Summary
En fremgangsmåte for isolering av EOB-DTPA og etterfølgende kompleksering med naturlig Ga (III) og 68 Ga er presentert heri, i tillegg til en grundig analyse av alle forbindelser og undersøkelser på merking effektivitet, stabilitet in vitro, og n- oktanol / vann fordelingskoeffisienten av det radiomerkede komplekset.
Abstract
Vi viser en fremgangsmåte for isolering av EOB-DTPA (3,6,9-triaza-3,6,9-tris (karboksymetyl) -4- (etoksybenzyl) -undecanedioic syre) fra dens Gd (III) -kompleks og protokoller for fremstillingen av den nye ikke-radioaktiv, dvs. naturlig Ga (III), så vel som radioaktiv 68 Ga kompleks. Liganden samt Ga (III) kompleks ble karakterisert ved kjernemagnetisk resonans (NMR) spektroskopi, massespektrometri og elementanalyse. 68 Ga ble oppnådd ved en standard metode eluering fra en 68 Ge / 68 Ga generator. Eksperimenter for å evaluere 68 Ga-merking effektiviteten av EOB-DTPA ved pH 3,8-4,0 ble utført. Etablert analyseteknikker radio TLC (tynnsjiktskromatografi) og radio HPLC (høy ytelse væskekromatografi) ble anvendt for å bestemme den radiokjemiske renheten av spor. Som et første undersøkelse av de 68 Ga tracere 'lipofilisitet den n- oktanol / vann distribution koeffisient av 68 Ga arter som finnes i en pH 7,4 løsning ble bestemt ved en utvinning metode. In vitro målinger av sporstoffet i ulike medier ved fysiologisk pH stabilitet ble utført, avslørende ulike satser for nedbryting.
Introduction
Gadoxetic syre, et vanlig navn for Gd (III) -komplekset av liganden EOB-DTPA 1, er en hyppig benyttet kontrastmiddel i hepatobiliær magnetisk resonansavbildning (MRI). 2,3 På grunn av dets spesifikke opptak av leveren hepatocytter og høy andel av hepatobiliære utskillelse det muliggjør lokalisering av fokale lesjoner og leversvulster. 2-5 Men visse begrensninger av MR teknikk (f.eks toksisitet av kontrastmidler, begrenset anvendelse i pasienter med klaustrofobi eller metall implantater) kaller for en alternativ diagnostisk verktøy .
Positronemisjonstomografi (PET) er en molekylær avbildningsmetode, karakterisert ved at en liten mengde av et radioaktivt stoff (sporstoff) administreres, hvorpå dens fordeling i kroppen er registrert av en PET-skanner. 6 PET er en dynamisk metode som gjør det mulig for høy romlig og tidsmessig oppløsning av bilder samt kvantifisering av resultatene, uten å måtteavtale med side-effekter av MRI-kontrastmidler. Den informative verdien av den oppnådde metabolsk informasjon kan ytterligere økes ved kombinasjon med anatomiske data som mottas fra flere avbildningsmetoder, som oftest oppnås ved å hybrid avbildning med computertomografi (CT) i PET / CT-skannere.
Den kjemiske strukturen til et sporstoff er egnet for PET må inneholde en radioaktiv isotop som tjener som positronemitter. Positroner har en kort levetid siden de nesten umiddelbart tilintetgjøre med elektroner i atomet skall av omkringliggende vev. Ved utslettelse to 511 keV gamma-fotoner med motsatt bevegelsesretning som slippes ut, som blir registrert av PET-skanneren. 7,8 For å danne en tracer, PET nuklider som kan bindes kovalent til et molekyl, slik tilfellet er i 2-deoxy- 2- [18 F] fluoroglucose (FDG), den mest brukte PET tracer. 7 kan imidlertid en nuklide også danne koordinerende bånd til en eller flere ligander (f.eks, [68 Ga] -DOTATOC 9,10) eller anvendes som oppløste uorganiske salter (for eksempel [18F] natriumfluorid 11). Fullstendig, er strukturen av spor viktig ettersom den bestemmer dens biodistribusjon, metabolisme og ekskresjon oppførsel.
En egnet PET nuklide bør kombinere fordelaktige egenskaper som praktisk positron energi og tilgjengeligheten, samt en halveringstid adekvat for den tilsiktede undersøkelsen. Den 68 Ga nuklide er blitt en vesentlig kraft i feltet av PET i løpet av de siste to tiårene. 12,13 Dette er hovedsakelig på grunn av dens tilgjengelighet i et generatorsystem, som tillater merking på stedet uavhengig fra nærheten av en syklotron. I en generator, mor nuklide 68 Ge absorberes på en kolonne fra hvilken datter nuklide 68 Ga elueres og deretter merket til en passende chelator. 6,14 Siden 68 Ga nuklide eksisterer som en trivalent kation på samme måte som Gd (III) 10,13, chelaterende EOB-DTPA med 68 Ga i stedet ville gi et kompleks med den samme totale negative ladning som gadoxetic syre. Følgelig kan det 68 Ga tracer kombinere en lignende karakteristikk lever spesifisitet med egnethet for PET billeddiagnostikk. Selv gadoxetic syre er kjøpt og administreres som dinatrium salt, i følgende sammenheng vil vi referere til det som Gd [EOB-DTPA] og til ikke-radioaktive Ga (III) kompleks som Ga [EOB-DTPA], eller 68 Ga [ EOB-DTPA] i tilfelle av radiomerket komponent for letthets skyld.
