Summary
Dit protocol beschrijft het gebruik van een inertiale-microfluidics gebaseerde buffer wisselkoersstrategie micro / nanodeeltjes gemanipuleerde cellen te zuiveren efficiënte uitputting van ongebonden deeltjes.
Abstract
Techniek cellen met actieve bestanddeel-loaded micro / nanodeeltjes (NP) wordt een steeds populaire methode om native therapeutische eigenschappen te verbeteren, in staat bio beeldvorming en controle cel fenotype. Een kritische nog onvoldoende gericht probleem is het grote aantal deeltjes die gebonden na labeling cel die niet gemakkelijk kan worden verwijderd met gebruikelijke centrifugatie blijven. Dit leidt tot een toename van bio imaging achtergrondruis en kan transformerende effecten op aangrenzende niet-doelwitcellen geven. In dit protocol, presenteren we een inertie-microfluidics gebaseerde buffer uitwisseling strategie genoemd als Dean Flow fractionering (DFF) naar gelabelde cellen uit vrije NP's in een high throughput wijze efficiënt te scheiden. De ontwikkelde spiraal microdevice vergemakkelijkt collecteren (> 90% celherstel) van gezuiverde cellen (THP-1 en MSC's) gesuspendeerd in nieuw bufferoplossing, terwijl het bereiken van> 95% afname van ongebonden fluorescerende kleurstof of kleurstof-geladen NP (silica of PLGA). Deze enkele-stap-afmeting gebaseerd cell zuiveringsstrategie maakt hoge verwerkingssnelheid cel (10 6 cellen / min) en is zeer bruikbaar voor grote celvolume zuivering van micro / nanodeeltjes gemanipuleerde cellen storingsvrije klinische toepassing te bereiken.
Introduction
Engineering-cellen door middel beladen micro / nanodeeltjes (NP) is een eenvoudige genomische integratie-vrij en veelzijdige methode Bio-imaging vermogen verbeteren en versterken / aanvullen zijn natieve therapeutische eigenschappen regeneratieve geneeskunde. 1-3 cellulaire veranderingen worden bereikt door het merken van de plasmamembraan of cytoplasma met een sterke concentratie van de agent geladen NP's aan de bindingsplaatsen te verzadigen. Echter, een belangrijk nadeel van deze werkwijze is de grote hoeveelheid ongebonden deeltjes achterblijft in oplossing na cel keurmerkprocessen, die mogelijk nauwkeurige identificatie van deeltjes gemanipuleerde cellen kunnen verwarren of compliceren therapeutische resultaten. 4,5 Bovendien blootstelling aan NPs met transformerende middelen (groeifactoren, corticosteroïden, enz.) bij te hoge concentratie kan cytotoxiciteit en verkeerd gerichte blootstelling kan onbedoelde gevolgen op non-target cellen te induceren. Zelfs deeltjesvormige dragers omvattende of "biocompatibel" stoffen [bijvoorbeeld poly (melkzuur co-glycolzuur), PLGA] kan aanzetten potente immune cel responsen onder bepaalde omstandigheden ook. 6 Dit vooral gevaarlijk bij personen met een aangetast immuunsysteem (bijvoorbeeld reumatoïde artritis) die mogelijk vertragingen systemische klaring nanodeeltjes. 7 Aldus efficiënte verwijdering van vrije deeltjes vóór de invoering van deeltjes gemanipuleerde cellen is van groot belang voor toxiciteitsprofiel minimum te beperken en verkeerd blootstelling aan stof geladen deeltjes in vivo.
