Summary
Este protocolo describe la aplicación de la tomografía combinado fluorescente en el infrarrojo cercano (NIRF) de formación de imágenes y micro-computarizada (microCT) para la visualización de tromboembolia cerebral. Esta técnica permite la cuantificación de la carga de trombo y la evolución. La técnica de imagen NIRF imagina y marcado con fluorescencia de trombos en el cerebro escindido, mientras que la técnica microCT visualiza trombo dentro de animales vivos utilizando nanopartículas de oro-.
Abstract
la visualización de trombos directa visualiza la causa del infarto tromboembólica. Ser capaz de imagen de trombo directamente permite mucho mejor la investigación de accidente cerebrovascular de confiar en mediciones indirectas, y será una herramienta de investigación vascular potente y robusto. Utilizamos un enfoque de imágenes ópticas que etiqueta trombos con un marcador de trombos imagen molecular - un Cy5.5 fluorescente en el infrarrojo cercano (NIRF) sonda que se une covalentemente a las hebras de fibrina del trombo por la acción enzimática de fibrina-reticulación de activado XIIIa factor de coagulación durante el proceso de maduración del coágulo. Un enfoque basado en tomografía micro-computarizada (microCT) utiliza nanopartículas de oro trombo de búsqueda (AuNPs) funcionalizados para orientar el componente principal del coágulo: fibrina. Este documento describe un protocolo detallado para el combinado in vivo y ex vivo microCT NIRF de imágenes de trombos en un modelo murino de accidente cerebrovascular embólico. Se demuestra que in vivo </ em> microCT y AuNPs glicol-quitosano de fibrina-dirigida (fib-GC-AuNPs) se puede utilizar para la visualización de trombos tanto en situ y trombos embólico cerebral. También describimos el uso de imágenes de trombos in vivo directa a base de microCT para controlar en serie los efectos terapéuticos de plasminógeno tisular trombólisis activador mediada. Después de la última sesión de imágenes, se demuestra por el ex vivo NIRF imágenes de la extensión y la distribución de tromboembolias residual en el cerebro. Por último, se describen los análisis de imagen cuantitativo de los datos de imagen y microCT NIRF. La técnica combinada de la visualización de trombos directa permite dos métodos independientes para la visualización de trombos que deben compararse: el área de la señal fluorescente relacionada trombo-en ex vivo NIRF de imágenes frente al volumen de trombos hyperdense microCT in vivo.
Introduction
Uno de cada 6 personas tendrá un derrame cerebral en algún momento de su vida. El ictus isquémico es de lejos el tipo más común de accidente cerebrovascular, y representa alrededor del 80 por ciento de todos los casos de accidente cerebrovascular. Debido a que los trombos causan la mayoría de estos accidentes cerebrovasculares isquémicos, existe un interés creciente en la visualización de trombos directa.
Se estima que alrededor de 2 millones de células cerebrales mueren durante cada minuto de oclusión de la arteria cerebral media 1, lo que lleva a la consigna "El tiempo es cerebro". La tomografía computarizada (TC) los estudios se puede hacer rápidamente, y están ampliamente disponibles; por esta razón, CT sigue siendo la imagen de elección para el diagnóstico y el tratamiento del ictus isquémico hiperagudo inicial. CT es particularmente valioso para informar a las decisiones tempranas críticas: la administración de activador de plasminógeno tisular (tPA) para la trombólisis y / o triaging a endovascular coágulo de recuperación de 2. Actual de formación de imágenes de trombos a base de CT, sin embargo, no puede realizar un seguimiento en serie cerebrosl trombos in vivo, ya que utiliza métodos indirectos para demostrar trombos: después de la opacificación de la acumulación de sangre en contraste yodado, los trombos se demostró como el relleno de defectos en los vasos. Hay límites y riesgos de dosis asociados con la administración repetida de contraste yodado, que excluyen la posibilidad de formación de imágenes de trombos repiten de esta manera.
Por lo tanto, hay una necesidad crítica de una metodología de formación de imágenes directa de trombos cerebral en pacientes con accidente cerebrovascular, para permitir mejores decisiones de tratamiento más rápido y a realizar. Proponemos de lograr esto mediante la mejora del valor de CT, la técnica de imagen de primera línea se utiliza actualmente para el accidente cerebrovascular, con el uso de un agente de imagen molecular de nanopartículas de trombos de búsqueda.
Hemos demostrado el uso de este agente mediante tomografía computarizada micro-(microCT), una alta resolución ex vivo o in vivo (animales pequeños) versión de imágenes de la TC que permite la adquisición rápida de datos <sup> 3,4. Incluso con el contraste de tejidos blandos relativamente pobre disponible para microCT de pequeños animales (mucho peor que la disposición de los escáneres de tamaño humano), el agente de imagen fue capaz de buscar y marcar trombos haciéndolos hyperdense en la TC, una "densa barco Indicativo 'reforzada por molecular formación de imágenes.
Como complemento a la técnica de TC, nuestro grupo ha desarrollado previamente una técnica de imagen óptica trombo directa usando la sonda fluorescente Cy5.5 en el infrarrojo cercano (NIRF) para visualizar cerebral carga trombótica 5. Esta es una técnica ex vivo en cerebros post mortem, pero es muy sensible, y sirve para confirmar los datos in vivo realizados en el marco de la investigación en.
Habiendo tanto la TC y NIRF basan las técnicas de imagen de trombo en busca nos permite comparar y contrastar estas técnicas para lograr datos de gran valor informativo sobre el papel de trombos y la visualización de trombos en el proceso de desarrollo de un accidente cerebrovascular isquémico.
