Summary
इस प्रोटोकॉल मस्तिष्क thromboemboli visualizing के लिए संयुक्त लगभग अवरक्त फ्लोरोसेंट (NIRF) इमेजिंग और सूक्ष्म गणना टोमोग्राफी (microCT) के आवेदन का वर्णन है। इस तकनीक thrombus बोझ और विकास की मात्रा का ठहराव की अनुमति देता है। NIRF इमेजिंग तकनीक fluorescently, excised मस्तिष्क में थक्का लेबल visualizes जबकि microCT तकनीक सोने-नैनोकणों का उपयोग कर रहने वाले जानवरों के अंदर thrombus visualizes।
Abstract
प्रत्यक्ष thrombus इमेजिंग thromboembolic रोधगलन की जड़ visualizes। छवि की thrombus करने में सक्षम होने के नाते सीधे अप्रत्यक्ष माप पर भरोसा से स्ट्रोक का बहुत ही अच्छा जांच की अनुमति देता है, और एक शक्तिशाली और मजबूत संवहनी अनुसंधान उपकरण होगा। हम एक ऑप्टिकल इमेजिंग दृष्टिकोण है कि एक आणविक इमेजिंग thrombus मार्कर के साथ thrombi लेबल का उपयोग - एक Cy5.5 लगभग अवरक्त फ्लोरोसेंट (NIRF) जांच कि covalently थक्का परिपक्वता की प्रक्रिया के दौरान सक्रिय जमावट कारक XIIIa की आतंच crosslinking एंजाइमी कार्रवाई से thrombus के आतंच किस्में से जुड़ा हुआ है। आतंच: एक सूक्ष्म गणना टोमोग्राफी (microCT) आधारित दृष्टिकोण thrombus की मांग सोने के नैनोकणों (AuNPs) का थक्का के प्रमुख घटक निशाना बनाने के लिए क्रियाशील उपयोग करता है। इस पत्र विवो microCT में संयुक्त और एम्बोलिक स्ट्रोक के एक माउस मॉडल में thromboemboli के पूर्व vivo NIRF इमेजिंग के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन है। हम इन विवो में पता चलता है कि </ em> microCT और आतंच-लक्षित ग्लाइकोल-chitosan AuNPs (मिथ्या-जीसी AuNPs) दोनों सीटू thrombi और मस्तिष्क एम्बोलिक thrombi में दृश्यमान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। हम भी इन विवो microCT आधारित प्रत्यक्ष thrombus इमेजिंग के उपयोग का वर्णन क्रमानुसार ऊतक plasminogen उत्प्रेरक की मध्यस्थता थ्रोम्बोलिसिस के उपचारात्मक प्रभाव पर नजर रखने के लिए। पिछले इमेजिंग सत्र के बाद, हम पूर्व vivo NIRF हद तक और मस्तिष्क में अवशिष्ट thromboemboli का वितरण इमेजिंग द्वारा प्रदर्शित करता है। अंत में, हम मात्रात्मक की छवि microCT और NIRF इमेजिंग डेटा का विश्लेषण का वर्णन है। प्रत्यक्ष thrombus इमेजिंग तकनीक के संयुक्त अनुमति देता है thrombus दृश्य के दो स्वतंत्र तरीकों की तुलना में किया जाना है: पर thrombus से संबंधित फ्लोरोसेंट संकेत के क्षेत्र पूर्व vivo इमेजिंग NIRF बनाम विवो में hyperdense microCT thrombi की मात्रा।
Introduction
6 में से एक व्यक्ति अपने जीवन में कुछ बिंदु पर एक स्ट्रोक होगा। इस्कीमिक स्ट्रोक अब तक का सबसे आम स्ट्रोक प्रकार से है, और सभी स्ट्रोक के मामलों के बारे में 80 प्रतिशत के लिए खातों। क्योंकि thromboemboli इन इस्कीमिक स्ट्रोक के बहुमत के कारण, वहाँ प्रत्यक्ष thrombus इमेजिंग में एक बढ़ती रुचि है।
यह अनुमान लगाया गया था के बारे में 2 लाख से मस्तिष्क की कोशिकाओं के बीच मस्तिष्क धमनी रोड़ा 1 के हर मिनट के दौरान मरने कि, नारा "समय मस्तिष्क है" के लिए अग्रणी। कम्प्यूटेड टोमोग्राफी (सीटी) के अध्ययन के लिए तेजी से किया जा सकता है, और व्यापक रूप से उपलब्ध हैं; इस कारण के लिए, सीटी प्रारंभिक निदान और hyperacute इस्कीमिक स्ट्रोक के इलाज के लिए पसंद की इमेजिंग बनी हुई है। थ्रोम्बोलिसिस के लिए ऊतक plasminogen उत्प्रेरक (टीपीए) प्रशासन और / या endovascular थक्का पुनः प्राप्ति के लिए 2 triaging: सीटी महत्वपूर्ण जल्दी निर्णय को सूचित करने के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है। वर्तमान सीटी आधारित thrombus इमेजिंग, तथापि, क्रमानुसार प्रमस्तिष्क ट्रैक नहीं कर सकतेविवो में एल thromboemboli, क्योंकि यह अप्रत्यक्ष तरीकों का उपयोग करता thrombi प्रदर्शित करने के लिए: iodinated इसके विपरीत द्वारा रक्त पूल के अपारदर्शन के बाद, thrombi वाहिकाओं में दोष भरने के रूप में प्रदर्शन कर रहे हैं। खुराक सीमा और जोखिम iodinated विपरीत के बार-बार प्रशासन के साथ जुड़े हैं, जो इस तरह से thrombi की इमेजिंग दोहराया छीन रहे हैं।
इस प्रकार, वहाँ स्ट्रोक रोगियों में मस्तिष्क thrombi के लिए एक प्रत्यक्ष इमेजिंग प्रणाली के लिए एक महत्वपूर्ण आवश्यकता है, तेजी से और बेहतर इलाज निर्णय किया जा करने की अनुमति है। हम सीटी, वर्तमान में इस्तेमाल किया स्ट्रोक के लिए सीमावर्ती इमेजिंग साधन का मूल्य बढ़ाने, एक thrombus की मांग nanoparticular आणविक इमेजिंग एजेंट के उपयोग के साथ द्वारा यह पूरा करने का प्रस्ताव है।
हम इस एजेंट के उपयोग का प्रदर्शन किया है सूक्ष्म गणना टोमोग्राफी (microCT), एक उच्च संकल्प पूर्व vivo या विवो (छोटे जानवर) सीटी की इमेजिंग संस्करण में है कि तेजी से डाटा अधिग्रहण <अनुमति देता का उपयोगsup> 3,4। यहां तक कि अपेक्षाकृत गरीब नरम ऊतक छोटे जानवर microCT (मानव आकार स्कैनर से उपलब्ध से भी बदतर) के लिए उपलब्ध विपरीत के साथ, इमेजिंग एजेंट तलाश करने और उन्हें सीटी, 'एक घने पोत पर हस्ताक्षर' आणविक द्वारा बढ़ाया पर hyperdense बनाकर thrombi को चिह्नित करने में सक्षम था इमेजिंग।
सीटी तकनीक के पूरक, हमारे समूह में पहले से एक ऑप्टिकल प्रत्यक्ष thrombus इमेजिंग तकनीक Cy5.5 लगभग अवरक्त फ्लोरोसेंट (NIRF) जांच का उपयोग मस्तिष्क thrombus बोझ 5 कल्पना करने के लिए विकसित किया गया है। यह पोस्टमार्टम दिमाग पर एक पूर्व vivo तकनीक है, लेकिन अत्यधिक संवेदनशील है, और अनुसंधान की स्थापना में विवो आंकड़ों में इस बात की पुष्टि करने के लिए कार्य करता है।