For å vurdere deres egnethet som sporstoffer for PET, radioaktive metallkomplekser må undersøkes mye i in vitro, in vivo eller ex vivo eksperimenter først. For å bestemme egnethet for en respektiv medisinsk problem, ulike spor egenskaper som biodistribusjon atferd og rydding profilen, stabilitet, orgel spesifisitet og celle eller tissue-opptaket må undersøkes. På grunn av deres ikke-invasiv karakter, er in vitro-bestemmelser ofte utført forut for in vivo eksperimenter. Det er generelt anerkjent at DTPA og dets derivater er begrenset egnet som kelatorer for 68 Ga grunn av disse kompleksene mangler kinetic treghet, noe som resulterer i forholdsvis rask nedbrytning når administrert in vivo. 14-20 Dette er først og fremst forårsaket av Apo transferrin opptre som en konkurrent for 68 Ga i plasma. Likevel, undersøkte vi dette nye tracer om dens mulig søknad i hepatobiliær bildebehandling, hvor diagnostisk informasjon kan gis i løpet av minutter etter injeksjon 3,4,21-23, og dermed ikke nødvendigvis krever langsiktig tracer stabilitet. For dette formål vi isolert EOB-DTPA fra gadoxetic syre og opprinnelig utførte kompleksering med naturlig Ga (III), som foreligger som blanding av to stabile isotoper, 69 Ga og 71 68 Ga. Vi brukte etablerte metoder og samtidig evaluert deres egnethet for å bestemme 68 effektiviteten av Galabeling EOB-DTPA og for å undersøke lipofilisiteten av den nye 68 Ga tracer og dens stabilitet i ulike medier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Utarbeidelse av EOB-DTPA og Ga [EOB-DTPA]
Forsiktig: Sjå alle relevante sikkerhetsdatablad (MSDS) av de benyttede organiske løsemidler, syrer og baser før bruk. Utfør alle trinn i et avtrekksskap og bruke personlig verneutstyr (vernebriller, hansker, frakk).
- Isolering av EOB-DTPA fra gadoxetic syre
- Satt 3 ml 0,25 M gadoxetic syre injiserbar oppløsning inn i en kolbe. Tilsett 500 mg (5,6 mmol) oksalsyre til den omrørte løsning.
- Etter omrøring i 1 time, filtrere suspensjonen gjennom en fritte ved hjelp av redusert trykk. Vask de rester tre ganger med 3 ml vann, respektivt.
- Kombiner de vandige filtrater og utstyre løsning med en pH-elektrode. Tilsett 12 M saltsyre til filtratet inntil pH-verdien er omtrent -0,1.
- Fjern løsningsmidlet i vakuum og ga en fargeløs rest. Oppbevar under inert gass.
- Vask residuet grundig (minst treganger) med etylacetat for å fjerne overskudd av oksalsyre. Tørk residuet i vakuum.
- Oppløses på nytt residuet i 2 ml vann ved romtemperatur, og deretter avkjøle løsningen i et isbad. Uten å fjerne isbadet, tilsett 0,5 M vandig natriumhydroksyd-oppløsning dråpevis inntil dannelsen av et fargeløst lim faststoff observeres.
- Fjerne vannet ved dekantering. Vask de faste ytterligere to ganger med 1 ml kaldt vann. Tørk det faste materiale i vakuum under dannelse av den første produktfraksjonen.
- Isolere en andre produktfraksjon fra de kombinerte fraksjoner av dekanterte vann via kolonne-kromatografi (silisiumdioksyd, metanol / vann 4/1). 24 Fjern løsningsmidlet i vakuum.
- Hvis det således oppnådde faste stoff er ikke ren hvit, gjenoppløse det i 1 ml vann, tilsett 10 ml etanol og deretter 10 ml dietyleter for å utfelle produktet. Filtrer gjennom en fritte ved hjelp av redusert trykk og tørke under vakuum.
- Kombinerebåde faste fraksjoner av EOB-DTPA og utføre NMR spektroskopi, 25 massespektrometrisk 26 og element 27 analyser.
- Syntese av Ga [EOB-DTPA]
FORSIKTIG: Lagre solid Ga (III) klorid under en tørr inert atmosfære, siden det kommer i kontakt med luft, fuktighet eller fett nedbrytning finner sted, noe som resulterer i korrosive gasser og dannelse av gule, brune eller svarte urenheter.- Fremstille en 0,11 M stamløsning ved å oppløse 1,94 g (11,0 mmol) av Ga (III) klorid i 100 ml vann. Fortynn 1 ml 25% vandig ammoniakkoppløsning med 4 ml vann.
- Oppløs 80 mg (0,15 mmol) av EOB-DTPA i en kolbe i 10 ml vann. Hvis det er nødvendig, oppvarme oppløsningsmidlet for å oppnå fullstendig oppløsning.
- Legg 1,4 ml (0,15 mmol) av Ga (III) klorid stamløsning. Utstyre kolben med et røreverk og pH-elektrode. Legg fortynnet, vandig ammoniakk-oppløsning dråpevis inntil pH i løsningen er omtrent 4,1. Rør i room temperaturen i 30 min.
- Fjern løsningsmidlet i vakuum. Plasser residuet i en kolbe utstyrt med en stillhead med en sentral og parallelle side halsen. Utstyre den sentrale hals med en kjølende finger og side hals med en vakuumpumpeutløpet
- Varm opp residuet under redusert trykk (125 ° C, 0,6 mbar). Periodisk å fjerne sublimert ammoniumklorid (synlig som hvitt belegg på glassoverflaten) fra kjølefingeren og likevel hode, så vel som fra de øvre deler av kolben med en fuktig klut. Fortsett prosessen til det ikke er synlige dannelse av nye sublimate.
- For å fjerne siste spor av ammoniumklorid vasker residuet tre ganger med 0,5 ml varm metanol, respektivt. Tørk det fargeløse residuum i vakuum. Utfør NMR spektroskopi, 25 massespektrometrisk 26 og element 27 analyser.
2. Generell Merking Prosedyre
FORSIKTIG: All experiments inkludert direkte eller indirekte kontakt med radioaktive stoffer må utføres av kvalifisert personell. Bruk passende skjerming utstyr. Samle alle radioaktivt avfall og lagre og kast i henhold til gjeldende regelverk.
- Eluering av generatoren
Merk: En 40 mCi 68 Ge / 68 Ga generator med moren nuklide bundet som oksid på dodecyl-3,4,5-trihydroxybenzoate silika ble brukt. Eluering og rensing kan utføres manuelt, eller, slik tilfellet var i denne fremgangsmåten, som et kombinert automatisert prosess ved anvendelse av en peristaltisk pumpe og dispenserenhet.- Fremstille oppløsninger av 5,5 M, 1,0 M og 0,05 M saltsyre. Forbered en løsning av 5,0 M natriumklorid inneholder 25 ul av 5,5 M saltsyre per ml. Fremstille en bufferløsning med pH 4,6 ved å kombinere 4,1 g natrium-acetat, 1 ml HCl (30%) og 2,5 ml iseddik, og fortynning av blandingen med vann til 50 ml.
