Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Microfluidos intercambio de tampón para la Micro / célula de nanopartículas Ingeniería sin interferencias

doi: 10.3791/54327 Published: July 10, 2016

Summary

Este protocolo describe el uso de una estrategia de intercambio de tampón a base de microfluídica inercial para purificar células de ingeniería micro / nanopartículas con el agotamiento eficiente de partículas no unidos.

Abstract

células de ingeniería con cargadas con sustancias activas, micro / nanopartículas (NP) se está convirtiendo en un método cada vez más popular para mejorar las propiedades terapéuticas nativas, permitirá bio imágenes y controlar el fenotipo celular. Una cuestión fundamental todavía insuficientemente reconocidos es el importante número de partículas que permanecen sin unir después del marcaje de células que no se pueden eliminar fácilmente mediante centrifugación convencional. Esto conduce a un aumento en el ruido de fondo de imagen bio y puede impartir efectos transformadores en las células no objetivo vecinos. En este protocolo, se presenta una estrategia basada en la microfluídica inercial tampón de intercambio denominado como Decano de flujo de fraccionamiento (DFF) para separar eficientemente las células marcadas de PN libres en una forma de alto rendimiento. El microdispositivo espiral desarrollado facilita la recogida continua (> recuperación de células 90%) de células purificadas (THP-1 y MSC) en suspensión en una nueva solución tampón, mientras que el logro% agotamiento de colorante fluorescente no unido o NPs de tinte cargado (sil> 95ica o PLGA). Esto solo paso, la estrategia de purificación de células basadas en el tamaño hace posible un rendimiento de procesamiento de alta celular (10 6 células / min) y es muy útil para la purificación de células a gran volumen de células micro / nanopartículas de ingeniería para lograr la aplicación clínica libre de interferencias.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

La ingeniería de células por micro / nanopartículas cargadas con agente (NPS) es un método de integración libre, versátil y sencilla, genómica para mejorar la capacidad de bioimagen y aumentar / suplementar sus propiedades terapéuticas nativos en la medicina regenerativa. 1-3 modificaciones celulares se consiguen mediante el etiquetado de la membrana plasmática o el citoplasma con un exceso de concentración de agente PN-cargado para saturar los sitios de unión. Sin embargo, un inconveniente principal de este método es las cantidades significativas de partículas no unidas que permanece en solución después de los procesos de etiquetado de células, lo que potencialmente puede confundir la identificación precisa de las células de partículas de ingeniería o complicar los resultados terapéuticos 4,5. Además, la exposición a NPs que contienen transformadora agentes (factores de crecimiento, corticoides, etc.) a concentraciones excesivamente altas pueden causar citotoxicidad y la exposición mal dirigida puede inducir consecuencias no deseadas en las células no diana. Incluso los vehículos en partículas que comprende Of materiales "biocompatibles" [por ejemplo, poli (co-glicólico ácido láctico), PLGA] pueden incitar respuestas de las células inmunes potentes bajo ciertas condiciones también. 6 Esto es especialmente arriesgado en individuos con inmunidad comprometida (por ejemplo, artritis reumatoide) que potencialmente retrasos . aclaramiento sistémico de nanopartículas 7 Por lo tanto, la eliminación eficaz de partículas libres antes de la introducción de las células de ingeniería de partículas es de gran importancia para minimizar el perfil de toxicidad y reducir la exposición a las partículas mal dirigido por agente cargado en vivo.