दोनों सीटी और NIRF आधारित thrombus की मांग इमेजिंग तकनीक के बाद हमें तुलना और इन तकनीकों के विपरीत इस्कीमिक स्ट्रोक के विकास की प्रक्रिया में thrombus और thrombus इमेजिंग की भूमिका पर बेहद जानकारीपूर्ण डेटा प्राप्त करने के लिए अनुमति देता है।
एचअरे, हम इन विवो microCT और पूर्व vivo NIRF इमेजिंग की एक संयुक्त तकनीक की एक विस्तृत प्रोटोकॉल सीधे एम्बोलिक स्ट्रोक के एक माउस मॉडल में thromboemboli कल्पना करने का वर्णन है। इन सरल और मजबूत तरीकों उपचार के दौरान विवो में एक त्वरित और मात्रात्मक तरीके से thrombus बोझ / वितरण और गतिशील thrombus विकास के लक्षण वर्णन के vivo मूल्यांकन में सटीक सक्रिय करने के द्वारा थ्रोम्बोटिक रोगों के बारे में हमारी समझ को अग्रिम करने के लिए उपयोगी होते हैं, पूर्व vivo डेटा है कि कार्य करता है के द्वारा पीछा एक नियंत्रण और vivo इमेजिंग निष्कर्षों की पुष्टि के लिए संदर्भ मानक के रूप में।
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Protocol
सभी पशु प्रक्रियाओं इस प्रोटोकॉल में प्रदर्शन की समीक्षा की गई है और Dongguk विश्वविद्यालय इल्सान अस्पताल पशु की देखभाल और उपयोग समिति ने मंजूरी दे दी और सिद्धांतों और प्रक्रियाओं की देखभाल और पशु के उपयोग के लिए एनआईएच गाइड में उल्लिखित के अनुसार आयोजित की।
1. exogenously गठित थक्का की तैयारी प्रतिदीप्ति मार्कर के साथ लेबल (चित्रा 1)
- 3 isoflurane% 30% ऑक्सीजन (1.5 एल / मिनट 100% ऑक्सीजन) के साथ मिश्रित का उपयोग कर एक प्रेरण कक्ष में एक माउस anesthetize। मांसपेशियों टोन देख और पैर की अंगुली चुटकी पलटा के अभाव की पुष्टि के द्वारा संज्ञाहरण की पर्याप्त गहराई सुनिश्चित करें।
- प्रवण स्थिति में एक बाँझ कपड़ा पर पशु प्लेस, और एक साँस लेना मुखौटा और 2% isoflurane 30% ऑक्सीजन के साथ मिश्रित का उपयोग कर संज्ञाहरण के तहत इसे रख लो। निम्नलिखित प्रक्रियाओं सड़न रोकनेवाला तकनीक और बाँझ गाउन / मास्क / दस्ताने / उपकरणों का उपयोग कर प्रदर्शन करना। सफाई और एक पहले 70% शराब के साथ प्रयोगात्मक क्षेत्र sanitizing द्वारा बाँझ स्थिति बनाए रखनेएन डी प्रक्रियाओं के बाद।
- कार्डियक पंचर 6 के बाद लगभग 300 ~ 1000 μl धमनियों से रक्त ले लीजिए। 30 μl C15 जांच 5 (20 μmol / एल एकाग्रता), एक Cy5.5 फ्लोरोसेंट जांच सक्रिय कारक तेरहवीं (FXIIIa) जमावट एंजाइम की आतंच crosslinking गतिविधि के प्रति संवेदनशील के साथ 70 μl पूरे रक्त मिक्स, fluorescently थक्का चिह्नित करने के लिए (चित्रा 1 ए )। एक 20 सेमी लंबा पॉलीथीन ट्यूब (पीई 50, आईडी 0.58 मिमी) में एक 3 मिलीलीटर सिरिंज (23 गेज सुई) का उपयोग मिश्रित रक्त इंजेक्षन। पीई ट्यूबिंग निष्फल किया जाना चाहिए (या निर्माता द्वारा प्रमाणित बाँझ) और थक्के एक टिशू कल्चर हुड में aseptically तैयार रहना चाहिए।
- श्वसन और हृदय नाड़ी की कमी को देख कर पशु की मौत की जाँच करें।
- 22 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर खून से भरी हुई ट्यूब को छोड़ दें, तो, और निम्न प्रक्रियाओं का प्रदर्शन, जैसा कि पहले 7 की सूचना दी।
- 1.5 सेमी लंबे टुकड़ों में थक्का-युक्त ट्यूब कट। एक 3 मिलीलीटर फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के साथ भरा सिरिंज का प्रयोग, धीरे ट्यूब के एक टुकड़े में पीबीएस इंजेक्शन लगाने के द्वारा एक पीबीएस युक्त 6 अच्छी तरह से थाली पर thrombus निष्कासित। पीबीएस (चित्रा 1 बी) के साथ thrombi तीन बार धोएं।
- ध्यान से धोया thrombus ड्राइंग, जबकि हवा के बुलबुले से परहेज, एक 30 के साथ एक नमकीन से भरे 1 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग करके एक 1.5 सेमी लंबे थक्का के साथ एक 15 सेमी लंबे पीई 10 ट्यूब (आईडी 0.28 मिमी) के बाहर का अंत भाग लोड गेज सुई कि ट्यूब के समीपस्थ अंत में डाला जाता है।
- एक 3 सेमी लंबे पीई 50 ट्यूब (आईडी 0.58 मिमी) एक पतला अंत (आईडी 200 माइक्रोन) है करने के लिए संशोधित है, जो मध्य मस्तिष्क धमनी (एमसीए) पर रखा जाएगा साथ thrombus से भरी हुई पीई 10 ट्यूब कनेक्ट - पूर्वकाल मस्तिष्क आंतरिक मन्या धमनी (आईसीए) एम्बोलिक स्ट्रोक के एक माउस मॉडल (चित्रा 1 सी) में की धमनी (एसीए) विभाजन के क्षेत्र।
2. मॉडलिंग thromboembolic स्ट्रोक के एक माउस मॉडल (चित्रा 2)
- Anesthetizके रूप में पहले 3% isoflurane 30% ऑक्सीजन (1.5 एल / मिनट) के साथ मिश्रित का उपयोग कर एक प्रेरण कक्ष में 7 की सूचना दी ईए अलग माउस stroked हो। शल्य चिकित्सा के बाद दर्द को दूर करने के लिए (5 मिलीग्राम / किग्रा) subcutaneously meloxicam इंजेक्षन। मांसपेशियों टोन देख और पैर की अंगुली चुटकी पलटा के अभाव की पुष्टि के द्वारा संज्ञाहरण की पर्याप्त गहराई सुनिश्चित करें।
- संज्ञाहरण के दौरान सूखापन को रोकने के लिए प्रत्येक आंख के लिए पशु चिकित्सा मरहम की एक छोटी राशि लागू करें। सड़न रोकनेवाला तकनीक और बाँझ गाउन / मास्क / दस्ताने / उपकरणों का उपयोग कर निम्नलिखित शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं का प्रदर्शन। सफाई और पहले शराब 70% के साथ शल्य चिकित्सा क्षेत्र sanitizing के दौरान, द्वारा बाँझ स्थिति बनाए रखने, और सर्जरी के बाद।
- एक ऑपरेटिंग मेज पर माउस ले जाएँ। प्रवण स्थिति में एक बाँझ कपड़ा पर पशु प्लेस, और एक साँस लेना मुखौटा और 2% isoflurane का उपयोग संज्ञाहरण के तहत इसे रख लो। फिर, एक गुदा थर्मामीटर से प्रतिक्रिया के साथ एक homeothermic कंबल का उपयोग कर 36.5 डिग्री सेल्सियस पर शरीर का तापमान दबाना।