- Precondition PS-H + patron ved å skylle det langsomt med 1 ml 1,0 M saltsyre og deretter 5 ml vann.
- Eluer silikakolonne av generatoren med 4 ml 0,05 M HCl. 12 Legg den 68 Ga eluatet på den PS-H + patron.
- Skyll kassetten med 5 ml vann og deretter tørke den med 5 ml luft. Eluer 68 Ga fra patronen med 1 ml 5,0 M surgjort natriumkloridoppløsning. 28
- Merking av EOB-DTPA med 68 Ga
- Oppløs 1 mg (1,9 umol) av EOB-DTPA i 1 ml vann. Fra denne oppløsning ta 100 ul (0,19 umol) og fortynne dem med 9,9 ml vann for å fremstille en 19 uM (10 ug / ml) stamløsning av EOB-DTPA.
- Fjern 50 ul (som tilsvarer 22 til 29 MBq) av oppløsningen inneholdende 68 Ga og satt inn i en ampulle. Tilsett 50 ul (0,5 ug) av en 19 mM stamløsning av EOB-DTPA og 300 ul of buffer for å heve pH til 4,0. Rist kort og inkubere oppløsningen ved romtemperatur i 5 min. Fjerne en prøve av 1-5 ul og satt til HPLC eller TLC-analyse.
- Utføre radio HPLC-analyse på en revers fase (RP) C18-kolonne 29 Bruk følgende mobil fase:. A - vann / trifluoreddiksyre (99,9% / 0,1%), B - acetonitril / trifluoreddiksyre (99,9% / 0,1%), gradient : 06 min 80% A → 0% A (0,5 ml / min), 610 min 0% A (0,5 ml / min).
- Bestem peak intensiteter av radio HPLC signaler som arealet under kurven. Beregn merking utbytte som radiokjemiske renhet (RCP) av sporstoffet som følger:
RCP = A Ga-EOB-DTPA / (A Ga + A Ga-EOB-DTPA) ∙ 100%
En Ga-EOB-DTPA: arealet under kurven for 68 Ga [EOB-DTPA]
A Ga: arealet under kurven for gratis 68 Ga
3. Merking Effektivitet
- Utfør merking prosedyrer som beskriverd i § 2. Bruk en konsekvent rekke starte aktivitet på 68 Ga eluatet, f.eks 22-29 MBq (40-140 ul, avhengig av friskhet av eluatet).
- Legge til den nødvendige mengden av bufferløsning for å justere pH til 3,8-4,0 (40-190 ul, avhengig av volumet av 68 Ga eluat). Legge til den nødvendige mengden av ligand stamløsningen (10 til 70 ul av en 19 mM løsning).
- Tilsett de nødvendige mengder vann for å justere det totale volum av hver merking sonde til 1,75 ml. Bland godt og la prøven stå i 5 min ved romtemperatur. Utfør HPLC-analyse som beskrevet i kapittel 2 for å bestemme merking yield.
- Utføre merking prosedyrer med mengder av ligand mellom 0,1 ug og 0,7 ug i trinn på 0,1 ug. Utføre eksperimenter i tre paralleller for hver ligand konsentrasjon. Beregn middelverdien utbytte og standardavvik.
4. In vitro-stabilitet
- Generelt procedure og forberedelser
- Oppløse en tablett av fosfatbufret saltvann (PBS) i 200 ml deionisert vann for å fremstille en PBS-stamløsning med en fosfatkonsentrasjon på 10 mM.
- Utfør merking av 22-29 MBq 68 Ga med 0,5 mL av EOB-DTPA stamløsning, som beskrevet i kapittel 2. Avhengig av volumet av den 68 Ga eluatet, justere mengden av buffer, som beskrevet i kapittel 3. Trekk prøver av merking løsning som inneholder 6-12 MBq av tracer for å utføre stabilitetsmålinger.
- Utføre radio TLC-analyse på 80 mm silikagelplater belagte aluminiumplater ved anvendelse av 0,1 M vandig natriumcitrat som elueringsmiddel og analysere platene med en TLC radioaktivitet scanner. 30 Bestem intensiteter av TLC-signalene som areal under kurve. Beregn RCP av sporstoffet som følger:
RCP = A Ga-EOB-DTPA / (A Ga fritt + A Ga-EOB-DTPA + A Ga-kolloidalt) ∙ 100%
En Ga-EOB-DTPA: arealet under kurven for 68 Ga [EOB-DTPA]
En Ga-free: arealet under kurven for gratis 68 Ga
En Ga-kolloidalt: arealet under kurven av kolloidalt 68 Ga - Beregn RCP t / RCP 0 for hvert tidspunkt. Plott således standardiserte RCP vs. tidsforskjell siden startpunktet t = 0 min.
RCP RCP = t av 68 Ga [EOB-DTPA] på tidspunkt t.
RCP RCP = 0 av 68 Ga [EOB-DTPA] ved t = 0 min.
- Stabilitet i fosfatbufret saltvann (A)
- Til 65 ul av merking oppløsning legge til 150 ul PBS-forrådsoppløsning og 60 ul av natriumhydroksyd-løsning (0,1 M) for å heve pH til 7,4. Bland grundig.
- Fjerne en prøve av 1-5 ul for å utføre TLC-analyse ( "utgangspunkt"). oppløsningen i en inkubator umiddelbart oppbevar ved 37 ° C og fjerne alikvoter for å utføre TLC-analyse ved representereAtive tidspunkter i løpet av tre timer.
- Stabilitet mot overkant av apo -transferrin i PBS (B)
- 120 ul av merking oppløsning legge til 50 mL PBS stamoppløsning og 430 ul av natriumhydroksyd-løsning (0,1 M) for å heve pH til 7,4. Legg 40 ul av en oppløsning av apo -transferrin (25 mg / ml). Bland grundig.
- Fjerne en prøve av 1-5 ul for å utføre TLC-analyse ( "utgangspunkt"). oppløsningen i en inkubator umiddelbart oppbevar ved 37 ° C og fjerne alikvoter for å utføre TLC-analyse på representative tidspunkter i løpet av 3 timer.