centrifugación en gradiente convencional se utiliza a menudo para separar las células de ingeniería de partículas libres pero es laborioso y operado en modo por lotes. Por otra parte, las tensiones de cizallamiento experimentadas por las células durante la centrifugación de alta velocidad y los constituyentes del medio de gradiente de densidad puede comprometer la integridad de las células y / o comportamiento de las células influencia. 8 microfluídica es una alternativa atractiva con sevtecnologías de separación va- incluyendo el desplazamiento lateral determinista (sistema antibloqueo de frenos) 9, dieletrophoresis 10,11 y 12 acoustophoresis desarrollado para la separación de partículas pequeñas y aplicaciones de intercambio de tampón. Sin embargo, estos métodos sufren de baja rendimiento (1-10 l · min - 1) y son propensos a la obstrucción cuestiones. separaciones activos tales como los métodos basados ​​en dielectroforesis también requieren diferencias de fenotipos de células dielectroforética intrínsecas o pasos adicionales de etiquetado de células para conseguir la separación. Un enfoque más prometedor implica la microfluídica inercial - la migración lateral de partículas o células a través agiliza centrarse en posiciones distintas debido a las fuerzas de elevación dominantes (F L) con alto número de Reynolds (Re) 13 Debido a sus condiciones de alto flujo y la resolución de tamaño superior. , a menudo ha sido explotada para aplicaciones de cambio de separación de células 14,15 basados ​​en tamaño y de amortiguamiento. 16-18 However, el rendimiento sigue siendo pobre intercambio de tampón con solución contaminante ~10-30% como las células separadas suelen permanecer cerca de la frontera entre las soluciones originales y nuevos de amortiguamiento. 16-18 Más importante aún, la distribución del tamaño de las células diana tiene que ser similar para lograr inercial enfoque preciso y la separación de la solución tampón original que plantea un problema especialmente en el tratamiento de los tipos de células-heterogéneos de tamaño, tales como células madre mesenquimales (MSCs). 19

Anteriormente hemos desarrollado una nueva técnica de células de microfluidos inercial de clasificación denomina Dean flujo Fraccionamiento (DFF) para aislar las células tumorales circulantes (CTC) 20 y 21 de las bacterias de la sangre entera usando un 2-entrada, el dispositivo de microcanales espiral de 2 salidas. En este protocolo de vídeo, vamos a describir el proceso de etiquetado de las células THP-1 (línea celular de leucemia monocítica aguda humana) monocıticas suspensión (~ 15 m) y MSC (10-30 micras) con calceína-lNPs oaded, seguido por la fabricación y el funcionamiento del microdispositivo espiral DFF para la recuperación eficiente de células marcadas y la eliminación de NPs no unidos. 22 Esta estrategia solo paso de purificación permite la recuperación continua de suspensión etiquetados y las células adherentes en suspensión en solución tampón fresco sin centrifugación. Por otra parte, se puede procesar hasta 10 millones de células · mL-1, una densidad de células susceptibles de aplicaciones de la medicina regenerativa.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Las nanopartículas (NP) Etiquetado de las células madre mesenquimales y monocitos

  1. células madre Cultura mesenquimales (MSC) en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS) y antibióticos para ≥80% de confluencia antes de etiquetado. Del mismo modo, la cultura células THP-1 (ATCC) en Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 suplementado con 10% FBS a una densidad de ~ 10 6 células / ml.
  2. PN carga de sílice (~ 500 micras) con una solución de colorante calceína (200 M) con agitación durante la noche. Fabrique PLGA-calceína AM (CAM) utilizando un protocolo descrito previamente. 22
    1. Disolver 250 g CAM y 100 mg de PLGA (50:50) en cloroformo a 4 ° C.
    2. Generar NPs emulsión individuales utilizando un homogeneizador de alta velocidad (13.600 xg, 60 sec) a temperatura ambiente. Evaporar el cloroformo en una campana química (≥3 hr) antes de la recogida usando centrifugación (3.400 xg durante 5 min), lavado (dobles distiagua llena), el secado por congelación y el almacenamiento de -20 ° C.
  3. Incubar CAM-PLGA PN (1 mg) o NPs de sílice calceína (150 g) en poli-L-lisina solución 0,01% (PLL) a temperatura ambiente durante 15-20 min.
  4. Centrifugar a 3400 xg durante 5 min para eliminar el exceso sobrenadante PLL antes de la resuspensión NPs en 1 ml de medio de cultivo respectivo.
  5. Se incuban las células con PN (MSC o THP-1, ~ 1 - 2 x 10 6 células en total) durante aproximadamente 24 horas (0,1 mg · ml-1 de concentración etiquetado).
  6. Disociarse y la cosecha de las MSC adherentes marcadas utilizando 2 ml de tripsina al 0,25% (5 min, 37 ° C) y se apaga con 6 ml de DMEM. Centrifugar las células a 1000 (xg, 4 min) y se resuspenden a una concentración de 10 05 al 10 06 células / ml para el procesamiento microfluídico. Utilice etiquetados células THP-1 (10 05 al 10 06 células / ml) directamente para la purificación de microfluidos.