- SURGI के बादbetadine और 70% शराब के साथ कैलोरी प्रस्तुत करने का, बाएं कान और आंख के बीच खोपड़ी पर एक छुरी का उपयोग करके एक 1 सेमी ऊर्ध्वाधर चीरा बनाते हैं। संपर्क में छोड़ दिया लौकिक हड्डी की सतह पर एक लेजर डॉपलर प्रवाहमापी के ऑप्टिकल फाइबर के बाहर का अंत गोंद (1 मिमी छोड़ दिया और शीर्षस्थान से नीचे 4 मिमी)। फिर, शुरू डॉपलर प्रवाह की निगरानी (2A चित्रा)।
- पशु लेट गया। एक स्ट्रिंग एक पिन से जुड़ी साथ ऊपरी सामने दाँत पर खींच कर गर्दन को सीधा और गर्दन क्षेत्र दाढ़ी। फिर, एक 3 सेमी खड़ी midline चीरा, यह खुला फैल बना है, और पेरी-नाड़ी कोमल ऊतकों विदारक द्वारा छोड़ा मन्या बल्ब क्षेत्र बेनकाब। वेगस तंत्रिका घायल नहीं सावधान रहें।
- छोड़ दिया समीपस्थ आम मन्या धमनी (सीसीए) एक बाँझ 6-0 काले रेशम सीवन का उपयोग ligate, और छोड़ दिया आईसीए और बाईं pterygopalatine धमनी (पीपीए) बाँझ 7-0 काले रेशम टांके का उपयोग कर ligate।
- छोड़ा बेहतर थाइरोइड धमनी, जो बाएँ बाहरी मन्या धमनी यूएसआई की एक शाखा है दाग़नाएनजी एक Monopolar बिजली गुल देना, और बाईं समीपस्थ बाहरी कैरोटिड धमनी (ईसीए) शिथिल और अधिक बाहर साइट कसकर बाँझ 7-0 काले रेशम टांके का उपयोग कर ligate।
- एक माइक्रो कैंची का प्रयोग, ईसीए के ligated साइटों के बीच एक छोटा सा छेद (लगभग 0.2 ~ 0.25 मीटर व्यास) बनाते हैं।
- जबकि समीपस्थ ईसीए बंधाव ढीला ईसीए में छेद में थक्का युक्त कैथेटर डालें। आदेश जगह में कैथेटर चिंच करने में सीसीए में कैथेटर को आगे बढ़ाने के बाद फिर से समीपस्थ ईसीए बंधाव मजबूत करनी होगी।
- ईसीए बाहर का हिस्सा है, जो बाहर का बंधाव साइट के लिए बाहर का है कटौती करने के लिए दाग़ना, और बारी बारी से मुक्त करने के समीपस्थ ईसीए जबकि सीसीए से कैथेटर वापस लेने आईसीए की दिशा में यह पंक्ति में दक्षिणावर्त। तुरंत आईसीए बंधाव ढीला के बाद बाहर का आईसीए के एसीए विभाजन क्षेत्र - तो फिर, कैथेटर एमसीए में लगभग 9 मिमी अग्रिम। फिर, आईसीए बंधाव कस लें।
- विभाजन के क्षेत्र में धीरे से thrombus रखेंसिरिंज दबाने 1 मिलीलीटर thrombus इंजेक्षन करने के लिए। डॉपलर मस्तिष्क में रक्त प्रवाह (CBF) है, जो आधारभूत की तुलना में 30% या कम से कम किया जाना चाहिए यदि thrombus सफलतापूर्वक पोत (चित्रा 2 बी) occluded की कमी की जाँच करें।
- कैथेटर निकालें, और तुरंत और कसकर ईसीए समीपस्थ साइट ligate। इसके अलावा, सीसीए और पीपीए unligate।
- 6-0 रेशम टांके का उपयोग कर चीरा साइट को बंद करें। एक आवश्यक समय अवधि से अधिक डॉपलर निगरानी जारी रखने के (यहाँ, thrombus इंजेक्शन के बाद 30 मिनट के लिए) के बाद संज्ञाहरण बंद करो। एक खाली पिंजरे में माउस लौटें, और यह गर्म रखने के एक हीटिंग दीपक के साथ। जब तक यह पर्याप्त चेतना प्राप्त की है स्टर्नल लेटना बनाए रखने के लिए माउस पहुंच से बाहर मत छोड़ो।
3. सेरेब्रल thrombus के vivo इमेजिंग में microCT (चित्रा 3)
- पुनः anesthetize एक पूर्व निर्धारित समय बिंदु पर 2.1 चरण में वर्णित के रूप में 2% isoflurane के साथ माउस (यहाँ, 1 घंटा) शुरू होने के बादएम्बोलिक स्ट्रोक का मस्तिष्क धमनी में थक्का के प्लेसमेंट की वजह से। पैर के अंगूठे चुटकी पलटा के अभाव की पुष्टि के द्वारा संज्ञाहरण की पर्याप्त गहराई सुनिश्चित करें। संज्ञाहरण के दौरान सूखापन को रोकने के लिए प्रत्येक आंख के लिए पशु चिकित्सा मरहम की एक छोटी राशि लागू करें।
- 10 मिमी पीबीएस में 10 मिलीग्राम Au / एमएल की एकाग्रता में आतंच-लक्षित सोने के नैनोकणों (मिथ्या-जीसी AuNP 4) Resuspend, और 30 मिनट के लिए thrombus इमेजिंग एजेंट sonicate विघटन और नैनोकणों के फैलाव सुनिश्चित करने के लिए। 300 μl मिथ्या-जीसी AuNP (10 मिलीग्राम / एमएल) शिश्न नस में इंजेक्षन।
- एक microCT मशीन के बिस्तर पर पशु प्लेस, और एक स्ट्रिंग एक पिन से जुड़ी गति कलाकृतियों को कम करने के साथ ऊपरी सामने दांत खींच कर गर्दन को सीधा।
- मिथ्या-जीसी AuNP के इंजेक्शन के बाद 5 मिनट में मस्तिष्क की microCT छवियों को प्राप्त करने के लिए शुरू। यहाँ वर्णित प्रयोगों के लिए, निम्न इमेजिंग मापदंडों का उपयोग: 65 केवीपी, 60 μA, 26.7 x 26.7 x 27.9 मिमी 3 देखने के क्षेत्र, 0.053 x 0.053 x 0.054 मिमी 3 voxel आकार, फ्रेम प्रति 100 मिसे, 1 औसतन 360 बार देखा गया, 512 x 512 पुनर्निर्माण मैट्रिक्स, 600 स्लाइस, 64 सेकंड स्कैन समय।
- एक खाली पिंजरे में माउस लौटें, और यह गर्म रखने के एक हीटिंग दीपक के साथ। जब तक यह पर्याप्त चेतना प्राप्त की है स्टर्नल लेटना बनाए रखने के लिए माउस पहुंच से बाहर मत छोड़ो।
- 'आरंभ' microCT स्कैनर पर स्थापित एक सॉफ्टवेयर पैकेज में 'पुनर्निर्माण' पैनल के आदेश का उपयोग चिकित्सा (DICOM) प्रारूप में डिजिटल इमेजिंग और संचार में कच्चे छवि डेटा रूपांतरण।
- छवियों (6 चरण में) के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए, निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सॉफ्टवेयर पैकेज का उपयोग करके झगड़ा प्रारूप में DICOM डेटा बदलना।
- गुणात्मक रूप में अच्छी तरह से मात्रात्मक एक सरल और अधिक तेजी से रास्ते में विश्लेषण के रूप में विश्लेषण के लिए, का एक नया सेट पैदा करने के लिए DICOM प्रारूप में सॉफ्टवेयर पैकेज और मूल 0.054 मिमी मोटी छवियों का उपयोगअक्षीय और राज्याभिषेक छवियों के रूप में निम्नानुसार, 1 या 2 मिमी (यहाँ, 2 मिमी) मोटाई के लिए गाया।
- 'डेटा स्रोत' पेड़ पर DICOM फ़ोल्डर का चयन सही माउस बटन पर क्लिक करें और 'MasterDB' या 'PrivateDB' के लिए फ़ोल्डर आयात करते हैं।
- 'डेटा स्रोत' पेड़ में 'MasterDB' या 'PrivateDB' पर क्लिक करें, और आयातित फ़ोल्डर का चयन करें। सबसे बाएँ पैनल पर '3 डी' टैब पर क्लिक करने के बाद, जब 'लोड हो रहा है विकल्प' विंडो को चबूतरे, प्रेस 'ठीक है' छवियों के एक दृश्य एक ढेर के रूप में फ़ोल्डर में आयात करने के लिए।