MARIDOERE, se describe un protocolo detallado de una técnica combinada de microCT in vivo y ex vivo de formación de imágenes para visualizar directamente NIRF tromboembolia en un modelo murino de accidente cerebrovascular embólico. Estos métodos sencillos y robustos son útiles para avanzar en nuestra comprensión de las enfermedades trombóticas habilitando la precisión en la evaluación in vivo de trombos carga / distribución y caracterización de la evolución del trombo dinámica de una manera rápida y cuantitativa in vivo durante el tratamiento, seguido de los datos ex vivo que sirve como control y estándar de referencia para la confirmación de los resultados de formación de imágenes in vivo.
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Protocol
Todos los animales procedimientos demostrados en este protocolo han sido revisados y aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Hospital de la Universidad de Dongguk Ilsan y realizada de conformidad con los principios y procedimientos descritos en la Guía del NIH para el Cuidado y Uso de Animales.
1. Preparación de forma exógena coágulo formado Etiquetada con marcador de fluorescencia (Figura 1)
- Anestesiar un ratón en una cámara de inducción utilizando 3% de isoflurano mezclado con 30% de oxígeno (1,5 L / min 100% de oxígeno). Asegurar una adecuada profundidad de la anestesia mediante la observación de tono muscular y confirmando la ausencia del reflejo del dedo del pie de presión.
- Colocar el animal en un campo estéril en posición de decúbito prono, y mantenerlo bajo anestesia utilizando una máscara de inhalación y el 2% de isoflurano mezclado con un 30% de oxígeno. Realice los siguientes procedimientos utilizando técnicas asépticas y vestidos / máscaras / guantes / instrumentos estériles. Mantener condiciones estériles por la limpieza y desinfección del área experimental con alcohol al 70% antes de unand después de los procedimientos.
- Recoger la sangre alrededor de 300 ~ 1.000 l arterial después de la punción cardíaca 6. Mezclar 70 l de sangre completa con 30 l de la sonda 5 C15 (20 mmol / L de concentración), una sonda fluorescente Cy5.5 sensible a la actividad de fibrina-reticulación del factor XIII activado (FXIIIa) enzima de coagulación, para marcar fluorescentemente el coágulo (Figura 1A ). Inyectar la mezcla de sangre con una jeringa de 3 ml (23 aguja de calibre) en un tubo de polietileno de 20 cm de largo (PE-50, ID 0,58 mm). tubo de PE debe ser esterilizado (o certificado estéril por el fabricante) y los coágulos debe estar preparado asépticamente en una campana de cultivo de tejidos.
- Verificar la muerte del animal mediante la observación de la falta de respiración y pulso cardíaco.
- Deje el tubo cargado de sangre a temperatura ambiente durante 2 horas, después a 4 ° C durante 22 horas, y llevar a cabo los siguientes procedimientos, como se informó anteriormente 7.
- Cortar el tubo que contiene el trombo-en trozos de 1,5 cm de largo. Usando una jeringa de 3 ml llena con solución salina tamponada con fosfato (PBS), expulsar a un trombo en una placa de 6 pocillos que contiene PBS inyectando suavemente PBS en cada trozo de tubo. Lavar los trombos tres veces con PBS (Figura 1B).
- Cargar la porción de extremo distal de un cm de largo PE-10 tubo 15 (ID 0,28 mm) con una 1,5 cm de largo trombo dibujando cuidadosamente el trombo lavado, evitando burbujas de aire, utilizando una jeringa de 1 ml lleno de solución salina con un 30 aguja de calibre que se inserta en el extremo proximal del tubo.
- Conectar el tubo de PE-10 trombo-cargado con un 3 cm de largo PE-50 tubo (ID 0,58 mm) modificado para tener un extremo cónico (ID 200 micras), que se coloca en la arteria cerebral media (MCA) - anterior cerebral área de la arteria (ACA) bifurcación de la arteria carótida interna (ACI) en un modelo de ratón de accidente cerebrovascular embólico (Figura 1C).
2. Modelado de un modelo de ratón de ictus tromboembólico (Figura 2)
- Anesthetizea ratón diferente a ser trazada como se informó anteriormente 7 en una cámara de inducción utilizando 3% de isoflurano mezclado con 30% de oxígeno (1,5 L / min). Inyectar meloxicam (5 mg / kg) por vía subcutánea para aliviar el dolor post-quirúrgico. Asegurar una adecuada profundidad de la anestesia mediante la observación de tono muscular y confirmando la ausencia del reflejo del dedo del pie de presión.
- Aplique una pequeña cantidad de pomada veterinaria a cada ojo para prevenir la sequedad durante la anestesia. Realice los siguientes procedimientos quirúrgicos utilizando técnicas asépticas y vestidos / máscaras / guantes / instrumentos estériles. Mantener condiciones estériles mediante la limpieza y desinfección de la zona quirúrgica con 70% de alcohol antes, durante y después de la cirugía.
- Mover el ratón para una mesa de operaciones. Colocar el animal en un campo estéril en posición de decúbito prono, y mantenerlo bajo anestesia utilizando una máscara de inhalación y el 2% de isoflurano. A continuación, fijar la temperatura corporal a 36,5 ° C utilizando una manta homeotermos con los comentarios de un termómetro rectal.
- después de Surgical de preparación con betadine y alcohol al 70%, hacer una incisión vertical de 1 cm mediante el uso de un bisturí en el cuero cabelludo entre la oreja izquierda y el ojo. Pegar el extremo distal de la fibra óptica de un medidor de flujo Doppler láser sobre la superficie del hueso temporal izquierdo expuesta (1 mm a la izquierda y 4 mm por debajo de la bregma). A continuación, iniciar la monitorización del flujo Doppler (Figura 2A).
