Microfluidic Buffer Exchange for Forstyrrelsesfri Micro / partikler Cell Engineering
Summary
Denne protokollen beskriver bruken av en treghets MicroFluidics basert bufferbytte strategi for å rense mikro / nanopartikkel modifiserte cellene med effektiv uttømming av ubundne partikler.
Abstract
Ingeniør celler med aktiv ingrediens lastet mikro / nanopartikler (NPS) blir en stadig mer populær metode for å forbedre innfødte terapeutiske egenskaper, gjør at bio bildebehandling og kontrollere cellefenotyp. En kritisk, men en tilfredsstill problemet er betydelig antall av partikler som forblir ubundet etter cellemerking som ikke lett kan fjernes ved vanlig sentrifugering. Dette fører til en økning i biologisk avbildning bakgrunnsstøy, og kan formidle transformerende effekter bort på nærliggende ikke-målceller. I denne protokollen, presenterer vi en treghets MicroFluidics basert buffer utveksling strategi betegnes som Dean Flow Fraksjone (DFF) for å effektivt skille merkede celler fra frie NPs i en høy gjennomstrømning måte. Den utviklede spiral microdevice letter sammenhengende samling (> 90% celle gjenvinning) av rensede celler (THP-1 og MSC) suspendert i ny buffer-oppløsning, samtidig som man oppnår> 95% reduksjon av ubundet fluorescerende fargestoff eller fargestoff belastede NPS (silica eller PLGA). Dette enkelt-trinn, gjør det mulig størrelse basert celle rensestrategi høy celle behandling gjennomløp (10 6 celler / min), og er meget nyttig for stor-volum celle rensing av mikro / nanopartikkel konstruert for celler for å oppnå støyfri klinisk anvendelse.
Introduction
Ingeniør celler ved nestleder lastet mikro / nanopartikler (NPS) er en enkel, genomisk integrering fritt, og allsidig metode for å forbedre Bioimaging evne og styrke / supplere sin opprinnelige terapeutiske egenskaper i regenerativ medisin. 1-3 Cellular modifikasjoner oppnås ved å merke plasma membran eller cytoplasma med et overskudd konsentrasjon av nestleder belastede NPs å mette bindingssteder. Imidlertid er en stor ulempe ved denne metode er de store mengder av ubundne partikler som er igjen i oppløsningen etter cellemerkeprosesser, noe som kan forvirre presis identifisering av partikkel-konstruerte celler eller komplisere terapeutiske resultater. 4,5 I tillegg, eksponering for NPS inneholdende transformerende agenter (vekstfaktorer, kortikosteroider, etc.) ved for høy konsentrasjon kan føre cytotoksisitet og irrelevante eksponering kan forårsake utilsiktede konsekvenser på ikke-målceller. Selv partikkel bærere bestående of "biokompatible" materialer [f.eks poly (melkesyre co-glykolsyre), PLGA] kan egge potente immuncellere under visse forhold også. 6 Dette er spesielt risikabelt i personer med nedsatt immunforsvar (for eksempel reumatoid artritt) som potensielt forsinkelser systemisk clearance nanopartikkel. 7 således effektiv fjerning av frie partikler før innføring av partikkel konstruerte celler som er av stor viktighet for å minimalisere toksikologisk profil og redusere feilsendt eksponering til agenten belastet partiklene in vivo.