- अक्षीय और राज्याभिषेक छवि Windows में शब्द 'एमआरपी' पर क्लिक करें और पॉप-अप मेनू पर 'एमआईपी' का चयन करके अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण (एमआईपी) प्रारूप के लिए छवि प्रतिनिधित्व बदलें। एक ही खिड़कियों में: फिर, '0 [मिमी] गु' क्लिक करने के बाद 2 मिमी मोटाई के लिए छवि बदल जाते हैं।
- ना 2 मिमी चौड़ाई 3 डी का उपयोगvigator बार है कि एक छवि ढेर की खोज और एक उचित कोण और स्थान पर यह टुकड़ा करने की क्रिया के लिए अनुमति देता है, विलिस (गाय) का चक्र है, जो thrombi बंदरगाहों की पूर्ण कवरेज के साथ एक 2 मिमी मोटी अक्षीय अनुभाग की छवि तैयार करते हैं। 'आउटपुट' पैनल पर कब्जा बटन (कैमरा आइकन) पर क्लिक करें। झगड़ा प्रारूप में छवि को बचाने।
- फिर, पांच 2 मिमी कि सेरिबैलम को ललाट पालि से समीपवर्ती कवर मोटी राज्याभिषेक अनुभाग छवियों तैयार करते हैं।
- एसीए thrombi - सबसे पहले, ध्यान से अक्षीय छवि पर नाविक बार संरेखित इतना है कि राज्याभिषेक की छवि अच्छी एमसीए कल्पना कर सकते द्वारा दूसरा टुकड़ा तैयार करते हैं।
- इसके बाद, एक सन्निहित रास्ते में अन्य चार स्लाइस तैयार करते हैं। 'आउटपुट' पैनल पर कब्जा बटन (कैमरा आइकन) पर क्लिक करें। झगड़ा प्रारूप में छवियों को बचाओ।
4. थ्रंबोलाइसिस और सेरेब्रल thrombus के vivo इमेजिंग में microCT (चित्रा 3)
- तैयार एक 100 सेमी लंबा पीई 1एक छोर पर एक 30 गेज सुई और दूसरे छोर पर एक 1 मिलीलीटर सिरिंज के साथ 0 ट्यूब। या तो खारा (600 μl) या टीपीए (यहाँ, 24 मिलीग्राम / किलो, 600 μl), जबकि हवा के बुलबुले से बचने के साथ ट्यूब भरें।
- 2.1 चरण में वर्णित के रूप में माउस पुनः anesthetize। जानवर की penile नस के भीतर सुई की नोक डालें। microCT मशीन के बिस्तर पर ध्यान पशु रखें। फिर, स्थिर और बिस्तर पर यह टेप से कैथेटर प्रणाली की नसों में इंजेक्शन हिस्सा स्थिर।
- पूर्व उपचार के आधार रेखा के रूप में एक अनुवर्ती इमेजिंग सत्र प्रदर्शन करना। फिर, कैथेटर प्रणाली में सिरिंज सवार निराशाजनक द्वारा या तो 60 μl सामान्य नमक या टीपीए इंजेक्षन। सांस में इंजेक्शन के बाद, समय (यहाँ, 30 मिनट) की अवधि में शेष समाधान (540 μl) तर करने के लिए शुरू करते हैं।
- 3.4 कदम के रूप में ही मापदंडों का उपयोग microCT छवियों को प्राप्त पूर्व निर्धारित समय अंक पर: यहाँ, सांस में इंजेक्शन के बाद 3 और 24 घंटे में। निम्नलिखित पूर्व vivo NIRF throm प्रदर्शन करने के लिएमस्तिष्क के बस इमेजिंग, ग्रीवा अव्यवस्था से संज्ञाहरण के तहत पशु euthanize।
5. पूर्व विवो NIRF thrombus इमेजिंग और triphenyl tetrazolium क्लोराइड (टीटीसी) मस्तिष्क के ऊतकों की धुंधला (चित्रा 4)
- कत्ल के बाद, खोपड़ी को हटा दें और ऊपर बाण सिवनी की ओर रंध्र मैग्नम से कैंची के साथ खोपड़ी के माध्यम से कटौती। ध्यान से कैंची का उपयोग करते समय अंतर्निहित मस्तिष्क को चोट से परहेज छिन्न खोपड़ी के किनारों को ऊपर उठाने, इस प्रकार गोलार्द्धों नंगे बिछाने से कपाल तिजोरी निकालें।
- मस्तिष्क के आधार के रूप में संभव के रूप में बंद मस्तिष्क की सतह के लिए ऑप्टिक नसों बाहर कट, क्योंकि वे विलिस धमनियों का चक्र है कि NIRF इमेजिंग पर देखे जा चाहिए के साथ ओवरलैप हो सकता है। फिर, आदेश में स्पष्ट रूप NIRF thrombus इमेजिंग के लिए वाई-आकार 'एमसीए / एसीए / बाहर का आईसीए' कल्पना करने में, बाहर बाहर का ICAS के रूप में दूर मस्तिष्क की सतह के लिए संभव के रूप में धीरे वें बेनकाब करने के लिए अनुमस्तिष्कीय आधार संपीड़ित करने के बाद कटौतीई काटने अंक (चित्रा -4 ए)।
- NIRF इमेजिंग (/ उत्तेजना उत्सर्जन, 675/690 एनएम, 1 सेकंड जोखिम) प्रदर्शन करना इसके आधार (चित्रा 4 बी, सी), जो गाय की धमनियों में fluorescently लेबल thromboemboli visualizes ओर इशारा करते हुए के साथ हटा दिया मस्तिष्क के ऊतकों की (चित्रा 4D) । फिर, मस्तिष्क ओर इशारा करते हुए, जो cortical thromboemboli visualizes के शिखर के साथ अतिरिक्त इमेजिंग प्रदर्शन करते हैं। ऊतक पर खारा की कुछ बूँदें डाल द्वारा मस्तिष्क के सूखने से बचें।
- निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक मस्तिष्क मैट्रिक्स डिवाइस का उपयोग करना, जल्दी से 2 मिमी मोटी स्लाइस मस्तिष्क coronally तैयार: 2 मिमी के 6 टुकड़े मोटी स्लाइस (2.3, 0.3, -1.7, -3.7, शीर्षस्थान से -5.7 मिमी)। खारा बूंदों का उपयोग करके मस्तिष्क के स्लाइस के सूखने से बचें, और दोनों के सामने और वर्गों के पीछे की सतह के NIRF इमेजिंग प्रदर्शन करते हैं।
- 20 मिनट के लिए 2% triphenyl tetrazolium क्लोराइड (टीटीसी) के घोल में मस्तिष्क स्लाइस रखो, जबकि जोखिम से बचने के लिए lighटी। फिर, 4 डिग्री सेल्सियस पर 4% formaldehyde समाधान में स्लाइस को स्थानांतरित करते हुए प्रकाश के संपर्क से परहेज।
6. thrombus क्षेत्र की मात्रा microCT छवियाँ और ImageJ (1.49d) सॉफ्टवेयर का उपयोग (चित्रा 5)
- ओपन छवियाँ (चित्रा 5 ए)।
- 'फ़ाइल> आयात> छवि अनुक्रम' या 'फ़ाइल> ओपन' का चयन करके एक ढेर फ़ाइल बनाने के लिए ओपन छवि अनुक्रम फ़ाइलें। 'छवि> प्रकार> 8 बिट' का उपयोग करके 8-बिट स्केल के लिए छवियों कन्वर्ट।
- मिलीमीटर (चित्रा 5 ए) इंच से इकाई में परिवर्तित।
- सीटी छवि फ़ाइलों में से एक पिक्सेल 0.053 मिमी से मेल खाती है, का उपयोग 'का विश्लेषण करें> सेट स्केल' में प्रवेश के लिए '1', '0.053', और 'के लिए पिक्सल में दूरी' 'मिमी', 'ज्ञात दूरी', और लंबाई की 'यूनिट ', क्रमशः।
- जब (केवल) एक पैमाने पर पट्टी उपलब्ध है,'सीधी रेखा' उपकरण का उपयोग कर इसकी लंबाई के साथ एक लाइन पैमाने पर पट्टी के बराबर आकर्षित। फिर, 'विश्लेषण> सेट स्केल' मिलीमीटर में पैमाने पर पट्टी की लंबाई में प्रवेश के लिए इस्तेमाल करते हैं।
