Summary
このプロトコルは、非結合粒子を効率的に枯渇してマイクロ/ナノ粒子操作された細胞を精製するために、慣性マイクロ流体ベースのバッファ交換戦略の使用を記載しています。
Abstract
活性成分ロードマイクロ/ナノ粒子を有する細胞を操作する（NPS）は、ネイティブの治療特性を向上させるバイオイメージングを可能にし、細胞表現型を制御するために、ますます一般的な方法になってきています。クリティカルまだ不十分な対処の問題は容易に従来の遠心分離によって除去することができない細胞標識後に結合しないままの粒子のかなりの数です。これは、バイオイメージング、バックグラウンドノイズの増加をもたらし、隣接する非標的細胞に変革効果を付与することができます。このプロトコルでは、我々は効率的に高スループットの方法で遊離のNPから標識細胞を分離するためのディーン・フロー分画（DFF）と呼ば慣性マイクロ流体ベースのバッファ交換戦略を提示します。未結合の蛍光色素又は染料装填のNP（SILの> 95％の枯渇を達成しながら開発スパイラルマイクロデバイスは、新たな緩衝液に懸濁精製細胞（THP-1およびMSC）の連続的な回収（> 90％の細胞回復）を容易にしますICAまたはPLGA）。このシングルステップ、サイズに基づく細胞の精製戦略は、高いセル処理能力（10 6細胞/分）を可能にし、干渉のない臨床応用を実現するために、マイクロ/ナノ粒子操作された細胞の大容量セルの精製に非常に有用です。
Introduction
エージェントにロードされたマイクロ/ナノ粒子（NPS）によって細胞を操作するには、バイオイメージング能力を高め、再生医療において、ネイティブの治療特性を補う/強化するために、単純な、ゲノム組込みフリーで、かつ汎用性の高い方法。1-3携帯修正は標識することによって達成されますエージェントにロードされたNPの過剰濃度の形質膜や細胞質は結合部位を飽和させます。しかし、この方法の主な欠点は、潜在的に、粒子操作された細胞の正確な同定を混乱させるまたは治療結果を複雑にすることができる細胞標識工程の後に溶液中に残存する未結合の粒子のかなりの量である。また4,5、変革を含むのNPへの曝露過度に高濃度の薬剤（成長因子、コルチコステロイド、 等）は、非標的細胞に意図しない結果を誘導し得る細胞毒性および誤った露出を引き起こす可能性があります。 Oを備えても粒子状キャリアF「生体適合性」材料[ 例えば 、ポリ（乳酸-co-グリコール酸）、PLGA]は同様に、一定の条件の下で強力な免疫細胞応答を扇動することができます。6これは、免疫障害（ 例えば 、関節リウマチ）、潜在的な遅延を有する個体において特に危険です全身ナノ粒子のクリアランス。7したがって、従来の粒子-操作された細胞の導入に自由粒子の効率的な除去は、毒性プロフィールを最小化し、in vivoでのエージェントにロードされた粒子に見当違いの露出を減らすために非常に重要です。
従来勾配遠心分離は、多くの場合、自由粒子から操作された細胞を分離するために使用されるが、面倒であり、バッチモードで操作されます。また、高速遠心分離中に細胞および細胞の完全性および/ または影響の細胞の挙動を損なう可能性密度勾配媒質の成分が経験するせん断応力は、8マイクロフルイディクスは、SEVで魅力的な代替手段であります決定論的横変位（DLD）9を含むERAL分離技術、10,11を dieletrophoresisと小さな粒子の分離およびバッファ交換用に開発12を acoustophoresis。しかしながら、これらの方法は、（分・1-10μL - 1）低いスループット苦しむとの問題を目詰まりを起こしやすいです。このような誘電泳動に基づく方法のような活性の分離はまた、分離を達成するために固有の誘電細胞表現型または追加の細胞標識手順の違いを必要とします。全体の粒子または細胞の横方向の移動をその高い流動条件と優れたサイズの解像度に起因する高レイノルズ数（Re）が13で支配的な揚力（F L）に別個の位置に集中する合理化-より多くの有望なアプローチは、慣性マイクロフルイディクスを伴います。それは、多くの場合、サイズに基づく細胞分離14,15とバッファ交換用途のために利用されている。16-18 Howeve分離した細胞は、通常、元のと新しい緩衝液との間の境界に近い残るように、R、バッファ交換性能が~10-30％、汚染物質溶液で貧しいまま。16-18さらに重要なのは、標的細胞のサイズ分布を達成することは似ているように持っています正確な慣性は、フォーカシング、特にそのような間葉系幹細胞（MSC）のような不均質なサイズの細胞型の処理に問題を提起し、元の緩衝液からの分離。19
