsverktyg. Vi använder en optisk avbildningsteknik som märker tromber med en molekylär avbildning tromb markör - en Cy5.5 nära infraröda fluorescerande (NIRF) prob som är kovalent bunden till de fibrinsträngarna av tromben av fibrin-tvärbindande enzymatiska verkan av aktiverad koagulationsfaktor Xllla under processen för koagel mognad. En mikro-datortomografi (microCT) -baserade tillvägagångssätt använder tromb söker guldnanopartiklar (AuNPs) funktionaliserade för att rikta den största delen av proppen: fibrin. Detta dokument beskriver ett detaljerat protokoll för den kombinerade in vivo microCT och ex vivo NIRF avbildning av tromboemboli i en musmodell av emboli stroke. Vi visar att in vivo </ em> microCT och fibrin inriktade glykol kitosan AuNPs (FIB-GC-AuNPs) kan användas för att visualisera både in situ tromber och cerebral embolisk tromber. Vi beskriver även användningen av in vivo microCT baserade direkttrombosavbildande för att seriellt övervaka de terapeutiska effekterna av vävnads-plasminogenaktivator-medierad trombolys. Efter den sista avbildning session, visar vi genom ex vivo NIRF avbildning omfattningen och fördelningen av rest tromboemboli i hjärnan. Slutligen beskriver vi kvantitativ bild analyser av microCT och NIRF bilddata. Den kombinerade tekniken direkt trombosavbildande gör två oberoende metoder för tromb visualisering att jämföra: området trombrelaterade fluorescerande signal på ex vivo NIRF imaging kontra volym hyperdense microCT tromber in vivo.
Introduction
En av 6 personer kommer att ha en stroke någon gång under sin livstid. Ischemisk stroke är den i särklass vanligaste stroke typ, och svarar för cirka 80 procent av alla strokefall. Eftersom tromboemboli orsakar majoriteten av dessa ischemisk stroke, det finns ett ökande intresse för direkt trombosavbildande.
Det uppskattas att cirka 2 miljoner hjärnceller dör under varje minut av Middle Cerebral artärocklusion en, vilket leder till parollen "Time is Brain". Datortomografi (CT) studier kan göras snabbt, och är allmänt tillgängliga; av denna anledning förblir CT avbildning av valet för den inledande diagnos och behandling av hyperakut ischemisk stroke. CT är särskilt värdefullt för att informera de kritiska tidiga beslut: administrera vävnadsplasminogenaktivator (tPA) för trombolys och / eller triaging till endovaskulär koagulera-hämtning två. Nuvarande CT-baserad trombosavbildande kan emellertid inte i serie spåra cerebral tromboemboli in vivo, eftersom den använder indirekta metoder för att demonstrera tromber: efter kontrast blodet poolen av joderade kontrastmedel är tromb demonstreras som fyller defekter i kärlen. Det finns dosgränser och risker som är förknippade med upprepad administrering av joderade kontrastmedel, som förhindrar upprepade avbildning av tromber på detta sätt.
Det finns således ett kritiskt behov av en direkt avbildning metodik för cerebral tromber hos strokepatienter, att möjliggöra bättre behandlingsbeslut snabbare och göras. Vi föreslår att åstadkomma detta genom att öka värdet på CT, det för närvarande använda frontlinjen avbildningsmodalitet för stroke, med användning av en tromb sökande nanopartikulära molekylär avbildningsmedel.
Vi har visat att användningen av detta medel med hjälp av mikro-datortomografi (microCT), en hög upplösning ex vivo eller in vivo (litet djur) avbildning version av CT som tillåter snabb datainsamling <sup> 3,4. Även med den relativt dåliga mjukdels kontrast för små djur microCT (mycket värre än tillgängliga från humana stora skannrar), avbildningsmedlet kunde söka och markera tromber genom att göra dem hyperdense på CT, en "tät fartyg tecken" förstärks av molekylär avbildning.
Som komplement till CT-tekniken, har vår grupp tidigare utvecklat en optisk direkttrombbildteknik med hjälp Cy5.5 nära infraröda fluorescerande (NIRF) sond för att visualisera cerebral trombos börda 5. Detta är en ex vivo teknik på obduktions hjärnor, men är mycket känslig, och tjänar till att bekräfta in vivo-data i inställningen forskning.
Med både CT och NIRF baserad tromb söker avbildningstekniker tillåter oss att jämföra och kontrastera dessa tekniker för att uppnå mycket informativa uppgifter om rollen av blodproppar och tromber avbildning i processen för ischemisk stroke utveckling.
Here, beskriver vi ett detaljerat protokoll av en kombinerad teknik för in vivo microCT och ex vivo NIRF avbildning för att direkt visualisera tromboemboli i en musmodell av emboli stroke. Dessa enkla och robusta metoder är användbara för att öka vår förståelse av trombotiska sjukdomar genom att aktivera exakt in vivo bedömning av trombbördan / distribution och karakterisering av dynamisk tromb utveckling på ett snabbt och kvantitativt sätt in vivo under behandlingen, följt av ex vivo-data som tjänar som en kontroll och referensstandard för bekräftelsen av in vivo imaging fynd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök visat i detta protokoll har granskats och godkänts av Dongguk Universitets Ilsan Hospital Djurvård och användning kommittén och genomförs i enlighet med de principer och förfaranden som beskrivs i NIH Guide för skötsel och användning av djur.
1. Framställning av Exogent Bildas Clot märkt med fluorescens Marker (Figur 1)
- Söva en mus i en induktionskammare med 3% isofluran blandat med 30% syre (1,5 l / min 100% syre). Säkerställa tillräcklig anestesidjup genom att observera muskeltonus och bekräftar frånvaron av tå nypa reflex.