Conventionele gradiënt centrifugatie wordt vaak gebruikt om gemanipuleerde cellen te scheiden van vrije deeltjes maar omslachtig en gebruikt in batch mode. Bovendien schuifspanning ervaren door cellen bij hoge snelheid centrifugatie en de bestanddelen van de dichtheidsgradiënt medium kan celintegriteit en / of invloed celgedrag beschadigen. 8 Microfluidics is een aantrekkelijk alternatief met sevrale scheiding technologieën, waaronder deterministische laterale verplaatsing (DLD) 9, dieletrophoresis 10,11 en acoustophoresis 12 ontwikkeld voor kleine deeltjes scheiding en buffer uitwisseling toepassingen. Echter, deze methoden lijden aan lage omzet (1-10 pl · min - 1) en zijn gevoelig voor verstopping problemen. Actieve scheidingen zoals dielectrophoresis-gebaseerde werkwijzen vereisen ook verschillen in intrinsieke diëlektroforetische celfenotypen of extra cel labeling stappen om scheiding te bereiken. Een veelbelovende benadering omvat inertie microfluïdische - de zijdelingse migratie van deeltjes of cellen in stroomlijnt richten op verschillende posities vanwege overheersende opwaartse krachten (F l) hoog Reynoldsgetal (Re) 13 Door de hoge stromingsomstandigheden en superieure maat resolutie. Het is vaak geëxploiteerd voor-afmeting gebaseerd celscheiding 14,15 en buffer uitwisseling toepassingen. 16-18 However, prestaties bufferuitwisseling blijft slecht met ~10-30% verontreiniging oplossing de afgescheiden cellen meestal dicht bij de grens tussen oorspronkelijke en nieuwe bufferoplossingen blijven. 16-18 Belangrijker is dat de grootteverdeling van doelcellen heeft vergelijkbare bereiken zijn nauwkeurige focussering en inertiale scheiding van de oorspronkelijke bufferoplossing die een probleem stelt met name bij de verwerking van heterogene afmetingen celtypes zoals mesenchymale stamcellen (MSCs). 19
We hebben eerder ontwikkelde een nieuwe inertie microfluidics celsortering techniek genaamd Dean Flow fractionering (DFF) voor het isoleren van circulerende tumorcellen (CTC's) 20 en bacteriën 21 uit vol bloed met behulp van een 2-inlaat, 2-outlet spiraal microkanaal apparaat. In deze video protocol, zullen we het proces van etikettering THP-1 (humane acute monocytische leukemie cellijn) surséance monocytische cellen (~ 15 pm) en MSC (10-30 pm) met calceïne-l beschrijvenoaded NP, gevolgd door fabricage en werking van de spiraalvormige DFF microdevice efficiënte terugwinning van gemerkte cellen en verwijdering van ongebonden NPs. 22 Deze stap zuiveringsstrategie maakt continue terugwinning van gelabelde suspensie en hechtende cellen gesuspendeerd in verse buffer oplossing zonder centrifugeren. Bovendien kan het tot verwerken tot 10 miljoen cellen · ml -1, een celdichtheid vatbaar regeneratieve geneeskunde toepassingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. nanodeeltjes (NP) Labeling van mesenchymale stamcellen en monocyten
- Cultuur mesenchymale stamcellen (MSCs) in Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en antibiotica ≥80% confluentie voorafgaand aan etikettering. Evenzo cultuur THP-1-cellen (ATCC) in Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium aangevuld met 10% FBS tot een dichtheid van ~ 10 6 cellen / ml.
- Load silica NP (~ 500 pm) met calceïne kleurstof-oplossing (200 M) met behulp van 's nachts roeren. Fabriceren PLGA-calceïne AM (CAM) met behulp van een protocol eerder beschreven. 22
- Los 250 g CAM en 100 mg PLGA (50:50) in chloroform bij 4 ° C.
- Genereren enkelvoudige NP emulsie onder toepassing van een homogeniseerinrichting met hoge snelheid (13.600 xg, 60 sec) bij kamertemperatuur. Damp het chloroform in een chemische kap (≥3 uur) voordat collectie met behulp van centrifugeren (3400 xg gedurende 5 minuten), het wassen (double Distiwater gevuld), vriesdrogen en opslag -20 ° C.
- Incubeer CAM-PLGA NPs (1 mg) of calceïne silica NP (150 ug) in 0,01% poly-L-lysine (PLL) oplossing bij kamertemperatuur gedurende 15 - 20 min.
- Centrifugeer bij 3400 xg gedurende 5 minuten om overtollige PLL supernatant vóór NP resuspensie verwijderen in 1 ml respectievelijke kweekmedium.
- Incubeer de NP met cellen (MSCs of THP-1, ~ 1-2 x 10 6 cellen in totaal) gedurende ongeveer 24 uur (0,1 mg · ml -1 labeling concentratie).
- Distantiëren en oogst de gemerkte hechtende MSCs middels 2 ml 0,25% trypsine (5 min, 37 ° C) en blussen met 6 ml DMEM. Spin down de cellen op (1000 xg, 4 min) en resuspendeer tot een concentratie van 10 mei-10 juni cellen / ml voor microfluïdische verwerking. Gebruik gemerkte THP-1-cellen (10 mei-10 juni cellen / ml) rechtstreeks microfluidics zuivering.