- पृष्ठभूमि घटाव (चित्रा 5 ब)
- थक्का या हड्डी से संबंधित hyperdense क्षेत्रों के बिना 'संपादन> चयन> निर्दिष्ट करें' का उपयोग जगह मस्तिष्क पैरेन्काइमा के एक क्षेत्र पर ब्याज (आरओआई) के एक परिपत्र या आयताकार क्षेत्र से। निर्दिष्ट रॉय ढेर के हर टुकड़ा करने के लिए लागू होता है क्योंकि, अगर यह प्रत्येक टुकड़ा में hyperdense क्षेत्रों के साथ छा नहीं है यह अवश्य जांच लें।
- 'प्लगइन> रॉय> रॉय से बीजी घटाव' चुनें और 'stdev के मतलब से नंबर' के लिए 2.0 दर्ज करें।
- Thromboemboli से संबंधित Hyperdense घावों के विभाजन (चित्रा 5C)
- 'छवि> समायोजित> दहलीज' चुनें, और 'लो के मूल्यों में प्रवेशwer दहलीज स्तर 'और' 22 और 255, क्रमशः के रूप में ऊपरी सीमा स्तर '। हरे रंग में ऊपरी सीमा मूल्य से ऊपर स्केल में नीले, thresholded पिक्सल में कम सीमा मूल्य से नीचे पिक्सल, और पिक्सल प्रदर्शित करने के लिए 'ऊपर / नीचे' का चयन करें।
- 'मुक्तहस्त चयन उपकरण' का प्रयोग ROIs कि बोनी क्षेत्रों को शामिल किए बिना thromboemboli से संबंधित hyperdense घावों के चारों ओर आकर्षित करने के लिए। बैठक के दौरान, दबाव या तो जोड़ने या क्रमशः एक क्षेत्र को दूर करने के लिए, [Shift] या [Alt] रहते हैं।
नोट: यदि hyperdense thromboembolic घावों 'मुक्तहस्त चयन उपकरण' के बजाय, बोनी संरचनाओं से दूर हैं, 'छड़ी उपकरण' सुरक्षित रूप से अपने 'सहिष्णुता' के स्तर को बदलने के बिना इस्तेमाल किया जा सकता है।
- खंडों घावों की मात्रा (चित्रा 5 डी)
- का प्रयोग करें 'का विश्लेषण करें> सेट माप' का चयन करने के लिए 'क्षेत्र', 'मतलब ग्रे मूल्य', और 'एकीकृत घनत्व (क्षेत्र x माध्य)9 ;. 'दहलीज को सीमा' और 'प्रदर्शन लेबल': निम्नलिखित विकल्पों की जाँच करें। का प्रयोग करें 'का विश्लेषण करें> उपाय' मात्रा निर्धारित डेटा पाने के लिए। फिर, एक ".xls" फ़ाइल के रूप में परिणाम बचाने के लिए।
- झगड़ा प्रारूप में ढेर फ़ाइल सहेजें। इसके अलावा, 'विश्लेषण> उपकरण> रॉय प्रबंधक' ROIs को बचाने के लिए इस्तेमाल करते हैं।
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Representative Results
बाहर का आंतरिक मन्या धमनी के एसीए विभाजन क्षेत्र (चित्रा 6 - आधारभूत microCT छवियों, प्रशासन मिथ्या-जीसी AuNP एम्बोलिक स्ट्रोक के बाद 1 घंटा (10 मिलीग्राम / एमएल, 300 μl), स्पष्ट रूप से एमसीए में मस्तिष्क thrombus से कल्पना के बाद विवो में प्राप्त )। अनुवर्ती microCT इमेजिंग खारा उपचार के साथ गाय thrombus में कोई बदलाव नहीं दिखाया। हालांकि, टीपीए के साथ इलाज गाय thrombus के एक क्रमिक विघटन (चित्रा 6 में नीले तीर) से पता चला है। यह निष्कर्ष यह दर्शाता है कि microCT thrombus इमेजिंग थ्रोम्बोलिसिस की चिकित्सीय निगरानी की अनुमति कर सकते हैं। वहाँ 24 घंटे में इन विवो सीटी घनत्व और पूर्व vivo NIRF के बीच एक उत्कृष्ट पत्राचार अवशिष्ट thromboemboli के लिए है। नोट अंतर्जात thrombus अंकन आतंच को निशाना AuNPs अच्छी तरह से करने के कारण NIRF संकेत क्षेत्रों के साथ सह स्थानीय द्वारा की वजह से hyperdense microCT क्षेत्रों बहिर्जात thrombus अंकन, जो EMBO से पहले प्रदर्शन किया गया थाएक Cy5.5 फ्लोरोसेंट जांच जमावट कारक XIIIa की मध्यस्थता आतंच crosslinking preformed थक्का की परिपक्वता की प्रक्रिया में गतिविधि (चित्रा 6) के प्रति संवेदनशील का उपयोग करके एलआईसी स्ट्रोक। के रूप में टीटीसी धुंधला द्वारा मापा प्रत्यक्ष thrombus इमेजिंग टीपीए की मध्यस्थता थ्रांबोलिटिक प्रभाव को प्रदर्शित करने के संयुक्त तकनीक ऊतकीय स्ट्रोक परिणाम को दर्शाता है। टीटीसी धुंधला एक स्पष्ट पशु टीपीए थ्रोम्बोलिसिस प्राप्त करने के लिए इस्कीमिक मस्तिष्क क्षति की राशि में (चित्रा 6 में श्वेताभ क्षेत्रों) में कमी देखी गई।
चित्रा 1:। Fluorescently लेबल खून का थक्का की तैयारी का अवलोकन (ए) Cy5.5 लगभग अवरक्त फ्लोरोसेंट साथ नए सिरे से पूरे रक्त का मिश्रण (NIRF) जांच (C15) कि covalently आतंच द्वारा thrombus के आतंच किस्में से जुड़ा हुआ है सक्रिय coagu की -crosslinking एंजाइमी कार्रवाईथक्का परिपक्वता की प्रक्रिया के दौरान आबादी कारक XIIIa। मिश्रित रक्त एक पॉलीथीन (पीई) -50 ट्यूब में इंजेक्ट किया और 24 घंटे के लिए छोड़ दिया थक्का बनने और परिपक्वता की अनुमति है। (बी) NIRF इमेजिंग C15 जांच के साथ thrombus के ऑप्टिकल लेबलिंग पुष्टि करने के लिए। thrombus कि पीई ट्यूब से हटा दिया गया था धोने के बाद नोट लगातार प्रतिदीप्ति। चूहों में आंतरिक मन्या धमनी का अग्र मस्तिष्क धमनी विभाजन क्षेत्र - (ग) thrombus से भरी हुई एक पीई 50 ट्यूब एक पतला अंत (200 माइक्रोन व्यास) मध्य मस्तिष्क धमनी में थ्रामोएम्बाल्जिम के लिए है करने के लिए संशोधित साथ पीई 10 ट्यूब। स्केल सलाखों:। 2 मिमी कृपया यहाँ यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।
चित्रा 2: मॉडलिंग अपरोक्ष के एक माउस मॉडल का अवलोकनmboembolic मस्तिष्क रोधगलन। (ए) के पहले और मध्य मस्तिष्क धमनी (एमसीए) का रोड़ा के बाद मस्तिष्क में रक्त प्रवाह (CBF) की लेजर डॉपलर निगरानी, लेजर डॉपलर प्रवाहमापी के ऑप्टिकल फाइबर बाएं कनपटी की हड्डी सतह से चिपके के बाहर का अंत के साथ (1 मिमी छोड़ दिया और शीर्षस्थान से नीचे 4 मिमी)। नोट डॉपलर CBF के बाद रोड़ा कमी है, जो आधारभूत की तुलना में 30% या कम से कम किया जाना चाहिए। (बी) thrombus युक्त कैथेटर की प्रविष्टि (यानी, चित्रा 1C में distally पतला पॉलीथीन -50 ट्यूब) बाह्य मन्या धमनी (ईसीए), में छेद में पीछा (अंततः) एमसीए में कैथेटर के बारे में 9 मिमी से आगे बढ़ कर - बाहर का आंतरिक मन्या धमनी (आईसीए) के पूर्वकाल मस्तिष्क धमनी (एसीए) विभाजन के क्षेत्र। सीसीए, आम मन्या धमनी; पीपीए, pterygopalatine धमनी। देखने के लिए यहाँ क्लिक करेंयह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण।
