Summary
Denne protokol beskriver anvendelsen af kombineret nær-infrarødt fluorescerende (NIRF) billedbehandling og mikro-computertomografi (microCT) til visualisering cerebral tromboemboli. Denne teknik tillader kvantificering af trombe byrde og evolution. Den NIRF imaging teknik visualiserer fluorescensmærkede blodprop i udskårne hjerne, mens microCT teknik visualiserer blodprop inde levende dyr ved hjælp af guld-nanopartikler.
Abstract
Direkte trombe imaging visualiserer den egentlige årsag til tromboembolisk infarkt. At kunne billedet trombe direkte giver langt bedre undersøgelse af slagtilfælde end at lægge indirekte målinger, og vil være en kraftig og robust vaskulær forskning værktøj. Vi bruger en optisk billeddannelse tilgang, etiketter tromber med en molekylær billeddannelse blodprop markør - en Cy5.5 nær-infrarødt fluorescerende (NIRF) probe, der er kovalent bundet til fibrinstrengene af thromben af fibrin-tværbinding enzymatiske virkning af aktiveret koagulationsfaktor Xllla under processen med koagel modning. En mikro-computertomografi (microCT) -baseret tilgang bruger trombe-søger guld nanopartikler (AuNPs) funktionaliserede at målrette hovedbestanddelen af blodprop: fibrin. Dette papir beskriver en detaljeret protokol for den kombinerede in vivo microCT og ex vivo NIRF billeddannelse af tromboemboli i en musemodel af embolisk slagtilfælde. Vi viser, at in vivo </ em> microCT og fibrin-målrettet glycol-chitosan AuNPs (FIB-GC-AuNPs) kan anvendes til at visualisere både in situ tromber og cerebral embolisk tromber. Vi beskriver også anvendelsen af in vivo microCT-baserede direkte trombeimagografimiddel til serielt overvåge de terapeutiske virkninger af vævsplasminogenaktivator-medieret trombolyse. Efter den sidste billeddannelse session, viser vi ved ex vivo NIRF billeddannelse omfanget og fordelingen af resterende tromboemboli i hjernen. Endelig beskriver vi kvantitativ billede analyser af microCT og NIRF billeddata. Den kombinerede teknik med direkte trombeimagografimiddel tillader to uafhængige fremgangsmåder til thrombe-visualisering, der skal sammenlignes: arealet af trombe-relaterede fluorescerende signal på ex vivo NIRF billeddannelse vs. mængden af hyperdense microCT tromber in vivo.
Introduction
En i 6 personer vil have et slagtilfælde på et tidspunkt i deres levetid. Iskæmisk slagtilfælde er langt den mest almindelige slag type og tegner sig for omkring 80 procent af alle slagtilfælde sager. Fordi tromboemboli forårsager størstedelen af disse iskæmiske slagtilfælde, er der en stigende interesse for direkte trombeimagografimiddel.
Det blev anslået, at omkring 2 millioner hjerneceller dør under hvert minut af midterste cerebral arterie okklusion 1, der fører til sloganet "Tid er Brain". Computertomografi (CT) undersøgelser kan gøres hurtigt, og er bredt tilgængelige; af denne grund, CT forbliver billeddannelse af valg for den første diagnose og behandling af hyperakut iskæmisk slagtilfælde. CT er særligt værdifuldt for at informere de kritiske tidlige beslutninger: administrere vævsplasminogenaktivator (TPA) til trombolyse og / eller triaging til endovaskulær blodprop-hentning 2. Nuværende CT-baserede trombeimagografimiddel kan imidlertid ikke serielt spore cerebral tromboemboli in vivo, fordi det bruger indirekte metoder til at demonstrere tromber: efter opacifikation af blodet pool ved jodholdige modsætning hertil er den tromber demonstreret som fyld fejl i karrene. Der er dosisgrænser og risici forbundet med den gentagen administration af jodholdige kontrastmidler, som udelukker gentagne billeddannelse af tromber på denne måde.
Således er der et kritisk behov for en direkte billeddannelse metode til cerebral thromber hos patienter med slagtilfælde, for at tillade en hurtigere og bedre behandling beslutninger, der skal foretages. Vi foreslår at opnå dette ved at øge værdien af CT, den aktuelt anvendte frontlinjen afbildningsmodalitet til slagtilfælde, ved anvendelse af en trombe-søger nanopartikelformige molekylær billeddannelse agent.
Vi har vist anvendelsen af dette middel med micro-computertomografi (microCT), en høj opløsning ex vivo eller in vivo (små dyr) afbildning version af CT, der tillader erhvervelse hurtige data <sup> 3,4. Selv med den relativt dårlige bløde væv kontrast til rådighed for små dyr microCT (meget værre end tilgængelige fra human størrelse scannere), det billeddannende agent var i stand til at søge og markere tromber ved at gøre dem hyperdense på CT, en 'tæt fartøj tegnet »forstærket af molekylær billeddannelse.
Som supplement til CT-teknik, har vores gruppe tidligere udviklet en optisk direkte trombe imaging teknik hjælp Cy5.5 nær-infrarødt fluorescerende (NIRF) sonde til at visualisere cerebral trombe byrde 5. Dette er en ex vivo teknik på obduktioner hjerner, men er meget følsom, og tjener til at bekræfte in vivo data i indstillingen forskning.
Under både CT og NIRF baseret trombe-søger billeddannelsesteknikker giver os mulighed for at sammenligne disse teknikker til at opnå meget informative data om den rolle, thrombus og trombeimagografimiddel i processen med iskæmisk slagtilfælde udvikling.