2. microfluïdische apparaat Voorbereiding
- Device Fabrication
- Fabriceren spiraal de microfluïdische inrichting (500 urn (w) x 115 urn (h)) met polydimethylsiloxaan (PDMS) vanaf een commerciële kit met standaard zachte lithografie stappen. 23
- Meng 30 g base prepolymeer en 3 g verharder grondig in een gewicht van de boot. De-gas van het mengsel in een exsiccator gedurende 60 minuten om eventuele luchtbellen te verwijderen.
- Giet het PDMS mengsel op de siliciumwafer meester mal patroon met de spiraalvormige kanaal ontwerp zorgvuldig tot een hoogte van ~ 5-10 mm.
- De-gas van het mengsel in een exsiccator vacuüm gedurende 60 minuten opnieuw om eventuele luchtbellen te verwijderen. Herhaal dit proces totdat alle luchtbellen worden geëlimineerd.
- Genezen van de PDMS mengsel in een 80 ° C oven gedurende 2 uur totdat het PDMS is ingesteld. Zorg ervoor dat de wafer wordt tijdens het uitharden een constante hoogte apparaat niet gekanteld.
- Knip de PDMS spiraal apparaat met behulp van een scalpel en zorgvuldig schil de PDMS plaat van de master mal.
- Trim de randen van de inrichting met een scalpel glad oppervlak te verkrijgen voor binding.
- Punch twee gaten (1,5 mm) voor de inlaten en twee gaten (1,5 mm) voor het uitlaten op het PDMS apparaat met behulp van een 1,5 mm biopsie puncher.
- Was het apparaat met isopropanol (IPA) om eventueel vuil van het apparaat in een 80 ° C oven te verwijderen en te drogen gedurende 5 minuten.
- Reinig de onderkant van de PDMS apparaat (met channel features) met behulp van plakband.
- Reine zijde van een glasplaatje (2 "door 3") met plakband.
- Zorgvuldig te plaatsen en bloot de gereinigde oppervlakken van het PDMS apparaat en glaasje in de kamer van een plasma schoner en deze te onderwerpen aan vacuüm gedurende 60 sec. Vervolgens schakelt de plasma macht om maximum en laat de kamer druk totdat de kamer draait roze van kleur.
- Expose de oppervlakken aan de lucht plasma voor 60 sec. Het plasma zorgt reactieve species op de blootgestelde oppervlakken van de PDMS en glas die strakke binding geactiveerd wanneer in fysieke gebrachtal contact. Schakel de plasma stroom en druk van het plasma reiniger aan het apparaat glasplaatje los te halen.
- Binden de PDMS apparaat en glasplaatje samen door stevig te drukken op de plasma blootgestelde oppervlakken en ervoor te zorgen dat er geen luchtbellen gevangen zitten tussen de twee oppervlakken.
- Verwarm de gebonden apparaat met een kookplaat ingesteld op 80 ° C gedurende 2 uur om de binding te versterken.
- Device Operation
- Snijd twee buisstukken (1,52 mm OD) van ~ 15 - 20 cm van de inlaat spuiten en bevestig een injectiespuit (gauge 23) aan één uiteinde van elke buis.
- Snijd twee buisstukken (1,52 mm OD) van ~ 5-10 cm van de uitlaten en hechten aan de afvoergaten van het PDMS apparaat.
- Voorafgaand aan de lopende proeven, handmatig prime het apparaat met een spuit met 70% ethanol tot het stroomt uit de uitlaat slang. Laat de ethanol zitten voor 30 sec tot 1 min naar de inrichting te steriliseren.
- Laad 30 ml gefiltreerd(0,2 um porie) schede buffer (fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) met 0,1% runderserumalbumine (BSA)) in de 60 ml spuit en zet de spuit op een injectiepomp. Stel de pomp op de juiste instellingen (Spuit maat: 60 ml, Volume: 60.000 pl).
Noot: De toevoeging van BSA PBS is cel-cel binding en niet-specifieke binding tussen de cellen en de PDMS apparaat te verkorten. - Load 3 ml van gelabelde cellen in de 3 ml spuit en zet de spuit op een aparte injectiepomp. Stel de pomp op de juiste instellingen (Spuit size: 3 ml, Volume: 3000 pl).