2. Preparación dispositivo de microfluidos

  1. la fabricación de dispositivos
    1. Fabricar el dispositivo de microfluidos espiral (500 micras (w) x 115 mm (h)) con polidimetilsiloxano (PDMS) de un kit comercial usando pasos de litografía suave estándar. 23
    2. Mezclar 30 g de prepolímero de base y 3 g de agente de curado a fondo en un recipiente de pesar. De-gas de la mezcla en un desecador durante 60 min para eliminar las burbujas de aire.
    3. Verter la mezcla de PDMS sobre el molde maestro oblea de silicio modelada con el diseño de canal espiral cuidadosamente a una altura de ~ 5 a 10 mm.
    4. De-gas de la mezcla en un vacío desecador durante 60 min de nuevo para eliminar cualquier burbuja de aire. Repita el proceso hasta que todas las burbujas se eliminan.
    5. Curar la mezcla de PDMS en un horno 80 ° C durante 2 horas hasta que el PDMS se establece. Asegúrese de que la oblea no se inclina durante el curado a tener una altura dispositivo constante.
    6. Cortar el dispositivo de espiral PDMS utilizando un bisturí y la cáscara con cuidado la losa de PDMS del molde maestro.
    7. Trim los bordes del dispositivo con un bisturí para asegurar que la superficie lisa para la unión.
    8. Haga dos agujeros (1,5 mm) para las entradas y dos agujeros (1,5 mm) para los puntos de venta en el dispositivo de PDMS usando un golpeador biopsia 1,5 mm.
    9. Lavar el dispositivo con isopropanol (IPA) para eliminar los residuos y seque el dispositivo en un horno a 80 ° C durante 5 min.
    10. Limpiar la superficie inferior del dispositivo de PDMS (con funciones de canal) usando cinta adhesiva.
    11. Clean un lado de una placa de vidrio (2 "por 3") utilizando cinta adhesiva.
    12. Colocar con cuidado y exponer las superficies a limpiar el dispositivo de PDMS y portaobjetos de vidrio en la cámara de un limpiador de plasma y someterlos al vacío durante 60 segundos. A continuación, active la alimentación de plasma al máximo y bajar la presión de la cámara hasta que la cámara se vuelve de color rosa.
      1. Exponer las superficies a plasma de aire durante 60 segundos. El plasma crea especies reactivas en las superficies expuestas de los PDMS y de vidrio que permite una unión apretada cuando se pone en physicAl contacto. Desconecte la alimentación de plasma y libere la presión del limpiador de plasma para recuperar el dispositivo y portaobjetos de vidrio.
    13. Unir el dispositivo de PDMS y portaobjetos de vidrio junto presionando las superficies de plasma expuestos herméticamente y asegurar que no hay burbujas quedan atrapadas entre las dos superficies.
    14. Calentar el dispositivo unido con una placa caliente puesta a 80 ° C durante 2 horas para reforzar la unión.
  2. Funcionamiento del dispositivo
    1. Cortar dos piezas de tubo (1,52 mm DO) de ~ 15 - 20 cm para las jeringas de entrada y conectar un extremo de la jeringa (calibre 23) en un extremo de cada tubo.
    2. Cortar dos piezas de tubo (1,52 mm DO) de ~ 5 - 10 cm para los puntos de venta y se unen a los orificios de salida del dispositivo de PDMS.
    3. Antes de probar en marcha, primer manualmente el dispositivo con una jeringa que contiene 70% de etanol hasta que fluye fuera del tubo de salida. Permitir que el plantón de etanol durante 30 segundos a 1 minuto para esterilizar el dispositivo.
    4. Cargar 30 ml de filtrado(0,2 micras de poro) tampón de vaina (Phosphate Buffered Saline-(PBS) con 0,1% albúmina de suero bovino (BSA)) en la jeringa 60 ml y asegurar la jeringa en una bomba de jeringa. Poner la bomba en la configuración correcta (tamaño de la jeringa: 60 ml, Tomo: 60.000 l).
      Nota: La adición de BSA a PBS es reducir al mínimo la unión célula-célula y la unión no específica entre las células y el dispositivo de PDMS.