Here, beskriver vi en detaljeret protokol af et kombineret teknik med in vivo microCT og ex vivo NIRF billeddannelse til direkte visualisere tromboemboli i en musemodel af embolisk slagtilfælde. Disse enkle og robuste metoder er anvendelige til at fremme vores forståelse af trombotiske sygdomme ved at muliggøre nøjagtige in vivo vurdering af trombe byrde / distribution og karakterisering af dynamisk trombe evolution på en hurtig og kvantitativ måde in vivo under behandlingen efterfulgt af ex vivo-data, der tjener som en kontrol og reference standard til bekræftelse af in vivo resultater billeddannelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøg påvist i denne protokol er blevet revideret og godkendt af Dongguk University Ilsan Hospital Animal Care og brug Udvalg og gennemføres i overensstemmelse med de principper og procedurer, der er beskrevet i NIH Guide for pasning og anvendelse af dyr.
1. Fremstilling af Exogent Formed Clot mærket med Fluorescence Marker (figur 1)
- Bedøver en mus i en induktion kammer under anvendelse af 3% isofluran blandet med 30% oxygen (1,5 l / min 100% oxygen). Sikre tilstrækkelig dybde af anæstesi ved at observere muskeltonus og bekræfter fraværet af tå knivspids refleks.
- Sende dyret på et sterilt afdækningsstykke i bugleje, og holde det under anæstesi ved anvendelse af en indånding maske og 2% isofluran blandet med 30% oxygen. Udfør følgende procedurer ved hjælp af aseptiske teknikker og sterile kitler / masker / handsker / instrumenter. Oprethold sterile betingelser ved rengøring og desinfektion det eksperimentelle område med 70% alkohol før ennd efter procedurerne.
- Indsamle omkring 300 ~ 1.000 pi arterieblod efter hjertepunktur 6. Bland 70 pi helblod med 30 pi C15 probe 5 (20 pmol / l koncentration), en Cy5.5 fluorescerende probe følsom over for fibrin-tværbindende aktivitet af aktiveret faktor XIII (FXIIIa) koagulation enzym, til fluorescens markere koagel (figur 1A ). Injicer blandet blod under anvendelse af en 3 ml sprøjte (23 gauge nål) i en 20 cm lang polyethylenrør (PE-50, ID 0,58 mm). PE rør skal steriliseres (eller certificeret steril af fabrikanten) og blodpropper skal udarbejdes aseptisk i en vævskultur hætte.
- Kontrollere dyrets død ved at observere den manglende respiration og hjerte puls.
- Lad blod-loaded rør ved stuetemperatur i 2 timer, derefter ved 4 ° C i 22 timer, og udføre følgende procedurer, som tidligere rapporteret 7.
- Skær trombe-indeholdende rør i 1,5 cm lange stykker. Anvendelse af en 3 ml sprøjte fyldt med phosphatbufret saltvand (PBS), udvise thrombe på en PBS-indeholdende 6-brønds plade ved forsigtigt at injicere PBS i hvert stykke rør. Vask trombi tre gange med PBS (figur 1B).
- Indlæse den distale endedel af en 15 cm lang PE-10 rør (ID 0.28 mm) med en 1,5 cm lang trombe ved omhyggeligt trække den vaskede thrombe, og samtidig undgå luftbobler, ved anvendelse af en saltopløsning fyldt 1 ml sprøjte med en 30 gauge nål, der indsættes i den proksimale ende af røret.
- Tilslut trombe-loaded PE-10 rør med en 3 cm lang PE-50 rør (ID 0.58 mm) modificeret til at have en tilspidset ende (ID 200 um), som vil blive placeret på den midterste cerebrale arterie (MCA) - anterior cerebral arterie (ACA) bifurkation område af det indre carotidarterie (ICA) i en musemodel af embolisk slagtilfælde (figur 1C).
2. Modellering en musemodel for tromboemboliske Stroke (figur 2)
- Anesthetizea anden mus, der skal strøg som tidligere rapporteret 7 i en induktion kammer under anvendelse af 3% isofluran blandet med 30% oxygen (1,5 l / min). Injicer meloxicam (5 mg / kg) subkutant til at lindre smerter efter operation. Sikre tilstrækkelig dybde af anæstesi ved at observere muskeltonus og bekræfter fraværet af tå knivspids refleks.
- Påfør en lille mængde af veterinær salve til hvert øje for at forhindre tørhed under anæstesi. Udfør følgende kirurgiske procedurer ved hjælp af aseptiske teknikker og sterile kitler / masker / handsker / instrumenter. Opretholde sterile betingelser ved rengøring og desinfektion af kirurgiske område med 70% alkohol før, under og efter operationen.
- Flyt musen til et operationsbord. Placer dyret på et sterilt afdækningsstykke i bugleje, og holde det under bedøvelse ved hjælp af en indånding maske og 2% isofluran. Derefter klemme legemstemperaturen ved 36,5 ° C ved anvendelse af et homeotermisk tæppe med feedback fra en rektal termometer.
- efter Surgical prep med betadin og 70% alkohol, gør en 1 cm vertikalt snit ved hjælp af en skalpel på hovedbunden mellem det venstre øre og øjne. Lim den distale ende af den optiske fiber af en laser Doppler flowmeter på den blottede venstre temporale knogle overflade (1 mm til venstre og 4 mm under fra bregma). Start derefter Doppler flow overvågning (figur 2A).
- Fastsætte dyret. Ret halsen ved at trække i den øvre fortand med en snor fastgjort til en stift og barbere nakken. Derefter lave en 3 cm lodret midterlinjen snit, sprede den åbne, og udsætte den venstre carotis pære område ved dissekere peri-vaskulære bløde væv. Pas på ikke at skade vagus nerve.
- Ligere venstre proximale fælles carotidarterie (CCA) med en steril 6-0 sort silkesutur, og liger venstre ICA og den venstre pterygopalatinarterien (PPA) anvendelse af sterile 7-0 sorte silkesuturer.
- Ætse venstre overlegen skjoldbruskkirtlen arterie, som er en gren af den venstre eksterne carotisarterie USIng en monopolær elektrisk kauterisation, og liger venstre proximale ydre carotidarterie (ECA) løst og mere distalt sted tæt med sterile 7-0 sorte silkesuturer.
- Ved hjælp af en mikro-saks, lave et lille hul (ca. 0,2 ~ 0,25 um diameter) mellem de ligerede steder i ECA.