चित्रा 3: के अवलोकन में विवो microCT आधारित प्रत्यक्ष thrombus इमेजिंग आतंच लक्षित सोने के नैनोकणों का उपयोग कर सेरेब्रल Thromboemboli कल्पना और मॉनिटर ऊतक plasminogen उत्प्रेरक (टीपीए) मध्यस्थता थ्रांबोलिटिक प्रभाव (ए) आतंच-लक्षित ग्लाइकोल-chitosan सोने के नैनोकणों की नसों में इंजेक्शन। (मिथ्या-जीसी AuNPs) thromboembolic स्ट्रोक के साथ एक माउस में। (बी) माउस एक microCT इमेजर के बिस्तर पर रखा गया है। (सी) मिथ्या-जीसी AuNPs के इंजेक्शन के बाद 5 मिनट पर microCT छवियों को प्राप्त करने। (डी) छवि के पुनर्निर्माण के लिए एक सॉफ्टवेयर पैकेज microCT स्कैनर पर स्थापित का उपयोग कर चिकित्सा (DICOM) प्रारूप में डिजिटल इमेजिंग और संचार में कच्चे छवि डेटा को बदलने की। (ई) छवि विश्लेषण और अक्षीय / सी की तैयारीoronal छवियों अधिक से अधिक तीव्रता प्रक्षेपण मोड का उपयोग करके 2 मिमी मोटाई के लिए गाया। (एफ) अंतःशिरा टीपीए की मध्यस्थता थ्रोम्बोलिसिस, जो नजर रखी जा सकती है और विश्लेषण microCT आधारित प्रत्यक्ष thrombus इमेजिंग विधि का उपयोग कर। (सी - ई) यहाँ यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।
चित्रा 4:। पूर्व विवो लगभग अवरक्त फ्लोरोसेंट (NIRF) सेरेब्रल Thromboemboli की इमेजिंग (ए और बी) के एक प्रतिनिधि मस्तिष्क के ऊतकों thromboembolic स्ट्रोक के साथ एक माउस से हटा का अवलोकन। पूर्वकाल मस्तिष्क धमनी (एसीए) विभाजन (आईसीए बाहर का आंतरिक मन्या धमनी का क्षेत्र, - सावधानी बरतने के मध्य मस्तिष्क धमनी में thromboemboli (लाल तीर) को खोना नहीं (एमसीए)नीले तीर) जब मस्तिष्क को हटाने। (सी और डी) पूर्व vivo NIRF thrombus इमेजिंग। मस्तिष्क के ऊतकों thrombus (डी में लाल तीर) एमसीए की एम्बोलिक रोड़ा पहले Cy5.5 फ्लोरोसेंट मार्कर C15 के साथ पूर्व लेबल के दृश्य के लिए एक NIRF इमेजर (सी) के प्रकाश तंग कक्ष के अंदर रखा गया है - एसीए विभाजन क्षेत्र। सीटी उपस्थिति के लिए यह आंकड़ा करने के लिए 5 की तुलना करें। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 5: microCT छवियाँ और का उपयोग कर बढ़ाता thrombus खंड का अवलोकन ImageJ (1.49d) (ए), एक नया ढेर फ़ाइल में छवियाँ आयात 8 बिट ग्रे स्केल में फ़ाइल स्वरूप परिवर्तित करने, और करने के लिए यूनिट बदल रहा है।मिमी। (बी) पृष्ठभूमि घटाव। (सी) hyperdense क्षेत्रों के आसपास ब्याज (आरओआई) के क्षेत्र ड्राइंग, जबकि बोनी संरचनाओं को छोड़कर द्वारा thromboembolic घावों के विभाजन। (डी) मेनू का उपयोग 'का विश्लेषण करें> उपाय' द्वारा रॉय के लिए मात्रात्मक डेटा हासिल करना। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 6:। प्रतिनिधि प्रत्यक्ष सेरेब्रल thrombus इमेजिंग डेटा एक्वायर्ड पहले और बनाम ऊतक plasminogen उत्प्रेरक (टीपीए) (ए) microCT (एमसीटी) thrombus इमेजिंग नमक के साथ stroked चूहे इलाज ऊतक plasminogen उत्प्रेरक की चिकित्सीय निगरानी की अनुमति के बाद (टीपीए) मध्यस्थता थ्रोम्बोलिसिस । (बी और
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Discussion
हम एम्बोलिक स्ट्रोक की प्रयोगात्मक मॉडल में प्रत्यक्ष thrombus इमेजिंग के लिए दो पूरक आणविक इमेजिंग तकनीक के उपयोग का प्रदर्शन: एक आतंच इन विवो microCT आधारित इमेजिंग के लिए सोने nanoparticle (मिथ्या-जीसी AuNP) को निशाना बनाया, और एक FXIIIa पूर्व के लिए ऑप्टिकल इमेजिंग जांच निशाना फ्लोरोसेंट इमेजिंग विवो।
मिथ्या-जीसी AuNPs की नसों में प्रशासन के बाद, thrombi दिखाई सीटी घने संरचनाओं के रूप में, बनने के बाद एकाग्रता gradient- कणों की वजह से आतंच को निशाना पेप्टाइड्स की कार्रवाई (कणों की सतह पर) द्वारा thrombi में फँस बनने झरझरा संरचना, यानी, thrombi में निर्भर प्रसार। इस प्रक्रिया में केवल एक ही दिशा में होने के लिए दिखाई दिया, और तेजी से रक्त में nanoparticle की अपेक्षाकृत कम मात्रा की वजह से थक्का में केंद्रित हो जाते हैं, और पर्याप्त अपने सीटी घनत्व को बदलने का पता लगाने की अनुमति है। 24 घंटे में फाइनल में विवो microCT इमेजिंगअच्छी तरह से पूर्व vivo मस्तिष्क का पोस्टमार्टम NIRF इमेजिंग के साथ सहसंबद्ध, प्रारंभिक thrombi कि fluorescently ऑप्टिकल जांच मस्तिष्क धमनी में रखा जा रहा से पहले FXIIIa की आतंच crosslinking गतिविधि पहचानने के साथ चिह्नित किया गया था के बाद टीपीए residua दिखा। इस तरीके में, दो आणविक इमेजिंग जांच, कार्रवाई और विभिन्न इमेजिंग तौर तरीकों, प्रत्येक रिपोर्ट और अलग तंत्र का उपयोग अन्य के निष्कर्षों पार की पुष्टि करें।
thrombi का विकास एक ही विधि का उपयोग पीछा किया जा सकता है; विशेष रूप से, टीपीए के साथ थ्रांबोलिटिक चिकित्सा की इजाजत दी थ्रोम्बोलिसिस की सफलता की एक तेजी से और समय पर readout सीटी द्वारा प्रदर्शन किया जा विवो में पीछा किया जा सकता है। यह नैदानिक थ्रोम्बोलिसिस के लिए गहरा प्रभाव पड़ता है, और भी नए विरोधी थ्रोम्बोटिक या थ्रांबोलिटिक उपचारों के विकास के लिए अनुसंधान आवेदन किया है।