    5. Cargar 3 ml de células marcadas en la jeringa de 3 ml y asegurar la jeringa en una bomba de jeringa separada. Poner la bomba en la configuración correcta (tamaño de la jeringa: de 3 ml, Volumen: 3.000 l).
    6. Comprobar que no queden burbujas de aire atrapadas en las jeringas para asegurar un flujo estable. Eliminar cualquier burbuja de aire por expulsar suavemente unas gotas de líquido fuera de la boquilla.
    7. Conectar las puntas de jeringa de entrada y los tubos de las jeringas, e insertarlos en las respectivas entradas del dispositivo (funda y entrada de la muestra). Asegúrese de que no haya burbujas a lo largo de la tubería.
    8. Montar los dispositivos en un invertidoed microscopio de contraste de fase para la formación de imágenes en tiempo real durante el proceso de clasificación de células.
    9. Asegurar un vaso pequeño de residuos y dos tubos de 15 ml cerca del dispositivo en la platina del microscopio utilizando adhesivos.
    10. Coloque los tubos de salida en el vaso de residuos.
    11. Ajuste la relación de flujo para la muestra a un tampón de vaina a 01:10 y empezar a ambas bombas de jeringa para iniciar el proceso de clasificación (Ejemplo: 120 l / min para la jeringuilla de la muestra y 1,200 l / min para jeringa vaina; velocidad de flujo de canal ~ 0,38 m / sec ).
    12. Ejecutar el dispositivo para 1,5 min para la velocidad de flujo se estabilice. Esto puede ser confirmado por la presencia de células por inercia centrado cerca de la pared interna del canal bajo de campo brillante con el contraste de fase usando una cámara de alta velocidad (~ 5.000 - 10.000 fotogramas por segundo (fps), el tiempo de exposición: 10-50 microsegundos).
    13. Coloque los tubos de salida en diferentes tubos para recoger los eluyentes desde la salida de la celda y salida de residuos.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Después de marcar las células con bio de imagen NPs agente cargado durante la noche, se cosechan las células marcadas (que contiene partículas libres) y se purificaron por microdispositivo espiral DFF para eliminar NPs libres en un solo proceso la etapa (Figura 1A). El 2-entrada, microcanal espiral de 2 salidas está diseñado por el software de ingeniería y microfabricado utilizando SU-8 fotoprotector. La oblea de silicio modelada se utiliza entonces como plantilla para el moldeo por réplicas de PDMS utilizando técnicas de litografía suave (Figura 1B). Para llevar a cabo la clasificación de células, la muestra de células se bombea en la entrada de la pared exterior del microdispositivo espiral mientras que la pared interior de entrada se ejecuta solución tampón fresca a un caudal superior (01:10) para pellizcar el flujo de la muestra celular. La separación se consigue centrándose inercial de células marcadas más grandes en la pared interior y la recirculación inducida por Dean de pequeñas NPs no unidos hacia la pared exterior (Figura 2A). El dispositivo fue la primera aplied para ordenar las células en suspensión marcado monocíticas (THP-1) de NPs de sílice fluorescentes cargadas con calceína (~ 500 nm de tamaño). Se obtuvieron eficiencias de separación de alta según lo confirmado por formación de imágenes de alta velocidad (Figura 2A) y citometría de flujo análisis (Figura 2B). Imágenes de eluyentes recogidos de salida de la célula dispositivo también indicaron la eliminación eficaz de sílice y PN PLGA (~ 1 - 5 micras) a partir de células THP-1. Además, imágenes de fluorescencia mostró que los NP internalizados en las células THP-1 marcadas se conservan bien durante la purificación DFF (inserciones) (Figura 3). Debido a la heterogeneidad MSC tamaño, la geometría microcanal espiral fue modificado posteriormente por el cambio de la altura del canal y el diseño de bifurcación para permitir la recogida eficaz de las MSC (Figura 4).