Konvensjonell gradient sentrifugering blir ofte brukt for å separere modifiserte cellene fra frie partikler, men er arbeidskrevende og drives i batch-modus. Videre skjærspenninger oppleves av celler under høyhastighetssentrifugering og bestanddelene av tettshetsgradient medium kan kompromittere celle integritet og / eller innflytelse celle atferd. 8 Microfluidics er et attraktivt alternativ med sevtater separasjonsteknologier, inkludert determinissideveis forskyvning (DLD) 9, dieletrophoresis 10,11 og acoustophoresis 12 utviklet for små partikler separasjon og buffer børs applikasjoner. Imidlertid er disse fremgangsmåter lider av lav gjennomstrømning (1-10 ul x min – 1) og er utsatt for tilstopping problemer. Aktive separasjoner som dielectrophoresis-baserte metoder krever også forskjeller i indre dielectrophoretic celle fenotyper eller ekstra celle merking skritt for å oppnå separasjon. En mer lovende tilnærming innebærer treghet MicroFluidics – lateral migrasjon av partikler eller celler over strømlinje å fokusere på forskjellige posisjoner på grunn av dominerende løftekraft (F L) ved høy Reynolds tall (Re) 13 På grunn av sin høye strømningsforhold og overlegen størrelse oppløsning. har det ofte vært utnyttet til størrelse basert celleseparasjon 14,15 og buffer børs applikasjoner. 16-18 However, forblir bufferbytte ytelsen dårlig med ~10-30% forurensningsoppløsning som de separerte celler som vanligvis er nær grensen mellom opprinnelige og nye bufferløsninger. 16-18 Viktigere er det at størrelsesfordelingen av målceller må være lik for å oppnå nøyaktig treghets fokusering og separasjon fra den opprinnelige bufferoppløsning som utgjør et problem, spesielt i behandlingen av heterogene størrelse celletyper slik som stamceller (MSC). 19
Vi har tidligere utviklet en ny treghets MicroFluidics cellesortering teknikk betegnes Dean Flow Fraksjonering (DFF) for å isolere sirkulerende tumorceller (CTCs) 20 og bakterier 21 fra helt blod ved hjelp av en to-innløp, 2-utløp spiral microchannel enhet. I denne video-protokollen, vil vi beskrive prosessen for merking av THP-1 (human akutt monocyttisk leukemicellelinje) suspensjon monocyttiske celler (~ 15 nm) og MSC (10-30 um) med calcein-loaded NPs, etterfulgt av fremstilling og drift av DFF spiral microdevice for en effektiv utvinning av merkede celler og fjerning av ubundne NPS. 22 Denne enkelttrinnsrensestrategi muliggjør kontinuerlig utvinning av merket suspensjon og adherente celler suspendert i frisk bufferløsning uten sentrifugering. Videre kan det behandle opptil 10 millioner celler · ml -1, en celle tetthet mottagelig for regenerativ medisin applikasjoner.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den DFF celle rensemetoder som er beskrevet her gjør det mulig hurtig og kontinuerlig separering av merkede celler i en høy gjennomstrømning måte. Denne separering tilnærmingen er ideell for stort prøvevolum eller høy cellekonsentrasjonen prøvebehandling, og er bedre enn konvensjonelle membran-baserte filtrering som er utsatt for tilstopping etter lang tids bruk. Tilsvarende krever affinitets-baserte magnetisk separasjon ytterligere celle merketrinn som er arbeidskrevende og kostbart. De rensede celler er vist ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Kind gift of THP-1 cells from Dr. Mark Chong and assistance in microfabrication from Dr. Yuejun Kang and Dr. Nishanth V. Menon (School of Chemical and Biomedical Engineering, Nanyang Technological University) were greatly acknowledged. This project was funded by NTU-Northwestern Institute of Nanomedicine (Nanyang Technological University). H.W.H. was supported by Lee Kong Chian School of Medicine (LKCMedicine) postdoctoral fellowship.
Materials
| Cell lines & Media | |||
| Mesenchymal Stem Cells (MSCs) | Lonza | PT-2501 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Lonza | 12-614F | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270-106 | |
| THP-1 monocyte cells (THP-1) | ATCC | TIB-202 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 media | Lonza | 12-702F | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Reagents & Materials | |||
| 0.01% poly-L-lysine (PLL) | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| 3 mL Syringe | BD | 302113 | Syringe 3ml Luer-Lock |
| 60 ml Syringe | BD | 309653 | Syringe 60ml Luer-Lock |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Biowest | P6154-100GR | |
| Calcein, AM (CAM) | Life Technologies | C1430 | |
| Calcein | Sigma-Aldrich | C0875 | |
| Isopropanol | Fisher Chemical | #P/7507/17 | HPLC Grade 2.5 L |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Lonza | 17-516Q/12 | |
| Plain Microscope Slides | Fisher Scientific | FIS#12-550D | 75 X 25 X 1 mm |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | SYLGARD® 184 | |
| Scotch tape | 3M | 21200702044 | 18mm x 25m |
| Silica NPs (∼200 μm) | Sigma-Aldrich | 748161 | Pore size 4 nm |
| Syringe Tip | JEC Technology | 7018302 | 23GA .013 X .25 |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Life Technologies | 25200-056 | |
| Tygon Tubing | Spectra-Teknik | 06419-01 | .02X.06" 100 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Equipment | |||
| Biopsy punch | Harris Uni-Core | 69036-15 | 1.50 mm |
| Dessicator | Scienceware | 111/4 IN OD | |
| High-speed Camera | Phantom | V9.1 | |
| Inverted phase-contrast microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-002 | |
| Syringe Pump | Chemyx | CX Fusion 200 | |
References
- Wiraja, C., et al. Aptamer technology for tracking cells’ status & function. Mol. Cell. Ther. 2, 33 (2014).