- Placera djuret på en steril duk i liggande ställning, och hålla den under anestesi med hjälp av en inandning mask och 2% isofluran blandat med 30% syre. Utför följande procedurer med hjälp av aseptisk teknik och sterila kappor / masker / handskar / instrument. Bibehålla sterila förhållanden genom rengöring och desinficering försöksområdet med 70% alkohol innan ennd efter förfarandena.
- Samla cirka 300 ~ 1000 l arteriellt blod efter hjärtpunktering 6. Blanda 70 pl helblod med 30 pl C15 sond 5 (20 mikromol / L koncentration), en Cy5.5 fluorescerande sond känslig för fibrin-tvärbindande aktivitet av aktiverad faktor XIII (FXIIIa) koagulering enzym, till fluorescerande markera koagel (Figur 1A ). Injicera blandat blod med hjälp av en 3 ml spruta (23 gauge) i en 20 cm lång polyetenrör (PE-50, ID 0,58 mm). PE slang måste steriliseras (eller bestyrkt sterila av tillverkaren) och blodproppar måste vara beredda aseptiskt i en vävnadsodling huva.
- Kontrollera djurets död genom att observera bristande andning och hjärtpuls.
- Lämna blod belastade rör vid rumstemperatur under 2 timmar och därefter vid 4 ° C under 22 timmar, och utför följande procedurer, som tidigare rapporterats 7.
- Skär trombinnehållande röret i 1,5 cm långa bitar. Med användning av en 3 ml spruta fylld med fosfatbuffrad saltlösning (PBS), utvisa tromb på en PBS-innehållande 6-brunnar genom att försiktigt injicera PBS i varje rörstycket. Tvätta tromboser tre gånger med PBS (Figur 1B).
- Ladda det distala ändpartiet av en 15 cm lång PE-10 rör (ID 0,28 mm) med en 1,5 cm lång tromb genom att försiktigt dra det tvättade tromben, samtidigt som man undviker luftbubblor, med användning av en saltlösningsfylld 1 ml spruta med en 30 gauge nål som sätts in i den proximala änden av röret.
- Anslut trombbelastade PE-10 rör med en 3 cm lång PE-50 rör (ID 0,58 mm) modifieras för att ha en avsmalnande ände (ID 200 nm), som kommer att placeras på mitten cerebral artär (MCA) - främre cerebral artär (ACA) bifurkation område av den inre halspulsådern (ICA) i en musmodell av emboli stroke (Figur 1C).
2. Modellering en musmodell av tromboembolisk stroke (Figur 2)
- Anesthetizea annan mus som ska strök som tidigare rapporterats 7 i en induktionskammare med 3% isofluran blandat med 30% syre (1,5 l / min). Injicera meloxikam (5 mg / kg) subkutant för att lindra postoperativ smärta. Säkerställa tillräcklig anestesidjup genom att observera muskeltonus och bekräftar frånvaron av tå nypa reflex.
- Applicera en liten mängd av veterinär salva till varje öga för att förhindra torrhet under narkos. Utför följande kirurgiska ingrepp med aseptisk teknik och sterila kappor / masker / handskar / instrument. Bibehålla sterila förhållanden genom rengöring och desinficering operationsområdet med 70% alkohol före, under och efter operationen.
- Flytta musen för att ett operationsbord. Placera djuret på en steril duk i liggande ställning, och hålla den under anestesi med hjälp av en inandning mask och 2% isofluran. Då, klämma kroppstemperaturen vid 36,5 ° C med användning av en homeothermic filt med återkoppling från en rektal termometer.
- efter Surgical prep med Betadine och 70% alkohol, gör en 1 cm vertikalt snitt genom en skalpell i hårbotten mellan vänster öra och öga. Limma den distala änden av den optiska fibern av en laser Doppler flödesmätare på den exponerade vänstra tinningbenet ytan (1 mm till vänster och 4 mm under från bregma). Starta sedan Doppler flödesövervakning (Figur 2A).
- Lägg ner djuret. Räta halsen genom att dra i den övre framtand med ett snöre fäst vid en tapp och raka halsområdet. Sedan gör en 3 cm vertikala mittlinjen snitt, sprida det öppna, och exponera den vänstra halspulsådern glödlampa område genom att dissekera peri-vaskulära mjuka vävnader. Var noga med att inte skada vagusnerven.
- Ligate vänster proximala gemensamma halspulsådern (CCA) med en steril 6-0 svart siden sutur, och ligera den vänstra ICA och den vänstra pterygopalatine artären (PPA) med sterila 7-0 svart siden suturer.
- Bränna den vänstra överlägsen sköldkörtel artär, som är en gren av den vänstra yttre halspulsådern USIng en monopolär elektrisk kauterisation, och ligera den vänstra proximala yttre halspulsådern (ECA) löst och mer distalt ställe ordentligt med sterila 7-0 svart siden suturer.
- Med hjälp av en mikro-sax, gör ett litet hål (ca 0,2 ~ 0,25 um diameter) mellan de ligerade platserna i ECA.
- Sätt i trombinnehållande kateter i hålet i ECA samtidigt lossa den proximala ECA ligering. Dra åt den proximala ECA ligering igen efter frammatning av katetern in i CCA för att cinch katetern på plats.
- Bränna att skära ECA distala delen, som är distal till den distala ligeringsstället, och rotera den fria proximala ECA medurs för att anpassa den till riktning mot ICA samtidigt dra tillbaka katetern från CCA. Sedan föra katetern ca 9 mm i MCA - ACA förgrening område av den distala ICA omedelbart efter att lossa ICA ligatur. Sedan dra åt ICA ligatur.