Figura 1
Figura 1. (A) Overall flujo de trabajo para la eliminación rápida de un solo paso de micro / nanopartículas (NP) a partir de la suspensión y las células adherentes post-etiquetado usando Dean flujo de fraccionamiento (DFF) la tecnología de microfluidos. (B) El dispositivo está diseñado espiral DFF por el software de ingeniería y modelado de oblea de silicio usando microfabricación. dispositivos de PDMS se producen posteriormente por métodos de litografía blanda. Montaje experimental consta de 2 bombas de jeringa para infundir células marcadas y tampón de solución salina fresca a diferentes caudales en el dispositivo para la purificación continua y la recogida de células marcadas. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2. Las nanopartículas de eliminación de células marcadas THP-1 a través de las fuerzas de facto. (A) Ilustración deprincipio de separación de facto. Células marcadas mayores experimentan fuertes fuerzas de inercia de elevación (F L, flechas rojas) y las fuerzas de arrastre Dean (F D, flechas amarillas) y se concentran cerca de la pared interna de microcanales. PN más pequeños y solución tampón están exclusivamente afectados por Dean arrastrar y recirculan a la pared exterior para conseguir la separación. Representante de alta velocidad y las imágenes de fluorescencia que indican posiciones de equilibrio de las células THP-1 (flechas rojas) y sílice PN cargados con colorante calceína en la zona de salida. Rendimiento (B) Separación basado en el análisis de citometría de flujo con acotamiento determinado por el tamaño (FSC-A) y la granularidad (SSC-A) características. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figura 3
Figura 3. > Representativas imágenes de campo claro de purificado marcado con células THP-1 (flechas rojas) y la eficiencia de eliminación PN utilizando DFF. El recuadro muestra el respectivo contrato de fase (arriba) y las imágenes de microscopía de fluorescencia de las células individuales. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4
Figura 4. Las nanopartículas de eliminación de las células madre mesenquimales (MSC) a través de las fuerzas de facto. Representante imágenes de alta velocidad (A) que ilustran la separación eficiente de las MSC (flechas rojas) y PLGA PN (flechas azules) en diferentes puntos de venta. Amarillo Las líneas discontinuas indican la posición aproximada de las paredes de microcanales. (B) el rendimiento de separación de las MSC de sílice y PLGA PN.pg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

La tecnología de purificación de células DFF descrito en este documento permite la separación rápida y continua de células marcadas en una forma de alto rendimiento. Este enfoque de separación es ideal para gran volumen de muestra o el procesamiento de muestras de alta concentración de células, y es mejor que la filtración a base de membrana convencional que es propenso a la obstrucción después de un uso prolongado. Del mismo modo, la separación magnética basada en la afinidad requiere pasos adicionales de etiquetado de células que son laboriosos y caros. Las células purificadas se muestran para retener sus agentes marcados y morfología de las células así (Figura 3) con un mínimo de flujo de efectos / cizalla inducida (τ tensión de cizallamiento, ~ 200-250 dinas / cm 2) debido a corto tiempo de residencia dentro del canal (< 1 seg) 20,24. Además, el usuario puede elegir la solución eluida de las células marcadas según simplemente sustituyendo el tampón de vaina (solución salina) con los medios de comunicación deseados o solución tampón.