我々は以前、新しい慣性マイクロ流体セルソーティング技術は、2-入口、2-アウトレットスパイラルマイクロチャネルデバイスを使用して、循環腫瘍細胞（CTCの）全血から20および細菌21を単離するためのディーン・フロー分画（DFF）と呼ばれる開発しました。このビデオプロトコルでは、我々は、標識THP-1（ヒト急性単球性白血病細胞株）懸濁単球細胞（〜15ミクロン）およびカルセイン-LでのMSC（10-30ミクロン）の処理について説明しますoadedのNP、標識された細胞と結合していないNPの除去を効率的に回収するためのDFFのスパイラルマイクロデバイスの製造および操作が続く。22この一段階精製戦略は、標識されたサスペンション、遠心分離することなく、新鮮な緩衝液に懸濁接着細胞の連続的な回復を可能にします。また、10万個の細胞・ml -1の、再生医療用途のために適した細胞密度まで処理することができます。
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Protocol
間葉系幹細胞と単球の1ナノ粒子（NPS）ラベリング
- ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）中で培養間葉系幹細胞（MSC）は、標識前に≥80％コンフルエントに10％ウシ胎児血清（FBS）および抗生物質を補充しました。同様に、約10 6細胞/ mlの密度まで、10％FBSを補充したロズウェルパーク記念研究所（RPMI）1640培地中で培養THP-1細胞（ATCC）。
- ロードシリカのNP（〜500μm）で一晩攪拌を使用して、カルセイン染料溶液（200μM）を持ちます。以前に記載されたプロトコルを使用して、PLGA-カルセインAM（CAM）を製作してください。22
- 4℃のクロロホルム中に250μgのCAMおよび100mgのPLGA（50:50）に溶解します。
- 室温で高速ホモジナイザー（13,600×gで、60秒）を使用して、単一乳剤のNPを生成します。 （二重distiを洗浄し、遠心分離を用いて収集する前に、化学フード（≥3時間）（5分間3400×gで）でクロロホルムを蒸発させ、満たさ水）は、凍結乾燥およびストレージを-20℃に。
- 20分 - CAM-PLGAのNP（1ミリグラム）または15室温で0.01％のポリ-L-リジン（PLL）溶液中のカルセインシリカのNP（150μgの）をインキュベートします。
- 5分間、3400×gで遠心分離し、それぞれの培地の1ミリリットル中のNP再懸濁する前に、過剰なPLL上清を除去しました。
- 約24時間（0.1 mgの・ml -1のラベリング濃度）のために-細胞（合計で2×10 6細胞のMSCまたはTHP-1、〜1）でのNPをインキュベートします。
- 解離し、0.25％トリプシン（5分、37°C）の2ミリリットルを用いて標識付着MSCを収穫し、DMEMの6ミリリットルでクエンチしました。 （千XG、4分）で細胞をスピンダウンし、10 5の濃度に再懸濁-マイクロ流体処理のために10 6細胞/ ml。直接マイクロフルイディクスの精製の ために- （10 6細胞/ ml 10 5）ラベルされたTHP-1細胞を使用してください。
2.マイクロ流体デバイスの準備
- デバイス製造
- マイクロ流体スパイラルデバイスを製造（500ミクロン115ミクロン（H）×（W））標準ソフトリソグラフィ工程を用いて市販のキットからのポリジメチルシロキサン（PDMS）を持つ。23
- ベースプレポリマーの30グラムと秤量ボートに徹底的に硬化剤3グラムを混ぜます。脱ガス気泡を除去するために60分間デシケーター中の混合物。
- 10ミリメートル - 〜5の高さに慎重に螺旋状のチャネル設計にパターニングされたシリコンウエハーマスターモールド上にPDMSの混合物を注ぎます。
- 脱ガス再び気泡を除去するために60分間デシケーター真空中の混合物。全ての気泡が除去されるまで、このプロセスを繰り返します。