- Sæt trombe-indeholdende kateter ind i hullet i ECA mens løsne den proximale ECA ligering. Spænd proximale ECA ligering igen efter fremføring af kateteret i CCA for at phono kateteret på plads.
- Cauterize at skære Revisionsretten distale del, som er distalt til den distale ligatur site, og drej den frie proksimale ECA uret for at tilpasse den til retningen af ICA, mens tilbagetrækning af kateteret fra CCA. Derefter fremføre kateteret omkring 9 mm ind i MCA - ACA bifurcation område af den distale ICA umiddelbart efter løsning ICA ligering. Derefter spændes ICA ligation.
- Placer trombe i bifurkationen område ved forsigtigttrykke sprøjten 1 ml at injicere thromben. Check faldet i Doppler cerebral blodstrøm (CBF), som bør sænkes med 30% eller lavere i forhold til baseline, hvis thromben held okkluderede beholderen (figur 2B).
- Fjern kateteret, og liger Revisionsretten proksimale sted umiddelbart og stramt. Desuden unligate CCA og PPA.
- Luk incisionssted hjælp 6-0 silke suturer. Stop anæstesi efter at de fortsatte Doppler overvågning på et påkrævet tidsrum (her i 30 minutter efter thrombe injektion). Retur musen i et tomt bur, og holde den varm med en varmelampe. Lad ikke musen uden opsyn, indtil det har fået tilstrækkelig bevidsthed til at opretholde brystleje.
3. In vivo MicroCT Imaging of Cerebral Blodprop (figur 3)
- Re-bedøver musen med 2% isofluran som beskrevet i trin 2.1 i en på forhånd fastsat tid-punkt (her 1 time) efter opståenaf embolisk slagtilfælde på grund af placeringen af thromben i den cerebrale arterie. Sikre tilstrækkelig dybde af anæstesi ved at bekræfte fraværet af tå knivspids refleks. Påfør en lille mængde af veterinær salve til hvert øje for at forhindre tørhed under anæstesi.
- Resuspender fibrin-målrettet guld nanopartikler (FIB-GC-AUNP 4) ved en koncentration på 10 mg Au / ml i 10 mM PBS, og sonikeres trombeimagografimiddel i 30 min for at sikre opløsning og dispersion af nanopartikler. Injicer 300 pi fib-GC-AUNP (10 mg / ml) ind i penis vene.
- Placer dyret på sengen af en microCT maskine, og ret nakken ved at trække den øverste fortand med en snor fastgjort til en stift til at reducere bevægelsesartefakter.
- 5 min efter injektionen af FIB-GC-AUNP, begynde at opnå microCT billeder af hjernen. For eksperimenterne beskrevet her, bruge følgende imaging parametre: 65 KVP, 60 pA, 26,7 x 26,7 x 27,9 mm 3 synsfelt, 0,053 x 0,053 x 0,054 mm 3 voxel størrelse, 100 millisekunder per frame, 1 gennemsnitsberegning, 360 visninger, 512 x 512 genopbygning matrix, 600 skiver, 64 sek scanningstid.
- Retur musen i et tomt bur, og holde den varm med en varmelampe. Lad ikke musen uden opsyn, indtil det har fået tilstrækkelig bevidsthed til at opretholde brystleje.
- Omdan de rå billeddata til digital billedbehandling og kommunikation i medicin (DICOM) format ved hjælp af 'Start' kommandoen over "Reconstruction" panel i en softwarepakke installeret på microCT scanneren.
- For kvantitative analyser af billederne (i trin 6), transformere DICOM data i TIFF-format ved anvendelse af en kommercielt tilgængelig softwarepakke ifølge producentens instruktioner.
- For kvalitative analyser samt kvantitative analyser på en enklere og hurtigere måde, bruge softwaren pakke og de oprindelige 0,054 mm tyk billeder i DICOM-format til at generere et nyt sætaksiale og koronale billeder afsmeltet at have 1 eller 2 mm (her, 2 mm) tykkelse, som følger.
- Vælg DICOM mappe på "Data Source 'træ, klik på højre museknap, og importere mappen til' MasterDB" eller "PrivateDB«.
- Klik på "MasterDB« eller »PrivateDB 'i' Data Source 'træ, og vælg den importerede mappe. Når du har klikket fanen '3D' på den venstre panel, når de "Henter Options 'vindue popper op, skal du trykke på' OK 'for at importere en sekvens af billeder i mappen som en stak.
- Skift billede repræsentation til maksimal intensitet projektion (MIP) format ved at klikke på ordet "MRP« i aksial og koronale billedvinduer og vælge 'MIP "på pop-up-menuen. Derefter ændre tykkelsen billedet til 2 mm efter at klikke på 'TH: 0 [mm] «i de samme vinduer.
- Brug af bredden 3D 2 mm navigator bar, der giver mulighed for at udforske en billedstak og skære det i en passende vinkel og placering, udarbejde en 2 mm tyk aksialsnit billede med fuld dækning af kredsen af Willis (COW), hvilke havne tromber. Klik på capture knappen (kamera ikon) på "Output" panel. Gem billedet i TIFF-format.
- Derefter forberede fem 2 mm tykke koronale sektion billeder, der dækker sammenhængende fra frontallappen til lillehjernen.
- Først forberede den anden skive ved forsigtigt at justere navigator bar på den aksiale billede, så det koronale billede bedst kan visualisere MCA - ACA tromber.
- Dernæst forberede de andre fire skiver i en sammenhængende måde. Klik på capture knappen (kamera ikon) på "Output" panel. Gem billederne i TIFF-format.
4. Trombolyse og in vivo MicroCT Imaging of Cerebral Blodprop (figur 3)
- Forbered en 100 cm lang PE-10 rør med en 30 gauge nål i den ene ende og en 1 ml sprøjte i den anden ende. Fyld røret med enten saltvand (600 pi) eller tPA (her, 24 mg / kg, 600 pi) og samtidig undgå luftbobler.