Es crítico queno hay suciedad o residuos en el uso anterior de microcanales que puede afectar negativamente el comportamiento de enfoque celular. Esto puede conseguirse mediante la limpieza de los agujeros de entrada a fondo con IPA, así como el uso de cinta adhesiva para limpiar la superficie antes de la unión PDMS plasma. Puesto que el microdispositivo opera en condiciones de alto flujo (~ 1 a 1,5 ml / min), también es importante para calentar los dispositivos PDMS unidos sobre una placa caliente para asegurar una fuerte unión entre el PDMS y el portaobjetos de vidrio. Durante el funcionamiento del dispositivo, si las células no se están centrando así, significa que las velocidades de flujo no son suficientes. Uno puede solucionar mediante la comprobación de la zona de entrada del dispositivo y la punta de jeringa para asegurar que no hay fugas.

La eliminación de NPs no unido de células marcadas no es trivial ya que las técnicas de separación de laboratorio común (por ejemplo, centrifugación) no puede separar las partículas / células de diferentes tamaños (por ejemplo, partículas no unidas y células marcadas). Si bien se puede argumentar que el lavado repetidoy el cambio de medio de cultivo puede eliminar NPs libres de células adherentes en cierta medida, el proceso es laborioso e ineficaz para cultivos de células en suspensión. El dispositivo de microfluidos DFF utiliza la clasificación basada en tamaño y es muy versátil, ya que puede ser utilizado tanto para la suspensión y las células adherentes con una gran gama de tamaños, así como la eliminación de NPs de diferentes materiales. Si las células diana son de diferentes tamaños, el dispositivo DFF se puede optimizar mediante el cambio de las condiciones de flujo o la geometría del canal (por ejemplo, altura del canal y la relación de anchuras de canal interior y exterior) para conseguir la separación eficiente. Se ha demostrado previamente que DFF es superior en comparación con la centrifugación convencional en la eliminación de NPs con la pérdida de células mínima. 22 Por otra parte, el rendimiento de recuperación de células se mantuvo alta (> 90%) cuando la concentración de la muestra se aumentó a 10 7 células / ml. Esto es una mejora clave sobre los métodos de separación de células de microfluidos inerciales existentes que son generalesmente limitada a 10 5 células / ml de capacidad debido a la interacción célula-célula y célula de hacinamiento en las posiciones de equilibrio. 25

Mientras que la tecnología DFF logra la separación basada en la diferencia de tamaño, no se puede utilizar para otros procesos de ingeniería celular, tales como la separación de células marcadas y no marcadas debido al cambio insignificante en el tamaño celular. marcadores de superficie celular para la clasificación basada en la afinidad y otras modalidades de separación común (susceptibilidad magnética y conductividad eléctrica) podrían ser considerados para este tipo de aplicaciones potenciales. DFF tecnología tampoco es adecuado para la clasificación de células multiplexado basado en fluorescencia. Una mejor opción sería utilizar células activadas por fluorescencia (FACS) para un solo paso de clasificación de células marcadas con fluorescencia diferente que opera a un alto rendimiento, pero requiere un equipo caro y voluminoso.