- PDMSが設定されるまで2時間80℃のオーブン中でPDMS混合物を硬化させます。ウェハが一定のデバイスの高さを持つように硬化時に傾いていないことを確認してください。
- メスを用いてPDMSスパイラル装置を切り取り、慎重にマスターモールドからPDMSスラブの皮をむきます。
- Trの接合のための滑らかな表面を確保するために、メスで、デバイスのエッジをイム。
- 注入口のための2つの穴（1.5ミリメートル）と1.5ミリメートル生検パンチャーを使用してPDMSデバイス上のコンセントのための2つの穴（1.5ミリメートル）をパンチ。
- 任意の破片を除去し、5分間80℃のオーブン中でデバイスを乾燥イソプロパノール（IPA）で装置を洗浄します。
- マスキングテープを使用して、（チャネル機能を備えた）PDMSデバイスの底面を清掃してください。
- マスキングテープを使用して（「3による「2）スライドガラスのクリーン片側。
- 慎重に配置し、プラズマクリーナーのチャンバ内にPDMS装置とスライドガラスの清浄面を露出させ、60秒間真空にそれらをかけます。次に、最大にプラズマ電源をオンにし、室内の色がピンクになるまでチャンバ圧力を下げます。
- 60秒間空気プラズマに表面を露出。下剤に持ち込まときにプラズマがタイトな結合を可能にPDMSとガラスの露出面上の反応種を作成します。アル接触。プラズマ電源を切り、デバイスとガラススライドを取得するために、プラズマクリーナーからの圧力を解放します。
- しっかりプラズマ露出面を押すと泡が2つの表面の間に捕捉されていないことを確実にすることによって、一緒にPDMSデバイスとスライドガラスを接着。
- 結合を強化するために2時間80℃に設定したホットプレートを用いて接合デバイスを加熱します。
- 素子動作
- 入口シリンジ20センチ、各チューブの一端にシリンジチップ（ゲージ23）を取り付け - 〜15のチューブの2枚（1.52ミリメートルのOD）をカットします。
- 〜5のチューブの2枚（1.52ミリメートルのOD）カット - アウトレット10センチとPDMSデバイスの出口穴に取り付けます。
- それは出口管から流出するまで70％エタノールを含有するシリンジを用いてプライム手動で、実行中のデバイスをサンプリングする前に。エタノールは、装置を滅菌する1分30秒のために座って許可します。
- 負荷フィルタリングの30ミリリットル（0.2μmの孔径）シース緩衝液（0.1％ウシ血清アルブミン（BSA）を含むリン酸緩衝生理食塩水（PBS））60ミリリットル注射器へとシリンジポンプにシリンジを固定します。正しい設定（：60ミリリットル、ボリューム：60,000μLシリンジサイズ）にポンプを設定します。
注：PBSのBSAの添加は、細胞 - 細胞結合および細胞およびPDMSデバイスとの間の非特異的結合を最小にすることです。 - 負荷3 mlシリンジへの標識された細胞の3ミリリットルと別々のシリンジポンプにシリンジを固定します。正しい設定（：3ミリリットル、ボリューム：3000μLシリンジサイズ）にポンプを設定します。
- 全く気泡が安定した流れを確保するために、注射器の中に閉じ込めていないことを確認してください。優しくノズルから液体を数滴を吐出することにより、任意の気泡を除去。
- 注射器に流入シリンジのヒントやチューブを接続し、デバイス（シースおよびサンプル入口）のそれぞれの入口に挿入してください。チューブに沿って気泡がないことを確認してください。
- 反転の上にデバイスをマウントします細胞選別プロセス中にリアルタイムイメージングのためのED位相差顕微鏡。
- 小さな廃棄物のビーカーや接着剤を使用して、顕微鏡ステージ上のデバイスに近い2 15ミリリットルのチューブを固定します。
- 廃棄物のビーカーに出口チューブを置きます。
- 1:10シースバッファへのサンプルのための流量比を設定し、ソート処理を開始するために、両方のシリンジポンプを起動します（例：サンプルシリンジとシースシリンジのための1200μL/分で120μL/分;チャネル流速〜0.38メートル/秒）。
- 流量が安定するのを1.5分間、デバイスを実行します。 （ - ：10-50マイクロ秒秒10,000フレーム（FPS）、露光時間〜5,000）、これは、高速度カメラを用いた位相差と明視野下のチャネルの内壁の近く慣性集束細胞の存在によって確認することができます。