- Controleer of er geen luchtbellen gevangen zitten in het spuiten van een stabiele stroom te verzekeren. Verwijder eventuele luchtbellen door voorzichtig uitstoten paar druppels vloeistof uit het mondstuk.
- Sluit de inlaat spuit tips en slang aan op de spuiten, en steek ze in de respectieve inlaten van het apparaat (mantel en sample inlaat). Zorg ervoor dat er geen luchtbellen langs de buis.
- Monteer de apparaten op een omkerened fase-contrast microscoop voor real-time beeldvorming tijdens cel sorteerproces.
- Bevestig een klein afval beker en twee 15 ml buizen in de buurt van het apparaat op de microscoop podium met behulp van lijmen.
- Plaats de uitlaat buizen in het afval beker.
- Stel de stroomverhouding voor monster sheath buffer 01:10 en beginnen beide spuitpompen het sorteerproces starten (Voorbeeld: 120 pl / min voor monster spuit en 1200 pl / min gedurende sheath injectiespuit kanaal stromingssnelheid ~ 0,38 m / sec ).
- Voer het apparaat gedurende 1,5 min voor het debiet te stabiliseren. Dit kan worden bevestigd door de aanwezigheid van inertially gerichte cellen in de buurt van het kanaal binnenwand onder felle-veld met fase contrast met behulp van een high-speed camera (~ 5000 - 10.000 frames per seconde (fps), belichtingstijd: 10-50 psec).
- Plaats de uitlaat buizen in verschillende buizen naar de elutiemiddelen verzamelen uit de cel uitlaat en uitlaat afval.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Na het labelen van de cellen met bio-imaging agens geladen NP nachts, worden de gelabelde cellen (met vrije deeltjes) geoogst en gezuiverd door DFF spiraalvormige microdevice gratis NP verwijderen in een enkele stap proces (Figuur 1A). De 2-inlaat, 2-outlet spiraal microkanalenplaat is ontworpen door engineering software en microfabricated gebruik van SU-8. De gestructureerde siliciumwafel wordt vervolgens gebruikt als een matrijs voor PDMS replica vormen met behulp van zachte lithografie technieken (Figuur 1B). Celsortering te voeren, wordt het celmonster gepompt in de buitenwand inlaat van de spiraal micro-inrichting terwijl de binnenwand inlaat loopt verse buffer oplossing met een hogere stroomsnelheid (01:10) om de cel monsterstroom knijpen. Scheiding wordt bereikt door inertie focussering van grotere gelabelde cellen bij de binnenwand en Dean veroorzaakte recirculatie van kleine ongebonden NPs naar de buitenwand (figuur 2A). Het toestel werd voor het eerst toepased aan gemerkt suspensie monocytische cellen (THP-1) van TL-silica NP's beladen met calceïne sorteren (~ 500 nm in grootte). Hoge scheidingsefficiëntie te verkregen als bevestigd door de hoge snelheid imaging (Figuur 2A) en flowcytometrie analyse (Figuur 2B). Beelden van elutiemiddelen vanuit apparaat cel uitlaat gaven ook efficiënte verwijdering van silica en PLGA NP (~ 1-5 pm) van THP-1 cellen. Bovendien fluorescentie beeldvorming bleek dat geïnternaliseerd NPs in de gelabelde THP-1-cellen werden behouden en tijdens DFF zuivering (bijvoegsels) (figuur 3). Door MSC grootte heterogeniteit werd de spiraalvormige geometrie microkanaal vervolgens aangepast door het veranderen van de goothoogte en bifurcatie ontwerp om efficiënt verzamelen van MSC's (figuur 4) mogelijk.
Figuur 1. (A) Overall workflow voor een snelle single-step micro / nanodeeltjes (NP) verwijdering uit schorsing en hechtende cellen post-labeling met behulp van Dean Flow fractionering (DFF) microfluïdische technologie. (B) De DFF spiraalvormige inrichting is ontworpen door engineering software en gevormd op silicium wafer via microfabricage. PDMS inrichtingen worden vervolgens door zachte lithografie werkwijzen. Experimentele opstelling bestaat uit 2 spuitpompen te gelabelde cellen en de frisse zout buffer bij verschillende debieten in het apparaat voor continue zuivering en verzameling van gelabelde cellen trekken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Nanodeeltjes verwijdering uit het label THP-1-cellen via DFF. (A) Afbeelding vanscheiding principe DFF. Grotere gelabelde cellen ervaren sterke inertie lift krachten (F L, rode pijlen) en Dean drag krachten (F D, gele pijlen) en de focus in de buurt van het microkanaal binnenwand. Kleinere NPS en bufferoplossing worden uitsluitend beïnvloed door Dean slepen en recirculeren naar de buitenste muur om scheiding te bereiken. Vertegenwoordiger hoge snelheid en fluorescentie beelden aangeeft evenwicht posities van THP-1-cellen (rode pijlen) en silica NP's beladen met calceïne kleurstof aan de uitlaat regio. (B) Scheiding prestaties op basis van flowcytometrie-analyse met gating bepaald door de omvang (FSC-A) en de granulariteit (SSC-A) eigenschappen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3.