- Re-bedøver musen som beskrevet i trin 2.1. Stik nålen spids i penis vene i dyret. Placer dyret forsigtigt på sengen af microCT maskine. Derefter, immobilisere og stabilisere injiceret intravenøst del af kateteret systemet ved at tape den til sengen.
- Udfør en opfølgende imaging session som forbehandling baseline. Derefter injiceres enten 60 pi normalt saltvand eller tPA ved at trykke sprøjtens stempel ind i kateteret systemet. Efter bolusinjektionen, begynder at gennemtrænge den resterende opløsning (540 pi) i løbet af en tidsperiode (her 30 minutter).
- Opnå microCT billeder ved hjælp af de samme parametre som i trin 3.4 på forhånd specificerede tidspunkter: her, ved 3 og 24 timer efter bolusinjektionen. For at udføre følgende ex vivo NIRF Thrombus billeddannelse af hjernen, aflive dyret under anæstesi ved cervikal dislokation.
5. Ex Vivo NIRF trombeimagografimiddel og triphenyltetrazoliumchlorid (TTC) Farvning af hjernevæv (figur 4)
- Efter halshugning, fjerne hovedbunden og skære gennem kraniet med en saks fra foramen magnum op mod sagittale sutur. Fjern kranielle deformiteter ved omhyggeligt at hæve kanterne af indridset kraniet med en saks og samtidig undgå skade på underliggende hjernen, hvilket blotlægger de halvkugler.
- Skåret ud synsnerven i hjernen basen så tæt som muligt til hjernen overflade, fordi de kunne overlappe den kreds af Willis arterier, der skal visualiseres på NIRF billeddannelse. Derefter, for klart at visualisere Y-form 'MCA / ACA / distal ICA' for NIRF trombeimagografimiddel, udskårne den distale ICAs så vidt muligt til hjernen overflade efter let komprimere cerebellar base at eksponere the skærende punkter (Figur 4a).
- Udfør NIRF imaging (excitation / emission, 675/690 nm 1 sek eksponering) af det fjernede hjernevæv med sin base pegende opad (figur 4B, C), der visualiserer fluorescensmærkede tromboemboli i arterierne i COW (figur 4D) . Udfør derefter yderligere billedbehandling med toppunktet af hjernen peger op, som visualiserer kortikale tromboemboli. Undgå udtørring af hjernen ved at sætte et par dråber saltvand på vævet.
- Ved hjælp af en hjerne matrix indretning ifølge producentens instruktioner, hurtigt at forberede 2 mm tykke hjernen skiver coronalt: 6 stykker af 2 mm tykke skiver (2,3, 0,3, -1,7, -3,7, -5,7 mm fra bregma). Undgå udtørring af hjernen skiver ved hjælp saltholdige dråber, og udfør NIRF billeddannelse af både forsiden og bagsiden af sektionerne.
- Sæt hjernen skiver i 2% triphenyltetrazoliumchlorid (TTC) opløsning i 20 minutter, og samtidig undgå udsættelse for Projektørt. Derefter flytte skiverne i 4% formaldehydopløsning ved 4 ° C, og samtidig undgå udsættelse for lys.
6. Kvantificering af Blodprop Area Brug MicroCT billeder og ImageJ (1.49d) Software (figur 5)
- Åbn billeder (figur 5A).
- Åbne billede sekvens filer til at oprette en stak fil ved at vælge 'Filer> Importer> billedsekvens' eller 'Filer> Åbn'. Konverter billeder til 8-bit gråtoner ved at bruge "Image> Type> 8-bit".
- Konverter enheden fra Inch til Millimeter (figur 5A).
- Når en pixel af CT billedfiler svarer til 0,053 mm, brug 'Analyser> Set Scale' for at indtaste '1', '0,053' og 'mm «for» Afstand i pixel', 'Kendt distance "og" Enhed for længden ', henholdsvis.
- Når (kun) en skala bar er tilgængelige,ved hjælp af 'Lige Linje' værktøj trække en linje med sin længde svarende til den af skalaen bar. Brug derefter 'Analyser> Set Scale' for at indtaste længden på skalaen bar i millimeter.
- Baggrund Subtraktion (figur 5B)
- Ved at bruge 'Rediger> Valg> Angiv' sted et cirkulært eller rektangulært område af interesse (ROI) på et område af hjernen parenkym uden blodprop eller knogle-relaterede hyperdense regioner. Fordi den angivne ROI gælder for hver bid af stakken, skal du kontrollere, hvis den ikke overlapper med hyperdense regioner i hver skive.
- Vælg 'Plugin> ROI> BG subtraktion fra ROI "og indtast 2.0 for" Antal STDEV fra middelværdien.
- Segmentering af tromboemboli-relaterede Hyperdense Læsioner (figur 5C)
- Vælg 'Billede> Justering> Threshold ", og indtast værdierne' Lower Threshold Level "og" øvre niveau "som 22 og 255, henholdsvis. Vælg 'Over / Under' for at vise pixels under den nedre tærskelværdi i blå, tærsklingsbehandlede pixels i gråtoner, og pixels over den øvre tærskelværdi med grønt.
- Brug 'Freehand Selection Tool "til at tegne ROI'er der omgiver tromboemboli-relaterede hyperdense læsioner uden at medtage benede områder. Under tegningen, skal du trykke enten [skift] eller [alt] for at tilføje eller fjerne en region, hhv.
Bemærk: Hvis hyperdense tromboemboliske læsioner er fjernt fra knoklede strukturer, i stedet for den "Freehand Selection Tool", kan 'Wand Tool "sikkert bruges uden at ændre sin» Tolerance «niveau.
- Kvantificering af de segmenterede Læsioner (figur 5D)
- Brug 'Analyser> Set Målinger "til at vælge" Area "," Mean Gray Value ", og" Integreret Density (Area X Mean)9 ;. Kontroller følgende valgmuligheder: "Begræns til Threshold" og "Display Label". Brug 'Analyser> Mål' for at få de kvantificerede data. Derefter gemme resultaterne som en ".xls" fil.
