Summary
פרוטוקול זה מתאר את השימוש של אסטרטגיית מיקרופלואידיקה מבוסס אינרציאלית חיץ החליפין לטהר תאים מהונדסים מיקרו / ננו-חלקיקים עם דלדול יעיל של חלקיקים מאוגד.
Abstract
תאים הנדסה עם מיקרו / חלקיקי ננו פעילים בעלי מרכיבים טעונים (NPS) הופך פופולארי יותר ויותר בשיטה כדי לשפר תכונות טיפוליות הילידים, לאפשר הדמיה ביו ולשלוט פנוטיפ התא. סוגיה קריטית עדיין התייחסה כראוי היא המספר המשמעותי של חלקיקים שנותרו מאוגד לאחר תיוג תא אשר לא ניתן להסיר בקלות על ידי צנטריפוגה קונבנציונלי. זה מוביל לעלייה רעשי רקע הדמיה ביו יכול להקנות ההשפעה הטרנספורמטיבית על תאי היעד הלא שכנות. בפרוטוקול זה, אנו מציגים אסטרטגיה חילופית חיץ מיקרופלואידיקה מבוסס אינרציאלית כפי שכונתה חלוקת זרימת דין (DFF) להפריד תאי שכותרתו ביעילות צירופים חינם באופן תפוקה גבוה. Microdevice הספירלה שפותח מסייע באיסוף רציף (> התאוששות תא 90%) של תאים מטוהרים (THP-1 ו MSCs) מרחפי פתרון חיץ חדש, תוך השגה> 95 דלדול% של צבע פלואורסצנטי מאוגד או צירופים טעונים לצבוע (silICA או PLGA). בשלב יחיד זה, אסטרטגית טיהור מבוססת תאי גודל מאפשרת קצב העברת נתוני עיבוד תא גבוה (10 6 תאים / min) והוא שימושי מאוד עבור טיהור תא גדול בנפח של תאים מהונדסי מייקרו / ננו-חלקיקים כדי להשיג יישום קליני ללא התערבות.
Introduction
סוכן טעון מייקרו / חלקיקי הנדסת תאים על ידי (NPS) היא שיטה פשוטה, גנומית אינטגרציה נטולה, צדדי כדי לשפר יכולת bioimaging ומגביר / להשלים התכונות הטיפוליות המקוריות שלו ברפואת רגנרטיבית. 1-3 שינויים סלולריים מושגות על ידי תיוג קרום או הציטופלסמה פלזמה עם ריכוז עודף של צירופים טעון סוכן להרוות את אתרי הקישור. עם זאת, החיסרון העיקרי של שיטה זו הוא כמויות משמעותיות של חלקיקים מאוגד הנותרים בתמיסה לאחר תהליכי תיוג תא, אשר יכולים לבלבל זיהוי מדויק של תאים מהונדסים חלקיק או לסבך תוצאות טיפוליות. 4,5 בנוסף, חשיפה צירופים המכילים טרנספורמטיבי סוכנים (גורמי גדילה, סטרואידים, וכו ') בריכוז גבוה יתר על מידה יכולים לגרום cytotoxicity וחשיפה שגויה עלולים לגרום לתוצאות בלתי צפויות על תאים שאינם יעד. אפילו נושאות חלקיקים המהווים of "ביולוגיים" חומרים [למשל, פולי (שיתוף גליקולית לקטית חומצה), PLGA] יכולים להסית תגובות תא חיסוניות חזקות בתנאים מסוימים גם כן. 6 זה מסוכן במיוחד אצל אנשים עם חסינות לקויה (למשל, דלקת מפרקים שגרוניות) אשר באופן פוטנציאלי עיכובים אישור nanoparticle מערכתי. 7 לכן, ההסרה ביותר של חלקיקים חינם לפני כניסתה של תאים מהונדסי חלקיקים הוא בעלת חשיבות רבה כדי למזער פרופיל רעיל ולהפחית חשיפה שגויה לחלקיקים טעוני סוכן in vivo.