Figuur 4. Nanodeeltjes verwijdering uit mesenchymale stamcellen (MSC's) via DFF. Image Vertegenwoordiger hoge snelheid (A) illustreert efficiënte scheiding van MSC's (rode pijlen) en PLGA NP (blauwe pijlen) in verschillende verkooppunten. Gele gestippelde lijnen geven de globale positie van het microkanaal muren. (B) Scheiding prestaties van MSC's uit silica en PLGA NP.pg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De DFF cel zuiveringstechnologie hierin beschreven maakt een snelle en voortdurende scheiding van gelabelde cellen in een high throughput manier. Deze scheiding benadering is ideaal voor grote monstervolume of hoge celconcentratie monster verwerking, en beter dan conventionele een membraan filtratie die gevoelig zijn voor verstopping na langdurig gebruik. Evenzo affiniteit gebaseerde magnetische scheiding vereist extra cel labeling stappen die omslachtig en duur zijn. De gezuiverde cellen is aangetoond dat het etiket agenten en celmorfologie vormt (figuur 3) met minimale stroom / afschuiving geïnduceerde effecten (afschuifspanning τ, ~ 200-250 dyne / cm 2) door korte verblijftijd in het kanaal vast te houden (< 1 sec) 20,24. Bovendien kan de gebruiker de geëlueerde oplossing van de gemerkte cellen gesorteerd selecteren door eenvoudig het substitueren van de huls buffer (zoutoplossing) met de gewenste media of bufferoplossing.
Het is essentieel dater is geen vuil of puin in de microkanaal voorafgaand gebruik dat nadelig kan beïnvloeden cel focus gedrag. Dit kan worden bereikt door het schoonmaken van de inlaatgaten grondig met IPA, alsmede het gebruik van plakband aan de PDMS oppervlak voordat plasma bonding reinigen. Aangezien de micro-inrichting werkt met hoge stromingsomstandigheden (~ 1-1,5 ml / min), is het ook belangrijk om te verwarmen gebonden PDMS inrichtingen op een kookplaat sterke hechting tussen de PDMS en het glaasje waarborgen. Tijdens werking van het apparaat, wanneer de cellen niet goed concentreren, betekent dit dat de stroomsnelheden onvoldoende. Men kan oplossen door het controleren van het apparaat inlaat regio en de spuit tips om ervoor te zorgen dat er geen lekkages.
Verwijdering van ongebonden NP van gelabelde cellen is niet triviaal, omdat gemeenschappelijke laboratorium scheidingstechnieken (bijvoorbeeld centrifugeren) kan niet los deeltjes / cellen van verschillende grootte (bijv ongebonden deeltjes en gelabelde cellen). Terwijl de ene dat herhaalde wassen kan argumenterenen het veranderen van kweekmedia kan vrij NP van hechtende cellen te verwijderen tot op zekere hoogte, het proces is bewerkelijk en inefficiënt voor suspensie celkweken. DFF het microfluïdische apparaat maakt gebruik-afmeting gebaseerd sorteren en is zeer veelzijdig omdat het kan worden gebruikt voor suspensie en hechtende cellen met een grote grootte, en het wegnemen van NPs -uitvoeringen. Als de doelcellen van verschillende afmetingen, kan het DFF inrichting worden geoptimaliseerd door verandering van de stroomomstandigheden of kanaalgeometrie (bijvoorbeeld goothoogte en de verhouding van binnenste en buitenste kanaalbreedtes) een doelmatige scheiding te bereiken. Eerder is aangetoond dat DFF superieur ten opzichte van conventionele centrifugeren in NPS verwijderen met minimale celverlies. 22 Bovendien cel terugwinningsprestaties bleef hoog (> 90%) wanneer het monster concentratie werd verhoogd tot 10 7 cellen / ml. Dit is een belangrijke verbetering ten opzichte van bestaande inertiale microfluïdische celscheiding werkwijzen die algemeenly beperkt tot 10 5 cellen / ml door cel-cel interacties en cel overbevolking in evenwichtspositie. 25
Terwijl de DFF technologie bereikt scheiding op basis van grootte verschil kan niet worden gebruikt voor andere mobiele technische processen zoals scheiding van gemerkte en niet-gemerkte cellen door verwaarloosbare wijziging in celgrootte. Celoppervlaktemerkers voor affiniteit gebaseerde verwerking en andere gebruikelijke scheiding modaliteiten (magnetische susceptibiliteit en elektrische geleidbaarheid) kan worden beschouwd voor een dergelijke mogelijke toepassingen. DFF technologie is ook niet geschikt voor multiplex celsortering op basis van fluorescentie. Een betere optie zou zijn om fluorescentie-geactiveerde celsortering toe te passen (FACS) voor het in één stap sortering van cellen gelabeld met verschillende fluorescentie die werkt met hoge doorvoer, maar vereist kostbare en omvangrijke apparatuur.