- Establecer el animal. Enderezar el cuello tirando del diente frontal superior con una cuerda atada a un alfiler y afeitar el área del cuello. A continuación, hacer una incisión de 3 cm de la línea media vertical, difundirlo abierta, y exponer los campos de tulipanes carótida izquierda mediante la disección de tejidos blandos peri-vasculares. Tenga cuidado de no lesionar el nervio vago.
- Ligar la arteria carótida común izquierda proximal (CCA) usando una sutura de seda negro estéril 6-0, y ligar la ACI izquierda y la arteria pterigopalatino izquierda (PPA) con 7-0 suturas de seda negra estériles.
- Cauterizar la arteria tiroidea superior izquierda, que es una rama de la USI arteria carótida externa izquierdang un cauterio monopolar eléctrica, y ligar la arteria carótida externa izquierda proximal (CEPA) sin apretar y el sitio más distal firmemente usando 7-0 suturas de seda negra estériles.
- El uso de un micro-tijera, hacer un agujero pequeño (alrededor de 0,2 ~ 0,25 m de diámetro) entre los sitios ligados de la ECA.
- Insertar el catéter que contiene un trombo-en el agujero en el TCE mientras afloja la ligadura proximal CEPA. Apriete la ligadura proximal CEPA de nuevo después de avanzar el catéter en el CCA con el fin de ceñir el catéter en su lugar.
- Cauterizar para cortar la parte distal de la CEPA, que es distal al sitio de la ligadura distal y proximal girar la CEPA libre hacia la derecha para ajustarla a la dirección de la ACI mientras se retira el catéter de la CCA. A continuación, avanzar el catéter cerca de 9 mm en el MCA - ACA área de bifurcación de la ACI distal inmediatamente después de aflojar la ligadura de la ACI. A continuación, apriete la ligadura de la ACI.
- Coloque el trombo en el área de bifurcación por la suavidadpresionando la jeringa de 1 ml para inyectar el trombo. Compruebe la disminución de Doppler del flujo sanguíneo cerebral (CBF), que debe ser rebajado por 30% o menor en comparación con la línea de base, si el trombo ocluyó con éxito el recipiente (Figura 2B).
- Retirar el catéter, y se liga al sitio proximal CEPA inmediatamente y con fuerza. Además, unligate la CCA y el PPA.
- Cerrar el sitio de la incisión mediante suturas de seda 6-0. Detener la anestesia después de continuar el seguimiento Doppler en un lapso de tiempo requerido (en este caso, durante 30 minutos después de la inyección de trombos). Vuelva a colocar el ratón en una jaula vacía y mantenerla caliente con una lámpara de calentamiento. No deje desatendido el ratón hasta que haya adquirido conciencia suficiente para mantener decúbito esternal.
3. En Vivo microTC de imagen de trombo cerebral (Figura 3)
- Re-anestesiar al ratón con 2% de isoflurano como se describe en la etapa 2.1 en una pre-especificada punto de tiempo (aquí, 1 hr) después de la apariciónde accidente cerebrovascular embólico, debido a la colocación de un trombo en la arteria cerebral. Garantizar una adecuada profundidad de la anestesia mediante la confirmación de la ausencia del reflejo del dedo del pie sujetador. Aplique una pequeña cantidad de pomada veterinaria a cada ojo para prevenir la sequedad durante la anestesia.
- Resuspender las nanopartículas de oro de fibrina-dirigida (fib-GC-AUNP 4) a una concentración de 10 mg de Au / ml en PBS 10 mM, y sonicar el agente de formación de imágenes de trombos durante 30 min para asegurar la disolución y dispersión de las nanopartículas. Inyectar 300 l fib-GC-AuNP (10 mg / ml) en la vena del pene.
- Colocar el animal en la cama de una máquina microCT, y enderezar el cuello tirando del diente frontal superior con una cuerda atada a un pasador para reducir los artefactos de movimiento.
- A los 5 minutos después de la inyección de fib-GC-AuNP, comenzar a obtener imágenes microCT del cerebro. Para los experimentos descritos aquí, utilice los siguientes parámetros de imagen: 65 kVp, 60 mu, 26,7 x 26,7 x 27,9 mm 3 campo de visión, 0,053 x 0,053 x 0,054 mm 3 tamaño de voxel, 100 milisegundos por cuadro, 1 de promedio, vistas de 360, 512 x 512 matriz de reconstrucción, 600 rebanadas, 64 seg tiempo de exploración.
- Vuelva a colocar el ratón en una jaula vacía y mantenerla caliente con una lámpara de calentamiento. No deje desatendido el ratón hasta que haya adquirido conciencia suficiente para mantener decúbito esternal.
- Transformar los datos de imágenes en bruto en Imagen Digital y Comunicaciones en formato Medicina (DICOM) utilizando el comando 'Inicio' del panel 'Reconstrucción' en un paquete de software instalado en el escáner microCT.
- Para los análisis cuantitativos de las imágenes (en el paso 6), transformar los datos en formato TIFF DICOM mediante el uso de un paquete de software disponible en el mercado de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Para análisis cualitativos, así como los análisis cuantitativos de una manera más simple y más rápida, utilice el paquete de software y los originales 0.054 mm de grosor imágenes en formato DICOM para generar un nuevo conjunto deimágenes axiales y coronales prestados a tener 1 o 2 mm (en este caso, 2 mm) de espesor, de la siguiente manera.
- Seleccione la carpeta DICOM en el árbol de la "Fuente de datos", haga clic en el botón derecho del ratón, e importar la carpeta de 'MasterDb' o 'PrivateDB'.
- Haga clic en el 'MasterDb' o 'PrivateDB' en el árbol de la 'Fuente de Datos' y seleccione la carpeta importada. Tras hacer clic en la pestaña '3D' en el panel de la izquierda, cuando la ventana 'Opciones' Cargando aparece, pulse "OK" para importar una secuencia de imágenes en la carpeta como una pila.