- Placera trombosen in bifurkationen området genom att försiktigttrycka på sprutan 1 ml för att injicera tromben. Kontrollera minskningen av Doppler cerebralt blodflöde (CBF), som skall sänkas med 30% eller lägre jämfört med baseline, om tromben framgångsrikt tilltäppt kärlet (Figur 2B).
- Ta bort katetern och ligera ECA proximala platsen omedelbart och tätt. Dessutom unligate CCA och PPA.
- Stäng snitt webbplatsen med 6-0 silke suturer. Stoppa anestesi efter att fortsätta Doppler övervakning under en önskad tidsperiod (här, för 30 minuter efter tromb injektion). Återgå musen i en tom bur, och hålla den varm med en värmelampa. Lämna inte musen utan uppsikt tills den har fått tillräcklig medvetenhet för att upprätthålla sternala VILA.
3. In vivo microCT avbildning av cerebral trombos (Figur 3)
- Re-söva musen med 2% isofluran som beskrivs i steg 2,1 vid en i förväg specificerad tid-punkten (här, en timme) efter debutenav emboli stroke på grund av placeringen av blodproppar i cerebral artär. Säkerställa tillräcklig djup anestesi genom att bekräfta frånvaron av tå nypa reflex. Applicera en liten mängd av veterinär salva till varje öga för att förhindra torrhet under narkos.
- Resuspendera fibrin inriktade guldnanopartiklar (fib-GC-AuNP 4) vid en koncentration av 10 mg Au / ml i 10 mM PBS, och sonikera trombbildåtergivningsmedel under 30 min för att säkerställa upplösning och dispersion av nanopartiklarna. Injicera 300 pl FIB-GC-AuNP (10 mg / ml) i penis ven.
- Placera djuret på sängen av en microCT maskin, och räta halsen genom att dra den övre framtand med ett snöre fäst vid en nål för att minska rörelseartefakter.
- Vid 5 min efter injektionen av fib-GC-AuNP, börjar att erhålla microCT bilder av hjärnan. För de experiment som beskrivs här, använd följande avbildningsparametrar: 65 KVP, 60 iA, 26,7 x 26,7 x 27,9 mm 3 synfält, 0,053 x 0,053 x 0,054 mm 3 voxelstorlek, 100 millisekunder per ram, en medelvärdes, 360 visningar, 512 x 512 rekonstruktion matris, 600 skivor, 64 sek söktiden.
- Återgå musen i en tom bur, och hålla den varm med en värmelampa. Lämna inte musen utan uppsikt tills den har fått tillräcklig medvetenhet för att upprätthålla sternala VILA.
- Omvandla råbilddata till digital bildbehandling och kommunikation i medicin (DICOM) format med hjälp av "Start" kommando av "Reconstruction" panel i ett programpaket installerat på microCT skannern.
- För kvantitativa analyser av bilderna (i steg 6), omvandla DICOM data till TIFF-format med hjälp av ett kommersiellt tillgängligt mjukvarupaket enligt tillverkarens anvisningar.
- För kvalitativa analyser samt kvantitativa analyser på ett enklare och snabbare sätt, använder programpaketet och de ursprungliga 0,054 mm tjocka bilder i DICOM-format för att generera en ny uppsättningaxiella och koronala bilder utförda att ha en eller två mm (här, 2 mm) tjocklek, på följande sätt.
- Välj DICOM mapp på "datakälla" träd, klicka på höger musknapp, och importera mappen till "MasterDB" eller "PrivateDB".
- Klicka på MasterDB "eller" PrivateDB "i" datakälla "träd, och välj den importerade mappen. När du har klickat på fliken "3D" på den vänstra panelen, när "Loading Options" fönstret dyker upp, tryck på "OK" för att importera en sekvens av bilder i mappen som en stapel.
- Ändra bildrepresentation till maximal intensitet projektion (MIP) format genom att klicka på ordet "MRP" i axiell och koronalt bildfönster och välja "MIP" på popupmenyn. Sedan ändra bildtjockleken till 2 mm efter att ha klickat "TH: 0 [mm]" i samma fönster.
- Använda 2 mm bredd 3D navigator bar som gör det möjligt att utforska en bildstapel och skära den med en lämplig vinkel och läge, förbereda en 2 mm tjock axialsektion bild med full täckning av kretsen av Willis (COW), som hyser tromber. Klicka på inspelningsknappen (kameraikon) på "Output" panel. Spara bilden i TIFF-format.
- Sedan förbereda fem 2 mm tjocka koronala avsnitt bilder som täcker intill varandra från frontalloben till lillhjärnan.
- Först förbereder den andra skiva genom att försiktigt rikta navigatören bar på axiella bilden så att den koronala bilden kan bäst visualisera MCA - ACA tromber.
- Därefter förbereda de övriga fyra skivor i ett angränsande sätt. Klicka på inspelningsknappen (kameraikon) på "Output" panel. Spara bilderna i TIFF-format.
4. Trombolys och in vivo microCT avbildning av cerebral trombos (Figur 3)
- Förbered en 100 cm lång PE-10 rör med en 30 gauge nål på en ände och en 1 ml spruta på den andra änden. Fyll röret med antingen saltlösning (600 | il) eller tPA (här, 24 mg / kg, 600 | j, l) och samtidigt undvika luftbubblor.
- Åter söva musen som har beskrivits i steg 2,1. För in nålspetsen inuti penilvenen av djuret. Placera djuret försiktigt på sängen av microCT maskinen. Då, immobilisera och stabilisera intravenöst injicerade del av katetersystemet genom att tejpa den till bädden.
- Gör en uppföljning avbildning session som före behandling. Sedan injicera antingen 60 pl normal koksaltlösning eller tPA genom att trycka på sprutkolven i katetersystemet. Efter bolusinjektion, börjar att infundera den kvarvarande lösningen (540 | il) under en tidsperiod (här, 30 min).