- Gem stakken filen i TIFF-format. Desuden bruger 'Analyze> Værktøjer> ROI Manager' for at gemme de ROI'er.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Baseline microCT billeder, opnået in vivo efter indgivelse FIB-GC-AUNP (10 mg / ml, 300 pi) efter 1 time efter embolisk slagtilfælde, klart visualiseret cerebral trombe i MCA - ACA bifurcation område af den distale arteria carotis interna (figur 6 ). Opfølgning microCT imaging viste ingen ændring i COW trombe med saltvand behandling. Men behandling med tPA viste en gradvis opløsning af COW trombe (blå pilespidser i figur 6). Dette fund viser, at microCT blodprop imaging kan tillade terapeutisk monitorering af trombolyse. Der er en fremragende overensstemmelse mellem in vivo CT tæthed og ex vivo NIRF for resterende tromboemboli ved 24 timer. Bemærk, at hyperdense microCT områder skyldes endogen blodprop-mærkning af fibrin-targeting AuNPs pænt co-lokaliserede med NIRF signal områder på grund af eksogen blodprop-mærkning, som blev udført før EMBOlic slagtilfælde ved anvendelse af en Cy5.5 fluorescerende probe følsom over for koagulationsfaktor Xllla-medieret fibrin-tværbindende aktivitet i processen med modningen af den forformede koagel (figur 6). Den kombinerede teknik direkte trombe imaging at demonstrere tPA-medieret trombolytisk effekt afspejler histologisk slagtilfælde resultat som målt ved TTC farvning. TTC farvning viste en klar reduktion i mængden af iskæmisk hjerneskade (hvidlige områder i figur 6) for dyret modtager tPA trombolyse.
Figur 1:. Oversigt over Fremstilling af fluorescensmærket blodprop (a) blanding af frisk fuldblod med Cy5.5 nær-infrarødt fluorescerende (NIRF) probe (C15), der er kovalent bundet til fibrinstrengene af thromben af fibrin -crosslinking enzymatiske virkning af aktiveret coaguning faktor Xllla under processen med koagel modning. Den blandede blod injiceres i en polyethylen (PE) -50 rør og efterladt i 24 timer for at tillade koageldannelse og modning. (B) NIRF billeddannelse for at bekræfte den optiske mærkning af thromben med C15-proben. Bemærk den vedvarende fluorescens efter vask thromben, som blev fjernet fra PE rør. (C) Blodprop-loaded PE-10 rør med en PE-50 rør modificeret til at have en tilspidset ende (200 um diameter) for tromboemboli i arteria cerebri media - anterior cerebral arterie bifurkation område af det indre carotidarterie i mus. Scale barer:. 2 mm Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Oversigt over Modeling en musemodel for Thromboembolic cerebral infarkt. (A) Laser Doppler overvågning af cerebral blodstrøm (CBF) før og efter okklusion af den midterste cerebrale arterie (MCA), med den distale ende af den optiske fiber af laseren Doppler flowmeter limet til venstre temporale knogle overflade (1 mm til venstre og 4 mm under fra bregma). Bemærk den post-okklusion fald i Doppler CBF, hvilket bør sænkes med 30% eller lavere i forhold til baseline. (B) Insertion af tromben-holdige kateter (dvs. den distalt tilspidset polyethylen-50 rør i figur 1C) i hullet i den ydre carotidarterie (ECA), efterfulgt (til sidst) ved at fremføre kateteret omkring 9 mm ind MCA - anterior cerebral arterie (ACA) bifurkation område af den distale arteria carotis interna (ICA). CCA, fælles carotidarterie; PPA, pterygopalatinarterien. Klik her for at seen større version af denne figur.
Figur 3: Oversigt over In vivo MicroCT-baserede Direkte trombeimagografimiddel hjælp Fibrin målrettet Gold Nanopartikler at Visualiser Cerebral tromboemboli og Monitor vævsplasminogenaktivator (tPA) -medieret Thrombolytiske effekter (A) Intravenøs injektion af fibrin-målrettet glycol-chitosan guld nanopartikler. (fib-GC-AuNPs) i en mus med tromboembolisk slagtilfælde. (B) Musen placeres på sengen af en microCT imager. (C) Erhvervelse microCT billeder 5 min efter injektionen af FIB-GC-AuNPs. (D) Image genopbygning at omdanne de rå billeddata til digital billedbehandling og kommunikation i medicin (DICOM) format ved hjælp af en software-pakke installeret på microCT scanneren. (E) Billedanalyse og forberedelse af aksial / coronal billeder gengives til at have 2 mm tykkelse ved hjælp af maksimal intensitet projektion mode. (F) Intravenøs tPA-medieret trombolyse, som kan overvåges og analyseres ved hjælp af microCT-baserede direkte trombeimagografimiddel metode. (C - E) Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Oversigt over ex vivo Near-infrarødt fluorescerende (NIRF) Billeddannelse af cerebral tromboemboli (A og B) En repræsentativ hjernevæv fjernet fra en mus med tromboembolisk slagtilfælde.. Tage forholdsregler ikke at miste tromboemboli (rød pil) i midterste cerebrale arterie (MCA) - anterior cerebral arterie (ACA) bifurkation område af den distale arteria carotis interna (ICA,blå pile), når fjerne hjernen. (C og D) Ex vivo NIRF trombeimagografimiddel. Hjernevævet er placeret inde i lystæt kammer i et NIRF imager (C) til visualisering af thromben (rød pil i D) pre-mærket med Cy5.5 fluorescerende markør C15 før embolisk okklusion af MCA - ACA bifurcation areal. Sammenlign med figur 5 for CT udseende. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Oversigt over Kvantificering Blodprop Volume hjælp MicroCT billeder og ImageJ (1.49d) (A) Import af billeder til en ny stak fil, konvertere filformatet i 8-bit gråtoner, og ændre den enhed til.mm. (B) Baggrund subtraktion. (C) Segmentering af de tromboemboliske læsioner ved at tegne området af interesse (ROI) omkring hyperdense områder samtidig udelukke knoglestrukturer. (D) Erhvervelse de kvantitative data for ROI ved at bruge menuen "Analyze> Measure". Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6:. Repræsentant Direkte Cerebral trombeimagografimiddel data indhentet før og efter behandling strøg Mus med Saline vs vævsplasminogenaktivator (tPA) (A) microCT (MCT) trombe imaging at tillade terapeutisk overvågning af vævsplasminogenaktivator (TPA) -medieret trombolyse . (B og
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi demonstrerede anvendelsen af to komplementære molekylære billeddannelsesteknikker til direkte trombeimagografimiddel i forsøgsmodeller af embolisk slagtilfælde: en fibrin målrettet guld nanopartikel (FIB-GC-AUNP) til in vivo microCT-baserede billeddannelse, og en FXIIIa målrettet optisk afbildning probe for ex vivo fluorescerende billeddannelse.