- Cambiar la representación de la imagen al formato de proyección de máxima intensidad (MIP) haciendo clic en la palabra "MRP" en las ventanas de imagen axial y coronal y eligiendo 'MIP' en el menú emergente. A continuación, cambiar el grosor imagen para 2 mm después de hacer clic en "TH: 0 [mm] 'en las mismas ventanas.
- Usando el 3D ancho de 2 mm navigator barra que permite la exploración de una pila de imágenes y cortar en un ángulo y la ubicación adecuada, preparar imagen de la sección de espesor axial a 2 mm, con una cobertura total del polígono de Willis (CP), que alberga trombos. Haga clic en el botón de captura (icono de la cámara) en el panel de "Salida". Guardar la imagen en formato TIFF.
- A continuación, preparar cinco 2 mm de espesor imágenes sección coronal que cubren de forma contigua desde el lóbulo frontal en el cerebelo.
- En primer lugar, preparar la segunda rebanada alineando cuidadosamente la barra del navegador en la imagen axial, de modo que la imagen coronal puede visualizar mejor la MCA - ACA trombos.
- A continuación, preparar los otros cuatro rebanadas de una manera contigua. Haga clic en el botón de captura (icono de la cámara) en el panel de "Salida". Guardar las imágenes en formato TIFF.
4. La trombolisis e in vivo microTC de imagen de trombo cerebral (Figura 3)
- Preparar un 100 cm de largo PE-10 tubo con una aguja de calibre 30 en un extremo y una jeringa de 1 ml en el otro extremo. Llenar el tubo con solución salina (600 l) o tPA (aquí, 24 mg / kg, 600 l), evitando burbujas de aire.
- Re-anestesiar el ratón como se describe en el paso 2.1. Inserte la punta de la aguja dentro de la vena del pene del animal. Colocar el animal con cuidado sobre la cama de la máquina microCT. Entonces, inmovilizar y estabilizar la parte inyectada por vía intravenosa del sistema de catéter con cinta adhesiva a la cama.
- Realizar una sesión de imágenes de seguimiento como línea de base pre-tratamiento. A continuación, inyectar o bien de 60 l de solución salina normal o tPA presionando el émbolo de la jeringa en el sistema de catéter. Después de la inyección en bolo, comenzar a infundir la solución restante (540 l) durante un período de tiempo (en este caso, 30 min).
- MicroCT obtener imágenes utilizando los mismos parámetros que en el paso 3.4 en el pre-especificados los puntos de tiempo: aquí, a las 3 y 24 horas después de la inyección en bolo. Para realizar el siguiente ex vivo NIRF tromformación de imágenes bus del cerebro, la eutanasia al animal bajo anestesia por dislocación cervical.
5. Ex Vivo NIRF de imágenes de trombos y el cloruro de trifenil tetrazolio (TTC) La tinción de los tejidos del cerebro (Figura 4)
- Después de la decapitación, quitar el cuero cabelludo y cortar el cráneo con una tijera desde el foramen magnum hacia la sutura sagital. Retire la bóveda craneal mediante la elevación cuidadosamente los bordes de la incisión cráneo con unas tijeras, evitando lesiones en el cerebro que subyace, por tanto, poner al descubierto los hemisferios.
- Cortar los nervios ópticos en la base del cerebro lo más cerca posible a la superficie del cerebro, ya que podrían solaparse con el círculo de Willis arterias que debe ser visualizado en la imagen NIRF. Entonces, con el fin de visualizar claramente la forma de Y 'MCA / ACA / ICA distal' para la formación de imágenes de trombos NIRF, cortar el ICA distal medida de lo posible a la superficie del cerebro después de comprimir suavemente la base del cerebelo para exponer THpuntos de corte e (Figura 4a).
- Realizar las imágenes NIRF (excitación / emisión, 675/690 nm; 1 segundos de exposición) del tejido cerebral eliminado con su base hacia arriba (Figura 4B, C), que visualiza la tromboembolia marcado con fluorescencia en las arterias de la vaca (Figura 4D) . A continuación, realice imágenes adicionales con el vértice del cerebro que apunta hacia arriba, lo que permite visualizar los trombos corticales. Evitar el secado del cerebro poniendo unas gotas de solución salina en el tejido.
- El uso de un dispositivo de matriz de cerebro de acuerdo con las instrucciones del fabricante, preparar rápidamente 2 mm de espesor cortes de cerebro coronal: 6 piezas de 2 mm rodajas gruesas (2,3, 0,3, -1,7, -3,7, -5,7 mm desde el bregma). Evitar el secado de las rodajas de cerebro mediante el uso de gotas de solución salina, y realizar NIRF de imágenes, tanto de la superficie frontal y posterior de las secciones.
- Poner las rodajas de cerebro en solución de cloruro de trifenil tetrazolio 2% (TTC) durante 20 min, evitando al mismo tiempo la exposición a light. A continuación, pasar las rebanadas en una solución de formaldehído al 4% a 4 ° C, evitando al mismo tiempo la exposición a la luz.
6. La cuantificación de trombo Área Usando MicroCT imágenes y ImageJ (1.49d) Software (Figura 5)
- Imágenes abiertos (Figura 5A).
- Abrir archivos de secuencias de imágenes para crear un archivo de pila con la opción 'Archivo> Importar> Secuencia de imágenes "o" Archivo> Abrir ". Convertir las imágenes a escala de grises de 8 bits mediante el uso de 'Imagen> Tipo> 8 bits'.
- Convertir la Unidad de pulgadas a milímetros (Figura 5A).
- Cuando un píxel de archivos de imagen de TC corresponde a 0,053 mm, utilice 'Analizar> Escala de Ajuste' para entrar en '1', '0.053', y 'mm' de 'Distancia en píxeles "," distancia conocida "y" unidad de longitud ', respectivamente.