צנטריפוגה שיפוע הקונבנציונלית משמשת לעתים קרובות כדי להפריד תאים מהונדסים מחלקיקים בחינם אבל הוא מייגע ומופעלת במצב יצווה. יתר על כן, מדגישה גזירה שחווה תאים במהלך צנטריפוגה במהירות גבוהה ואת המרכיבים של מדיום שיפוע צפיפות עשויה להתפשר על יושרת תא ו / או התנהגות תא שפעה. 8 מיקרופלואידיקה היא חלופה אטרקטיבית עם sevטכנולוגיות הפרדה eral כולל תזוזה לרוחב דטרמיניסטית (DLD) 9, dieletrophoresis 10,11 ו acoustophoresis 12 פיתח להפרדת חלקיקים קטנים ויישומים חילופי חיץ. עם זאת, שיטות אלו סובלים תפוקה נמוכה (1-10 μl · דק '- 1) והם מועדים סתימת בעיות. פרדות Active כגון שיטות מבוססות dielectrophoresis דורשות גם הבדלים פנוטיפים תא dielectrophoretic מהותי או צעדי תיוג תא נוספים כדי להשיג פרדה. גישה מבטיחה יותר כרוכה מיקרופלואידיקה אינרציה - ההגירה לרוחב של חלקיקים או תאים ברחבי מייעל להתמקד בעמדות נבדלות בשל כוחות להרים דומיננטיים (L F) בבית המספר ריינולדס גבוה (Re) 13 בשל תנאי הזרימה הגבוהה שלה ברזולוצית גודל מעולה. , שהוא נוצל לעתים קרובות להפרדה מבוססת תאים בגודל 14,15 ויישומים חילופים חיץ. 16-18 However, ביצועי חיץ חליפין נשארו עניים עם ~10-30% פתרון מזהם כמו התאים המופרדים בדרך כלל להישאר קרוב לגבול בין תמיסות בופר המקוריות וחדשני. 16-18 יתרה מכך, חלוקת הגודל של תאי יעד צריכה להיות דומה כדי להשיג אינרציה מדויקת התמקדות והפרדה מפתרון החיץ המקורי שמהווה בעיה במיוחד בעיבוד של סוגי תאים הטרוגנית בגודל כגון בתאי גזע mesenchymal (MSCs). 19
פתחנו בעבר תא מיקרופלואידיקה אינרציה חדשה טכניקת מיון כינה הדין חלוקה זרימה (DFF) לבידוד תאים סרטניים במחזור (CTCs) 20 וחיידקים 21 מדם כולו באמצעות מכשיר microchannel ספירלת 2-כניסה, 2-לשקע. בפרוטוקול הווידאו הזאת, נתאר את התהליך של THP-1 תיוג (שורת תאים monocytic חריפה האדם לוקמיה) תאים monocytic ההשעיה (~ 15 מיקרומטר) ו MSCs (10-30 מיקרומטר) עם calcein-lצירופי oaded, ואחריו ייצור ותפעול של microdevice ספירלת DFF עבור התאוששות יעילה של תאים שכותרתו והסרת צירופים מאוגדים. 22 אסטרטגיה לטיהור בצעד אחד זה מאפשרת התאוששות מתמשכת של השעיה שכותרתו תאים חסידים המרחפים פתרון חיץ טרי ללא צנטריפוגה. יתר על כן, הוא יכול לעבד עד 10 מיליון תאים · מיליליטר -1, צפיפות תאים מקובלים עבור יישומים ברפואה רגנרטיבית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. חלקיקים (NPS) תיוג של בתאי גזע mesenchymal ומונוציטים
- בתאי גזע mesenchymal התרבות (MSCs) במדיום של הנשר השונה של Dulbecco (DMEM) בתוספת 10% בסרום שור עוברי (FBS) ואנטיביוטיקה כדי ≥80% confluency לפני התיוג. באופן דומה, תרבות THP-1 תאים (ATCC) ברוזוול ממוריאל פארק המכון (RPMI) בינוני 1640 בתוספת 10% FBS כדי בצפיפות של ~ 10 6 תאים / מ"ל.
- צירופים סיליקה טען (~ 500 מיקרומטר) עם פתרון צבע calcein (200 מיקרומטר) באמצעות ערבוב בין לילה. לפברק AM PLGA-calcein (CAM) באמצעות פרוטוקול שתואר לעיל. 22
- ממיסים 250 מיקרוגרם CAM ו -100 מ"ג PLGA (50:50) ב כלורופורם על 4 מעלות צלזיוס.