- Skaffa microCT bilder med samma parametrar som i steg 3,4 vid fördefinierade tidpunkter: här, på 3 och 24 timmar efter bolusinjektionen. För att utföra följande ex vivo NIRF Thrombuss avbildning av hjärnan, avliva djuret under anestesi genom cervikal dislokation.
5. Ex Vivo NIRF trombosavbildande och trifenyl-tetrazoliumklorid (TTC) Färgning av hjärnvävnad (Figur 4)
- Efter dekapitering, ta bort hårbotten och skär genom skallen med sax från foramen magnum upp mot sagittala suturen. Avlägsna skalle genom att försiktigt höja kanterna på snittade skallen med sax och samtidigt undvika skador på den underliggande hjärnan, alltså om bare halvkloten.
- Klipp ut synnerverna i hjärnan bas så nära som möjligt till hjärnans yta, eftersom de skulle kunna överlappa med kretsen av Willis artärer som ska visualiseras på NIRF avbildning. Sedan, för att tydligt visualisera Y-form "MCA / ACA / distal ICA" för NIRF trombosavbildande, klippa ut den distala ICAs så långt som möjligt till hjärnans yta efter försiktigt komprimera lillhjärnan bas för att exponera the skärpunkter (figur 4A).
- Utför NIRF imaging (excitation / emission, 675/690 nm, en sek exponering) av den borttagna hjärnvävnaden med sin bas pekar uppåt (figur 4B, C), som visualiserar den fluorescensmärkta tromboemboli i artärerna i COW (Figur 4D) . Sedan utföra ytterligare avbildning med spetsen i hjärnan pekar uppåt, som visualiserar kortikala tromboemboli. Undvika uttorkning av hjärnan genom att sätta några droppar saltlösning på vävnaden.
- Med hjälp av en hjärnmatrisanordning i enlighet med tillverkarens instruktioner, snabbt förbereda 2 mm tjocka hjärnan skivor koronalt: 6 stycken 2 mm tjocka skivor (2,3, 0,3, -1,7, -3,7, -5,7 mm från bregma). Undvika uttorkning av hjärnan skivor med näsdroppar, och utföra NIRF avbildning av både fram- och baksidan av sektionerna.
- Sätta hjärnan skivor i 2% trifenyl-tetrazoliumklorid (TTC) lösning under 20 min, samtidigt som man undviker exponering för Strålkastaret. Gå därefter skivorna i 4% formaldehydlösning vid 4 ° C, samtidigt som man undviker exponering för ljus.
6. Kvantifiering av tromber området Använda microCT bilder och ImageJ (1.49d) Software (Figur 5)
- Öppna bilder (figur 5A).
- Öppna bildsekvensfiler för att skapa en stapel fil genom att välja "Arkiv> Importera> bildsekvens" eller "Arkiv> Öppna". Konvertera bilderna till 8-bitars gråskala med hjälp av "Image> typ> 8-bitars".
- Konvertera enheten från Inch till Millimeter (figur 5A).
- När en bildpunkt i CT-bildfiler motsvarar 0,053 mm, använda "Analysera> Ställ Skala" för att ange "1", "0.053", och "mm" för "Avstånd i pixlar", "Kända avstånd" och "Enhet längd ', respektive.
- När (endast) en skala bar är tillgänglig,med hjälp av "Straight Line" verktyg rita en linje med dess längd lika stor som skalfältet. Använd sedan "Analysera> Ställ Skala" för att ange längden av skalan bar i millimeter.
- Bakgrundssubtraktion (figur 5B)
- Genom att använda "Redigera> Val> Ange" plats ett cirkulärt eller rektangulärt område av intresse (ROI) på ett område i hjärnan parenkym utan tromb eller benrelaterade hyperdense regioner. Eftersom den angivna ROI gäller varje del av stapeln, kontrollera att vara säker på om det inte överlappas med hyperdense regioner i varje skiva.
- Välj "Plugin> ROI> BG subtraktion från ROI" och ange 2,0 för "Antal stdav från medelvärdet.
- Segmentering av tromboemboli-relaterade Hyperdense lesioner (figur 5C)
- Välj "Bild> Justera> Tröskel" och ange värdena för "Lower tröskelnivå "och" övre tröskelnivå "som 22 och 255, respektive. Välj "Över / Under" för att visa pixlar under den nedre tröskelvärdet i blått, tröskelpunkter i gråskala, och pixlar ovanför det övre tröskelvärdet i grönt.
- Använd "Freehand Selection Tool" för att rita ROI som omger tromboemboli relaterade hyperdense skador utan att inkludera beniga områden. Under ritningen hålla trycka antingen [skift] eller [alt] för att lägga till eller ta bort en region, respektive.
Obs: Om hyperdense tromboemboliska lesioner är långt från benstrukturer, i stället för "Freehand Selection Tool", kan "Wand Tool" tryggt användas utan att ändra sin "Tolerans" nivå.
- Kvantifiering av de segmente Lesioner (Figur 5D)
- Använd "Analysera> Ställ Mått" för att välja "Area", "Mean Gray Value" och "Integrerad densitet (Area X Mean)9 ;. Kontrollera följande alternativ: "Gräns för Threshold" och "Display Label". Använd "Analysera> åtgärd för att få de kvantifierade data. Sedan spara resultaten som en ".xls" fil.
- Spara stackfilen i TIFF-format. Dessutom använder "Analysera> Verktyg> ROI manager" för att spara ROI.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Baslinje microCT bilder, som erhållits in vivo efter administrering av fib-GC-AuNP (10 mg / ml, 300 | j, l) vid 1 h efter embolisk stroke, visualiseras tydligt cerebral tromb i MCA - ACA bifurkation område av det distala inre halsartären (Figur 6 ). Uppföljning microCT avbildning visade ingen förändring i COW tromben med koksaltlösning behandling. Emellertid behandling med tPA visade en gradvis upplösning av COW tromb (blå pilspetsar i figur 6). Denna upptäckt visar att microCT trombosavbildande kan tillåta terapeutisk övervakning av trombolys. Det finns en utmärkt överensstämmelse mellan in vivo CT densitet och ex vivo NIRF för rest tromboemboli vid 24 tim. Observera att hyperdense microCT områden på grund av endogen tromb märkning av fibrin inriktning AuNPs fint samlokaliserade med NIRF signal områden på grund av exogena tromb märkning, som genomfördes före EMBOlic stroke med användning av en Cy5.5 fluorescerande sond känslig för koagulationsfaktorn Xllla-medierad fibrin-tvärbindande aktivitet i processen för mognaden av den förformade koagel (Figur 6). Den kombinerade tekniken direkt trombosavbildande att demonstrera tPA-förmedlad trombolytisk effekt speglar histologiska stroke resultatet mätt med TTC färgning. TTC färgning visade en tydlig minskning av mängden ischemisk hjärnskada (vitaktiga områdena i figur 6) för djuret mottagande tPA trombolys.
Figur 1:. Översikt över Beredning av fluorescerande Blodpropp (A) Blandning av färskt helblod med Cy5.5 nära infraröda fluorescerande (NIRF) sond (C15) som är kovalent bunden till fibrin delarna av tromben av fibrin -crosslinking enzymatisk verkan av aktiverad coaguning faktor Xllla under processen för koagel mognad. Den blandade blod sprutas in i en polyeten (PE) -50 röret och lämnades under 24 timmar för att tillåta koagelbildning och mognad. (B) NIRF avbildning för att bekräfta den optiska märkningen av tromben med C15 sonden. Notera den ihållande fluorescens efter tvättning av tromben som togs bort från PE-röret. (C) Trombos belastade PE-10 rör med en PE-50 rör modifierats för att ha en avsmalnande ände (200 um diameter) för tromboembolism i mitten cerebral artär - främre cerebral artär bifurkation område av den inre halspulsådern hos möss. Skala barer. 2 mm Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Översikt över Modellering en musmodell av Thromboembolic cerebral infarkt. (A) Laser Doppler övervakning av cerebralt blodflöde (CBF) före och efter ocklusion av mellersta hjärnartären (MCA), med den distala änden av den optiska fibern enligt laser Doppler flödesmätare limmad mot den vänstra temporal benytan (1 mm till vänster och 4 mm under från bregma). Notera den efter tilltäppning minskning med Doppler CBF, vilken bör sänkas med 30% eller lägre jämfört med baslinjen. (B) Insättning av tromben innehållande kateter (dvs den distalt avsmalnande polyeten-50 röret i figur 1C) i hålet i den yttre halsartären (ECA), följt (så småningom) genom att föra fram katetern ca 9 mm in i MCA - främre cerebral artär (ACA) bifurkation område av det distala inre halspulsådern (ICA). CCA, gemensamma halspulsådern, PPA, pterygopalatine artär. Klicka här för att seen större version av denna siffra.
Figur 3: Översikt av In vivo microCT baserade Direct Tromb bildåtergivning med Fibrin riktade guld nanopartiklar för att visualisera Cerebral tromboemboli och Övervaka vävnadsplasminogenaktivator (tPA) -medierad Trombolytiska Effects (A) Intravenös injektion av fibrin inriktade glykol kitosan guldnanopartiklar. (FIB-GC-AuNPs) i en mus med tromboembolisk stroke. (B) Musen placeras på sängen av en microCT imager. (C) Att förvärva microCT bilder vid 5 min efter injektionen av fib-GC-AuNPs. (D) Bildrekonstruktion att omvandla råbilddata till digital bildbehandling och kommunikation i format Medicine (DICOM) med hjälp av ett mjukvarupaket installeras på microCT skannern. (E) Bildanalys och beredning av axiell / coronal bilder återges ha två mm tjocklek med maximal intensitet projektion. (F) Intravenös tPA-förmedlad trombolys, som kan övervakas och analyseras med hjälp av microCT baserade direkt trombosavbildningsmetod. (C - E) Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Översikt över Ex vivo Near-Infrared Fluorescent (NIRF) avbildning av cerebral tromboemboli (A och B) En representativ hjärnvävnad bort från en mus med tromboembolisk stroke.. Vidta försiktighetsåtgärder inte förlora tromboemboli (röd pil) i mitten cerebral artär (MCA) - främre cerebral artär (ACA) bifurkation område av det distala inre halspulsådern (ICA,blå pilar) när du tar bort hjärnan. (C och D) Ex vivo NIRF trombosavbildande. Hjärnvävnaden är placerad inuti den ljustäta kammare av en NIRF kameran (C) för visualisering av tromber (röd pil i D) i förväg märkt med Cy5.5 fluorescerande markör C15 innan embolisk ocklusion av MCA - ACA bifurkation område. Jämför med figur 5 för CT utseende. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Översikt över Kvantifiera Tromb volym med microCT bilder och ImageJ (1.49d) (A) Importera bilder till en ny bunt fil, konvertera filformat i 8-bitars gråskala och ändra enheten.mm. (B) Bakgrund subtraktion. (C) segmentering av tromboemboliska skador genom att rita regionen av intresse (ROI) runt hyperdense områden samtidigt exklusive benstrukturer. (D) förvärva de kvantitativa data för ROI genom att använda menyn "Analysera> Measure". Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6:. Representant Direkt Cerebral trombosavbildande Data som förvärvats före och efter behandling strök Möss med Saline vs vävnadsplasminogenaktivator (tPA) (A) microCT (MCT) trombosavbildande för att möjliggöra terapeutisk övervakning av vävnadsplasminogenaktivator (tPA) -medierad trombolys . (B och
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi visade användningen av två kompletterande molekylära avbildningstekniker för direkttrombosavbildande i experimentella modeller av emboli stroke: en fibrin riktad guld nanopartiklar (FIB-GC-AuNP) för in vivo microCT baserad avbildning och en FXIIIa riktad optisk avbildning sond för ex vivo fluorescerande avbildning.