- Cuando (sólo) una barra de escala está disponible,con la función 'Straight Line' dibujar una línea con su longitud igual a la de la barra de escala. A continuación, utilice 'Analizar> Escala de Ajuste' para introducir la longitud de la barra de escala en milímetros.
- La sustracción de fondo (Figura 5B)
- Por lugar usando 'Editar> Cambios> Especificar' una región circular o rectangular de interés (ROI) en un área del parénquima cerebral y sin trombos o regiones hiperdensas relacionadas con los huesos. Debido a que el retorno de la inversión especificada se aplica a cada rebanada de la pila, verifique para asegurarse si no se solapa con las regiones hiperdensas en cada rebanada.
- Elija 'Plugin> ROI> BG sustracción de retorno de la inversión "e introduzca 2.0 para el" Número de desvest respecto a la media'.
- La segmentación de lesiones relacionadas con el hiperdensas tromboembolias (Figura 5C)
- Elija 'Imagen> Ajustar> Umbral', e introduzca los valores de 'Lower Nivel de umbral "y" Alto nivel de umbral "como 22 y 255, respectivamente. Seleccione "Más / Menos" para mostrar píxeles por debajo del valor umbral inferior en azul, thresholded píxeles en escala de grises, y los píxeles por encima del valor umbral superior en verde.
- Utilice la 'Herramienta de selección a mano alzada "para dibujar regiones de interés que rodean las lesiones relacionadas con tromboembolia hiperdensas-sin incluir las zonas óseas. Durante el dibujo, mantenga presionando [SHIFT] o [Alt] para añadir o eliminar una región, respectivamente.
Nota: Si las lesiones tromboembólicos hiperdensas están distantes de las estructuras óseas, en lugar de la "Herramienta de selección a mano alzada", "Wand Tool 'con seguridad se puede utilizar sin cambiar su nivel de' tolerancia '.
- La cuantificación de las lesiones segmentadas (Figura 5D)
- Utilizar "Analizar> Set 'Medidas para elegir' Zona ',' valor de gris promedio ', y' Densidad Integrado (Zona Media X)9 ;. Compruebe las siguientes opciones: "Límite de Umbral" y "Etiqueta de visualización '. Use 'Analizar> Medida' para obtener los datos cuantificados. A continuación, guardar los resultados como un archivo ".xls".
- Guarde el archivo en formato TIFF pila. Además, utilizar "Analizar> Herramientas> Gestor de retorno de la inversión 'para guardar las regiones de interés.
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Representative Results
Las imágenes basales microCT, obtenidos in vivo después de la administración de fib-GC-AuNP (10 mg / ml, 300 l) a 1 hora después del accidente cerebrovascular embólico, visualiza claramente trombo cerebral en el MCA - área de bifurcación ACA de la arteria carótida interna distal (Figura 6 ). imágenes de seguimiento microCT no mostró ningún cambio en el trombo VACA con tratamiento salino. Sin embargo, el tratamiento con tPA mostró una disolución gradual del trombo COW (puntas de flecha de color azul en la Figura 6). Este hallazgo demuestra que la visualización de trombos microCT puede permitir el control terapéutico de la trombólisis. Hay una excelente correspondencia entre la densidad CT in vivo y ex vivo NIRF para tromboembolia residual a las 24 h. Tenga en cuenta que las áreas hyperdense microCT debido a un trombo-marcado por las AuNPs de fibrina-focalización muy bien co-localizada con áreas de señal debido a NIRF endógeno exógeno trombo-marca, que se realizó antes de la EMBOlic accidente cerebrovascular mediante el uso de una sonda fluorescente Cy5.5 sensible al factor de coagulación XIIIa mediada por fibrina-reticulación de la actividad en el proceso de la maduración del coágulo preformado (Figura 6). La técnica combinada de formación de imágenes de trombos directa para demostrar el efecto trombolítico mediada por tPA refleja pronóstico del accidente cerebrovascular histológico tal como se mide por tinción con TTC. TTC tinción mostró una clara reducción en la cantidad de daño cerebral isquémico (zonas blanquecinas en la Figura 6) para el animal que recibe tPA trombolisis.
Figura 1:. Descripción general de la Preparación de coágulo de sangre marcada con fluorescencia (A) La mezcla de sangre entera fresca con Cy5.5 fluorescente en el infrarrojo cercano (NIRF) sonda (C15) que está unido covalentemente a las hebras de fibrina del trombo por la fibrina -crosslinking acción enzimática de coagu activadoel factor XIIIa mento durante el proceso de maduración del coágulo. La mezcla de sangre se inyecta en un polietileno (PE) -50 tubo y se dejó durante 24 horas para permitir la formación y maduración del coágulo. (B) de formación de imágenes NIRF para confirmar el etiquetado óptico del trombo con la sonda C15. Tenga en cuenta la fluorescencia persistente después de lavar el trombo que fue retirado del tubo de PE. (C) del trombo-cargado tubo de PE-10 con un tubo de PE-50 modificado para tener un extremo cónico (200 micras de diámetro) de tromboembolismo en la arteria cerebral media - anterior área de bifurcación de la arteria cerebral de la arteria carótida interna en ratones. Las barras de escala:. 2 mm Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Visión general de Modelado de un modelo de ratón de Thromboembolic infarto cerebral. (A) el seguimiento láser Doppler del flujo sanguíneo cerebral (CBF) antes y después de la oclusión de la arteria cerebral media (ACM), con el extremo distal de la fibra óptica del medidor de flujo Doppler láser pegado a la superficie del hueso temporal izquierdo (1 mm a la izquierda y 4 mm por debajo de la bregma). Tenga en cuenta la disminución posterior a la oclusión de Doppler CBF, que debe ser rebajado en un 30% o menor en comparación con el valor basal. (B) La inserción del catéter que contiene trombo-(es decir, la distalmente ahusada polietileno-50 tubo en la Figura 1C) en el orificio en la arteria carótida externa (ACE), seguido (con el tiempo) haciendo avanzar el catéter alrededor de 9 mm en el MCA - área de la arteria cerebral anterior (ACA) bifurcación de la arteria carótida interna distal (ICA). CCA, la arteria carótida común; PPA, la arteria pterigopalatino. Haga clic aquí para veruna versión más grande de esta figura.