- צור צירופים אמולסיה יחיד באמצעות homogenizer במהירות גבוהה (13,600 XG, 60 שניות) בטמפרטורת החדר. לאדות את כלורופורם במנדף כימי (≥3 hr) לפני הגבייה באמצעות צנטריפוגה (3,400 XG במשך 5 דקות), שטיפה (Disti כפולהמים מילאו), להקפיא-ייבוש ואחסון ב- C -20 °.
- דגירה CAM-PLGA צירופים (1 מ"ג) או צירופים סיליקה calcein (150 מיקרוגרם) בתמיסה 0.01% פולי- L- ליזין (PLL) בטמפרטורת החדר למשך 15 - 20 דקות.
- צנטריפוגה ב 3,400 XG במשך 5 דקות כדי להסיר supernatant PLL עודף לפני resuspension צירופים ב 1 מ"ל של מדיום תרבות בהתאמה.
- דגירה צירופים עם תאים (MSCs או THP-1, ~ 1 - 2 x 10 6 תאים בסך הכל) למשך כ 24 שעות (מ"ג 0.1 · מ"ל -1 ריכוז תיוג).
- לנתק ולאסוף את MSCs חסיד שכותרתו באמצעות 2 מ"ל של טריפסין 0.25% (5 דק ', 37 ° C) להרוות עם 6 מ"ל של DMEM. ספין למטה התאים ב (1,000 XG, 4 דק ') ו resuspend לריכוז של 10 5 - 10 6 תאים / מ"ל לעיבוד microfluidic. השתמש שכותרתו תאים THP-1 - ישירות (10 5 10 6 תאים / מ"ל) לטיהור מיקרופלואידיקה.
2. הכנת התקן Microfluidic
- ייצור מכשיר
- לפברק את מכשיר microfluidic הספירלה (500 מיקרומטר (w) x 115 מיקרומטר (ח)) עם polydimethylsiloxane (PDMS) מתוך ערכה מסחרית באמצעות צעדים ליתוגרפיה רכים רגילים. 23
- מערבבים 30 גרם של prepolymer בסיס ו -3 G סוכן ריפוי ביסודיות בסירה במשקל. דה-גז התערובת בתוך תא ייבוש במשך 60 דקות כדי להסיר בועות אוויר.
- יוצקים את התערובת PDMS על עובש אמן פרוסות סיליקון בדוגמת עם העיצוב ערוץ ספירלה בקפידה עד לגובה של ~ 5 - 10 מ"מ.
- דה-גז התערובת בחלל ריק ייבוש למשך 60 דקות שוב כדי להסיר בועות אוויר. חזור על התהליך עד שכל הבועות בוטלו.
- לרפא את התערובת PDMS בתנור C 80 מעלות במשך שעה 2 עד PDMS מוגדר. ודא רקיק אינו מוטה במהלך ריפוי לקיים לגובה מכשיר קבוע.
- חותך את מכשיר ספירלת PDMS באמצעות אזמל מקלף בזהירות את לוח PDMS מתבנית האב.
- Trim את הקצוות של המכשיר עם אזמל כדי להבטיח משטח חלק מליטה.
- פאנץ שני חורים (1.5 מ"מ) עבור צריכת האוויר ושני חורים (1.5 מ"מ) עבור השקעים במכשיר PDMS באמצעות אגרופן ביופסיה 1.5 מ"מ.
- שטפו את המכשיר עם isopropanol (IPA) כדי להסיר כל פסולת ולייבש את המכשיר בתנור 80 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
- נקה את המשטח התחתון של המכשיר PDMS (עם תכונות ערוץ) באמצעות דבק.
- אחד נקי בצד של זכוכית שקופית (2 "על ידי 3") באמצעות דבק.
- בזהירות במקום ולחשוף את המשטחים הנקיים של מכשיר PDMS וחלק זכוכית בתא של שואב הפלזמה לייחד להם מקום לשאוב במשך 60 שניות. לאחר מכן, לעבור על כוח הפלזמה למקסימום ולהפחית את הלחץ הקאמרי עד לתא הופך ורוד בצבע.
- לחשוף את משטחי פלזמת אוויר עבור 60 שניות. פלזמה יוצר מינים תגובתי על פני השטח החשוף של PDMS וזכוכית המאפשרת מליטה חזק כאשר הם מובאים לזירת physicקשר אל. כבה את כוח הפלזמה לשחרר את הלחץ מן שואב הפלזמה כדי לאחזר את שקופית המכשיר וזכוכית.
- איגרות חוב מכשיר PDMS וזכוכית השקופיות יחד על ידי לחיצה על משטחי הפלזמה חשופות בחוזקה להבטיח כי אין בועות לכודות בין שני המשטחים.
- מחמם את המכשיר מלוכד באמצעות פלטה חשמלית נקבעה על 80 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות כדי לחזק את המליטה.
- מבצע ההתקנים
- חותך שתי חתיכות של צינורות (1.52 מ"מ OD) של ~ 15 - 20 סנטימטרים עבור מזרקי הכניסה ולצרף קצה מזרק (מד 23) בקצה אחד של כל צינורות.
- חותכים שתי חתיכות של צינורות (1.52 מ"מ OD) של ~ 5 - 10 ס"מ עבור שקעים ולצרף החורים לשקע של המכשיר PDMS.
- לפני לדגום ריצה, ידני ממשלה מכשירה עם מזרק המכיל אתנול 70% עד שהוא זורם מתוך הצינור לשקע. אפשר לשבת אתנול למשך 30 שניות עד 1 דקות כדי לעקר את המכשיר.
- טען 30 מ"ל של מסוננים(0.2 מיקרומטר נקבוביות) חיץ נדן (פוספט-בופר (PBS) עם 0.1% שור סרום אלבומין (BSA)) לתוך מזרק 60 מ"ל ומאובטח את המזרק על משאבת מזרק. הגדר את המשאבה את ההגדרות הנכונות (גודל מזרק: 60 מ"ל, נפח: 60,000 μl).
הערה: התוספת של BSA כדי PBS היא למזער תאי תאי חייב הלא ספציפי מחייב בין תאים והתקן PDMS. - טען 3 מיליליטר של תאים שכותרתו לתוך מזרק 3 מ"ל ומאובטח את המזרק על משאבת מזרק נפרדת. הגדר את המשאבה את ההגדרות הנכונות (גודל מזרק: 3 מ"ל, נפח: 3,000 μl).
- בדוק כי אין בועות אוויר לכודות המזרקים כדי להבטיח זרימה יציבה. הסר את כל בועות אוויר על ידי ולהוציא בעדינות כמה טיפות של נוזל מתוך הנחיר.
- חבר את טיפי מזרק כניסת צינורות אל המזרקים, ולהכניס אותם לתוך פתחי הכניסה בהתאמה של המכשיר (נדן ועל כניסת מדגם). ודא שאין בועות לאורך הצינורות.
- הר המכשירים על גבי הפוךמיקרוסקופ שלב בניגוד ed הדמיה בזמן אמת במהלך תהליך מיון התא.
- Secure מבחנה פסולת קטנה ושני 15 מיליליטר צינורות קרובה המכשיר על במת מיקרוסקופ באמצעות דבקים.
- מניח את tubings לשקע לתוך הכוס הפסולת.
- הגדר את יחס תזרים עבור מדגם נדן חיץ 1:10 ו להתחיל הן משאבות מזרק כדי להתחיל בתהליך המיון (דוגמה: 120 μl / min מזרק מדגם ו -1,200 μl / min מזרק נדן; מהירות זרימה בתעלות ~ 0.38 מ '/ שנייה ).
- הפעל את המכשיר עבור 1.5 דקות עבור קצב הזרימה כדי לייצב. זה יכול להיות מאושר על ידי נוכחות של תאים ממוקדים inertially ליד הקיר הפנימי הערוץ תחת בהיר שדה עם ניגודיות שלבו באמצעות מצלמה במהירות גבוהה (~ 5,000 - 10,000 מסגרות לשנייה (fps), זמן חשיפה: 10-50 μsec).
- מקם את tubings לשקע לתוך צינורות שונים כדי לאסוף את eluents משקע התא לשקע פסולת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
לאחר סימון התאים עם צירופי סוכן טעון הדמיה ביו לילה, התאים שכותרתו (המכיל חלקיקים חינם) נקצרים מטוהרים על ידי microdevice ספירלת DFF להסיר צירופים חופשיים (איור 1 א) יחיד שלב בתהליך. 2-הכניסה, microchannel ספירלת 2-לשקע הוא תוכנן על ידי תוכנת הנדסת microfabricated באמצעות photoresist SU-8. פרוסות סיליקון בדוגמת מכן משמשות כתבנית דפוס העתק PDMS באמצעות טכניקות ליתוגרפיה רכות (איור 1 ב). כדי לבצע מיון תא, מדגם התא נשאב לתוך כניסת הקיר החיצונית של microdevice הספירלה בעוד כניסת הקיר הפנימית פועלת פתרון חיץ טרי בקצב זרימה גבוה (1:10) לצבוט את זרימת מדגם תא. הפרדה מושגת על ידי אינרצית ההתמקדות של תאים שכותרתו גדולים על הקיר הפנימי ואת סחרור הדין-induced של צירופים מאוגדים הקטנים כלפי הקיר החיצוני (איור 2 א). המכשיר היה ראשון applied למיין תאי monocytic השעיה שכותרתו (THP-1) מ צירופי סיליקה פלורסנט עמוסים calcein (~ 500 ננומטר בגודל). יעילות ההפרדה גבוהה התקבלו כפי שאושרו על ידי הדמיה במהירות גבוהה (איור 2 א) ו ניתוח תזרים cytometry (איור 2 ב). תמונות של eluents שנאסף משקע תא המכשיר גם ציינו הסרה יעילה של סיליקה PLGA צירופים (~ 1 - 5 מיקרומטר) מתאי THP-1. בנוסף, דימות פלואורסצנטי הראתה כי צירופים מופנמים בתאי THP-1 שכותרתו נשמרו היטב במהלך טיהור DFF (ריבועים) (איור 3). בגלל ההטרוגניות גודל MSC, הגיאומטריה microchannel ספירלה מכן שונתה על ידי שינוי גובה ערוץ ועיצוב הסתעפות כדי לאפשר גבייה יעילה של MSCs (איור 4).
באיור 1. (א) Ovעבודה erall עבור מיקרו / ננו-חלקיקים בשלב יחיד מהירה (NPS) הסרת ההשעיה תאים חסיד תיוג הפוסט באמצעות דין חלוקה זרימה (DFF) הטכנולוגיה microfluidic. (ב) מכשיר ספירלת DFF הוא תוכנן על ידי תוכנת הנדסה בדוגמת על פרוסות סיליקון באמצעות microfabrication. מכשירי PDMS מיוצרים לאחר מכן על ידי שיטות ליתוגרפיה רכות. התקנה ניסיונית מורכבת מ -2 משאבות מזרק להחדיר תאים שכותרתו חיץ מלוח טרי ברמות ספיקה שונה למכשיר לטיהור רציפה אוסף של תאים שכותרתו. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
הסרת איור 2. חלקיקים מתאים THP-1 שכותרתו באמצעות DFF. (א) איור שלעקרון ההפרדה DFF. גדולים יותר תאים שכותרתו לחוות כוחות להרים אינרציה חזקים (L F, חצים אדומים) ודין כוחות גרירה (F D, חיצים צהובים) ולהתמקד ליד קיר microchannel הפנימי. צירופים קטנים פתרון חיץ מושפעים אך ורק על ידי דיקן גרור recirculate אל הקיר החיצוני כדי להשיג הפרדה. מהירות גבוהה נציג ותמונות קרינה המציין עמדות שיווי משקל של תאי THP-1 (חיצים אדומים) ו NPS סיליקה עמוסים לצבוע calcein על האזור לשקע. (ב) ביצועי הפרדה מבוסס על ניתוח תזרים cytometry עם gating נקבע על פי גודלן (FSC-A) גרעיניות (SSC-A) מאפיינים. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3.
חלקיקי איור 4. הסרת מתאי גזע mesenchymal (MSCs) באמצעות DFF. (א) תמונה במהירות גבוהה נציג ממחישות הפרדה יעילה של MSCs (חיצים אדומים) ו PLGA צירופים (חיצים כחולים) לשקעים שונים. צהוב קווים מקווקווים מציינים את המיקום המשוער של קירות microchannel. (ב) ביצועים הפרדת MSCs מ סיליקה PLGA צירופים."Target =" pg _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
טכנולוגית טיהור תא DFF המתוארת כאן מאפשרת הפרדה מהירה ומתמשכת של תאים שכותרתו באופן תפוקה גבוה. גישת פרדה זו היא אידיאלית עבור נפח דגימה גדול או עיבוד מדגם ריכוז תא גבוה, והוא טוב יותר מאשר סינון מבוסס קרום קונבנציונלי אשר נוטה וסותם לאחר שימוש ממושך. באופן דומה, הפרדה מגנטית מבוסס זיקה מחייב צעדי תיוג תא נוספים אשר מייגעים ויקרים. התאים מטוהרים מוצגים לשמור סוכני שכותרתו שלהם ומורפולוגיה תא היטב (איור 3) עם זרימה מינימלית / אפקטים הנגרמת גזירה (τ מאמץ הגזירה, ~ 200-250 ס"מ / דיין 2) בשל הזמן מגוריו קצר בתוך הערוץ (< 1 sec) 20,24. בנוסף, המשתמש יכול לבחור את פתרון eluted של התאים שכותרתו מסודרים על ידי פשוט החליף למאגר הנדן (מלוח) עם התקשורת הרצויה או פתרון חיץ.
זה קריטי, כיאין לכלוך או פסולת בשימוש microchannel לפני שיכול להשפיע לרעה על התנהגות התמקדות התא. זו יכולה להיות מושגת על ידי ניקוי חורי המפרצון ביסודיות עם IPA, כמו גם באמצעות קלטת מסוך כדי לנקות את שטח PDMS לפני מליטת פלזמה. מאז microdevice פועלת בתנאי זרימה גבוהים (~ 1 - 1.5 מיליליטר / דקה), כמו כן, חשוב לחמם את תקני PDMS מלוכדים על פלטה חמה כדי להבטיח מליטה חזקה בין PDMS ואת שקופיות הזכוכית. במהלך פעולת מכשיר, אם התאים לא מתמקדים גם, זה אומר כי הספיקות אינן מספיקות. אפשר לפתור על ידי בדיקה באזור כניסת המכשיר ואת טיפי מזרק כדי להבטיח שאין דליפות.
הסרת צירופים מאוגדים מתאי שכותרתו אינה טריוויאלי מאז טכניקות הפרדת מעבדה המשותפת (למשל, צנטריפוגה) לא יכול חלקיקים נפרדים / תאים בגדלים שונים (למשל, חלקיקי מאוגד ותאיים שכותרתו). בעוד שניתן לטעון כי כביסה חזרהושינוי של תקשורת בתרבות יכול להסיר צירופים חינם מתאים חסידים במידה מסוימת, התהליך מייגע ולא יעיל עבור תרביות תאי השעיה. מכשיר microfluidic DFF מנצל מיון מבוסס-גודל הוא תכליתי מאוד כפי שהוא יכול לשמש הן השעית תאים חסידים עם מגוון גודל גדול, כמו גם סרה של צירופים של חומרים שונים. אם תאי היעד הם בגדלים שונים, מכשיר DFF יכול להיות מותאם על ידי שינוי תנאי הזרימה או גיאומטרית ערוץ (למשל, גובה ערוץ ויחס של רוחבי ערוץ פנימי וחיצוני) כדי להשיג הפרדה יעילה. זה כבר הוכיח בעבר כי DFF עדיפה לעומת צנטריפוגה קונבנציונלית הסרת צירופים עם אובדן התא מינימלי. 22 יתר על כן, הביצועים התאוששות התא נותר גבוה (> 90%) כאשר ריכוז המדגם עלה ל -10 7 תאים / מ"ל. זהו שיפור מרכזי על פני שיטות להפרדת תאי microfluidic אינרציה קיימות אשר הנן כללייםly מוגבל 10 5 תאים / מ"ל קיבולת בשל הצפיפות הרבה אינטראקציה תא-תא עמדות שיווי משקל. 25
בעוד הטכנולוגיה DFF משיג הפרדה המבוססת על ההבדל בגודל, זה לא יכול לשמש עבור תהליכי הנדסה תאים אחרים כגון הפרדת תאים שכותרתו ללא תווית עקב שינוי זניח גודל התא. פני תא סמנים של מיון מבוסס זיקה ואופני הפרדה נפוצה אחרים (רגישות מגנטית מוליכות חשמלית) יכולים להיחשב עבור יישומים פוטנציאליים כאלה. טכנולוגית DFF היא גם לא מתאים מיון תא מרובב המבוסס על קרינה. אפשרות טובה יותר תהיה להשתמש תא קרינת מיון מופעל (FACS) למיון בשלב יחיד של תאים שכותרתו עם קרינה שונה הפועלת קצב העברת נתונים גבוהים, אך דורשת ציוד יקר ומסורבל.
לבסוף, פרוטוקול זה שימושי במיוחד עבור הטיהור של תאים מהונדסים כאשרצירופים המכילים סוכנים טרנספורמטיבי (גורמי גדילה, תרופות, סטרואידים, וכו ') משמשים bioimaging ו / או טיפול בתא. הסיבה לכך היא כי צירופים חינם שריד יכולות להשפיע באורח טרנספורמטיבי מחוץ היעד על תאים שכנים או תאים חיסוניים המגיבים חלקיקים זרים אלה כאשר הוא מוזרק in vivo. היא עשויה גם שלא בכוונה ליצור אותות שיכולים להטעות במהלך bioimaging. הסרת הצירופים הללו בחינם לפני שימוש ובכך להפחית את הסיכון לתאי היעד הלא, למזער אוספים במערכת חיסונית, להפחית בעיות זיהום בין השלבים במהלך תיוג / הנדסה רציפה של תאים. היישום המוצלח שלה מאוד מקל תיוג תא ומאפשר השימוש חופשי-ההתערבות של הנדסת תא חלקיקים מבוססות בטיפול.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים אין לי מה לחשוף.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell lines & Media | |||
| Mesenchymal Stem Cells (MSCs) | Lonza | PT-2501 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Lonza | 12-614F | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270-106 | |
| THP-1 monocyte cells (THP-1) | ATCC | TIB-202 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 media | Lonza | 12-702F | |
| Reagents & Materials | |||
| 0.01% poly-L-lysine (PLL) | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| 3 ml Syringe | BD | 302113 | Syringe 3 ml Luer-Lock |
| 60 ml Syringe | BD | 309653 | Syringe 60 ml Luer-Lock |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Biowest | P6154-100GR | |
| Calcein, AM (CAM) | Life Technologies | C1430 | |
| Calcein | Sigma-Aldrich | C0875 | |
| Isopropanol | Fisher Chemical | #P/7507/17 | HPLC Grade 2.5 L |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Lonza | 17-516Q/12 | |
| Plain Microscope Slides | Fisher Scientific | FIS#12-550D | 75 x 25 x 1 mm3 |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | SYLGARD® 184 | |
| Scotch tape | 3M | 21200702044 | 18 mm x 25 m |
| Silica NPs (∼200 μm) | Sigma-Aldrich | 748161 | Pore size 4 nm |
| Syringe Tip | JEC Technology | 7018302 | 23 G 0.013 x 0.25 |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Life Technologies | 25200-056 | |
| Tygon Tubing | Spectra-Teknik | 06419-01 | 0.02 x 0.06" 100 |
| Poly (D,L-lactide-co-glycolide) (PLGA; 50:50) | Sigma-Aldrich | P2191 | |
| Equipment | |||
| Biopsy punch | Harris Uni-Core | 69036-15 | 1.50 mm |
| Dessicator | Scienceware | 111/4 IN OD | |
| High-speed Camera | Phantom | V9.1 | |
| Inverted phase-contrast microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-002 | |
| Syringe Pump | Chemyx | CX Fusion 200 |
References
- Wiraja, C., et al. Aptamer technology for tracking cells' status & function. Mol. Cell. Ther. 2, 33 (2014).
- Yeo, D. C., Wiraja, C., Mantalaris, A., Xu, C. Nanosensors for Regenerative Medicine. J. Biomed. Nanotech. 10, 2722-2746 (2014).
- Naumova, A. V., Modo, M., Moore, A., Murry, C. E., Frank, J. A. Clinical imaging in regenerative medicine. Nat. Biotechnol. 32, 804-818 (2014).
- Soenen, S. J., et al. Cellular toxicity of inorganic nanoparticles: Common aspects and guidelines for improved nanotoxicity evaluation. Nano Today. 6, 446-465 (2011).
- Donaldson, K., Poland, C. A. Nanotoxicity: challenging the myth of nano-specific toxicity. Curr. Opin. Biotechnol. 24, 724-734 (2013).
- Veiseh, O., et al. Size- and shape-dependent foreign body immune response to materials implanted in rodents and non-human primates. Nat. Mater. 14, 643-651 (2015).
- Jones, S. W., et al. Nanoparticle clearance is governed by Th1/Th2 immunity and strain background. J. Clin. Invest. 123, 3061-3073 (2013).
- Marchi, L. F., Sesti-Costa, R., Chedraoui-Silva, S., Mantovani, B. Comparison of four methods for the isolation of murine blood neutrophils with respect to the release of reactive oxygen and nitrogen species and the expression of immunological receptors. Comp. Clin. Pathol. 23, 1469-1476 (2014).
- Morton, K. J., et al. Hydrodynamic metamaterials: Microfabricated arrays to steer, refract, and focus streams of biomaterials. Proc. Natl. Acad. of Sci USA. 105, 7434-7438 (2008).
- Hu, X., et al. Marker-specific sorting of rare cells using dielectrophoresis. Proc. Natl. Acad. of Sci USA. 102, 15757-15761 (2005).
- Cummings, E. B. Streaming dielectrophoresis for continuous-flow microfluidic devices. IEEE Eng. Med. Biol. Mag. 22, 75-84 (2003).
- Augustsson, P., Persson, J., Ekstrom, S., Ohlin, M., Laurell, T. Decomplexing biofluids using microchip based acoustophoresis. Lab Chip. 9, 810-818 (2009).
- Di Carlo, D., Irimia, D., Tompkins, R. G., Toner, M. Continuous inertial focusing, ordering, and separation of particles in microchannels. Proc. Natl. Acad. of Sci USA. 104, 18892-18897 (2007).
- Hur, S. C., Henderson-MacLennan, N. K., McCabe, E. R. B., Di Carlo, D. Deformability-based cell classification and enrichment using inertial microfluidics. Lab Chip. 11, 912-920 (2011).
- Mach, A. J., Di Carlo, D. Continuous scalable blood filtration device using inertial microfluidics. Biotechnol. Bioengin. 107, 302-311 (2010).
- Gossett, D. R., et al. Inertial manipulation and transfer of microparticles across laminar fluid streams. Small. 8, 2757-2764 (2012).
- Amini, H., et al. Engineering fluid flow using sequenced microstructures. Nat. Commun. 4, 1826 (2013).
- Sollier, E., et al. Inertial microfluidic programming of microparticle-laden flows for solution transfer around cells and particles. Microfluid. Nanofluid. 19, 53-65 (2015).
- Lee, W. C., et al. Multivariate biophysical markers predictive of mesenchymal stromal cell multipotency. Proc. Natl. Acad. of Sci USA. 111, E4409-E4418 (2014).
- Hou, H. W., et al. Isolation and retrieval of circulating tumor cells using centrifugal forces. Sci. Rep. 3, 1259 (2013).
- Hou, H. W., Bhattacharyya, R. P., Hung, D. T., Han, J. Direct detection and drug-resistance profiling of bacteremias using inertial microfluidics. Lab Chip. 15, 2297-2307 (2015).
- Yeo, D. C., et al. Interference-free Micro/nanoparticle Cell Engineering by Use of High-Throughput Microfluidic Separation. ACS Appl. Mater. Inter. 7, 20855-20864 (2015).
- Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft Lithography. Angew. Chem. Int. Edit. 37, 550-575 (1998).
- Lee, W. C., et al. High-throughput cell cycle synchronization using inertial forces in spiral microchannels. Lab Chip. 11, 1359-1367 (2011).
- Kuntaegowdanahalli, S. S., Bhagat, A. A., Kumar, G., Papautsky, I. Inertial microfluidics for continuous particle separation in spiral microchannels. Lab Chip. 9, 2973-2980 (2009).