- セル出口と廃液出口から溶離液を収集するために別のチューブに出口チューブを置きます。
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Representative Results
一晩バイオイメージング剤を装填したNPで細胞を標識した後、（自由粒子を含む）標識された細胞を回収し、単一ステップのプロセス（ 図1A）に無料のNPを除去するために、DFFのスパイラルマイクロデバイスによって精製しました。 2-入口、2-コンセントスパイラルマイクロチャネルは、SU-8フォトレジストを用いたエンジニアリングソフトウェアによって設計され、微細加工されています。パターニングされたシリコンウェハは、次いで、ソフトリソグラフィー技術（ 図1B）を使用してPDMSレプリカ成形用の鋳型として使用されます。内壁入口は細胞サンプル流を挟むために、より高い流量（1:10）で、新鮮な緩衝液を実行しながら、細胞選別を行うために、細胞試料は、スパイラルマイクロデバイスの外壁の入口に圧送されます。分離は慣性が内壁と外壁（ 図2A）に向かって小さな未結合のNPのディーンによって誘発される再循環でより大きな標識細胞のフォーカシングによって達成されます。装置は、第一アプリでしたカルセイン（サイズは〜500 nm）を用いてロードされた蛍光シリカのNPからラベルされたサスペンション単球細胞（THP-1）をソートするエド。高速イメージング（ 図2A）によって確認した （ 図2B）フローサイトメトリー分析のような高分離効率が得られました。 THP-1細胞から - （5ミクロン〜1）デバイスのセル出口から収集溶離液の画像は、シリカおよびPLGA NPの効率的な除去を示しました。また、蛍光イメージングは、標識されたTHP-1細胞に内蔵NPはよくDFF精製（挿入図）（ 図3）の間に保持されたことを示しました。 MSCサイズの不均一性のため、スパイラルマイクロチャネルの幾何学的形状は、その後のMSC（ 図4）の効率的な収集を可能にするために、チャネルの高さと分岐の設計を変更することによって修正されました。
図1（A）Ovとディーン・フロー分画（DFF）マイクロ流体技術を用いて、サスペンションや接着細胞標識後から急速なシングルステップのマイクロ/ナノ粒子（NPS）を除去するためのerallワークフロー。 （B）DFFスパイラル装置はエンジニアリングソフトウェアによって設計され、微細加工を用いてシリコンウエハー上にパターン化されます。 PDMSデバイスは、その後、ソフトリソグラフィー法により製造されます。実験装置は、標識された細胞の連続精製および回収するための装置に異なる流量で標識された細胞、新鮮な生理食塩水緩衝液を注入するために2シリンジポンプで構成されています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
DFFを介して標識されたTHP-1細胞からの 図2. ナノ粒子除去。（A）のイラストDFF分離原則。より大きな標識された細胞は、強い慣性揚力（F L、赤矢印）とディーン抗力（F D、黄色の矢印）を経験し、マイクロチャネル内壁近くに集中します。小さいのNPおよび緩衝液は、単独ディーン抗力の影響を受けて分離を達成するために外壁に再循環されます。出口領域でのカルセイン色素を負荷したTHP-1細胞（赤色矢印）、シリカNPの平衡位置を示す代表的な高速および蛍光画像。サイズ（FSC-A）および粒度（SSC-A）の特性によって決定ゲーティングとフローサイトメトリー分析に基づいて、（B）の分離性能を提供します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3。
別のコンセントに効率的なMSCの分離（赤矢印）とPLGAのNPを（青い矢印）を示す図4.ナノ粒子のDFFを経由して、間葉系幹細胞（MSC）からの除去。（A）代表高速画像。黄色はラインがマイクロチャネル壁のおおよその位置を示す点線。 （B）シリカ及びPLGAのNPからのMSCの分離性能。pgの "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