Figura 3: Visión general de trombos in vivo directa de imágenes usando-dirigida de fibrina nanopartículas de oro para visualizar cerebral tromboembolias y Monitor activador tisular del plasminógeno (tPA) mediada por efectos trombolíticos basados en microTC (A) La inyección intravenosa de nanopartículas de oro-glicol quitosano fibrina-dirigida. (FIB-GC-AuNPs) en un ratón con ictus tromboembólico. (B) El ratón se coloca en el lecho de un generador de imágenes microCT. (C) La adquisición de imágenes microCT en 5 min después de la inyección de fib-GC-AuNPs. (D) Reconstrucción de imágenes para transformar los datos de imágenes en bruto en Imagen Digital y Comunicaciones en formato Medicina (DICOM) utilizando un paquete de software instalado en el escáner microCT. (E) Análisis de la imagen y preparación de axial / cimágenes oronal prestados a tener un espesor de 2 mm utilizando el modo de proyección de intensidad máxima. Trombolisis mediada por tPA (F) por vía intravenosa, que puede ser controlada y analizada mediante el método de visualización de trombos directa basada en microCT. (C - E) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Vista general de la ex vivo de infrarrojo cercano fluorescente (NIRF) Obtención de imágenes de tromboembolia cerebral (A y B) Un representante de tejido cerebral extraído de un ratón con ictus tromboembólico.. Tome precauciones para no perder tromboembolias (flecha roja) en la arteria cerebral media (ACM) - área anterior de la arteria cerebral (ACA) bifurcación de la arteria carótida interna distal (ICA,flechas azules) al retirar el cerebro. (C y D) Ex vivo NIRF de imágenes de trombos. El tejido cerebral se coloca dentro de la cámara hermética a la luz de un generador de imágenes NIRF (C) para la visualización del trombo (flecha roja en D) pre-etiquetado con el marcador fluorescente C15 Cy5.5 antes de la oclusión embólica de la MCA - ACA bifurcación zona. Comparar con la Figura 5 para la aparición CT. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Vista general de cuantificar trombo volumen usando Imágenes MicroCT y ImageJ (1.49d) (A) Importación de imágenes en un nuevo archivo de pila, que convierte el formato de archivo en la escala de grises de 8 bits, y el cambio de la unidad a.mm. (B) Antecedentes resta. (C) Segmentación de las lesiones tromboembólicos mediante la elaboración de la región de interés (ROI) en torno a las áreas hiperdensas excluyendo las estructuras óseas. (D) La adquisición de los datos cuantitativos para el retorno de la inversión mediante el menú "Analizar> Medida '. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6:. Representante directa del trombo cerebral Imaging datos obtenidos antes y después de tratar ratones trazadas con solución salina vs activador tisular del plasminógeno (tPA) de formación de imágenes (A) microCT (MCT) trombo para permitir la monitorización terapéutica de activador tisular del plasminógeno (tPA) mediada por la trombolisis . (B y
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Discussion
Se comprobó el uso de dos técnicas de imagen molecular complementarios para la visualización de trombos directa en modelos experimentales de accidente cerebrovascular embólico: un fibrina dirigido nanopartículas de oro (FIB-GC-AuNP) de imágenes basado en microCT in vivo, y un FXIIIa apuntamos sonda de imagen óptica para la ex vivo de imágenes fluorescentes.
Después de la administración intravenosa de fib-GC-AuNPs, los trombos se hizo visible a la TC como estructuras densas, causada por las partículas quede atrapado en los trombos por la acción de los péptidos de fibrina-orientación (en la superficie de las partículas) después de la concentración de gradiente difusión depende en la estructura porosa, es decir, los trombos. Este proceso parece ocurrir solamente en una dirección, y rápidamente hizo que las concentraciones relativamente bajas de nanopartículas en la sangre para concentrarse en el coágulo, y el cambio de su densidad CT suficientemente para permitir la detección. La final en vivo de imágenes microCT a las 24 horasmuy bien correlacionado con post-mortem NIRF de formación de imágenes del cerebro ex vivo, que muestra post-tPA Residua de los trombos inicial que había sido marcada con fluorescencia con la sonda óptica reconociendo la actividad de fibrina-reticulación de FXIIIa antes de ser colocado en la arteria cerebral. De esta manera, dos sondas de imagen molecular, utilizando diferentes mecanismos de acción y diferentes modalidades de imagen, cada informe y transversal verificar los resultados de la otra.
La evolución de los trombos se pudo seguir utilizando el mismo método; En concreto, la terapia trombolítica con tPA se pudo seguir in vivo, lo que permite una lectura rápida y oportuna del éxito de la trombolisis a realizar por CT. Esto tiene profundas implicaciones para la trombólisis clínica, y también tiene aplicaciones en investigación para el desarrollo de nuevas terapias anti-trombóticos o trombolíticos.