- Stabilitet i human serum (C)
- Til 500 pl humant serum legge til 25 ul av merking oppløsning og 45 ul av natriumhydroksyd-løsning (0,1 M) for å heve pH til 7,4. Bland grundig.
- Fjerne en prøve av 1-5 ul for å utføre TLC-analyse ( "utgangspunkt"). Umiddelbart lagre løsningen i en incubator ved 37 ° C og fjerne alikvoter for å utføre TLC-analyse på representative tidspunkter i løpet av 3 timer.
5. Fastsettelse av fordelingskoeffisienten LogD
- Utføre merking fremgangsmåter som beskrevet i avsnitt 2. Til 50 ul av merking oppløsning legge til 20 mL PBS stamoppløsning og 170 ul av natriumhydroksyd-løsning (0,1 M) for å heve pH til 7,4.
- Uttak 200 ul fra den løsningen og sette det inn i en plast V-hetteglass. Tilsett 200 ul av n- oktanol. Lukk flasken og virvle i 2 min. Sentrifuger deretter prøven ved 1600 xg i 5 min.
- Fjern triplicates av 40 ul fra n-oktanol fasen og vannfasen hver og legg dem i egne V-ampuller. Vær forsiktig med å blande lagene.
- Måle aktiviteten av hver prøve i en gammateller godt i 30 sekunder. For hver prøve ble straks gjenta målingen to ganger og derav beregne den midlere aktivitet Ᾱ t t, W1, Ᾱ t, W2 og Ᾱ t, W3 (aktiviteter i vandige prøver) og Ᾱ t, O1, Ᾱ t, O2, Ᾱ t, O3 (aktiviteter i log Pow) sammen med de respektive tidspunkt t av sin besluttsomhet.
- Definerer tidspunktet for målingen av den siste prøven som t 0. Bestem og liste At i min ved å beregne At = tt 0. Utfør forfall korrigering av Ᾱ t, ved hjelp av følgende formel:
Ᾱ 0 = Ᾱ t * 2 (At / 68 min). - Beregn Ᾱ 0, W som gjennomsnittet av Ᾱ 0, W1, Ᾱ 0, W2 og Ᾱ 0, W3 samt Ᾱ 0, O som gjennomsnittet av Ᾱ 0, O1, Ᾱ 0, O2 og Ᾱ 0, O3. Beregn logD ved hjelp av følgende formel:
logD = log [(Ᾱ - Utføre hele eksperimentet i tre paralleller, og beregne gjennomsnittet logD sammen med dens standardavvik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Liganden EOB-DTPA og den ikke-radioaktive Ga (III) kompleks ble analysert via 1H og 13C {1H} NMR-spektroskopi, massespektroskopi og elementanalyse. Resultatene er oppført i Tabell 1 og vist i figurene 1-6 bekrefte renheten av stoffene.
Eluering av 68 Ge / 68 Ga generator ga oppløsninger av 400-600 MBq 68 Ga. De beskrevne merking fremgangsmåte resulterer i dannelse av den ønskede sporstoff 68 Ga [EOB-DTPA], angitt som radio HPLC-topp som utviser en retensjonstid på 2,8 min (figur 7). Sammenligning med retensjonstiden for Ga [EOB-DTPA] standard i UV-vis detektor ved 220 nm (2,7 min, figur 8) bekrefter vellykket merking. Ukoordinert 68 Ga oppdages som radio topp på 2,1 min (Figur7). 68 Ga-merking effektiviteten av EO-BDTPA ble undersøkt ved å bestemme merkings utbytte som en funksjon av ligandkonsentrasjonen via HPLC (figur 9). Utbyttene ble bestemt i triplikat og standard avvik ble beregnet.
Avhengig av pH-verdien og konsentrasjonen av anioner som er tilstede i oppløsning, ukoordinerte eller ikke-merket 68 Ga kan eksistere i forskjellige arter, for eksempel, gallater eller uløselig hydroksyd. 31. Den generaliserte Uttrykket "fri 68 Ga" 32 brukes for alle ikke-merket arter i oppløsning, bortsett fra hydroksyd, som vanligvis er referert til som "kolloidalt 68 Ga". Under de beskrevne analysebetingelsene, beveger seg fritt 68 Ga med løsningsmiddelfronten (Rf = 1,0) på en TLC-plate. Kolloidalt 68 Ga ikke kan oppdages via HPLC, mens på en TLC-plate det ser ut som aktiviteti origo (Rf = 0). Et representativt kromatogram av en TLC-plate analysert med TLC radioaktivitet Skanneren er vist i figur 10. Sporstoff oppviser forskjellig retensjon oppførsel, avhengig av hvorvidt en prøve av merkeløsning (pH 3,8-4,0, Rf = 0,3) eller en prøve av fysiologisk pH (Rf = 0,5) ble analysert.
For å undersøke stabiliteten av spor, fersk merket 68 Ga [EOB-DTPA] ble tilsatt til prøver av fysiologisk pH, inneholdende fortynnet PBS (fosfatkonsentrasjon 5,5 mM, A), overskudd av Apo transferrin (1,6 mg / ml i PBS fortynnet med en fosfatkonsentrasjon på 0,8 mM, B) og humant serum (C), henholdsvis. Over tid ble den radiokjemiske renhet (RCP t) av tracer i prøvene bestemt ved TLC. Prosentandelen av intakte tracer ble beregnet som forholdet mellom RCP t vedde respektive tidspunkter og RCP 0 på startpunktet (tabell 2). Dette var nødvendig på grunn av de merkings oppløsninger som inneholder tracer med forskjellig RCP 0 (93-96%). Den således standardiserte prosentandel av intakte tracer er avbildet som en funksjon av tid i figur 11.
For bestemmelse av logD vandige prøver av tracer i en fortynnet PBS-løsning ble forberedt. Prøvene ble blandet med n-oktanol, sentrifugert og hvorpå prøvene ble fjernet for å bestemme aktivitetskonsentrasjonen i begge faser. Aktivitetsverdier og etterfølgende beregning av logD derav er vist i tabell 3. Den midlere logD verdi er 3,54 ± 0,08.