इससे पहले, हमारे समूह स्ट्रोक चिकित्सा में एक आम समस्या का पता लगाने में सक्षम था, आरई-थ्रोम्बोसिस 3 अक्सर बाद में फिर से रोड़ा और बिगड़ती परिणामों के साथ, एक आंशिक रूप से इलाज किया थक्का के आसपास होने वाली। पुनः थ्रोम्बोसिस ही पशुओं में अलग अलग समय पर अलग-अलग स्थानों 4 (बाएं बाहर का सीसीए, छोड़ दिया समीपस्थ सीसीए, सही बाहर का सीसीए, और फिर सही समीपस्थ सीसीए) पर 1 मिमी FeCl 3 -soaked फिल्टर कागजात (ग्रेड 42) क्रमिक रूप से लागू करने से मॉडलिंग की थी । सभी मामलों में, घूम मिथ्या-जीसी AuNP thrombi में जमते प्रदर्शन किया गया, और सीटी के साथ इमेजिंग के लिए इन दिखाई प्रतिपादन। इस आशय की यह अवधि केवल मिथ्या-जीसी AuNP, जो वर्तमान में अज्ञात है की जैविक आधा जीवन तक सीमित किया जा रहा है, और fib- की प्रारंभिक इंजेक्शन के बाद एक विस्तारित समय (अप करने के लिए 3 सप्ताह के लिए) के लिए देखा गया है जीसी AuNP। यह चिकित्सकीय महान ब्याज की है क्योंकि nanoparticle एजेंट की एक खुराक दोनों सफलता और चिकित्सीय उपचार परहेजों की विफलताओं के अवलोकन के लिए कारगर साबित हो सकता है। आगे के अध्ययन फार्माकोकाइनेटिक्स और biodistri का आकलन करने के लिए आवश्यक हैंमिथ्या-जीसी AuNP की bution।
मिथ्या-जीसी AuNPs की रासायनिक संश्लेषण पहले से विस्तार से 4 में वर्णित किया गया है। संक्षेप में, आतंच को निशाना पेप्टाइड्स (tyrosine-D-glutamine सिस्टीन-hydroxyproline-एल-3-chlorotyrosine ग्लाइसिन-leucine सिस्टीन-tyrosine-isoleucine-glutamine) ईपी-2104R चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग में इस्तेमाल (एमआरआई) एजेंट 8 हैं मानक ठोस चरण Fmoc पेप्टाइड रसायन विज्ञान के द्वारा संश्लेषित, और 1-इथाइल-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide और एन हाइड्रोक्सी succinimide का उपयोग कर जीसी लेपित AuNPs की सतह के लिए संयुग्मित। अंतिम उत्पाद, शुद्ध मिथ्या-जीसी AuNPs centrifugation द्वारा एकत्र कर रहे हैं।
Preformed thrombus के ऑप्टिकल लेबलिंग के लिए C15 NIRF जांच एक 15 एमिनो एसिड पेप्टाइड FXIIIa द्वारा मान्यता प्राप्त है और लाइसिन अवशेषों Cy5.5 फ्लोरोसेंट डाई के साथ 9,10 के ε अमीनो समूहों पर लेबल है। ऑप्टिकल इमेजिंग एजेंट covalently अधिनियम के enzymatic कार्रवाई से thrombus के आतंच किस्में से जुड़ा हुआ हैजमावट कारक ivated, जब यह थक्का परिपक्वता 11,12 की प्रक्रिया के दौरान आतंच किस्में crosslinks। C15 NIRF thrombus मार्कर की रासायनिक संश्लेषण भी पहले से विस्तार से 4 में वर्णित किया गया है। संक्षेप में, FXIIIa समानता पेप्टाइड्स (ग्लाइसिन-asparagine-alanine-ग्लूटामेट-glutamine-valine-सेरीन प्रोलाइन-leucine-threonine-leucine-leucine-लाइसिन-नियासिन) alph-2-antiplasmin के एन टर्मिनस के आधार पर ठोस द्वारा संश्लेषित कर रहे हैं चरण पेप्टाइड संश्लेषण और फिर Cy5.5 के साथ लेबल सिस्टीन पक्ष श्रृंखला के माध्यम से fluorochromes। उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी का उपयोग, उत्पाद शुद्ध है और अंतिम यौगिक एकत्र किया जाता है।
दोनों NIRF और सोने nanoparticle एजेंटों की सफलता क्योंकि इन एजेंटों की मजबूत जैविक डिजाइन सुविधाओं की संभावना है। FXIIIa 11 एक मौलिक महत्वपूर्ण थ्रोम्बिन सक्रिय tetrameric transglutaminase, जमावट एंजाइम है कि fibrinolytic प्रतिरोध मध्यस्थता करता है। इस की गतिविधिएंजाइम नवगठित thrombi की एक बानगी के रूप में माना जाता है। हमारे दोनों एजेंटों इस मौलिक रक्त जमावट एंजाइम (FXIIIa संवेदन C15 ऑप्टिकल एजेंट) के द्वारा या उसके सब्सट्रेट (आतंच को निशाना मिथ्या-जीसी AuNP सीटी एजेंट द्वारा) के साथ दृढ़ता से बातचीत।
सह स्थानीयकरण के अध्ययन से पता चला है परस्पर की वजह से पूर्व vivo प्रतिदीप्ति (बहिर्जात thrombus मार्कर) और आतंच बाध्यकारी nanoparticle, जो उम्मीद है के साथ imaged मस्तिष्क thrombi के लिए विवो में microCT घनत्व (अंतर्जात thrombus मार्कर) के बीच एक उत्कृष्ट पत्राचार नहीं था, दोनों एजेंटों के लिए संबंधित जैविक फंसाने तंत्र।
वहाँ कई चीजें हैं जब दोहरे मोडल प्रत्यक्ष thrombus इमेजिंग तकनीक का उपयोग पर विचार कर रहे हैं। सबसे पहले, एकत्रीकरण से मिथ्या-जीसी AuNPs को रोकने के लिए और biocompatibility प्राप्त करने के लिए, ग्लाइकोल chitosan सतह कोटिंग 13 के लिए प्रयोग किया जाता है। नसों में इंजेक्शन हालांकि इससे पहले, thrombus इमेजिंग एजेंट resuspen किया जाना चाहिएपीबीएस में ded, और विघटन और नैनोकणों के फैलाव सुनिश्चित करने के लिए sonicated। इसके अलावा, nanoparticle स्थिरता मिथ्या-जीसी AuNPs की ताजा बनाम पुराने स्टॉक, जो दोनों के 519 एनएम के बारे में होना चाहिए की सतह plasmon अनुनाद चोटियों तुलना करने के लिए पराबैंगनी दिखाई (यूवी विज़) अवशोषण स्पेक्ट्रोस्कोपी का उपयोग करके मूल्यांकन किया जा सकता है।
इस तरह, 600 से 1,200 स्लाइस से 'स्कैन संख्या' बढ़ाने या 1 से 3 तक 'औसत' वृद्धि के रूप में जो हालांकि समय की आवश्यकता को पूरा वृद्धि होगी: दूसरा, microCT thrombus छवियों का संकल्प स्कैनिंग मानकों को बदलने से सुधार किया जा सकता है स्कैन।
इस अध्ययन में थक्का के फ्लोरोसेंट लेबलिंग के लिए 3 से 5: तीसरा, रक्त और C15 NIRF इमेजिंग एजेंट 7 के अनुपात में मिलाया गया। हमारे अनुभव के अनुसार, एक अपेक्षाकृत कम रक्त की मात्रा thrombus गठन में बाधा सकता है, जबकि एक अपेक्षाकृत उच्च रक्त की मात्रा thrombus के detectability कम कर सकता हैपूर्व vivo फ्लोरोसेंट thrombus से उत्सर्जन संकेत के क्षीणन की वजह से। इसके अलावा, यह है कि कई अलग अलग दृष्टिकोण एक thrombus 14 के विभिन्न घटकों के फ्लोरोसेंट दृश्य के लिए इस्तेमाल किया जा सकता उल्लेखनीय है।