Anteriormente, nuestro grupo fue capaz de detectar una complicación común en la terapia del movimiento, la re-trombosis 3 a menudo se producen en torno a un coágulo parcialmente tratadas, con la posterior re-oclusión y los resultados que empeoran. Vuelva a la trombosis se modeló mediante la aplicación de 1 mm FeCl3 -soaked papeles de filtro (grado 42) secuencialmente en 4 lugares diferentes (CCA distal, proximal a la izquierda a la izquierda del CCA, CCA distal derecho, y luego proximal derecha CCA) en diferentes momentos en los mismos animales . En todos los casos, que circula fib-GC-AuNP se demostró que se acumula en los trombos, y la prestación de estos visible para la formación de imágenes con TC. Esta duración de este efecto parece estar limitado sólo a la vida media biológica de la fib-GC-AuNP, que es actualmente desconocido, y se ha observado durante un tiempo prolongado (hasta 3 semanas) después de la inyección inicial de fib- GC-AuNP. Esto es de gran interés clínico, debido a que una sola dosis de agente de nanopartícula puede ser eficaz para la observación tanto de los éxitos y fracasos de los regímenes de tratamiento clínico. Se requieren estudios adicionales para evaluar la farmacocinética y biodistribución de fib-GC-AuNP.
La síntesis química de fib-GC-AuNPs se ha descrito anteriormente en detalle 4. Brevemente, los péptidos de fibrina-focalización (tirosina-D-glutamina-cisteína-hidroxiprolina-L-3-clorotirosina-glicina-leucina-cisteína-tirosina-isoleucina-glutamina) usado en la formación de imágenes de resonancia magnética EP-2104R (MRI) agente 8 son sintetizada por química de péptidos Fmoc en fase sólida estándar, y conjugado a la superficie de AuNPs GC recubiertos usando-3- 1-etil carbodiimida (3-dimetilaminopropil) y N-hidroxi succinimida. Los productos finales purificados, FIB-GC-AuNPs se recogen por centrifugación.
La sonda C15 NIRF para el etiquetado óptico de trombo preformado es un péptido de 15 aminoácidos reconocido por FXIIIa y etiquetados en los grupos amino de residuos de lisina varepsilon 9,10 con colorante fluorescente Cy5.5. El agente de formación de imágenes ópticas se une covalentemente a las hebras de fibrina del trombo por la acción enzimática de la Leyivated factor de coagulación, cuando se reticula hebras de fibrina durante el proceso de maduración del coágulo 11,12. La síntesis química del marcador trombo C15 NIRF también se ha descrito anteriormente en detalle 4. Brevemente, los péptidos de afinidad FXIIIa (glicina-asparagina-alanina-glutamato-glutamina-valina-serina-prolina-leucina-treonina-leucina-leucina-lisina-triptófano), basado en el N-terminal de alph-2-antiplasmina son sintetizados por sólida -Fase síntesis de péptidos y luego marcado con fluorocromos Cy5.5 a través de la cadena lateral de la cisteína. El uso de cromatografía líquida de alto rendimiento, el producto se purifica y se recoge el compuesto final.
es probable que el éxito de tanto el NIRF y agentes de nanopartículas de oro debido a las características de diseño biológicos fuertes de estos agentes. FXIIIa 11 es una importancia fundamental transglutaminasa tetramérica activado por trombina, la enzima de coagulación que media la resistencia fibrinolítico. La actividad de estaenzima se considera como una característica de trombos recién formados. Tanto nuestros agentes interactúan fuertemente con esta enzima fundamental coagulación de la sangre (por el agente óptica C15 FXIIIa de detección) o su sustrato (por el agente de fib-GC-AuNP CT fibrina-targeting).
Estudios de co-localización mostraron que había una excelente correspondencia entre ex vivo de fluorescencia (marcador de trombo exógeno) y in vivo microCT densidad (marcador trombo endógeno) para trombos cerebral fotografiado con la nanopartícula de unión a fibrina, que se espera, debido a la mutuamente mecanismos de atrapamiento biológicos relacionados, tanto para los agentes.
Hay varias cosas a considerar cuando se utiliza la técnica de imágenes de trombos directa dual-modal. En primer lugar, para evitar fib-GC-AuNPs de agregación y de lograr biocompatibilidad, quitosano glicol se utiliza para el revestimiento de superficie 13. Antes de la inyección intravenosa sin embargo, el agente de formación de imágenes de trombos se debe resuspenDED en PBS, y se sometió a ultrasonidos para asegurar la disolución y dispersión de las nanopartículas. Además, la estabilidad de las nanopartículas se puede evaluar mediante el uso de espectroscopia de absorción ultravioleta-visible (UV-Vis) para comparar la superficie picos de resonancia de plasmón de frente a viejos stocks frescas de fib-GC-AuNPs, los cuales deben estar a aproximadamente 519 nm.
En segundo lugar, la resolución de las imágenes de trombos microCT se puede mejorar cambiando los parámetros de análisis: como el aumento de la "Número Scan 'de 600 a 1.200 rebanadas o el aumento de la" media' de 1 a 3, sin embargo lo que aumentará el tiempo requerido para completar la exploración.
En tercer lugar, la sangre y agente de imagen C15 NIRF se mezclaron en la relación de 7: 3 5 para el etiquetado fluorescente de trombos en este estudio. De acuerdo con nuestra experiencia, un volumen de sangre relativamente baja podría obstaculizar la formación de trombos, mientras que un volumen de sangre relativamente alta podría reducir la capacidad de detección de trombosdebido a la atenuación de la señal ex vivo fluorescente que emite del trombo. Además, es notable que varios enfoques diferentes se pueden utilizar para la visualización fluorescente de varios componentes de un trombo 14.
En cuarto lugar, en comparación con el modelo de trombosis de FeCl 3 mediada in situ donde la arteria objetivo es sólo parcialmente ocluida, visualización microCT de tromboembolia cerebral que ocluye completamente el vaso requiere de relativamente alta dosis de fib-GC-AuNPs 4. Por lo tanto, podría haber problemas de toxicidad, aunque se considera que los coloides de oro para ser biocompatible y FIB-GC-AuNPs no mostró toxicidad sistémica / neuroconductual notable en un estudio previo 4.
En quinto lugar, los ensayos clínicos demostraron que las plaquetas eran específicas como agentes de MRI de fibrina orientada gadolinio (Gd) -basado podría aumentar la hiperintensidad de los trombos en las cavidades del corazón, las arterias carótidas, y el arco aórtico en las imágenes ponderadas en T1 15. Aunque la RM tiene un excelente contraste de los tejidos blandos y una resolución espacial alta, MRI es una prueba de tiempo. CT sufre de relativamente pobre contraste de los tejidos blandos, sin embargo las TC se pueden realizar rápidamente. En consecuencia, TC sigue siendo la técnica de imagen más utilizado en el tratamiento agudo del ictus 16. Además, los sistemas microCT para formación de imágenes de pequeños animales no requieren protección contra la radiación arquitectónico para ser instalado, y ofrecen imágenes de alta resolución. Por lo tanto, microCT combina con ex vivo de imágenes de fluorescencia de reflexión o la tomografía de fluorescencia in vivo en 17 es muy útil para la investigación de pequeños animales. Alternativamente, MRI / CT de imagen dual-modal utilizando nanopartículas de Au-Fe 18-20 También puede haber una potente plataforma para la visualización de trombos en animales y seres humanos; RM y la TC pueden complementarse entre sí y, a diferencia de las imágenes ópticas, que no sufren el problema de la baja penetración en el tejido.
contenido "> En conclusión, CT combinada y de imagen fluorescente para la visualización de trombos directa es una poderosa herramienta de investigación para la investigación de un accidente cerebrovascular isquémico, con la promesa de mejorar la detección de trombos, el seguimiento de la terapia, y la detección de re-trombosis que complica la terapia. Además, existe un gran potencial para aplicaciones clínicas de estas técnicas.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
DE.K., JY.K, CH.A, y KK son los titulares de las patentes de la nanopartícula de oro de fibrina-dirigida (10-1474063-0000, Coreana de Propiedad Intelectual Oficina). El resto de los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por el Korea Salud Tecnología Proyecto I + D, Ministerio de Salud y Bienestar (HI12C1847, HI12C0066), el Programa de Biología y Medicina Tecnología para el Desarrollo (desde 2.010 hasta 0019862) y el programa Laboratorio de Investigación Global (GRL) (NRF-2015K1A1A2028228) de la Fundación nacional de Investigación, financiado por el gobierno de Corea.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Machines | |||
| microCT | NanoFocusRay, JeonJu, Korea | NFR Polaris-G90 | |
| NIRF imaging system | Roper-scientific,Tucson, AZ | coolsnap-Ez | |
| Laser Doppler flowmeter | Perimed, Stockholm, Sweden | PeriFlux System 5000 | |
| Surgical microscope | Leica Microsystems, Seoul, Korea | EZ4HD | |
| Inhalation anesthesia machine | PerkinElmer, Massachusetts, USA | XGI-8 | |
| Software | |||
| NFR control | NanoFocusRay, JeonJu, Korea | NFR Polaris-G90 | microCT control software |
| Lucion | Infinitt, Seoul, Korea | Lucion | 3D render imaging software |
| Lab chart 7 | ADInstruments, Colorado, USA | Lab chart 7 | rCBF |
| ImageJ software | Wanye Rasband, NIH, USA | 1.49d | imaging analysis |
| Devices/Instruments | |||
| Infusion pump | Harvard, Massachusetts, USA | pump 22(55-2226) | |
| Homeothermic blanket | Panlab, Barcelona, Spain | HB101 | |
| Pocket cautery | Daejong, Seoul, Korea | DJE-39 | |
| Brain matrice | Ted pella, CA, USA | 15003 | coronal section |
| PE-50 tubing | Natsume, Tokyo, Japan | SP-45(PE-50) | I.D. 0.58 mm O.D. 0.96 mm |
| PE-10 tubing | Natsume, Tokyo, Japan | SP-10(PE-10) | I.D. 0.28 mm O.D. 0.61 mm |
| 30 gauge needle | sungshim-medical, Seoul, Korea | ||
| Syringe | CPL-medical, Ansan, Korea | 1 & 3 cc | |
| Gauze | Panamedic, Cheonan, Korea | ||
| Tape | Scotch, Seoul, Korea | 3M-810 | |
| Micro forceps | Fine Science Tools, Vancouver, Canada | 11253-27 | Dumont #L5 |
| Micro scissor | Fine Science Tools, Vancouver, Canada | 15000-03 | Vannas spring |
| Scissor | Fine Science Tools, Vancouver, Canada | 14084-08 | 8.5 cm |
| Black silk suture | Ailee, Busan, Korea | SK6071, SK728 | 6-0 and 7-0 |
| Reagents | |||
| meloxicam | Yuhan, Seoul, Korea | ||
| vet ointment | Novartis, Basel, Swiss | ||
| 10% Povidone-iodine (betadine) | Firson, Cheon-an, Korea | ||
| FeCl3 | Sigma, Missouri, United States | 157740-5G | |
| TTC | Amresco, Ohio, USA | 0765-100g | |
| Isoflurane | Hana-Pham, Gyeonggi, Korea | Ifran | 100 ml |
| PBS | Welgene, Daegu, Korea | LB001-02 | 500 ml |
| Gold nanoparticles | Synthesis | ||
| C15 optical agent | Synthesis | ||
| Tissue plasminogen activator | Boehringer Ingelheim, Biberach, Germany | rtPA(actilyse) | 20 mg |
| Normal saline | Daihan Pham, Seoul, Korea | 48N3AF3 | 20 ml |
References
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