Por último, este protocolo es de gran utilidad para la purificación de células modificadas cuandoNPs que contienen agentes de transformación (factores de crecimiento, fármacos, corticosteroides, etc.) se utilizan para bioimagen y / o la terapia celular. Esto se debe a que los NP libres remanentes pueden ejercer transformador fuera de objetivo efectos sobre las células vecinas o células inmunes que responden a estas partículas extrañas cuando se inyecta in vivo. También puede generar involuntariamente señales que pueden inducir a error durante bioimagen. La eliminación de estos NPs libres antes de su uso por lo tanto a reducir el riesgo para las células no objetivo, minimizar compilaciones en el sistema inmunológico, y reducir los problemas de contaminación entre pasos durante secuencial etiquetado / ingeniería de las células. Su implementación exitosa facilita en gran medida el etiquetado de células y permite el uso libre de interferencias de la ingeniería celular basado en la terapia de partículas.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell lines & Media
Mesenchymal Stem Cells (MSCs) Lonza PT-2501
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) Lonza 12-614F
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco 10270-106
THP-1 monocyte cells (THP-1) ATCC TIB-202
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 media Lonza 12-702F
Reagents & Materials
0.01% poly-L-lysine (PLL) Sigma-Aldrich P8920
3 ml Syringe BD 302113 Syringe 3 ml Luer-Lock
60 ml Syringe BD 309653 Syringe 60 ml Luer-Lock
Bovine Serum Albumin (BSA) Biowest P6154-100GR
Calcein, AM (CAM) Life Technologies C1430
Calcein Sigma-Aldrich C0875
Isopropanol Fisher Chemical #P/7507/17 HPLC Grade 2.5 L
Phosphate-Buffered Saline (PBS) Lonza 17-516Q/12
Plain Microscope Slides Fisher Scientific FIS#12-550D 75 x 25 x 1 mm3
Polydimethylsiloxane (PDMS) Dow Corning SYLGARD® 184
Scotch tape 3M 21200702044 18 mm x 25 m
Silica NPs (∼200 μm) Sigma-Aldrich 748161 Pore size 4 nm
Syringe Tip JEC Technology 7018302 23 G 0.013 x 0.25
Trypsin-EDTA (0.25%) Life Technologies 25200-056
Tygon Tubing Spectra-Teknik 06419-01 0.02 x 0.06" 100
Poly (D,L-lactide-co-glycolide) (PLGA; 50:50) Sigma-Aldrich P2191
Equipment
Biopsy punch Harris Uni-Core 69036-15 1.50 mm
Dessicator Scienceware 111/4 IN OD
High-speed Camera Phantom  V9.1
Inverted phase-contrast microscope  Nikon Eclipse Ti
Plasma cleaner Harrick Plasma PDC-002
Syringe Pump Chemyx CX Fusion 200

