Summary
Este protocolo descreve o uso de uma estratégia de troca de tampão à base de microfluidos inercial para purificar as células manipuladas micro / nanopartículas com depleção eficaz de partículas não ligadas.
Abstract
células de engenharia com micro ativo-ingrediente-carregado / nanopartículas (NPs) está se tornando um método cada vez mais popular para melhorar as propriedades terapêuticas nativos, permitem imagiologia bio e controlar fenótipo celular. Um problema crítico é ainda tratado de forma inadequada ao número significativo de partículas que permanecem não ligados após a marcação de células que não podem ser facilmente removidas por centrifugação convencional. Isto leva a um aumento do ruído de fundo de imagem bio e pode conferir efeitos de transformação em células não alvo vizinhos. Neste protocolo, apresentamos uma estratégia inercial baseada em microfluidics tampão de câmbio denominado como Dean Fluxo Fracionamento (DFF) para separar eficientemente células marcadas de NPs livres de uma forma de alto rendimento. O microdispositivo espiral desenvolvido facilita a recolha contínua (> recuperação de células de 90%) das células purificadas (THP-1 e MSCs) suspensas em solução tampão nova, ao conseguir% depleção de corante fluorescente não ligado ou NPs tingem-carregado (sil> 95ica ou PLGA). Este único passo, estratégia de purificação de células à base de tamanho permite que o rendimento de processamento de alta celular (10 6 células / min) e é altamente útil para a purificação de células de grande volume de células micro / nanopartículas projetada para alcançar uma aplicação clínica livre de interferências.
Introduction
Engenharia células, carregado por agente micro / nanopartículas (NPs) é um método livre de integração, e versátil simples, genômica para melhorar a capacidade bioimaging e aumentar / complementar suas propriedades terapêuticas nativas em medicina regenerativa. 1-3 modificações celulares são alcançados por rotular o membrana plasmática ou citoplasma com um excesso de concentração de NPs carregado por agente para saturar os locais de ligação. No entanto, uma grande desvantagem deste método é a de quantidades significativas de partículas não ligadas que permanece em solução depois de processos de rotulagem de células, que podem potencialmente confundir identificação precisa das células de engenharia de partículas ou complicam resultados terapêuticos 4,5. Além disso, a exposição aos PN contendo transformador agentes (fatores de crescimento, corticosteróides, etc.) em excessivamente alta concentração pode causar citotoxicidade ea exposição mal direcionada pode induzir consequências indesejadas sobre as células não-alvo. Mesmo os transportadores em partículas que compreendem of materiais "biocompatíveis" [por exemplo, poli (ácido co-glicólico), PLGA] pode incitar respostas celulares imunes potentes, em determinadas condições, assim. 6 Este é especialmente perigosa em indivíduos com imunidade diminuída (por exemplo, artrite reumatóide), susceptível de atrasos depuração sistémica de nanopartículas. 7 Assim, a remoção eficiente de partículas livres, antes da introdução das células de engenharia de partículas é de grande importância para minimizar o perfil de toxicidade e reduzir a exposição a partículas carregadas mal dirigido por agente in vivo.
centrifugação em gradiente convencional é muitas vezes usado para separar as células manipuladas de partículas livres, mas é trabalhoso e operado em modo de lote. Além disso, tensões de cisalhamento experimentado pelas células durante a centrifugação de alta velocidade e os elementos constituintes do meio de gradiente de densidade pode comprometer a integridade celular e / ou o comportamento das células influência. 8 microfluídica é uma alternativa atraente, com sevtecnologias de separação rais, incluindo deslocamento lateral determinista (DLD) 9, dieletrophoresis 10,11 e acoustophoresis 12 desenvolvido para a separação de partículas pequenas e aplicações de troca de tampão. No entanto, estes métodos sofrem de baixa taxa de transferência (1-10 ul · min - 1) e são propensos a problemas de entupimento. separações activa, tais como os métodos baseados em dieletroforese também requerem diferenças em fenótipos celulares dieletroforética intrínsecas ou passos adicionais de rotulagem de células para conseguir a separação. Uma abordagem mais promissora envolve microfluídica inercial - a migração lateral de partículas ou células através agiliza a concentrar-se em posições distintas devido a forças de sustentação dominantes (F L) com alto número de Reynolds (Re) 13 Devido às suas condições de alto fluxo e resolução de tamanho superior. , tem sido frequentemente explorados para aplicações de câmbio baseada em tamanho separação de células 14,15 e tampão. 16-18 However, desempenho troca de tampão continua pobre com uma solução contaminante ~10-30% como as células separadas geralmente permanecem perto da fronteira entre soluções originais e novas tampão. 16-18 Mais importante ainda, a distribuição do tamanho das células-alvo deve ser semelhante para alcançar inercial uma focagem precisa e a separação a partir da solução tampão original, que constitui um problema especialmente no processamento de tipos heterogéneos de tamanho de células, tais como células estaminais mesenquimais (MSCs). 19
Temos desenvolvido anteriormente uma nova técnica célula microfluídica inercial de classificação denominado Dean Fluxo Fracionamento (DFF) para isolar células tumorais circulantes (CTCs) 20 e bactérias 21 do sangue total usando a 2 de entrada, dispositivo de microcanal espiral 2-outlet. Neste protocolo de vídeo, iremos descrever o processo de rotulagem de células THP-1 (linha celular de leucemia aguda monocítica humana) monocíticas suspensão (~ 15? M) e MSC (10-30 um) com calceina-lNPs oaded, seguido de fabricação e operação do microdispositivo espiral DFF para a recuperação eficiente de células marcadas e remoção de NPs de não ligados. 22 Esta estratégia de purificação de um só passo permite uma recuperação contínua de suspensão rotulado e as células aderentes em suspensão numa solução tampão fresco sem centrifugação. Além disso, ele pode processar até 10 milhões de células · ml -1, uma densidade de células susceptíveis de aplicações de medicina regenerativa.
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Protocol
1. Nanopartículas (NPs) Rotulagem de células-tronco mesenquimais e monócitos
- as células estaminais mesenquimais Cultura (MSCs) em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (SFB) e antibióticos para ≥80% de confluência antes da marcação. Do mesmo modo, a cultura de células THP-1 (ATCC) em Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 suplementado com FBS a 10% para uma densidade de ~ 10 6 células / ml.
- NPs de carga de sílica (~ 500 mm) com uma solução de corante calceina (200 ^ M) usando agitação durante a noite. Fabricar AM PLGA-calceína (CAM), utilizando um protocolo descrito anteriormente. 22
- Dissolve-se 250 ug CAM e 100 mg de PLGA (50:50) em clorofórmio a 4 ° C.
- Gerar NPs de emulsão única usando um homogeneizador de alta velocidade (13.600 xg, 60 seg) à temperatura ambiente. Evapora-se o clorofórmio em uma capa química (≥3 h) antes da recolha através de centrifugação (3400 xg durante 5 min), lavagem (disti duplasencheram água), a secagem por congelação e armazenamento em -20 ° C.
- Incubar CAM-PLGA PN (1 mg) ou nanopartículas de sílica calceina (150 ug) em solução a 0,01% de poli-L-lisina (PLL) à temperatura ambiente durante 15 - 20 min.
- Centrifugar a 3.400 xg durante 5 min para remover o excesso de sobrenadante PLL antes de ressuspensão em 1 ml de NPs de respectivo meio de cultura.
- Incubar os PN com células (MSCs ou THP-1, ~ 1 - 2 x 10 6 células no total) durante aproximadamente 24 horas (0,1 mg mL-1 · concentração rotulagem).
- Dissociar e colheita das MSCs marcadas aderentes utilizando 2 ml de tripsina a 0,25% (5 min, 37 ° C) e diluiu-se com 6 ml de DMEM. Girar as células AT (1000 x g, 4 minutos) e ressuspender a uma concentração de 10 junho 05-10 células / ml para o processamento de microfluidos. Utilização de células THP-1 marcadas (10 junho 05-10 células / ml) directamente para a purificação de microfluidos.
2. Preparação Dispositivo de microfluidos
- fabricação de dispositivos
- Fabricar o dispositivo microfluídico espiral (500 mm (w) × 115 mm (h)) com polidimetilsiloxano (PDMS) a partir de um kit comercial utilizando etapas padrão litografia macia. 23
- Misture 30 g de pré-polímero de base e 3 g agente de cura completamente em um barco de pesagem. De gás-se a mistura num excicador durante 60 minutos para remover quaisquer bolhas de ar.
- Verter a mistura de PDMS sobre o molde mestre de bolacha de silicone modelado com o design do canal espiral cuidadosamente a uma altura de aproximadamente 5 - 10 mm.
- De gás-se a mistura no vácuo exsicador durante 60 minutos novamente para remover quaisquer bolhas de ar. Repetir o processo até que todas as bolhas são eliminados.
- Curar a mistura PDMS num forno de 80 ° C durante 2 horas até que o PDMS está definido. Assegurar a bolacha não é inclinado durante a cura ter uma altura constante dispositivo.
- Cortar o dispositivo espiral PDMS utilizando um bisturi e retire cuidadosamente a laje de PDMS do molde mestre.
- Trim as bordas do dispositivo com um bisturi para assegurar a superfície lisa para a colagem.
- Perfurar dois buracos (1,5 mm) para as entradas e dois orifícios (1,5 mm) para as saídas no dispositivo de PDMS utilizando um perfurador de biópsia de 1,5 mm.
- Lavar o dispositivo com isopropanol (IPA) para remover todos os detritos e secar o dispositivo num forno de 80 ° C durante 5 min.
- Limpar a superfície inferior do dispositivo de PDMS (com características de canal) usando fita adesiva.
- um lado limpo de uma lâmina de vidro (2 "por 3") usando fita adesiva.
- Com cuidado, coloque e expor as superfícies limpas do dispositivo PDMS e lâmina de vidro na câmara de um aspirador de plasma e submetê-las a vácuo durante 60 segundos. Em seguida, ligue a corrente de plasma para o máximo e reduzir a pressão da câmara até que a câmara se transforma na cor rosa.
- Expor as superfícies a plasma de ar durante 60 segundos. O plasma cria espécies reactivas sobre as superfícies expostas dos PDMS e vidros, que permite a ligação apertada quando posta em físicocontato al. Desligue a alimentação de plasma e liberar a pressão do limpador de plasma para recuperar o dispositivo e vidro slide.
- Unir o dispositivo de PDMS e lâmina de vidro em conjunto, pressionando as superfícies expostas ao plasma firmemente e assegurar que não há bolhas estão presos entre as duas superfícies.
- Aquecer o dispositivo ligado usando uma chapa quente fixada em 80 ° C durante 2 h para reforçar a ligação.
- Operação dispositivo
- Cortar duas peças de tubagem (1,52 mm de diâmetro externo) de ~ 15 - 20 cm para as seringas de entrada e anexar uma ponta de seringa (calibre 23) sobre uma extremidade de cada tubo.
- Cortar duas peças de tubagem (1,52 mm de diâmetro externo) de ~ 5 - 10 cm para as tomadas e para prender os orifícios de saída do dispositivo de PDMS.
- Antes da amostra de funcionamento, o dispositivo manualmente privilegiada com uma seringa contendo 70% de etanol, até que flui para fora do tubo de saída. Permitir que a sente de etanol durante 30 segundos a 1 min para esterilizar o dispositivo.
- Carregar 30 ml de filtrou(0,2 uM de poro) tampão de bainha (fosfato-salino tamponado (PBS) com 0,1% de albumina de soro bovino (BSA)) para a seringa de 60 ml e fixar a seringa numa bomba de seringa. Definir a bomba para as configurações corretas (tamanho Seringa: 60 ml, Volume: 60.000 ul).
Nota: A adição de BSA para PBS é minimizar ligação à célula-célula e a ligação não específica entre as células e o dispositivo de PDMS. - Carga 3 ml de células marcadas para a seringa de 3 ml e fixar a seringa numa bomba de seringa separada. Definir a bomba para as configurações corretas (tamanho Seringa: 3 ml, Volume: 3,000 L).
- Verifique se não há bolhas de ar presas nas seringas para assegurar um fluxo estável. Remover quaisquer bolhas de ar por ejecção de suavemente algumas gotas de líquido para fora do bocal.
- Ligue as pontas de seringa de entrada e tubulação para as seringas, e inseri-los nas respectivas entradas do dispositivo (bainha e de entrada da amostra). Certifique-se que não há bolhas ao longo da tubulação.
- Montar os dispositivos em um invertidoEd microscópio de contraste de fase para imagens em tempo real durante o processo de separação de células.
- Garantir um pequeno copo de resíduos e dois tubos de 15 ml perto do dispositivo no palco microscópio usando adesivos.
- Coloque os tubos de saída para o copo de resíduos.
- Definir a razão de escoamento para a amostra para tampão de bainha a 1:10 e comece a ambas as bombas de seringa para iniciar o processo de triagem (Exemplo: 120 ul / min durante seringa amostra e 1200 ul / min durante seringa bainha; velocidade de fluxo do canal ~ 0,38 m / seg ).
- Executar o dispositivo durante 1,5 min para a taxa de fluxo para estabilizar. Isso pode ser confirmado pela presença de células inercial focadas próximo da parede interior do canal sob o brilhante-campo com contraste de fase com uma câmera de alta velocidade (~ 5.000 - 10.000 quadros por segundo (fps), tempo de exposição: 10-50 ms).
- Posicione os tubos de saída em diferentes tubos para recolher os eluentes da tomada celular e saída de resíduos.
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Representative Results
Após a marcação das células com bio-imagem NPs carregado agente durante a noite, as células marcadas (que contém partículas livres) são colhidos e purificados por DFF espiral microdispositivo para remover NPs livres num processo de etapa (Figura 1A). O 2-entrada, microcanal espiral 2-outlet foi concebido pelo software de engenharia e microfabricados usando SU-8 fotorresiste. A bolacha de silício modelado é depois utilizado como um molde para moldagem por PDMS réplica usando técnicas de litografia suave (Figura 1B). Para executar a separação de células, a amostra de células é bombeado para dentro da entrada da parede exterior do microdispositivo espiral, enquanto a parede interna de entrada corre solução tampão fresca a uma taxa de fluxo mais elevada (1:10) para comprimir o fluxo de amostra de células. A separação é obtida por inércia com foco de células marcadas maiores na parede interna e recirculação induzida por Dean de pequenas NPs não ligados na direcção da parede exterior (Figura 2A). O dispositivo foi a primeira apliEd para classificar células em suspensão (marcado monocíticas THP-1) a partir de NPs de sílica com calceína fluorescentes carregados (~ 500 nm de tamanho). A eficiência de separação elevada foram obtidas tal como foi confirmado por meio de imagens de alta velocidade (Figura 2A) e citometria de fluxo (Figura 2B). Imagens de eluentes recolhidos a partir de células de saída do dispositivo também indicaram remoção eficiente de sílica e PLGA PN (~ 1-5 um) a partir de células THP-1. Além disso, imagens de fluorescência mostraram que o NPS internalizados nas células THP-1 marcadas foram bem retida durante a purificação DFF (inserções) (Figura 3). Devido à heterogeneidade de tamanho MSC, a geometria espiral microcanal foi subsequentemente modificado, alterando a altura de canal e design bifurcação para permitir a recolha eficiente de MSC (Figura 4).
Figura 1. (A) Ovfluxo de trabalho erall para a remoção rápida de etapa única micro / nanopartículas (NPs) de suspensão e células aderentes pós-rotulagem utilizando Dean Fluxo Fracionamento (DFF) tecnologia microfluídica. (B) O dispositivo espiral DFF é projetado pelo software de engenharia e modelado na pastilha de silício usando microfabricação. dispositivos PDMS são subsequentemente produzidos por métodos de litografia macia. Configuração experimental é composto por 2 bombas de seringa para infundir células marcadas e tampão de solução salina fresca em diferentes taxas de fluxo no dispositivo para a purificação contínua e coleta de células marcadas. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Nanopartículas de remoção a partir de células THP-1 marcadas por E DFF. (A) Ilustração deprincípio da separação DFF. Células marcadas maiores experimentar fortes forças inerciais de elevação (F L, setas vermelhas) e forças de arrasto Dean (F D, setas amarelas) e concentrar-se perto da parede interior do microcanal. NPs menores e solução tampão são apenas afectados por Dean arrastar e recircular para a parede exterior para conseguir a separação. Representante imagens de fluorescência que indicam posições de equilíbrio de células THP-1 (setas vermelhas) e sílica NPs carregadas com corante calceína na região de saída de alta velocidade e. Desempenho (B) Separação baseado em citometria de fluxo com gating determinado pelo tamanho (FSC-A) e granularidade (SSC-A) características. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3.
Figura 4. As nanopartículas de remoção a partir de células-tronco mesenquimais (MSCs), através de DFF. De imagem de alta velocidade Representante (A) que ilustram a separação eficiente de MSCs (setas vermelhas) e PLGA PN (setas azuis) em diferentes pontos de venda. Amarelo linhas tracejadas indicam a posição aproximada das paredes de microcanais. (B) O desempenho Separação de MSCs de sílica e PLGA NPS.pg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A tecnologia de purificação de célula DFF aqui descrita permite a separação rápida e contínua de células marcadas de um modo de elevado rendimento. Esta abordagem é ideal para a separação do volume da amostra ou grande processamento de amostras alta concentração de células, e é melhor do que a filtração à base de membrana convencional, que é propenso ao entupimento após uso prolongado. Da mesma forma, a separação magnética baseados em afinidade requer passos adicionais de rotulagem de células que são trabalhosos e caros. As células purificadas são mostrados para reter seus agentes marcados e morfologia celular bem (Figura 3) com o mínimo de fluxo de efeitos / induzida por cisalhamento (τ tensão de cisalhamento, ~ 200-250 dyne / cm 2) devido a curto tempo de residência dentro do canal (< 1 seg) 20,24. Além disso, o utilizador pode escolher a solução eluída das células marcadas Weaver simplesmente substituindo o tampão de revestimento (solução salina) com os meios desejados ou solução tampão.
É fundamental quenão há nenhuma sujeira ou detritos na microcanais uso prévio que pode afetar negativamente o comportamento focando celular. Isto pode ser obtido com a limpeza completamente os orifícios de entrada com IPA, bem como usando fita adesiva para limpar a superfície do PDMS antes da colagem do plasma. Uma vez que o microdispositivo opera sob condições de fluxo elevadas (~ 1 - 1,5 mL / min), que também é importante para aquecer os dispositivos PDMS coladas sobre uma placa de aquecimento para assegurar uma forte ligação entre o PDMS e a lâmina de vidro. Durante o funcionamento do dispositivo, se as células não estão concentrando assim, isso significa que as taxas de fluxo não são suficientes. Pode-se solucionar problemas, verificando a região de entrada do dispositivo e as pontas de seringa para garantir que não há vazamentos.
Remoção de NPs não ligadas a partir de células marcadas não é trivial uma vez que técnicas de separação comuns de laboratório (por exemplo, centrifugação) não podem separar partículas / células de tamanhos diferentes (por exemplo, partículas não ligadas e células marcadas). Embora se possa argumentar que a lavagens repetidase mudança de meio de cultura pode remover NPs livres a partir de células aderentes, em certa medida, o processo é laborioso e ineficaz para culturas de células em suspensão. O dispositivo de microfluidos DFF utiliza triagem baseada em tamanho e é altamente versátil, uma vez que pode ser utilizado tanto para a suspensão e as células aderentes com uma grande gama de tamanho, assim como a remoção de NPs de materiais diferentes. Se as células alvo são de tamanhos diferentes, o dispositivo de DFF pode ser optimizado por alteração das condições de fluxo ou geometria do canal (por exemplo, altura do canal e a relação das larguras dos canais interior e exterior) para conseguir a separação eficiente. Foi previamente demonstrado que DFF é superior em comparação com centrifugação convencional na remoção NPs com a perda de células mínima. 22 Além disso, o desempenho de recuperação celular manteve-se elevado (> 90%) quando a concentração da amostra foi aumentado para 10 7 células / ml. Esta é uma melhoria fundamental em relação aos métodos de separação de células existentes inerciais microfluídicos que são em geralLY limitado a 10 5 células / ml de capacidade devido a interacção célula-célula e célula superlotação em posições de equilíbrio. 25
Embora a tecnologia DFF consegue a separação com base na diferença de tamanho, não pode ser usado para outros processos de engenharia celular, tais como a separação de células marcadas e não marcadas devido às alterações insignificantes no tamanho da célula. marcadores de superfície celular para triagem baseada em afinidade e outras modalidades de separação comum (susceptibilidade magnética e condutividade elétrica) poderia ser considerado para tais aplicações potenciais. tecnologia DFF também não é adequado para a separação de células multiplexado com base em fluorescência. A melhor opção seria a utilização de células activadas por fluorescência (FACS) para a de um único passo de triagem de células marcadas com fluorescência diferente, que opera a alta taxa de transferência, mas requer equipamento caro e volumoso.
Finalmente, este protocolo é altamente útil para a purificação de células manipuladas quandoNPs contendo agentes de transformação (factores de crescimento, drogas, corticosteróides, etc.) são utilizados para bioimaging e / ou terapia celular. Isto é porque NPs livres remanescentes pode exercer efeitos fora do alvo de transformação em células vizinhas ou células imunitárias que respondem a estas partículas estranhas, quando injectado in vivo. Ele também pode involuntariamente gerar sinais que podem ser enganadoras durante bioimaging. A remoção destes NPs livres antes do uso, assim, reduzir o risco de células não-alvo, em minimizar compilações sistema imunitário, e reduzir os problemas de contaminação entre os passos sequenciais durante a etiquetagem / engenharia de células. Sua implementação bem sucedida facilita muito a marcação celular e permite o uso livre de interferências da engenharia celular partícula baseada em terapia.
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Disclosures
Os autores não têm nada para revelar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell lines & Media | |||
| Mesenchymal Stem Cells (MSCs) | Lonza | PT-2501 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Lonza | 12-614F | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270-106 | |
| THP-1 monocyte cells (THP-1) | ATCC | TIB-202 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 media | Lonza | 12-702F | |
| Reagents & Materials | |||
| 0.01% poly-L-lysine (PLL) | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| 3 ml Syringe | BD | 302113 | Syringe 3 ml Luer-Lock |
| 60 ml Syringe | BD | 309653 | Syringe 60 ml Luer-Lock |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Biowest | P6154-100GR | |
| Calcein, AM (CAM) | Life Technologies | C1430 | |
| Calcein | Sigma-Aldrich | C0875 | |
| Isopropanol | Fisher Chemical | #P/7507/17 | HPLC Grade 2.5 L |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Lonza | 17-516Q/12 | |
| Plain Microscope Slides | Fisher Scientific | FIS#12-550D | 75 x 25 x 1 mm3 |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | SYLGARD® 184 | |
| Scotch tape | 3M | 21200702044 | 18 mm x 25 m |
| Silica NPs (∼200 μm) | Sigma-Aldrich | 748161 | Pore size 4 nm |
| Syringe Tip | JEC Technology | 7018302 | 23 G 0.013 x 0.25 |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Life Technologies | 25200-056 | |
| Tygon Tubing | Spectra-Teknik | 06419-01 | 0.02 x 0.06" 100 |
| Poly (D,L-lactide-co-glycolide) (PLGA; 50:50) | Sigma-Aldrich | P2191 | |
| Equipment | |||
| Biopsy punch | Harris Uni-Core | 69036-15 | 1.50 mm |
| Dessicator | Scienceware | 111/4 IN OD | |
| High-speed Camera | Phantom | V9.1 | |
| Inverted phase-contrast microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-002 | |
| Syringe Pump | Chemyx | CX Fusion 200 |
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