चौथा, FeCl 3 मध्यस्थता बगल में घनास्त्रता मॉडल जहां लक्ष्य धमनी केवल आंशिक रूप से अवरोधित है के साथ तुलना में, मस्तिष्क thromboemboli की microCT दृश्य है कि पूरी तरह से रोक देना पोत मिथ्या-जीसी AuNPs 4 के अपेक्षाकृत उच्च खुराक की आवश्यकता है। इस प्रकार, वहाँ विषाक्तता चिंताओं, हालांकि सोने कोलाइड biocompatible हो सकता है और मिथ्या-जीसी AuNPs पिछले एक अध्ययन में ध्यान देने योग्य 4 प्रणालीगत / neurobehavioral विषाक्तता नहीं दिखा था माना जाता है हो सकता है।
पांचवां, क्लिनिकल परीक्षण से पता चला कि प्लेटलेट-लक्षित या आतंच-लक्षित gadolinium (जीडी) आधारित एमआरआई एजेंटों दिल कक्षों, मन्या धमनियों में thrombi की hyperintensity वृद्धि कर सकता है, और महाधमनी चाप T1 भारित छवियों 15 पर। हालांकि एमआरआई एक उत्कृष्ट नरम ऊतक विपरीत है और एक उच्च स्थानिक संकल्प किया है, एमआरआई एक समय लेने वाली परीक्षा है। सीटी अपेक्षाकृत गरीब नरम ऊतक विपरीत से ग्रस्त है, हालांकि सीटी स्कैन तेजी से किया जा सकता है। तदनुसार, सीटी 16 स्ट्रोक की तीव्र प्रबंधन में सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल इमेजिंग तकनीक बनी हुई है। इसके अलावा, छोटे पशु इमेजिंग के लिए microCT सिस्टम की आवश्यकता नहीं है वास्तु विकिरण परिरक्षण स्थापित करने के लिए, और उच्च संकल्प छवियों प्रदान करते हैं। इस प्रकार, microCT पूर्व vivo reflectance प्रतिदीप्ति इमेजिंग के साथ या विवो प्रतिदीप्ति टोमोग्राफी 17 में संयुक्त छोटा सा जानवर अनुसंधान के लिए बहुत उपयोगी है। वैकल्पिक रूप से, एमआरआई / सीटी दोहरे मोडल Au-फे का उपयोग कर इमेजिंग नैनोकणों 18-20 भी दोनों पशुओं और मनुष्यों में थक्का इमेजिंग के लिए एक शक्तिशाली मंच हो सकता है; एमआरआई और सीटी एक दूसरे के पूरक हो सकता है और, ऑप्टिकल इमेजिंग के विपरीत, वे कम ऊतक प्रवेश की समस्या से ग्रस्त नहीं है।
सामग्री "> निष्कर्ष, संयुक्त सीटी और प्रत्यक्ष thrombus दृश्य के लिए फ्लोरोसेंट इमेजिंग में इस्कीमिक स्ट्रोक की जांच के लिए एक शक्तिशाली अनुसंधान उपकरण, thrombus का पता लगाने, चिकित्सा की निगरानी, और चिकित्सा उलझी फिर से घनास्त्रता का पता लगाने में सुधार करने का वादा किया है। इसके अलावा, वहाँ इन तकनीकों के नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए महत्वपूर्ण क्षमता है।Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
DE.K., JY.K, CH.A, और केके आतंच-लक्षित सोने nanoparticle के पेटेंट धारक हैं (10-1474063-0000, कोरियाई बौद्धिक संपदा कार्यालय)। शेष लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।
Acknowledgments
इस काम कोरिया हेल्थकेयर प्रौद्योगिकी अनुसंधान एवं विकास परियोजना, स्वास्थ्य एवं कल्याण मंत्रालय (HI12C1847, HI12C0066) द्वारा समर्थित किया गया था, जैव प्रौद्योगिकी और चिकित्सा विकास कार्यक्रम (2010-0019862) और ग्लोबल रिसर्च लैब (GRL) कार्यक्रम के (एनआरएफ-2015K1A1A2028228) नेशनल रिसर्च फाउंडेशन, कोरियाई सरकार द्वारा वित्त पोषित।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Machines | |||
| microCT | NanoFocusRay, JeonJu, Korea | NFR Polaris-G90 | |
| NIRF imaging system | Roper-scientific,Tucson, AZ | coolsnap-Ez | |
| Laser Doppler flowmeter | Perimed, Stockholm, Sweden | PeriFlux System 5000 | |
| Surgical microscope | Leica Microsystems, Seoul, Korea | EZ4HD | |
| Inhalation anesthesia machine | PerkinElmer, Massachusetts, USA | XGI-8 | |
| Software | |||
| NFR control | NanoFocusRay, JeonJu, Korea | NFR Polaris-G90 | microCT control software |
| Lucion | Infinitt, Seoul, Korea | Lucion | 3D render imaging software |
| Lab chart 7 | ADInstruments, Colorado, USA | Lab chart 7 | rCBF |
| ImageJ software | Wanye Rasband, NIH, USA | 1.49d | imaging analysis |
| Devices/Instruments | |||
| Infusion pump | Harvard, Massachusetts, USA | pump 22(55-2226) | |
| Homeothermic blanket | Panlab, Barcelona, Spain | HB101 | |
| Pocket cautery | Daejong, Seoul, Korea | DJE-39 | |
| Brain matrice | Ted pella, CA, USA | 15003 | coronal section |
| PE-50 tubing | Natsume, Tokyo, Japan | SP-45(PE-50) | I.D. 0.58 mm O.D. 0.96 mm |
| PE-10 tubing | Natsume, Tokyo, Japan | SP-10(PE-10) | I.D. 0.28 mm O.D. 0.61 mm |
| 30 gauge needle | sungshim-medical, Seoul, Korea | ||
| Syringe | CPL-medical, Ansan, Korea | 1 & 3 cc | |
| Gauze | Panamedic, Cheonan, Korea | ||
| Tape | Scotch, Seoul, Korea | 3M-810 | |
| Micro forceps | Fine Science Tools, Vancouver, Canada | 11253-27 | Dumont #L5 |
| Micro scissor | Fine Science Tools, Vancouver, Canada | 15000-03 | Vannas spring |
| Scissor | Fine Science Tools, Vancouver, Canada | 14084-08 | 8.5 cm |
| Black silk suture | Ailee, Busan, Korea | SK6071, SK728 | 6-0 and 7-0 |
| Reagents | |||
| meloxicam | Yuhan, Seoul, Korea | ||
| vet ointment | Novartis, Basel, Swiss | ||
| 10% Povidone-iodine (betadine) | Firson, Cheon-an, Korea | ||
| FeCl3 | Sigma, Missouri, United States | 157740-5G | |
| TTC | Amresco, Ohio, USA | 0765-100g | |
| Isoflurane | Hana-Pham, Gyeonggi, Korea | Ifran | 100 ml |
| PBS | Welgene, Daegu, Korea | LB001-02 | 500 ml |
| Gold nanoparticles | Synthesis | ||
| C15 optical agent | Synthesis | ||
| Tissue plasminogen activator | Boehringer Ingelheim, Biberach, Germany | rtPA(actilyse) | 20 mg |
| Normal saline | Daihan Pham, Seoul, Korea | 48N3AF3 | 20 ml |
References
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