Efter intravenøs administration af FIB-GC-AuNPs, tromber blev synlige til CT som tætte strukturer, forårsaget af partiklerne bliver indesluttet i tromber ved virkningen af fibrin-targeting peptider (på overfladen af partiklerne) efter koncentrering-gradient- afhængig diffusion ind i den porøse struktur, dvs. tromber. Denne proces synes at forekomme i kun en retning, og hurtigt forårsagede de relativt lave koncentrationer af nanopartikel i blodet til at blive koncentreret i koagulatet, og ændre dens CT massefylde tilstrækkeligt til at tillade detektion. Den endelige in vivo microCT imaging ved 24 timerpænt korreleret med post mortem NIRF billeddannelse af ex vivo hjernen, der viser post-tPA residua af den oprindelige tromber, der var blevet fluorescensmærket med den optiske probe anerkender fibrin-tværbindende aktivitet af FXIIIa inden det bringes i den cerebrale arterie. På denne måde to molekylære billeddiagnostiske sonder, ved hjælp af forskellige virkningsmekanismer og forskellige billeddiagnostiske modaliteter, hver rapport og tværs kontrollere resultaterne af den anden.
Udviklingen i tromber kunne følges under anvendelse af den samme fremgangsmåde; konkret kunne thrombolytisk terapi med tPA følges in vivo, hvilket tillader en hurtig og rettidig aflæsning af succes trombolyse, der skal udføres af CT. Dette har vidtrækkende konsekvenser for klinisk trombolyse, og har også forskningsansøgninger til udvikling af nye anti-trombotiske eller trombolytiske terapier.
Tidligere vores gruppe var i stand til at opdage en almindelig komplikation i slagtilfælde terapi, re-trombose 3 ofte forekommende omkring en delvist behandlet blodprop med efterfølgende re-okklusion og forværrede resultater. Re-trombose blev modelleret ved at anvende 3 -soaked filterpapir (grad 42) i rækkefølge 1 mm FeCl på 4 forskellige steder (venstre distale CCA, venstre proximal CCA, højre distale CCA, og derefter til højre proximal CCA) på forskellige tidspunkter i de samme dyr . I alle tilfælde, cirkulerende fib-GC-AUNP blev demonstreret akkumulere i tromber, og gøre disse synlige for billeddannelse med CT. Denne varighed af denne effekt synes at være begrænset til den biologiske halveringstid af FIB-GC-AUNP, som i øjeblikket er ukendt, og er blevet observeret i længere tid (op til 3 uger) efter den første injektion af fib- GC-AUNP. Dette er af stor interesse klinisk, fordi en enkelt dosis af nanopartikel middel viser sig at være effektive til iagttagelse både gode og dårlige kliniske behandlingsplaner. Yderligere undersøgelser er nødvendige for at vurdere farmakokinetik og biodistriling af fib-GC-AUNP.
Den kemiske syntese af FIB-GC-AuNPs er tidligere blevet beskrevet detaljeret 4. Kort fortalt, fibrin-targeting peptider (tyrosin-D-glutamin-cystein-hydroxyprolin-L-3-chlortyrosin-glycin-leucin-cystein-tyrosin-isoleucin-glutamin), der anvendes i EP-2104R magnetisk resonans (MRI) agent 8 er syntetiseres ved standard fastfase Fmoc peptidkemi, og konjugeret til overfladen af GC-coatede AuNPs anvendelse af 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimid og N-hydroxysuccinimid. De endelige produkter, renset fib-GC-AuNPs opsamles ved centrifugering.
C15 NIRF probe til optiske mærkning af præformet thrombe er en 15-aminosyrepeptid genkendes af FXIIIa og mærkes på e aminogrupper i lysinrester 9,10 med Cy5.5 fluorescerende farvestof. Den optiske billeddannende middel er kovalent bundet til fibrinstrengene af thromben ved enzymatisk indvirkning af den handlingivated koagulationsfaktor, når det tværbinder fibrinstrenge under processen med blodprop modning 11,12. Den kemiske syntese af C15 NIRF trombe markør er også blevet beskrevet tidligere i detaljer 4. Kort fortalt FXIIIa affinitet peptider (glycin-asparagin-alanin-glutamat-glutamin-valin-serin-prolin-leucin-threonin-leucin-leucin-lysin-tryptophan) baseret på N-terminalen af Alph-2-antiplasmin syntetiseres ved fast -fase peptidsyntese og derefter mærket med Cy5.5 fluorochromer via cystein-sidekæden. Ved hjælp af høj-performance væskekromatografi, produktet oprenses og den endelige forbindelse opsamles.
Succesen med både NIRF og guld nanopartikler agenter sandsynligvis på grund af de stærke biologiske design af disse midler. FXIIIa 11 er et fundamentalt vigtig thrombin-aktiverede tetramere transglutaminase, koagulering enzym, der medierer fibrinolytisk modstand. Aktiviteten af detteenzym betragtes som kendetegnende for nydannede thromber. Begge vores agenter interagerer stærkt med denne grundlæggende blod koagulation enzym (ved FXIIIa-sensing C15 optisk middel) eller dets substrat (ved fibrin-targeting fib-GC-AUNP CT agent).