Figur 1. 1H-NMR-spekteret for EOB-DTPA. < / strong> Spekteret ble registrert i D 2 O på 400,1 MHz. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. 13 C {1 H}-NMR spekteret av EOB-DTPA. Spekteret ble registrert i D 2 O på 100,6 MHz. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. MS for EOB-DTPA (elektrospray ionisering (ESI), metanol, negativ modus).54334fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. 1 H-NMR spekter av Ga [EOB-DTPA]. Spekteret ble registrert i D 2 O på 400,1 MHz. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. 13 C {1 H}-NMR spekter av Ga [EOB-DTPA]. Spekteret ble registrert i D 2 O på 100,6 MHz. Vennligst klikk her e for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6. MS Ga [EOB-DTPA] (ESI, metanol, negativ modus), sammen med en detaljert skildring av isotopen mønster av molekyltopp. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7. Representative HPLC-kromatogram av en prøve av 68 Ga [EOB-DTPA] inneholdende i deler ukoordinerte 68 Ga, opptatt av den radioaktive detektoren. Ukoordinert 68 Ga oppviser en retensjonstid på 2,1 min, mens sporstoffet detekteres ved 2,8 min .target = "_ blank"> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 8. Representant HPLC kromatogram av standard stoffet Ga [EOB-DTPA], som påvises i UV-vis kanal på 220 nm. Oppholdstiden på den kalde standard er 2,7 min. Klikk her for å se en større versjon av denne figur.
Figur 9. Visning av 68 Ga-merking effektiviteten av EOB-DTPA. Merkingen utbytte som bestemt ved HPLC er plottet som en funksjon av konsentrasjonen av EOB-DTPA (22-29 MBq utgangs aktivitet, pH 3,8 til 40,0, 5 min, RT). Standardavviket er avbildet av feilfelt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 10. Representative TLC kromatogram avslørende forskjellige 68 Ga arter. En prøve av 68 Ga [EOB-DTPA] i fortynnet PBS (fosfatkonsentrasjon 5,5 mM, pH = 7,4) ble analysert etter 110 minutters inkubering. Eksemplarisk fordeling av kolloidalt 68 Ga (R f = 0), 68 Ga [EOB-DTPA] (Rf = 0,5) og fri 68 Ga (Rf = 1,0) på en 70 mm TLC-plate som detekteres av en TLC radioaktivitet scanner er presentert. Teller er forfall korrigert. Klikk her for å se et størreversjon av denne figuren.
Figur 11. Stabilitet bestemmelser av 68 Ga [EOB-DTPA] i ulike medier. Forfallet korrigert, standardisert andel av intakte tracer som bestemmes via TLC, er avbildet som en funksjon av tid. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet .
Tabell 1. Resultater av NMR spektroskopi, MS og elementanalyser utført for EOB-DTPA og Ga [EOB-DTPA]. Relative MS peak intensitet er gitt i%, oppdrag til toppene er gitt i klammer. Elemental CHN verdiene var beregn-lert for C 23 H 33 N 3 O 11 · H 2 O (EOB-DTPA) og (NH4) 0,75 H 1,25 [C 23 H 28 Gan 3 O 11] · 2 H 2 O (Ga [EOB-DTPA]).
Tabell 2. Stabilitet bestemmelse av 68 Ga [EOB-DTPA] i forskjellige media. Den RCP på 68 Ga [EOB-DTPA] i media A, B og C ble bestemt ved hjelp av TLC ved gitte tidspunkter. Sammensetningen av prøvene er gitt som prosentandeler i% av sporstoff / fri 68 Ga / kolloidale 68 Ga. Prosentandelen av intakte tracer er standardisert som forholdet mellom RCP t / RCP 0. RCP 0 er den respektive RCP av spor ved t = 0 min.
. Tabell 3. Bestemmelse av logD Råte korrigerte verdier a 0, X i tre porsjoner (x = 1, 2, 3) fjernes fra hver fase (W: vandig, O: n-oktanol) i en prøve. Alle aktiviteter er gitt i CPM. LogD beregnes som beskrevet i kapittel 5 i protokollen. Forsøket ble gjentatt to ganger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
EOB-DTPA er tilgjengelig gjennom en flertrinns syntese 33, men kan like gjerne være isolert fra tilgjengelige kontrastmidler inneholdende gadoxetic syre. For dette formål kan den sentrale Gd (III) -ionet utfelles med et overskudd av oksalsyre. Etter fjerning av Gd (III) oksalat og oksalsyre liganden kan isoleres ved utfelling i kaldt vann ved pH 1,5. Imidlertid, for å forbedre utbytter kolonnekromatografi av filtratet kan utføres i stedet for eller som en oppfølgingsprosedyre. Enten metode gir det analytisk rene ligand i totale utbytter på 70% (figur 1-3, tabell 1).
Vi har funnet at for å isolere Ga [EOB-DTPA] justering av pH med ammoniakkløsning er fordelaktig sammenlignet med bruk av natriumhydroksyd, siden biproduktet ammoniumklorid kan fjernes fra det meget hydrofile rest via sublimering. Under de nevnte betingelsene denne prosessen foregår langsomly. Siden ikke-neglisjerbare mengder av klorid var fremdeles detekterbare etter fem dager, ble det gjenværende saltet ble vasket ut med metanol. Selv om denne opparbeidelsesprosedyren gir delvis tap av Ga [EOB-DTPA], ble produktet erholdt i analytisk renhet med et totalt utbytte på 46% (figur 4-6, tabell 1). For isolering av både EOB-DTPA og dens Ga (III) kompleks, bør bruk av reversfase-kromatografi betraktes som en alternativ metode for rensing, spesielt siden dekomponering av silikagel er sannsynlig ved bruk av sterkt polare oppløsningsmidler.
Merkingen Fremgangsmåte ifølge EOB-DTPA kreves bruk av meget rent løsningsmidler, kjemikalier og metallfritt utstyr for å unngå tilstedeværelse av konkurrerende metallioner, på grunn av 68 Ga er tilstede i nanomolare mengder (2 MBq av 68 Ga i en 1,75 ml prøve tilsvare en nuklide konsentrasjon på 0,14 nM). Merking av EOB-DTPA til 68 Ga skjer ved pH 3,8-4,0 innen fem minutterter ved romtemperatur. Undersøkelser på 68 Ga-merking effektivitet krever bestemmelse av merkingen utbytte samtidig som reaksjonsbetingelser pH, temperatur og reaksjonstid, så vel som å starte aktiviteten av 68 Ga konstant eller på et forsvarlig hold. For hvert datapunkt (dvs. ligandkonsentrasjon) forsøket bør utføres minst tre ganger for å tilveiebringe en rimelig konfidensnivå, ettersom konsentrasjonene av både ligand og 68 Ga er meget lav og merking utbyttet derfor følsom for selv små avvik i reaksjonsbetingelser. For eksempel, som de 68 Ga eluat alder, alikvoter av økende volum må trekkes tilbake for å tilveiebringe en konstant utgangs aktivitet, for derved å kreve økende volumer av buffer. Videre aldring av eluatet fører til økende konsentrasjoner av nedbrytning produkt 68 Zn, som i seg selv kan virke som en konkurrent til 68 Ga, således negativt påvirker labeling effektivitet. 13,34,35 Praktisk talt kvantitativ merking av 22-29 MBq 68 Ga er oppnådd under de ovennevnte betingelser med mengder av EOB-DTPA ≥ 0,7 ug (figur 9), med innholdet av fritt 68 Ga ≤ 2% og omtrent 5 % av kolloidalt 68 Ga til stede i prøvene.
Mens HPLC tilgjengelig overlegen grunnlinje-separasjon av fri 68 Ga og 68 Ga [EOB-DTPA], er det ikke egnet for å detektere kolloidal 68 Ga. Vi har derfor valgt TLC for å bestemme den RCP i løpet av stabilitetsmålinger, karakterisert ved at kvantifisering av transferrin eller proteinbundet 68 Ga var nødvendig. Vi har funnet grunnlinje-separasjon akseptable for dette formål (figur 10); imidlertid, til bruk av størrelseseksklusjonskromatografi eller filtreringsmetoder 15,36 fjerne kolloidale fraksjoner, etterfulgt av HPLC-analyse, kan betraktes som alternativer. Den 68 Ga kompleks viser en sterkere retention på TLC-plater (Rf = 0,3) hvis prøven tas ut direkte fra merking oppløsning i motsetning til prøvene ved fysiologisk pH (Rf = 0,5). Vi foreslår at denne observasjonen kan forklares med ulike protonering tilstander av komplekset.
In vitro stabilitets bestemmelser av 68 Ga sporstoff blir vanligvis utført i PBS 15,17 eller alternative buffersystemer som etterligner den fysiologiske pH 37, så vel som i oppløsninger inneholdende Apo transferrin 37, som er den viktigste konkurrent for 68 Ga i blod, eller i humant serum 15,17. I våre eksperimenter var nødvendig tilsetning av 0,1 M natriumhydroksyd-løsning til PBS for å justere pH av prøvene til 7,4. Vi kunne ikke hevde at fosfatkonsentrasjonen påvirker nedbrytningshastigheten, siden stabilitetseksperimenter i oppløsninger av varierende fosfatkonsentrasjon (0,8 mM og 5,5 mM (A)) ga ikke-reproduCIBLE resultater. Men vi fant at en løsning B, som inneholder apo -transferrin (1,6 mg / ml, som er innenfor rekkevidde av den normale plasma innhold 38) og 0,8 mM fosfat (menneskeblod vanligvis viser en fosfatnivå 0,8-1,5 mm 39,40 ), fører til dekomponering ved en hastighet sammenlignbar med den som observeres i humanserum (C). Oppløsnings AC, etter 185 minutter ble innholdet av kolloidalt 68 Ga hadde økt med omtrent 24%, mens innholdet av frie 68 Ga hadde øket med 11% i oppløsning A, 17% i oppløsning B og 27% i oppløsning C (tabell 2 ). Det faktum at 68 Ga dannet av tracer dekomponering er hovedsakelig til stede som fri 68 Ga i motsetning til kolloidale eller protein-bundet 68 Ga i B og C kan være på grunn transferrinmetning eller forholdsvis langsomme transferrin binding priser.
For å forutsi et sporstoff vev distribusjon n- oktanol / vann-koeffisienter loggP eller fordelings koeffisienter logD kan bestemmes som forholdet mellom aktivitet konsentrasjonene i de to faser. Ved definisjon betyr logD parameter ikke skille mellom ulike arter som er tilstede i et medium, som gjør den egnet for våre eksperimenter på grunn av muligheten for forskjellige protonering tilstander av sporstoffet så vel som dets nedbrytning i den vandige fase. For å bestemme logD ved ekstraksjon det vandige medium er vanligvis bufret med PBS for å etterligne blod forhold. 17,43-45 For nevnte grunner som vi anvendte fortynnede PBS, som oppviser en fosfatkonsentrasjon på 0,8 mM og fysiologisk pH. Etter ekstraksjon med n-oktanol og sentrifugering, fjerning av flere aliquoter fra samme fase gjør det mulig for unøyaktigheter forårsaket ved pipettering for å bli redusert. På grunn av den svært lave aktivitetskonsentrasjoner i log Pow man bør være forsiktig for å unngå krysskontaminering med vannfasen og sikre kvantitative overføring til en egen hetteglass. Distribution koeffisientene bestemmes av denne prosedyren var reproduserbar, og mens de tillater for en grov estimering av lipofilisitet, er ikke det mulig med en direkte sammenligning til en logP Gd [EOB-DTPA]. På grunn av spesifisiteten av Gd [EOB-DTPA] resulterer ikke primært fra lipofilisitet men snarere dets hepatobiliære opptaks ytterligere forsøk i levende individer eller celler, ville det være nødvendig å tilveiebringe mer omfattende informasjon om biofordelingen samt stabilitet in vivo av 68 Ga [EOB -DTPA]. Til sammen et program som avbildnings agent for perfusjon og tidlig hepatobiliær fase er tenkelig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| primovist | Bayer | - | 0.25 M |
| gallium(III) chloride | Sigma-Aldrich Co. | 450898 | |
| water (deionized) | - | - | tap water deionizing equipment by Auma-Tec GmbH |
| hydrochloric acid 12 M | VWR | 20252.29 | |
| sodium hydroxide | Polskie Odczynniki Chemiczne S.A. | 810925429 | |
| oxalic acid | Sigma-Aldrich Co. | 75688 | |
| ethyl acetate | Brenntag GmbH | 10010447 | |
| silica gel | Merck KGaA | 1.10832.9025 | Geduran Si 60 0.063-0.2 mm |
| TLC silica gel 60 F254 | Merck KGaA | 1.16834.0001 | |
| methanol | VWR | 20903.55 | |
| ethanol | Brenntag GmbH | 10018366 | |
| eiethylether | VWR | 23807.468 | stored over KOH plates |
| ammonia solution (25%) | VWR | 1133.1 | |
| pH electrode | VWR | 662-1657 | |
| stirring and heating unit | Heidolph | 505-20000-00 | |
| pump | Ilmvac GmbH | 322002 | |
| frit | - | custom design | |
| NMR spectrometer | Bruker Coorporation | - | Ultra Shield 400 |
| mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific Inc. | - | |
| elemental analyser | Hekatech GmbH Analysentechnik | - | EuroVector EA 3000 CHNS |
| deuterated water D2O | euriso-top | D214 | 99.90% D |
| Material/Equipment required for labeling procedures | |||
| 68Ge/68Ga generator | ITG Isotope Technologies Garching GmbH | A150 | |
| pump and dispenser system | Scintomics GmbH | - | Variosystem |
| hydrochloric acid 30% (suprapur) | Merck KGaA | 1.00318.1000 | |
| water (ultrapur) | Merck KGaA | 1.01262.1000 | |
| sodium chloride (suprapur) | Merck KGaA | 1.06406.0500 | |
| sodium acetate (suprapur) | Merck KGaA | 1.06264.0050 | |
| glacial acetic acid (suprapur) | Merck KGaA | 1.00066.0250 | |
| sodium citrate dihydrate | VEB Laborchemie Apolda | 10782 | >98.5% |
| PS-H+ Cartridge (S) | Macherey-Nagel | 731867 | Chromafix |
| apo-Transferrin | Sigma-Aldrich Co. | T2036 | |
| PBS buffer (tablets) | Sigma-Aldrich Co. | 79382 | |
| human serum | Sigma-Aldrich Co. | H4522 | from human male AB plasma |
| flasks, columns, etc. | custom design | ||
| pH electrode | Knick Elektronische Messgeräte GmbH & Co. KG | 765-Set | |
| binary pump (HPLC) | Hewlett-Packard | G1312A (HP 1100) | |
| UV Vis detector (HPLC) | Hewlett-Packard | G1315A (HP 1100) | |
| radioactive detector (HPLC) | EGRC Berthold | ||
| HPLC C-18-PFP column | Advanced Chromatography Technologies Ltd. | ACE-1110-1503/A100528 | |
| HPLC glass vials | GTG Glastechnik Graefenroda GmbH | 8004-HP-H/i3µ | |
| pipette | Eppendorf | - | |
| plastic vials | Sarstedt AG & Co. | 6542.007 | |
| plastic vials | Greiner Bio-One International GmbH | 717201 | |
| activimeter | MED Nuklear-Medizintechnik Dresden GmbH | - | Isomed 2010 |
| tweezers | custom design | ||
| incubator | Heraeus Instruments GmbH | 51008815 | |
| vortex mixer | Fisons | - | Whirlimixer |
| centrifuge | Heraeus Instruments GmbH | 75003360 | |
| gamma well counter | MED Nuklear-Medizintechnik Dresden GmbH | - | Isomed 2100 |
| water for chromatography | Merck KGaA | 1.15333.2500 | |
| acetonitrile for chromatography | Merck KGaA | 1.00030.2500 | |
| trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | 91707 | |
| TLC radioactivity scanner | raytest Isotopenmessgeräte GmbH | B00003875 | equipped with beta plastic detector |
References
- Weinmann, H. J., et al. A new lipophilic gadolinium chelate as a tissue-specific contrast medium for MRI. Magn. Reson. Med. 22, 233-237 (1991).
- Stroszczynski, C., et al. Aktueller Stand der MRT-Diagnostik mit leberspezifischen Kontrastmitteln. Radiologe. 44, 1185 (2004).
- Van Beers, B. E., Pastor, C. M., Hussain, H. K. Primovist, Eovist - what to expect. J. Hepatol. 57, 421-429 (2012).
- Zech, C. J., Herrmann, K. A., Reiser, M. F., Schoenberg, S. O. MR Imaging in Patients with Suspected Liver Metastases: Value of Liver-specific Contrast Agent Gd-EOB-DTPA. Magn. Reson. Med. Sci. 6, 43-52 (2007).
- Leonhardt, M., et al. Hepatic Uptake of the Magnetic Resonance Imaging Contrast Agent Gd-EOB-DTPA: Role of Human Organic Anion Transporters. Drug Metab. Dispos. 38, 1024-1028 (2010).
- Wadas, T. J., Wong, E. H., Weisman, G. R., Anderson, C. Coordinating Radiometals of Copper, Gallium, Indium, Yttrium, and Zirconium for PET and SPECT Imaging of Disease. J. Chem. Rev. 110, 2858-2902 (2010).
- Ametamey, S. M., Honer, M., Schubiger, P. A. Molecular Imaging with PET. Chem. Rev. 108, 1501-1516 (2008).
- Cutler, C. S., Hennkens, H. M., Sisay, N., Huclier-Markai, S., Jurisson, S. S. Radiometals for Combined Imaging and Therapy. Chem. Rev. 113, 858-883 (2013).
- Henze, M., et al. PET Imaging of Somatostatin Receptors Using [68GA]DOTA-D-Phe1-Tyr3-Octreotide: First Results in Patients with Meningiomas. J. Nucl. Med. 42, 1053-1056 (2001).
- Hofmann, M., et al. Biokinetics and imaging with the somatostatin receptor PET radioligand 68Ga-DOTATOC: preliminary data. Eur. J. Nucl. Med. 28, 1751-1757 (2001).
- Blau, M., Nagler, W., Bender, M. A. Fluorine-18: a new isotope for bone scanning. J. Nucl. Med. 3, 332-334 (1962).
- Green, M. A., Welch, M. J. Gallium Radiopharmaceutical Chemistry. Int. J. Radiat. Appl. Instrum. B. 16, 435-448 (1989).
- Rösch, F. Past, present and future of 68Ge/68Ga generators. Appl. Radiat. Isot. 76, 24-30 (2013).
- Liu, S. The role of coordination chemistry in the development of target-specific radiopharmaceuticals. Chem. Soc. Rev. 33, 445-461 (2004).
- Haubner, R., et al. Development of (68)Ga-labelled DTPA galactosyl human serum albumin for liver function imaging. Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging. 40 (68), 1245-1255 (2013).
- Yang, W., Zhang, X., Liu, Y. Asialoglycoprotein Receptor-Targeted Radiopharmaceuticals for Measurement of Liver Function. Curr. Med. Chem. 21, 4-23 (2014).
- Chauhan, K., et al. 68Ga based probe for Alzheimer's disease: synthesis and preclinical evaluation of homodimeric chalcone in β-amyloid imaging. Org. Biomol. Chem. 12, 7328-7337 (2014).
- Chakravarty, R., Chakraborty, S., Dash, A., Pillai, M. R. A. Detailed evaluation on the effect of metal ion impurities on complexation of generator eluted 68Ga with different bifunctional chelators. Nucl. Med. Biol. 40, 197-205 (2013).
- Clevette, D. J., Orvig, C. Comparison of ligands of differing denticity and basicity for the in vivo chelation of aluminum and gallium. Polyhedron. 9, 151-161 (1990).
- Prinsen, K., et al. Development and evaluation of a 68Ga labeled pamoic acid derivative for in vivo visualization of necrosis using positron emission tomography. Bioorg. Med. Chem. 18, 5274-5281 (2010).
- Vogl, T. J., et al. Liver tumors: comparison of MR imaging with Gd-EOB-DTPA and Gd-DTPA. Radiology. 200, 59-67 (1996).
- Reimer, P., et al. Phase II clinical evaluation of Gd-EOB-DTPA: dose, safety aspects, and pulse sequence. Radiology. , 177-183 (1996).
- Ba-Ssalamah, A., et al. MRT der Leber. Radiologe. 44, 1170-1184 (2004).
- Scott, R. P. W. Journal of Chromatography Library. 22A, Elsevier Scientific Publishing Co. A137-A160 (1983).
- Reichenbaecher, M., Popp, J. Strukturanalytik organischer und anorganischer Verbindungen. , 1st, B. G. Teubner Verlag. Wiesbaden. (2007).
- Gross, J. H. Mass Spectrometry: A Textbook. , Springer. (2004).
- Ma, T. S., Rittner, R. C. Modern Organic Elemental Analysis. , Marcel Dekker, Inc. (1979).
- Mueller, D., et al. Simplified NaCl Based 68Ga Concentration and Labeling Procedure for Rapid Synthesis of 68Ga Radiopharmaceuticals in High Radiochemical Purity. Bioconjugate Chem. 23, 1712-1717 (2012).
- Roberts, T. R. Radio-column chromatography. Journal of Chromatography Library. 14, 103-132 (1978).
- Roberts, T. R. Radio-thin-layer chromatography. Journal of Chromatography Library. 14, 45-83 (1978).
- Green, M. A., Welch, M. J. Gallium radiopharmaceutical chemistry. Nucl. Med. Biol. 16, 435-448 (1989).
- Notni, J., Plutnar, J., Wester, H. J. Bone-seeking TRAP conjugates: surprising observations and their implications on the development of gallium-68-labeled bisphosphonates. EJNMMI Res. 2, 13 (2012).
- Schmitt-Willich, H., et al. Synthesis and Physicochemical Characterization of a New Gadolinium Chelate: The Liver-Specific Magnetic Resonance Imaging Contrast Agent Gd-EOB-DTPA. Inorg. Chem. 38, 1134-1144 (1999).
- 68Ga generator for positron emission tomography. Zhernosekov, K., Nikula, T. , DE102010037964B3 (2012).
- Simecek, J., Hermann, P., Wester, H. J., Notni, J. How is 68Ga Labeling of Macrocyclic Chelators Influenced by Metal Ion Contaminants in 68Ge/68Ga Generator Eluates? ChemMedChem. 8, 95-103 (2013).
- Baur, B., et al. Synthesis, Radiolabelling and In Vitro Characterization of the Gallium-68-, Yttrium-90- and Lutetium-177-Labelled PSMA Ligand, CHX-A''-DTPA-DUPA-Pep. Pharmaceuticals (Basel). 7, 517-529 (2014).
- Boros, E., et al. RGD conjugates of the H2dedpa scaffold: synthesis, labeling and imaging with 68Ga. Nucl. Med. Biol. 39, 785-794 (2012).
- Beck, W. S. Hematology. , 5th, MIT press. Cambridge, Massachusetts. (1998).
- Patel, V., Morrissey, J. Practical and Professional Clinical Skills. , 1, Oxford University Press Inc. New York. (2001).
- Bartke, A., Constanti, A. Basic Endocrinology. , 1, CRC Press. (1998).
- Bernstein, L. R. Mechanisms of Therapeutic Activity for Gallium. Pharmacol. Rev. 50, 665-682 (1998).
- Clausen, J., Edeling, C. J., Fogh, J. 67Ga Binding to Human Serum Proteins and Tumor Components. Cancer Res. 34, 1931-1937 (1974).
- Dumont, R. A., et al. Novel 64Cu- and 68Ga-Labeled RGD conjugates show improved PET imaging of αvβ3 integrin expression and facile radiosynthesis [Erratum to document cited in CA156:116856. J. Nucl. Med. 52, 1498 (2011).
- Pohle, K., et al. 68Ga-NODAGA-RGD is a suitable substitute for 18F-Galacto-RGD and can be produced with high specific activity in a cGMP/GRP compliant automated process. Nucl. Med. Biol. 39, 777-784 (2012).
- Notni, J., Pohle, K., Wester, H. J. Be spoilt for choice with radiolabelled RGD peptides: Preclinical evaluation of 68 Ga-TRAP(RGD)3. Nucl. Med. Biol. 40, 33-41 (2013).