- Yeo, D. C., Wiraja, C., Mantalaris, A., Xu, C. Nanosensors for Regenerative Medicine. J. Biomed. Nanotech. 10, 2722-2746 (2014).
- Naumova, A. V., Modo, M., Moore, A., Murry, C. E., Frank, J. A. Clinical imaging in regenerative medicine. Nat. Biotechnol. 32, 804-818 (2014).
- Soenen, S. J., et al. Cellular toxicity of inorganic nanoparticles: Common aspects and guidelines for improved nanotoxicity evaluation. Nano Today. 6, 446-465 (2011).
- Donaldson, K., Poland, C. A. Nanotoxicity: challenging the myth of nano-specific toxicity. Curr. Opin. Biotechnol. 24, 724-734 (2013).
- Veiseh, O., et al. Size- and shape-dependent foreign body immune response to materials implanted in rodents and non-human primates. Nat. Mater. 14, 643-651 (2015).
- Jones, S. W., et al. Nanoparticle clearance is governed by Th1/Th2 immunity and strain background. J. Clin. Invest. 123, 3061-3073 (2013).
- Marchi, L. F., Sesti-Costa, R., Chedraoui-Silva, S., Mantovani, B. Comparison of four methods for the isolation of murine blood neutrophils with respect to the release of reactive oxygen and nitrogen species and the expression of immunological receptors. Comp. Clin. Pathol. 23, 1469-1476 (2014).
- Morton, K. J., et al. Hydrodynamic metamaterials: Microfabricated arrays to steer, refract, and focus streams of biomaterials. Proc. Natl. Acad. of Sci USA. 105, 7434-7438 (2008).
- Hu, X., et al. Marker-specific sorting of rare cells using dielectrophoresis. Proc. Natl. Acad. of Sci USA. 102, 15757-15761 (2005).
- Cummings, E. B. Streaming dielectrophoresis for continuous-flow microfluidic devices. IEEE Eng. Med. Biol. Mag. 22, 75-84 (2003).
- Augustsson, P., Persson, J., Ekstrom, S., Ohlin, M., Laurell, T. Decomplexing biofluids using microchip based acoustophoresis. Lab Chip. 9, 810-818 (2009).
- Di Carlo, D., Irimia, D., Tompkins, R. G., Toner, M. Continuous inertial focusing, ordering, and separation of particles in microchannels. Proc. Natl. Acad. of Sci USA. 104, 18892-18897 (2007).
- Hur, S. C., Henderson-MacLennan, N. K., McCabe, E. R. B., Di Carlo, D. Deformability-based cell classification and enrichment using inertial microfluidics. Lab Chip. 11, 912-920 (2011).
- Mach, A. J., Di Carlo, D. Continuous scalable blood filtration device using inertial microfluidics. Biotechnol. Bioengin. 107, 302-311 (2010).
- Gossett, D. R., et al. Inertial manipulation and transfer of microparticles across laminar fluid streams. Small. 8, 2757-2764 (2012).
- Amini, H., et al. Engineering fluid flow using sequenced microstructures. Nat. Commun. 4, 1826 (2013).
- Sollier, E., et al. Inertial microfluidic programming of microparticle-laden flows for solution transfer around cells and particles. Microfluid. Nanofluid. 19, 53-65 (2015).
- Lee, W. C., et al. Multivariate biophysical markers predictive of mesenchymal stromal cell multipotency. Proc. Natl. Acad. of Sci USA. 111, E4409-E4418 (2014).
- Hou, H. W., et al. Isolation and retrieval of circulating tumor cells using centrifugal forces. Sci. Rep. 3, 1259 (2013).
- Hou, H. W., Bhattacharyya, R. P., Hung, D. T., Han, J. Direct detection and drug-resistance profiling of bacteremias using inertial microfluidics. Lab Chip. 15, 2297-2307 (2015).
- Yeo, D. C., et al. Interference-free Micro/nanoparticle Cell Engineering by Use of High-Throughput Microfluidic Separation. ACS Appl. Mater. Inter. 7, 20855-20864 (2015).
- Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft Lithography. Angew. Chem. Int. Edit. 37, 550-575 (1998).
- Lee, W. C., et al. High-throughput cell cycle synchronization using inertial forces in spiral microchannels. Lab Chip. 11, 1359-1367 (2011).
- Kuntaegowdanahalli, S. S., Bhagat, A. A., Kumar, G., Papautsky, I. Inertial microfluidics for continuous particle separation in spiral microchannels. Lab Chip. 9, 2973-2980 (2009).