本明細書に記載されDFF細胞精製技術は、ハイスループット様式で標識された細胞の迅速かつ継続的な分離を可能にします。この分離法は、大きな試料体積または高細胞濃度の試料処理のために理想的であり、長期間の使用後に目詰まりを起こしやすい従来の膜ベースの濾過よりも良好です。同様に、親和性に基づく磁気分離は面倒かつ高価である追加の細胞標識のステップを必要とします。精製された細胞は、<（チャンネル内により短い滞留時間に（〜200〜250ダイン/ cm 2のせん断応力τ、）最小限の流れ/せん断によって誘発される効果とよく（ 図3）、その標識された薬剤と細胞の形態を保持していることが示されています1秒）20,24。また、ユーザは、単に所望の媒体または緩衝液とシースバッファー（生理食塩水）を代入することによりソート標識細胞の溶出液を選択することができます。
それはすることが重要です悪セルフォーカシング動作に影響を与えることができ、マイクロチャネル使用前には埃やゴミがありません。これはIPAで十分に入口穴を洗浄、並びにプラズマ接合前PDMS表面を洗浄するためにマスキングテープを使用することによって達成することができます。マイクロデバイスは、高流量条件下で動作するので（約1 - 1.5ml /分）は、PDMSとガラススライドとの間に強固な結合を確実にするためにホットプレート上に結合したPDMSデバイスを加熱することも重要です。細胞が十分に集束されていない場合、デバイスの動作中に、その流量が十分でないことを意味します。一つは、全く漏れがないことを確認するために、デバイス入口領域とシリンジのヒントをチェックしてトラブルシューティングを行うことができます。
標識された細胞から未結合のNPの除去は、一般的な実験の分離技術（ 例えば、遠心分離）以来、些細なことではないことはできない独立した粒子/異なるサイズ（ 例えば、未結合粒子および標識された細胞）の細胞。 1は、洗濯を繰り返し主張することができますがそして培養培地の変化がある程度接着細胞から無料のNPを削除することができ、処理が面倒と懸濁細胞培養のために無効です。 DFFマイクロ流体デバイスは、サイズに基づく選別を利用し、サスペンションや接着細胞大きいサイズ範囲で、ならびに異なる物質のNPの除去の両方のために使用することができるように汎用性の高いです。標的細胞は、異なるサイズのものである場合には、DFFのデバイスは、効率的な分離を達成するために、フロー条件またはチャネルの形状（ 例えば、チャネルの高さと内外チャネル幅の比）を変えることにより最適化することができます。以前にDFFが最小セル損失でのNPの除去に従来の遠心分離に比べて優れていることが実証されている。22はまた、細胞の回復性能が高いままであった（> 90％）試料濃度が10 7細胞/ mlに増加したとき。これは一般的なもので、既存の慣性マイクロ流体細胞分離方法を超えるキー改善されていますLYによる細胞-細胞相互作用および細胞が平衡位置に過密に10 5細胞/ mlの容量に限定されるもので25
DFF技術は、大きさの違いに基づく分離を達成するが、それは、細胞の大きさのごくわずかな変化による標識および非標識細胞の分離のような他の細胞工学プロセスのために使用することができません。親和性に基づくソートや他の一般的な分離様式（磁化率と電気伝導度）のための細胞表面マーカーは、このような潜在的なアプリケーションのために考慮することができます。 DFF技術は、蛍光に基づく多重化細胞選別のために適していません。より良いオプションは、ハイスループットで動作するが、高価でかさばる装置を必要と異なる蛍光で標識された細胞の単一ステップのソートのための蛍光活性化セルソーティング（FACS）を使用することであろう。
最後に、このプロトコルは、ときに操作された細胞の精製のために非常に有用です変革剤（成長因子、薬物、コルチコステロイド、 等）を含むのNPは、バイオイメージングおよび/ または細胞療法のために使用されます。レムナント無料NPは、in vivoで注射した場合、これらの異物に反応する隣接セルまたは免疫細胞上のオフターゲット変革効果を発揮することができるからです。また、意図せずにバイオイメージングの間に誤解を招く可能性が信号を生成することができます。使用前にこれらの無料のNPの除去は、このように、非標的細胞へのリスクを軽減する免疫システムでコンパイルを最小限に抑え、細胞の連続ラベリング/エンジニアリング中にステップ間の汚染問題を減らします。その成功の実装が大幅に細胞標識を容易にし、治療に細胞工学系粒子の干渉のない使用を可能にします。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell lines & Media | |||