Tenslotte dit protocol is zeer nuttig voor het zuiveren van gemanipuleerde cellen bijNPs met transformerende middelen (groeifactoren, geneesmiddelen, corticosteroïden, enz.) Worden gebruikt voor Bio-imaging en / of celtherapie. Dit komt omdat overblijfsel gratis NP off-target transformatieve effecten op naburige cellen of immuuncellen die reageren op deze vreemde deeltjes bij injectie in vivo kunnen uitoefenen. Het kan ook onbedoeld genereren signalen die misleidend kunnen zijn tijdens het Bio-imaging. Verwijdering van deze gratis NP's voorafgaand aan het gebruik dus vermindering van risico voor niet-target cellen, compilaties in het immuunsysteem van een minimum te beperken, en problemen besmetting tussen de stappen tijdens sequentiële etikettering / engineering van cellen te verminderen. De succesvolle implementatie aanzienlijk vergemakkelijkt cel etikettering en maakt het storingsvrij gebruik van deeltjes gebaseerd cel techniek in therapie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell lines & Media | |||
| Mesenchymal Stem Cells (MSCs) | Lonza | PT-2501 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Lonza | 12-614F | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270-106 | |
| THP-1 monocyte cells (THP-1) | ATCC | TIB-202 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 media | Lonza | 12-702F | |
| Reagents & Materials | |||
| 0.01% poly-L-lysine (PLL) | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| 3 ml Syringe | BD | 302113 | Syringe 3 ml Luer-Lock |
| 60 ml Syringe | BD | 309653 | Syringe 60 ml Luer-Lock |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Biowest | P6154-100GR | |
| Calcein, AM (CAM) | Life Technologies | C1430 | |
| Calcein | Sigma-Aldrich | C0875 | |
| Isopropanol | Fisher Chemical | #P/7507/17 | HPLC Grade 2.5 L |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Lonza | 17-516Q/12 | |
| Plain Microscope Slides | Fisher Scientific | FIS#12-550D | 75 x 25 x 1 mm3 |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | SYLGARD® 184 | |
| Scotch tape | 3M | 21200702044 | 18 mm x 25 m |
| Silica NPs (∼200 μm) | Sigma-Aldrich | 748161 | Pore size 4 nm |
| Syringe Tip | JEC Technology | 7018302 | 23 G 0.013 x 0.25 |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Life Technologies | 25200-056 | |
| Tygon Tubing | Spectra-Teknik | 06419-01 | 0.02 x 0.06" 100 |
| Poly (D,L-lactide-co-glycolide) (PLGA; 50:50) | Sigma-Aldrich | P2191 | |
| Equipment | |||
| Biopsy punch | Harris Uni-Core | 69036-15 | 1.50 mm |
| Dessicator | Scienceware | 111/4 IN OD | |
| High-speed Camera | Phantom | V9.1 | |
| Inverted phase-contrast microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-002 | |
| Syringe Pump | Chemyx | CX Fusion 200 |
References
- Wiraja, C., et al. Aptamer technology for tracking cells' status & function. Mol. Cell. Ther. 2, 33 (2014).
- Yeo, D. C., Wiraja, C., Mantalaris, A., Xu, C. Nanosensors for Regenerative Medicine. J. Biomed. Nanotech. 10, 2722-2746 (2014).
- Naumova, A. V., Modo, M., Moore, A., Murry, C. E., Frank, J. A. Clinical imaging in regenerative medicine. Nat. Biotechnol. 32, 804-818 (2014).
- Soenen, S. J., et al. Cellular toxicity of inorganic nanoparticles: Common aspects and guidelines for improved nanotoxicity evaluation. Nano Today. 6, 446-465 (2011).
- Donaldson, K., Poland, C. A. Nanotoxicity: challenging the myth of nano-specific toxicity. Curr. Opin. Biotechnol. 24, 724-734 (2013).
- Veiseh, O., et al. Size- and shape-dependent foreign body immune response to materials implanted in rodents and non-human primates. Nat. Mater. 14, 643-651 (2015).
- Jones, S. W., et al. Nanoparticle clearance is governed by Th1/Th2 immunity and strain background. J. Clin. Invest. 123, 3061-3073 (2013).
- Marchi, L. F., Sesti-Costa, R., Chedraoui-Silva, S., Mantovani, B. Comparison of four methods for the isolation of murine blood neutrophils with respect to the release of reactive oxygen and nitrogen species and the expression of immunological receptors. Comp. Clin. Pathol. 23, 1469-1476 (2014).
- Morton, K. J., et al. Hydrodynamic metamaterials: Microfabricated arrays to steer, refract, and focus streams of biomaterials. Proc. Natl. Acad. of Sci USA. 105, 7434-7438 (2008).
- Hu, X., et al. Marker-specific sorting of rare cells using dielectrophoresis. Proc. Natl. Acad. of Sci USA. 102, 15757-15761 (2005).
- Cummings, E. B. Streaming dielectrophoresis for continuous-flow microfluidic devices. IEEE Eng. Med. Biol. Mag. 22, 75-84 (2003).
- Augustsson, P., Persson, J., Ekstrom, S., Ohlin, M., Laurell, T. Decomplexing biofluids using microchip based acoustophoresis. Lab Chip. 9, 810-818 (2009).
- Di Carlo, D., Irimia, D., Tompkins, R. G., Toner, M. Continuous inertial focusing, ordering, and separation of particles in microchannels. Proc. Natl. Acad. of Sci USA. 104, 18892-18897 (2007).
- Hur, S. C., Henderson-MacLennan, N. K., McCabe, E. R. B., Di Carlo, D. Deformability-based cell classification and enrichment using inertial microfluidics. Lab Chip. 11, 912-920 (2011).
- Mach, A. J., Di Carlo, D. Continuous scalable blood filtration device using inertial microfluidics. Biotechnol. Bioengin. 107, 302-311 (2010).
- Gossett, D. R., et al. Inertial manipulation and transfer of microparticles across laminar fluid streams. Small. 8, 2757-2764 (2012).
- Amini, H., et al. Engineering fluid flow using sequenced microstructures. Nat. Commun. 4, 1826 (2013).
- Sollier, E., et al. Inertial microfluidic programming of microparticle-laden flows for solution transfer around cells and particles. Microfluid. Nanofluid. 19, 53-65 (2015).
- Lee, W. C., et al. Multivariate biophysical markers predictive of mesenchymal stromal cell multipotency. Proc. Natl. Acad. of Sci USA. 111, E4409-E4418 (2014).
- Hou, H. W., et al. Isolation and retrieval of circulating tumor cells using centrifugal forces. Sci. Rep. 3, 1259 (2013).
- Hou, H. W., Bhattacharyya, R. P., Hung, D. T., Han, J. Direct detection and drug-resistance profiling of bacteremias using inertial microfluidics. Lab Chip. 15, 2297-2307 (2015).
- Yeo, D. C., et al. Interference-free Micro/nanoparticle Cell Engineering by Use of High-Throughput Microfluidic Separation. ACS Appl. Mater. Inter. 7, 20855-20864 (2015).
- Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft Lithography. Angew. Chem. Int. Edit. 37, 550-575 (1998).
- Lee, W. C., et al. High-throughput cell cycle synchronization using inertial forces in spiral microchannels. Lab Chip. 11, 1359-1367 (2011).
- Kuntaegowdanahalli, S. S., Bhagat, A. A., Kumar, G., Papautsky, I. Inertial microfluidics for continuous particle separation in spiral microchannels. Lab Chip. 9, 2973-2980 (2009).