Co-lokalisering undersøgelser viste, at der var en fremragende overensstemmelse mellem ex vivo fluorescens (exogent trombe markør) og in vivo microCT densitet (endogen thrombe markør) til cerebral thromber afbildes med fibrin-bindende nanopartikel, som forventes på grund af den indbyrdes relaterede biologiske fastklemning mekanismer for både agenter.
Der er flere ting at overveje, når du bruger dual-modal direkte trombe billedteknik. Først for at undgå fib-GC-AuNPs fra aggregering og at opnå biokompatibilitet, er glycol chitosan anvendes til overfladebelægning 13. Før intravenøs injektion imidlertid bør trombeimagografimiddel blive resuspenDED i PBS og sonikeret for at sikre opløsning og dispersion af nanopartikler. Desuden kan nanopartikel stabilitet vurderes ved hjælp af ultraviolet synligt (UV-Vis) absorption spektroskopi til at sammenligne overfladeplasmonresonans toppe af friske vs gamle lagre af fib-GC-AuNPs, som begge skal være på omkring 519 nm.
For det andet, kan opløsningen af microCT trombe billeder forbedres ved at ændre scanningsparametrene: såsom at øge "Scan Number" fra 600 til 1.200 skiver eller øge den "Average" fra 1 til 3, som dog vil øge den tid, der kræves for at fuldføre scanningen.
Tredje, blod og C15 NIRF billeddannende middel blev blandet i forholdet 7: 3 5 for fluorescerende mærkning af trombe i denne undersøgelse. Ifølge vores erfaring, kunne en volumen relativt lav blod hæmmer trombedannelse, mens en relativt høj volumen blod kan reducere spores blodproppå grund af dæmpningen af ex vivo fluorescerende signal udsender fra thromben. Desuden er det bemærkelsesværdigt at flere forskellige fremgangsmåder kan anvendes til fluorescerende visualisering af forskellige komponenter af en thrombe 14.
Fjerde sammenlignet med FeCl3 medierede in situ thrombosemodel hvor målet arterie er kun delvist okkluderet, microCT visualisering af cerebral tromboemboli der fuldstændig okkludere karret kræver relativt høje doser af FIB-GC-AuNPs 4. Således kunne der være toksicitetsovervejelser, selvom guldkolloider anses for at være biokompatible og FIB-GC-AuNPs viste ikke mærkbar systemisk / neurologisk adfærd toksicitet i en tidligere undersøgelse 4.
Femte viste kliniske forsøg, at blodplade-målrettede eller fibrin målrettet gadolinium (Gd) -baseret MRI agenter kunne øge hyperintensity af tromber i hjertekamrene, halspulsårer og aortabuen på T1-vægtede billeder 15. Selvom MRI har en fremragende bløddele kontrast og en høj rumlig opløsning, MRI er en tidskrævende test. CT lider under relativ dårlig bløddele modsætning hertil CT-scanninger kan udføres hurtigt. Følgelig CT stadig den mest udbredte billedteknik i den akutte håndtering af slagtilfælde 16. Desuden giver microCT systemer til små dyr imaging ikke kræver arkitektonisk stråling afskærmning, der skal installeres, og tilbyde billeder i høj opløsning. Således microCT kombineret med ex vivo reflektans fluorescensafbildning eller in vivo fluorescens tomografi 17 er meget nyttigt for små dyr forskning. Alternativt MR / CT dual-modal billeddannelse ved hjælp af Au-Fe nanopartikler 18-20 kan også være en stærk platform for blodprop billeddannelse i både dyr og mennesker; MRI og CT kunne komplementere hinanden og i modsætning optisk afbildning, de ikke lider af den lave vævspenetration problem.
indhold "> Som konklusion, kombineret CT og fluorescerende billeddannelse til direkte trombe visualisering er et kraftfuldt forskning værktøj til undersøgelse af iskæmisk slagtilfælde, lover at forbedre påvisningen af blodprop, overvågning af behandlingen, og påvisning af nye tromboser komplicerende terapi. Desuden er der er et betydeligt potentiale for kliniske anvendelser af disse teknikker.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
DE.K., JY.K, CH.A, og KK er patenthavere af fibrin målrettet guld nanopartikler (10-1474063-0000, koreansk Intellectual Property Office). De resterende Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Korea Healthcare Technology R & D Project, Ministeriet for Sundhed og Velfærd (HI12C1847, HI12C0066), Bio & Medical Technology Development Program (2010 til 0.019.862) og Global Research Lab (GRL) program (NRF-2015K1A1A2028228) af National Research Foundation, finansieret af den koreanske regering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Machines | |||
| microCT | NanoFocusRay, JeonJu, Korea | NFR Polaris-G90 | |
| NIRF imaging system | Roper-scientific,Tucson, AZ | coolsnap-Ez | |
| Laser Doppler flowmeter | Perimed, Stockholm, Sweden | PeriFlux System 5000 | |
| Surgical microscope | Leica Microsystems, Seoul, Korea | EZ4HD | |
| Inhalation anesthesia machine | PerkinElmer, Massachusetts, USA | XGI-8 | |
| Software | |||
| NFR control | NanoFocusRay, JeonJu, Korea | NFR Polaris-G90 | microCT control software |
| Lucion | Infinitt, Seoul, Korea | Lucion | 3D render imaging software |
| Lab chart 7 | ADInstruments, Colorado, USA | Lab chart 7 | rCBF |
| ImageJ software | Wanye Rasband, NIH, USA | 1.49d | imaging analysis |
| Devices/Instruments | |||
| Infusion pump | Harvard, Massachusetts, USA | pump 22(55-2226) | |
| Homeothermic blanket | Panlab, Barcelona, Spain | HB101 | |
| Pocket cautery | Daejong, Seoul, Korea | DJE-39 | |
| Brain matrice | Ted pella, CA, USA | 15003 | coronal section |
| PE-50 tubing | Natsume, Tokyo, Japan | SP-45(PE-50) | I.D. 0.58 mm O.D. 0.96 mm |
| PE-10 tubing | Natsume, Tokyo, Japan | SP-10(PE-10) | I.D. 0.28 mm O.D. 0.61 mm |
| 30 gauge needle | sungshim-medical, Seoul, Korea | ||
| Syringe | CPL-medical, Ansan, Korea | 1 & 3 cc | |
| Gauze | Panamedic, Cheonan, Korea | ||
| Tape | Scotch, Seoul, Korea | 3M-810 | |
| Micro forceps | Fine Science Tools, Vancouver, Canada | 11253-27 | Dumont #L5 |
| Micro scissor | Fine Science Tools, Vancouver, Canada | 15000-03 | Vannas spring |
| Scissor | Fine Science Tools, Vancouver, Canada | 14084-08 | 8.5 cm |
| Black silk suture | Ailee, Busan, Korea | SK6071, SK728 | 6-0 and 7-0 |
| Reagents | |||
| meloxicam | Yuhan, Seoul, Korea | ||
| vet ointment | Novartis, Basel, Swiss | ||
| 10% Povidone-iodine (betadine) | Firson, Cheon-an, Korea | ||
| FeCl3 | Sigma, Missouri, United States | 157740-5G | |
| TTC | Amresco, Ohio, USA | 0765-100g | |
| Isoflurane | Hana-Pham, Gyeonggi, Korea | Ifran | 100 ml |
| PBS | Welgene, Daegu, Korea | LB001-02 | 500 ml |
| Gold nanoparticles | Synthesis | ||
| C15 optical agent | Synthesis | ||
| Tissue plasminogen activator | Boehringer Ingelheim, Biberach, Germany | rtPA(actilyse) | 20 mg |
| Normal saline | Daihan Pham, Seoul, Korea | 48N3AF3 | 20 ml |
References
- Saver, J. L. Time is brain--quantified. Stroke. 37 (1), 263-266 (2006).
- Latchaw, R. E., et al. Recommendations for imaging of acute ischemic stroke: a scientific statement from the American Heart Association. Stroke. 40 (11), 3646-3678 (2009).
- Kim, D. E., et al. Hyperacute direct thrombus imaging using computed tomography and gold nanoparticles. Ann Neurol. 73 (5), 617-625 (2013).
- Kim, J. Y., et al. Direct Imaging of Cerebral Thromboemboli Using Computed Tomography and Fibrin-targeted Gold Nanoparticles. Theranostics. 5 (10), 1098-1114 (2015).
- Kim, D. E., et al. Direct thrombus imaging as a means to control the variability of mouse embolic infarct models: the role of optical molecular imaging. Stroke. 42 (12), 3566-3573 (2011).
- Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. Blood sample collection in small laboratory animals. J Pharmacol Pharmacother. 1 (2), 87-93 (2010).
- Durukan, A., Tatlisumak, T. Animal models of ischemic stroke. Handbook of clinical neurology: Stroke Part 1: Basic and epidemiological aspects.Volume 92. Fisher, M. 92, Elsevier. 43-66 (2009).
- Overoye-Chan, K., et al. EP-2104R: a fibrin-specific gadolinium-Based MRI contrast agent for detection of thrombus. J Am Chem Soc. 130 (18), 6025-6039 (2008).
- Kim, D. E., Schellingerhout, D., Jaffer, F. A., Weissleder, R., Tung, C. H. Near-infrared fluorescent imaging of cerebral thrombi and blood-brain barrier disruption in a mouse model of cerebral venous sinus thrombosis. J Cereb Blood Flow Metab. 25 (2), 226-233 (2005).
- Tung, C. H., et al. Novel factor XIII probes for blood coagulation imaging. Chembiochem. 4 (9), 897-899 (2003).
- Robinson, B. R., Houng, A. K., Reed, G. L. Catalytic life of activated factor XIII in thrombi. Implications for fibrinolytic resistance and thrombus aging. Circulation. 102 (10), 1151-1157 (2000).
- Reed, G. L., Houng, A. K. The contribution of activated factor XIII to fibrinolytic resistance in experimental pulmonary embolism. Circulation. 99 (2), 299-304 (1999).
- Sun, I. C., et al. Biocompatible glycol chitosan-coated gold nanoparticles for tumor-targeting CT imaging. Pharm Res. 31 (6), 1418-1425 (2014).
- Celi, A., et al. Thrombus formation: direct real-time observation and digital analysis of thrombus assembly in a living mouse by confocal and widefield intravital microscopy. J Thromb Haemost. 1 (1), 60-68 (2003).
- Chen, I. Y., Wu, J. C. Cardiovascular molecular imaging: focus on clinical translation. Circulation. 123 (4), 425-443 (2011).
- Wintermark, M., et al. Imaging recommendations for acute stroke and transient ischemic attack patients: a joint statement by the American Society of Neuroradiology, the American College of Radiology and the Society of NeuroInterventional Surgery. J Am Coll Radiol. 10 (11), 828-832 (2013).
- Weissleder, R., Tung, C. H., Mahmood, U., Bogdanov, A. Jr In vivo imaging of tumors with protease-activated near-infrared fluorescent probes. Nat Biotechnol. 17 (4), 375-378 (1999).
- Narayanan, S., et al. Biocompatible magnetite/gold nanohybrid contrast agents via green chemistry for MRI and CT bioimaging. ACS Appl Mater Interfaces. 4 (1), 251-260 (2012).
- Amendola, V., et al. Magneto-plasmonic Au-Fe alloy nanoparticles designed for multimodal SERS-MRI-CT imaging. Small. 10 (12), 2476-2486 (2014).
- Zhu, J., et al. Synthesis of Au-Fe3O4 heterostructured nanoparticles for in vivo computed tomography and magnetic resonance dual model imaging. Nanoscale. 6 (1), 199-202 (2014).