Efter intravenös administrering av fib-GC-AuNPs blev tromber synliga för CT som täta strukturer, som orsakas av partiklarna blir inneslutna i tromber genom verkan av de fibrin-targeting peptider (på ytan av partiklarna) efter koncentration-gradient- beroende diffusion in i den porösa struktur, det vill säga, tromber. Denna process verkar inträffa i endast en riktning, och snabbt orsakas de relativt låga koncentrationer av nanopartikel i blodet för att bli koncentrerad i koaglet, och ändring av dess CT densitet tillräckligt för att medge detektering. Den slutliga in vivo microCT imaging på 24 timmarsnyggt korrelerade med post mortem NIRF avbildning av ex vivo hjärnan, som visar post-tPA rester av den ursprungliga tromber som hade fluorescensmärkt med den optiska sonden känner igen fibrin-tvärbindande aktivitet hos FXIIIa innan de placeras i den cerebrala artären. På detta sätt två molekylära avbildningssonder, med olika verkningsmekanismer och olika avbildningsmetoder, varje rapport och kors kontrollera resultaten av den andra.
Utvecklingen av tromber kunde följas med samma metod; specifikt, kan trombolytisk behandling med tPA följas in vivo, vilket tillåter en snabb och i rätt tid avläsning av framgången för trombolys som ska utföras av CT. Detta har djupgående konsekvenser för klinisk trombolys, och har även forskningsansökningar för utveckling av nya anti-trombotiska eller trombolytiska terapier.
Tidigare vår grupp kunde upptäcka en vanlig komplikation vid stroke terapi, re-trombos 3 ofta förekommande runt en delvis behandlad koagel, med efterföljande reocklusion och förvärrade resultat. Reocklusion modellerades genom att tillämpa en mm FeCl3 -soaked filterpapper (grad 42) i tur och ordning på 4 olika platser (vänster distal CCA, vänster proximal CCA, höger distal CCA och höger proximal CCA) vid olika tidpunkter i samma djur . I samtliga fall cirkulerande FIB-GC-AuNP visades ansamlas i tromber, och gör dessa synliga för avbildning med CT. Denna varaktighet av denna effekt verkar vara begränsad till den biologiska halveringstiden för FIB-GC-AuNP, som för närvarande är okänd, och har observerats under en längre tid (upp till 3 veckor) efter den första injektionen av fib- GC-AuNP. Detta är av stort intresse kliniskt, eftersom en enda dos av nanopartiklar agent kan visa sig effektiv för att observera både framgångar och misslyckanden av kliniska behandlingsregimer. Ytterligare studier krävs för att bedöma farmakokinetiken och biodistribution av fib-GC-AuNP.
Den kemiska syntesen av FIB-GC-AuNPs har tidigare beskrivits i detalj fyra. Kortfattat, fibrin-målsökande peptider (tyrosin-D-glutamin-cystein-hydroxiprolin-L-3-klortyrosin-glycin-leucin-cystein-tyrosin-isoleucin-glutamin) som används i EP-2104R magnetisk resonanstomografi (MRI) medel 8 är syntetiseras genom standard fastfas-Fmoc peptidkemi, och konjugerades till ytan av GC-belagda AuNPs med användning av en-etyl-3- (3-dimetylaminopropyl) karbodiimid och N-hydroxisuccinimid. Slutprodukterna, renade FIB-GC-AuNPs samlas genom centrifugering.
C15 NIRF sond för optiska märkning av förformade tromb är en 15-aminosyrapeptid som känns igen av FXIIIa och märkta med e-aminogrupperna i lysinrester 9,10 med Cy5.5 fluorescerande färgämne. Det optiska avbildningsmedel är kovalent kopplad till de fibrinsträngarna av tromben genom den enzymatiska verkan av ageraivated koagulationsfaktor, när den tvärbinder fibrinsträngar under processen för koagel mognad 11,12. Den kemiska syntesen av den C15 NIRF tromb markör har också tidigare beskrivits i detalj 4. Kortfattat, FXIIIa affinitets peptider (glycin-asparagin-alanin-glutamat-glutamin-valin-serin-prolin-leucin-treonin-leucin-leucin-lysin-tryptofan) baserat på N-terminalen av alph-2-antiplasmin syntetiseras genom fast -fas peptidsyntes och sedan märkt med Cy5.5 fluorokromer via cystein sidokedjan. Med användning av HPLC, produkten renas och den slutliga föreningen uppsamlas.
Framgången för både NIRF och guldnanopartiklar medel är sannolikt på grund av den starka biologiska designfunktioner av dessa medel. FXIIIa 11 är en fundamentalt viktig trombin-aktiverade tetra transglutaminas, koagulering enzym som förmedlar fibrinolytisk motstånd. Aktiviteten hos dettaenzym betraktas som ett kännetecken för nybildade tromber. Både våra agenter interagerar starkt med denna grundläggande blod koagulering enzym (genom FXIIIa kännande C15 optisk agent) eller dess substrat (av fibrin inriktning FIB-GC-AuNP CT agent).
Samlokalisering studier visade att det var en utmärkt korrespondens mellan ex vivo fluorescens (exogen tromb markör) och in vivo microCT densitet (endogena tromb markör) för cerebral tromber avbildas med fibrin-bindande nanopartiklar, som förväntas, på grund av de inbördes relaterade biologiska inneslutningsmekanismer för både agenter.
Det finns flera saker att tänka på när du använder dubbla modal direkt trombosavbildningsteknik. Först, för att förhindra FIB-GC-AuNPs från aggregering och för att uppnå biokompatibilitet är glykol kitosan används för ytbeläggning 13. Före intravenös injektion bör dock trombosavbildande medlet resuspended i PBS, och sonikerades för att säkerställa upplösning och dispersion av nanopartiklarna. Vidare kan bedömas nanopartiklar stabilitet genom användning av ultraviolett-synligt (UV-Vis) absorptionsspektroskopi att jämföra ytplasmonresonans toppar färska kontra gamla lager av FIB-GC-AuNPs, vilka båda bör vara vid omkring 519 nm.
För det andra, kan upplösningen av microCT blodpropps bilder förbättras genom att ändra inläsningsparametrarna: som att öka "Scan Number" från 600 till 1200 skivor eller öka "Medel" från 1 till 3, som dock kommer att öka den tid som krävs för att slutföra skanningen.
Tredje, blod och C15 NIRF avbildningsmedel blandades i förhållandet 7: 3 5 för den fluorescerande märkningen av tromb i denna studie. Enligt vår erfarenhet, kan en relativt låg blodvolym hämmar trombosbildning, medan en relativt hög blodvolym kan minska detekterbarheten av trombpå grund av dämpningen av ex vivo fluorescerande signal avger från tromben. Dessutom är det anmärkningsvärt att flera olika tillvägagångssätt kan användas för fluorescerande visualisering av olika komponenter hos en tromb 14.
Fjärde, jämfört med FeCl 3-medierad in situ trombosmodell där målet artär är endast partiellt tilltäppt, microCT visualisering av cerebral tromboemboli som helt ockludera kärlet kräver relativt höga doser av fib-GC-AuNPs 4. Således kan det finnas toxicitetsproblem, även om guld kolloider anses vara biokompatibelt och FIB-GC-AuNPs visade inte märkbar systemisk / neurobehavioral toxicitet i en tidigare studie 4.
Femte, kliniska studier visade att blodplättsinriktade eller fibrin inriktade gadolinium (Gd) -baserade MRI-medel kan öka hyperintensitet av tromber i hjärtats kammare, halspulsådrorna, och aortabågen på T1-viktade bilder 15. Även om MRI har en utmärkt mjuk-vävnadskontrast och en hög spatial upplösning, är MR en tidskrävande test. CT lider relativt dålig mjukdels kontrast, men Datortomografi kan utföras snabbt. Följaktligen kvarstår CT den mest använda bildteknik i den akuta hantering av stroke 16. Dessutom gör microCT system för små djur avbildning inte kräver arkitektonisk strålskydd som ska installeras, och erbjuder hög upplösning. Således microCT kombination med ex vivo reflektions fluorescens avbildning eller in vivo fluorescens tomografi 17 är mycket användbar för små djurförsök. Alternativt, MRI / CT dubbla modal avbildning med Au-Fe nanopartiklar 18-20 kan också vara en kraftfull plattform för trombosavbildande i både djur och människor; MRI och CT kan komplettera varandra och, till skillnad från optisk avbildning, de inte lider av den låga vävnadspenetrering problem.
innehåll "> Sammanfattningsvis kombinerad CT och fluorescerande avbildning för direkt tromb visualisering är ett kraftfullt forskningsverktyg för undersökning av ischemisk stroke, lovar att förbättra upptäckten av blodproppar, övervakning av terapi, och upptäckten av re-trombos komplicerar behandlingen. Dessutom finns det en betydande potential för klinisk användning av dessa tekniker.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
DE.K., JY.K, CH.A, och KK är patent innehavare av fibrin inriktade guldnanopartiklar (10-1474063-0000, koreanska Intellectual Property Office). De återstående Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Korea Healthcare Technology R & D Project, ministeriet för hälsa och välfärd (HI12C1847, HI12C0066), Bio och sjukvård Technology Development Program (2010 till 0.019.862) och Global Research Lab (GRL) program (NRF-2015K1A1A2028228) av National Research Foundation, som finansieras av den koreanska regeringen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Machines | |||
| microCT | NanoFocusRay, JeonJu, Korea | NFR Polaris-G90 | |
| NIRF imaging system | Roper-scientific,Tucson, AZ | coolsnap-Ez | |
| Laser Doppler flowmeter | Perimed, Stockholm, Sweden | PeriFlux System 5000 | |
| Surgical microscope | Leica Microsystems, Seoul, Korea | EZ4HD | |
| Inhalation anesthesia machine | PerkinElmer, Massachusetts, USA | XGI-8 | |
| Software | |||
| NFR control | NanoFocusRay, JeonJu, Korea | NFR Polaris-G90 | microCT control software |
| Lucion | Infinitt, Seoul, Korea | Lucion | 3D render imaging software |
| Lab chart 7 | ADInstruments, Colorado, USA | Lab chart 7 | rCBF |
| ImageJ software | Wanye Rasband, NIH, USA | 1.49d | imaging analysis |
| Devices/Instruments | |||
| Infusion pump | Harvard, Massachusetts, USA | pump 22(55-2226) | |
| Homeothermic blanket | Panlab, Barcelona, Spain | HB101 | |
| Pocket cautery | Daejong, Seoul, Korea | DJE-39 | |
| Brain matrice | Ted pella, CA, USA | 15003 | coronal section |
| PE-50 tubing | Natsume, Tokyo, Japan | SP-45(PE-50) | I.D. 0.58 mm O.D. 0.96 mm |
| PE-10 tubing | Natsume, Tokyo, Japan | SP-10(PE-10) | I.D. 0.28 mm O.D. 0.61 mm |
| 30 gauge needle | sungshim-medical, Seoul, Korea | ||
| Syringe | CPL-medical, Ansan, Korea | 1 & 3 cc | |
| Gauze | Panamedic, Cheonan, Korea | ||
| Tape | Scotch, Seoul, Korea | 3M-810 | |
| Micro forceps | Fine Science Tools, Vancouver, Canada | 11253-27 | Dumont #L5 |
| Micro scissor | Fine Science Tools, Vancouver, Canada | 15000-03 | Vannas spring |
| Scissor | Fine Science Tools, Vancouver, Canada | 14084-08 | 8.5 cm |
| Black silk suture | Ailee, Busan, Korea | SK6071, SK728 | 6-0 and 7-0 |
| Reagents | |||
| meloxicam | Yuhan, Seoul, Korea | ||
| vet ointment | Novartis, Basel, Swiss | ||
| 10% Povidone-iodine (betadine) | Firson, Cheon-an, Korea | ||
| FeCl3 | Sigma, Missouri, United States | 157740-5G | |
| TTC | Amresco, Ohio, USA | 0765-100g | |
| Isoflurane | Hana-Pham, Gyeonggi, Korea | Ifran | 100 ml |
| PBS | Welgene, Daegu, Korea | LB001-02 | 500 ml |
| Gold nanoparticles | Synthesis | ||
| C15 optical agent | Synthesis | ||
| Tissue plasminogen activator | Boehringer Ingelheim, Biberach, Germany | rtPA(actilyse) | 20 mg |
| Normal saline | Daihan Pham, Seoul, Korea | 48N3AF3 | 20 ml |
References
- Saver, J. L.
- Latchaw, R. E., et al. Recommendations for imaging of acute ischemic stroke: a scientific statement from the American Heart Association. Stroke. 40 (11), 3646-3678 (2009).
- Kim, D. E., et al. Hyperacute direct thrombus imaging using computed tomography and gold nanoparticles. Ann Neurol. 73 (5), 617-625 (2013).
- Kim, J. Y., et al. Direct Imaging of Cerebral Thromboemboli Using Computed Tomography and Fibrin-targeted Gold Nanoparticles. Theranostics. 5 (10), 1098-1114 (2015).
- Kim, D. E., et al. Direct thrombus imaging as a means to control the variability of mouse embolic infarct models: the role of optical molecular imaging. Stroke. 42 (12), 3566-3573 (2011).
- Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. Blood sample collection in small laboratory animals. J Pharmacol Pharmacother. 1 (2), 87-93 (2010).
- Durukan, A., Tatlisumak, T. Animal models of ischemic stroke. Handbook of clinical neurology: Stroke Part 1: Basic and epidemiological aspects.Volume 92. Fisher, M. 92, Elsevier. 43-66 (2009).
- Overoye-Chan, K., et al. EP-2104R: a fibrin-specific gadolinium-Based MRI contrast agent for detection of thrombus. J Am Chem Soc. 130 (18), 6025-6039 (2008).
- Kim, D. E., Schellingerhout, D., Jaffer, F. A., Weissleder, R., Tung, C. H. Near-infrared fluorescent imaging of cerebral thrombi and blood-brain barrier disruption in a mouse model of cerebral venous sinus thrombosis. J Cereb Blood Flow Metab. 25 (2), 226-233 (2005).
- Tung, C. H., et al. Novel factor XIII probes for blood coagulation imaging. Chembiochem. 4 (9), 897-899 (2003).
- Robinson, B. R., Houng, A. K., Reed, G. L. Catalytic life of activated factor XIII in thrombi. Implications for fibrinolytic resistance and thrombus aging. Circulation. 102 (10), 1151-1157 (2000).
- Reed, G. L., Houng, A. K. The contribution of activated factor XIII to fibrinolytic resistance in experimental pulmonary embolism. Circulation. 99 (2), 299-304 (1999).
- Sun, I. C., et al. Biocompatible glycol chitosan-coated gold nanoparticles for tumor-targeting CT imaging. Pharm Res. 31 (6), 1418-1425 (2014).
- Celi, A., et al. Thrombus formation: direct real-time observation and digital analysis of thrombus assembly in a living mouse by confocal and widefield intravital microscopy. J Thromb Haemost. 1 (1), 60-68 (2003).
- Chen, I. Y., Wu, J. C. Cardiovascular molecular imaging: focus on clinical translation. Circulation. 123 (4), 425-443 (2011).
- Wintermark, M., et al. Imaging recommendations for acute stroke and transient ischemic attack patients: a joint statement by the American Society of Neuroradiology, the American College of Radiology and the Society of NeuroInterventional Surgery. J Am Coll Radiol. 10 (11), 828-832 (2013).
- Weissleder, R., Tung, C. H., Mahmood, U., Bogdanov, A. Jr In vivo imaging of tumors with protease-activated near-infrared fluorescent probes. Nat Biotechnol. 17 (4), 375-378 (1999).
- Narayanan, S., et al. Biocompatible magnetite/gold nanohybrid contrast agents via green chemistry for MRI and CT bioimaging. ACS Appl Mater Interfaces. 4 (1), 251-260 (2012).
- Amendola, V., et al. Magneto-plasmonic Au-Fe alloy nanoparticles designed for multimodal SERS-MRI-CT imaging. Small. 10 (12), 2476-2486 (2014).
- Zhu, J., et al. Synthesis of Au-Fe3O4 heterostructured nanoparticles for in vivo computed tomography and magnetic resonance dual model imaging. Nanoscale. 6 (1), 199-202 (2014).