| Mesenchymal Stem Cells (MSCs) | Lonza | PT-2501 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Lonza | 12-614F | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270-106 | |
| THP-1 monocyte cells (THP-1) | ATCC | TIB-202 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 media | Lonza | 12-702F | |
| Reagents & Materials | |||
| 0.01% poly-L-lysine (PLL) | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| 3 ml Syringe | BD | 302113 | Syringe 3 ml Luer-Lock |
| 60 ml Syringe | BD | 309653 | Syringe 60 ml Luer-Lock |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Biowest | P6154-100GR | |
| Calcein, AM (CAM) | Life Technologies | C1430 | |
| Calcein | Sigma-Aldrich | C0875 | |
| Isopropanol | Fisher Chemical | #P/7507/17 | HPLC Grade 2.5 L |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Lonza | 17-516Q/12 | |
| Plain Microscope Slides | Fisher Scientific | FIS#12-550D | 75 x 25 x 1 mm3 |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | SYLGARD® 184 | |
| Scotch tape | 3M | 21200702044 | 18 mm x 25 m |
| Silica NPs (∼200 μm) | Sigma-Aldrich | 748161 | Pore size 4 nm |
| Syringe Tip | JEC Technology | 7018302 | 23 G 0.013 x 0.25 |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Life Technologies | 25200-056 | |
| Tygon Tubing | Spectra-Teknik | 06419-01 | 0.02 x 0.06" 100 |
| Poly (D,L-lactide-co-glycolide) (PLGA; 50:50) | Sigma-Aldrich | P2191 | |
| Equipment | |||
| Biopsy punch | Harris Uni-Core | 69036-15 | 1.50 mm |
| Dessicator | Scienceware | 111/4 IN OD | |
| High-speed Camera | Phantom | V9.1 | |
| Inverted phase-contrast microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-002 | |
| Syringe Pump | Chemyx | CX Fusion 200 |
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