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wiraja, C., et al. Aptamer technology for tracking cells' status & function. Mol. Cell. Ther. 2, 33 (2014).
  2. Yeo, D. C., Wiraja, C., Mantalaris, A., Xu, C. Nanosensors for Regenerative Medicine. J. Biomed. Nanotech. 10, 2722-2746 (2014).
  3. Naumova, A. V., Modo, M., Moore, A., Murry, C. E., Frank, J. A. Clinical imaging in regenerative medicine. Nat. Biotechnol. 32, 804-818 (2014).
  4. Soenen, S. J., et al. Cellular toxicity of inorganic nanoparticles: Common aspects and guidelines for improved nanotoxicity evaluation. Nano Today. 6, 446-465 (2011).
  5. Donaldson, K., Poland, C. A. Nanotoxicity: challenging the myth of nano-specific toxicity. Curr. Opin. Biotechnol. 24, 724-734 (2013).
  6. Veiseh, O., et al. Size- and shape-dependent foreign body immune response to materials implanted in rodents and non-human primates. Nat. Mater. 14, 643-651 (2015).
  7. Jones, S. W., et al. Nanoparticle clearance is governed by Th1/Th2 immunity and strain background. J. Clin. Invest. 123, 3061-3073 (2013).
  8. Marchi, L. F., Sesti-Costa, R., Chedraoui-Silva, S., Mantovani, B. Comparison of four methods for the isolation of murine blood neutrophils with respect to the release of reactive oxygen and nitrogen species and the expression of immunological receptors. Comp. Clin. Pathol. 23, 1469-1476 (2014).
  9. Morton, K. J., et al. Hydrodynamic metamaterials: Microfabricated arrays to steer, refract, and focus streams of biomaterials. Proc. Natl. Acad. of Sci USA. 105, 7434-7438 (2008).
  10. Hu, X., et al. Marker-specific sorting of rare cells using dielectrophoresis. Proc. Natl. Acad. of Sci USA. 102, 15757-15761 (2005).
  11. Cummings, E. B. Streaming dielectrophoresis for continuous-flow microfluidic devices. IEEE Eng. Med. Biol. Mag. 22, 75-84 (2003).
  12. Augustsson, P., Persson, J., Ekstrom, S., Ohlin, M., Laurell, T. Decomplexing biofluids using microchip based acoustophoresis. Lab Chip. 9, 810-818 (2009).
  13. Di Carlo, D., Irimia, D., Tompkins, R. G., Toner, M. Continuous inertial focusing, ordering, and separation of particles in microchannels. Proc. Natl. Acad. of Sci USA. 104, 18892-18897 (2007).
  14. Hur, S. C., Henderson-MacLennan, N. K., McCabe, E. R. B., Di Carlo, D. Deformability-based cell classification and enrichment using inertial microfluidics. Lab Chip. 11, 912-920 (2011).
  15. Mach, A. J., Di Carlo, D. Continuous scalable blood filtration device using inertial microfluidics. Biotechnol. Bioengin. 107, 302-311 (2010).
  16. Gossett, D. R., et al. Inertial manipulation and transfer of microparticles across laminar fluid streams. Small. 8, 2757-2764 (2012).
  17. Amini, H., et al. Engineering fluid flow using sequenced microstructures. Nat. Commun. 4, 1826 (2013).
  18. Sollier, E., et al. Inertial microfluidic programming of microparticle-laden flows for solution transfer around cells and particles. Microfluid. Nanofluid. 19, 53-65 (2015).
  19. Lee, W. C., et al. Multivariate biophysical markers predictive of mesenchymal stromal cell multipotency. Proc. Natl. Acad. of Sci USA. 111, E4409-E4418 (2014).
  20. Hou, H. W., et al. Isolation and retrieval of circulating tumor cells using centrifugal forces. Sci. Rep. 3, 1259 (2013).
  21. Hou, H. W., Bhattacharyya, R. P., Hung, D. T., Han, J. Direct detection and drug-resistance profiling of bacteremias using inertial microfluidics. Lab Chip. 15, 2297-2307 (2015).
  22. Yeo, D. C., et al. Interference-free Micro/nanoparticle Cell Engineering by Use of High-Throughput Microfluidic Separation. ACS Appl. Mater. Inter. 7, 20855-20864 (2015).
  23. Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft Lithography. Angew. Chem. Int. Edit. 37, 550-575 (1998).
  24. Lee, W. C., et al. High-throughput cell cycle synchronization using inertial forces in spiral microchannels. Lab Chip. 11, 1359-1367 (2011).
  25. Kuntaegowdanahalli, S. S., Bhagat, A. A., Kumar, G., Papautsky, I. Inertial microfluidics for continuous particle separation in spiral microchannels. Lab Chip. 9, 2973-2980 (2009).
Microfluidos intercambio de tampón para la Micro / célula de nanopartículas Ingeniería sin interferencias
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tay, H. M., Yeo, D. C., Wiraja, C., Xu, C., Hou, H. W. Microfluidic Buffer Exchange for Interference-free Micro/Nanoparticle Cell Engineering. J. Vis. Exp. (113), e54327, doi:10.3791/54327 (2016).More

Tay, H. M., Yeo, D. C., Wiraja, C., Xu, C., Hou, H. W. Microfluidic Buffer Exchange for Interference-free Micro/Nanoparticle Cell Engineering. J. Vis. Exp. (113), e54327, doi:10.3791/54327 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter