Summary
Процедура выделения EOB-DTPA и последующего комплексообразования с природным Ga (III) и 68 Ga представлено в настоящем документе, а также тщательного анализа всех соединений и исследований по эффективности мечения, стабильность ин витро и н - октанол / вода коэффициент распределения радиоактивно меченого комплекса.
Abstract
Демонстрируется способ выделения EOB-DTPA (3,6,9-триаза-3,6,9-трис (карбоксиметил) -4- (этоксибензил) -undecanedioic кислоты) от своего Б-га (III) комплекса и протоколы подготовка его нового нерадиоактивного, то есть природный Ga (III) , а также радиоактивный 68 комплекса Ga. В качестве лиганда, а также Ga (III) , комплекс характеризовались ядерного магнитного резонанса (ЯМР), масс - спектрометрии и элементного анализа. 68 Ga был получен стандартным методом элюции из / 68 генератора 68 Ge Ga. Эксперименты по оценке эффективности 68 Ga-маркировка EOB-DTPA при рН 3,8-4,0 были выполнены. Установлено методы анализа радио ТСХ (тонкослойная хроматография) и радио-ВЭЖХ (высокоэффективной жидкостной хроматографии), были использованы для определения радиохимической чистоты индикаторного. В первом исследовании липофильности 68 Ga трассеры 'п- октанол / вода distributioп коэффициент 68 видов Ga , присутствующих в растворе , рН 7,4 определяли методом экстракции. В пробирке измерения устойчивости трейсера в различных средах при физиологических рН были выполнены, выявляя различные скорости разложения.
Introduction
Gadoxetic кислота, общее название для комплекса Gd (III) лиганда EOB-DTPA 1, является часто используемым контрастное вещество в гепатобилиарной магнитно - резонансной томографии (МРТ). 2,3 Из - за его специфического поглощения гепатоцитами печени и высокий процент гепатобилиарной экскреции она позволяет локализацию очаговых поражений и опухолей печени. 2-5 Однако, некоторые ограничения метода МРТ (например, токсичность контрастных агентов, ограниченная применимость у пациентов с клаустрофобии или металлическими имплантатами) требуют альтернативного диагностического прибора ,
Позитронно - эмиссионной томографии (ПЭТ) является методом молекулярной визуализации, в котором небольшое количество радиоактивного вещества (индикаторного) администрирована, при котором его распределение в организме записывается с помощью сканера ПЭТ. 6 ПЭТ представляет собой динамический метод , который позволяет для высокого пространственное и временное разрешение изображений, а также количественная оценка результатов, без необходимостииметь дело с побочными эффектами МРТ контрастных агентов. Информативность полученной метаболической информации может быть дополнительно увеличена путем комбинации с анатомическими данными, полученными от дополнительных методов визуализации, так как чаще всего достигается за счет гибридной визуализации с компьютерной томографии (КТ) в сканерах ПЭТ / КТ.
Химическая структура трассера подходящей для ПЭТ должен включать радиоактивный изотоп, служащий в качестве позитронного эмиттера. Позитроны имеют короткий срок службы, так как они почти сразу аннигилируют с электронами атома оболочек окружающих тканей. При аннигиляции двух гамма - фотонов 511 кэВ , с противоположным направлением движения излучаются, которые записаны с помощью сканера ПЭТ. 7,8 Сформировать Tracer, ПЭТ нуклиды может быть ковалентно связана с молекулой, как это происходит в 2-дезокси 2- [18 F] fluoroglucose (ФДГ), наиболее широко используется ПЭТ трассирующими. 7 Тем не менее, нуклид может также образовывать координирующие связями с одним или несколькими лигандами (например ,, [68 Ga] -DOTATOC 9,10) или применяться в качестве растворенных неорганических солей (например, [18 F] фторид натрия 11). В целом, структура трейсера имеет решающее значение, поскольку он определяет его биораспределении, метаболизм и экскрецию поведение.
Подходящий ПЭТ нуклид должен сочетать в себе благоприятные характеристики, как удобный энергии позитронов и доступности, а также период полураспада адекватной для предполагаемого исследования. 68 Ga нуклидов стала важной силой в области ПЭТ в течение последних двух десятилетий. 12,13 Это происходит главным образом из - за своей доступности через систему генератора, что позволяет на месте маркировки независимо от близости от циклотрона. В генераторе, мать нуклида 68 Ge поглощается на колонке , из которой дочерний нуклид 68 Ga элюируют , а затем меченым к соответствующему хелатор. 6,14 Поскольку 68 Ga нуклид существует как тривиальныйлор катион, как и Gd (III) 10,13, хелатирующие EOB-DTPA с 68 Ga , а не даст комплекс с тем же самым общим отрицательным зарядом как gadoxetic кислоты. Соответственно, что 68 Ga трейсер может сочетать подобную характерную специфичность печени с пригодности для ПЭТ - визуализации. Хотя gadoxetic кислота покупается и вводят в виде динатриевой соли, в следующем контексте мы будем называть его Б - га [EOB-DTPA] и к комплексу нерадиоактивного Ga (III) в качестве Ga [EOB-DTPA], или 68 Ga [ EOB-DTPA] в случае радиоактивно меченого компонента для удобства.
Для того, чтобы оценить их применимость в качестве индикаторов для ПЭТ, радиоактивные металлические комплексы должны быть рассмотрены широко в в пробирке, в естественных условиях или экспериментов бывших естественных условиях в первую очередь. Для того, чтобы определить пригодность для соответствующей медицинской проблемы, различные индикаторные характеристики, такие как поведение биораспределения и профиль зазора, стабильности, органной специфичности и клетки или Tissuе поглощение должны быть исследованы. Из - за их неинвазивный характер, определения в пробирке часто выполняются до экспериментов в естественных условиях. Общепризнанно , что ДТПА и его производные имеют ограниченную пригодность как энтеросорбенты 68 Ga из - за этих комплексов , не имеющих кинетическую инертность, что приводит к сравнительно быстрому разложению при введении в естественных условиях. 14-20 Это в первую очередь вызвано апо- трансферрина , действующей в качестве конкурентом 68 Ga в плазме. Тем не менее, мы исследовали этот новый трейсер относительно его возможного применения в гепатобилиарной визуализации, в котором диагностическая информация может быть предоставлена в течение нескольких минут после инъекции 3,4,21-23, таким образом , не обязательно требует долгосрочной стабильности копира. Для этого мы выделили EOB-DTPA из gadoxetic кислоты и первоначально проводили комплексообразование с натуральным Ga (III), который существует в виде смеси двух стабильных изотопов, 69 Ga и 71 68 Ga. Мы использовали установленные методы и одновременно оценивали их пригодность для определения эффективности 68 Galabeling из EOB-DTPA и исследовать липофильности нового 68 Ga трассирующими и его устойчивость в различных средах.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Получение EOB-DTPA и Ga [EOB-DTPA]
Внимание: Пожалуйста, обратитесь все соответствующие паспорта безопасности материала (MSDS) от используемых органических растворителей, кислот и щелочей перед использованием. Выполните все шаги в вытяжном шкафу и использовать средства индивидуальной защиты (защитные очки, перчатки, лабораторный халат).
- Выделение EOB-DTPA из gadoxetic кислоты
- Поместите 3 мл 0,25 М раствора для инъекций gadoxetic кислоты в колбу. Добавить 500 мг (5,6 ммоль) щавелевой кислоты к раствору при перемешивании.
- После перемешивания в течение 1 ч, Суспензию фильтруют через пористый фильтр с использованием пониженного давления. Промыть остатков трижды с 3 мл воды, соответственно.
- Объединяют водные фильтраты и оснащать раствора с рН электрода. Добавьте 12 М соляной кислоты к фильтрату до тех пор пока рН не достигнет примерно -0,1.
- Растворитель удаляют в вакууме с получением бесцветного осадка. Хранить в атмосфере инертного газа.
- Промывают остаток тщательно (по крайней мере, трираз) с этилацетатом, чтобы удалить избыток щавелевой кислоты. Высушивают остаток в вакууме.
- Повторно растворить остаток в 2 мл воды при комнатной температуре, а затем охлаждают с получением раствора на бане со льдом. Без снятия ванны со льдом, добавьте 0,5 по каплям водный раствор гидроксида натрия М до образования бесцветного твердого вещества клейкий наблюдается.
- Удалите воду с помощью декантации. Промывать твердый еще два раза с 1 мл холодной воды. Сушат твердое вещество в вакууме с получением указанного в первую фракцию продукта.
- Изолировать вторую фракцию продукта из объединенных фракций сливают воды методом колоночной хроматографии (силикагель, метанол / вода 4/1). 24 Растворитель удаляют в вакууме.
- Если полученный таким образом твердый не чисто белый, растворяться его в 1 мл воды, добавляют 10 мл этанола и затем 10 мл диэтилового эфира, чтобы осадить продукт. Смесь фильтруют через пористый фильтр с использованием пониженного давления и сушат в вакууме.
- скомбинироватьоба твердые фракции EOB-DTPA и проводить ЯМР - спектроскопические, 25 масс - спектрометрического 26 и элементный 27 анализов.
- Синтез Ga [EOB-DTPA]
ВНИМАНИЕ: твердый Ga (III) хлорид Хранить в сухом инертной атмосфере, так как при контакте с воздухом, влагой или разложения смазки происходит, в результате чего в агрессивных паров и образование желтого, коричневого или черного цвета примесей.- Приготовьте 0,11 М маточного раствора путем растворения 1,94 г (11,0 ммоль) Ga (III) хлорида в 100 мл воды. Развести 1 мл 25% -ного водного раствора аммиака с 4 мл воды.
- Растворите 80 мг (0,15 ммоль) EOB-DTPA в колбу в 10 мл воды. При необходимости нагреть растворитель, чтобы достичь полного растворения.
- Добавить 1,4 мл (0,15 ммоль) Ga (III) хлорида раствор. Оборудуйте колбу с мешалкой и рН-электродом. Добавьте по каплям водный раствор разбавленного нашатырного спирта до тех пор пока рН раствора не составляет приблизительно 4,1. Перемешивают при ротемпература О.М. в течение 30 мин.
- Растворитель удаляют в вакууме. Поместите остаток в колбе, снабженный stillhead с центральным и параллельной боковой шеи. Оборудуйте центральную шею с охлаждающим пальцем и боковой шеи с выходом вакуумного насоса
- Нагреть остатка при пониженном давлении (125 & deg; С, 0,6 мбар). Периодически удалять сублимированный хлорид аммония (видимый в виде белого покрытия поверхности стекла) от охлаждающего пальца и до сих пор головы, а также из верхних частей колбы со слегка влажной тканью. Продолжайте процесс до тех пор, пока не видно формирование нового возгона.
- Для удаления последних следов хлористого аммония моют Остаток трижды с 0,5 мл гор чего метанола, соответственно. Сушат бесцветный остаток в вакууме. Выполнение ЯМР - спектроскопические, 25 масс - спектрометрического 26 и 27 элементарного анализа.
2. Общая процедура маркировки
ВНИМАНИЕ: Все ехрименты в том числе прямой или косвенный контакт с радиоактивными веществами должны проводиться только квалифицированным персоналом. Пожалуйста, используйте соответствующее оборудование экранирования. Собрать любые радиоактивные отходы отдельно и хранить и утилизировать в соответствии с действующими правилами.
- Вымывание генератора
Использовали 40 мКи 68 Ge / 68 Ga генератор с матерью нуклида связаны как оксид на додецил-3,4,5-trihydroxybenzoate кремнезема: Примечание. После элюирования и очистка может быть выполнена вручную или, как это имело место в этой процедуре, в качестве комбинированного автоматизированного процесса с использованием перистальтического насоса и блок дозатора.- Готовят растворы 5,5 М, 1,0 М и 0,05 М соляной кислоты. Готовят раствор 5,0 М хлорида натрия, содержащего 25 мкл 5,5 М соляной кислоты на мл. Приготовьте буферный раствор с рН 4,6, комбинируя 4,1 г ацетата натрия, 1 мл HCl (30%) и 2,5 мл ледяной уксусной кислоты и разбавление смеси с водой до объема 50 мл.
- Precondition PS-H + картридж смыв медленно с 1 мл 1,0 М соляной кислоты и затем 5 мл воды.
- Элюируют колонку диоксида кремния генератора с 4 мл 0,05 М HCl. 12 Нагрузка 68 Ga элюата на PS-H + картридж.
- Промыть картридж с 5 мл воды, а затем высушить его с помощью 5 мл воздуха. Элюируют 68 Ga из картриджа с 1 мл 5,0 М подкисленный раствор хлорида натрия. 28
- Маркировку EOB-DTPA с 68 Ga
- Растворите 1 мг (1,9 мкмоль) EOB-DTPA в 1 мл воды. Из этого раствора принимают по 100 мкл (0,19 мкмоль) и разбавить их с 9,9 мл воды для приготовления 19 мкМ (10 мкг / мл) исходного раствора EOB-DTPA.
- Удалить 50 мкл ( что эквивалентно 22-29 МБк) раствора , содержащего 68 Ga и помещают в пробирку. Добавляют 50 мкл (0,5 мкг) в 19 мМ исходного раствора EOB-DTPA и 300 мкл Oе буфера для повышения рН до 4,0. Кратко взболтать и инкубировать раствор при комнатной температуре в течение 5 мин. Удалить аликвоту 1-5 мкл и положить ВЭЖХ или ТСХ-анализа.
- Выполнить анализ радио ВЭЖХ на обращенной фазе (RP) С18 колонка 29 Используйте следующую подвижная фаза:. А - вода / трифторуксусна кислота (99,9% / 0,1%), B - ацетонитрил / трифторуксусна кислота (99,9% / 0,1%), градиент : 06 мин 80% А → 0% А (0,5 мл / мин), 610 мин 0% A (0,5 мл / мин).
- Определение интенсивностей пиков ВЭЖХ радио сигналов, как площадь под кривой. Рассчитывают выход маркировке радиохимической чистоты (RCP) индикаторного следующим образом:
RCP = A Ga-EOB-DTPA / (A + A Ga Ga-EOB-DTPA) ∙ 100%
ОЛ-EOB-DTPA: площадь под кривой 68 Ga [EOB-DTPA]
ОЛ: площадь под кривой свободного 68 Ga
3. Этикетировочное Эффективность
- Выполните процедуры маркировки, как описаноd в разделе 2. Используйте последовательный диапазон начиная активности 68 Ga элюата, например, 22-29 МБк (40-140 мкл, в зависимости от свежести элюата).
- Добавьте необходимое количество буферного раствора для доведения рН до 3,8-4,0 (40-190 мкл, в зависимости от объема 68 Ga элюата). Добавьте необходимое количество лиганда исходного раствора (10-70 мкл 19 мМ раствора).
- Добавьте необходимое количество воды, чтобы регулировать общую громкость каждой маркировки зонда до 1,75 мл. Тщательно перемешать и дать образец постоять в течение 5 мин при комнатной температуре. Выполнить анализ ВЭЖХ, как описано в разделе 2, чтобы определить выход маркировки.
- Выполните процедуры маркировки с количествами лиганда от 0,1 мкг до 0,7 мкг с шагом 0,1 мкг. Выполнение экспериментов в трех экземплярах для каждой концентрации лиганда. Вычислить среднее доходность и стандартное отклонение.
4. В Vitro стабильности
- Общие рrocedure и препараты
- Растворите таблетку фосфатно-буферного раствора (PBS) в 200 мл деионизированной воды, чтобы приготовить исходный раствор, PBS с концентрацией фосфата 10 мМ.
- Выполните маркировку 22-29 МБк 68 Ga с 0,5 мкл EOB-DTPA маточного раствора, как описано в разделе 2. В зависимости от объема 68 Ga элюата, регулировать количество буфера, как это описано в разделе 3. Вывод образцы этикетирование раствор, содержащий 6-12 МБк трассера для выполнения измерений стабильности.
- Выполните радио ТСХ - анализ на 80 мм силикагеля покрытием алюминиевых пластин с использованием 0,1 М водного раствора цитрата натрия в качестве элюента и анализируют пластины с радиоактивной сканера TLC. 30 Определение интенсивности сигналов ТСХ , как площадь под кривой. Вычислить RCP индикаторного следующим образом:
RCP = A Ga-EOB-DTPA / (A Ga-Free + A Ga-EOB-DTPA + A Ga-коллоидный) ∙ 100%
ОЛ-EOB-DTPA: площадь под кривой 68 Ga [EOB-DTPA]
ОЛ-бесплатно: площадь под кривой свободного 68 Ga
ОЛ-коллоидного: площадь под кривой коллоидного 68 Ga - Вычислить RCP т / RCP 0 для каждой временной точки. Постройте таким образом стандартизированный RCP против разницы во времени с момента начальной точки Т = 0 мин.
RCP т = RCP 68 Ga [EOB-DTPA] в момент времени т.
RCP 0 = RCP 68 Ga [EOB-DTPA] при Т = 0 мин.
- Стабильность в фосфатно - солевом буфере (А)
- К 65 мкл раствора мечения добавляют 150 мкл PBS раствора и 60 мкл раствора гидроксида натрия (0,1 М) для повышения рН до 7,4. Тщательно перемешать.
- Аликвоту 1-5 мкл для проведения анализа ТСХ ( «начальная точка»). Сразу же хранить раствор в термостате при температуре 37 ° С и удалить аликвот для проведения анализа тонкослойной хроматографии при представлятьтельной моменты времени в течение 3 часов.
- Устойчивость по отношению к сверх апо -transferrin в PBS (В)
- К 120 мкл раствора мечения добавляют 50 мкл PBS раствора и 430 мкл раствора гидроксида натрия (0,1 М) для повышения рН до 7,4. Добавьте 40 мкл раствора апо -transferrin (25 мг / мл). Тщательно перемешать.
- Аликвоту 1-5 мкл для проведения анализа ТСХ ( «начальная точка»). Сразу же хранить раствор в термостате при температуре 37 ° С и удалить аликвот для проведения анализа тонкослойной хроматографии при репрезентативных точках времени, в течение 3 ч.
- Стабильность в сыворотке крови человека (С)
- К 500 мкл сыворотки крови человека добавляют 25 мкл раствора мечения и 45 мкл раствора гидроксида натрия (0,1 М) для повышения рН до 7,4. Тщательно перемешать.
- Аликвоту 1-5 мкл для проведения анализа ТСХ ( «начальная точка»). Немедленно хранить раствор в INCUBator при температуре 37 ° C и удалить аликвот для проведения анализа тонкослойной хроматографии при репрезентативных точках времени, в течение 3 ч.
5. Определение коэффициента распределения LogD
- Выполните процедуры маркировки, как описано в разделе 2. К 50 мкл раствора мечения добавляют 20 мкл PBS раствора и 170 мкл раствора гидроксида натрия (0,1 М) для повышения рН до 7,4.
- Вывод 200 мкл из этого раствора и поместить его в пластиковый V-флакон. Добавьте 200 мкл н - октанол. Закройте флакон и вихрь в течение 2 мин. Затем центрифугирование образца при 1600 х г в течение 5 мин.
- Удалить утраивает из 40 мкл из фазы н октанол и водную фазу каждого и поместить их в отдельные V-флаконах. Будьте осторожны, чтобы не перепутать слои.
- Измерьте активность каждого образца в счетчике гамма также в течение 30 сек. Для каждого образца немедленно повторите измерение дважды и его вычислить среднюю активность альфа т т а, W1, а т, W2 и а т, W3 (деятельность в водных пробах) и а т, O1, а т, O2, а т, O3 (деятельность в п - октанола) вместе с соответствующими момент времени т их определения.
- Определить момент времени измерения последнего образца при T 0. Определить и перечислить & Delta ; t в мин путем вычисления DT = TT 0. Выполнить коррекцию затухания Л Т, с использованием следующей формулы:
Ᾱ 0 = Ᾱ т · 2 (t / 68 мин). - Вычислить 0, а W как среднее Ᾱ 0, W1, Ᾱ 0, W2 и Ᾱ 0, W3 , а также Ᾱ 0, О как среднее Ᾱ 0, О1, Ᾱ 0, O2 и Ᾱ 0, О3. Вычислить logD по следующей формуле:
logD = журнал [(Ᾱ - Выполнить весь эксперимент в трех экземплярах и вычислить среднее logD вместе со своим стандартным отклонением.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В качестве лиганда используют EOB-DTPA и нерадиоактивных Ga (III) , комплекс анализировали с помощью 1 Н и 13 С {1 Н} ЯМР - спектроскопии, масс - спектрометрии и элементного анализа. Результаты , приведенные в таблице 1 и показанные на фиг.1-6 проверить чистоту веществ.
Вымывание генератора 68 Ge / 68 Ga получали решения 400-600 МБк 68 Ga. Описанные результаты процедуры маркировки в образовании желаемого Tracer 68 Ga [EOB-DTPA], указывается как пик радио ВЭЖХ , проявляющего время удерживания 2,8 мин (рисунок 7). Сравнение с временем удерживания стандарта Ga [EOB-DTPA] в детекторе UV-VIS при длине волны 220 нм (2,7 мин, рис 8) подтверждает успешную маркировку. Нескоординированное 68 Ga определяется как пик радио на 2,1 мин (рис7). Эффективность 68 Ga-мечение ЭО-BDTPA исследовали путем определения выхода этикетированию в зависимости от концентрации лиганда с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (рисунок 9). Выходы были определены в трех экземплярах и были рассчитаны стандартные отклонения.
В зависимости от величины рН и концентрации анионов , присутствующих в растворе, несогласованных или немеченого 68 Ga , могут существовать в различных видах, например, галлатах или нерастворимые гидроокиси. 31 Обобщенный термин "свободный 68 Ga" 32 используется для всех не меченных частиц в растворе , за исключением гидроксида, который обычно называют "коллоидный 68 Ga". При описанных условиях анализа, свободный 68 Ga движется с фронтом растворителя (R F = 1,0) на пластине ТСХ. Коллоидный 68 Ga не может быть обнаружен с помощью ВЭЖХ, в то время как на ТСХ - пластинку представляется как активностьв начале координат (R F = 0). Представитель хроматограмма пластины анализировали при помощи ТСХ с радиоактивной сканера TLC показано на рисунке 10. Трассирующими демонстрирует различное поведение удержания, в зависимости от того , образец раствора маркировки (рН 3,8-4,0, R F = 0,3) или образец физиологического рН (R F = 0,5) анализировалась.
Для исследования устойчивости индикаторного, свеже меченого 68 Ga [EOB-DTPA] был добавлен в образцах физиологического рН, содержащий разведенный PBS (фосфатный концентрации 5,5 мМ, А), избыток апо- трансферрина (1,6 мг / мл в разбавленной PBS с концентрацией фосфата 0,8 мМ, в) и сыворотки человека (с) соответственно. Со временем, радиохимической чистоты (RCP т) трассера в образцах определяли с помощью ТСХ. Процентное содержание интактного трассера рассчитывалось как отношение RCP т всоответствующие моменты времени и RCP 0 в начальной точке (таблица 2). Это было необходимо из - за маркировки растворов , содержащих меченых отличаясь RCP 0 (93-96%). Таким образом стандартизированный процент неповрежденной трассера изображается как функция времени на рисунке 11.
Для определения logD водных образцов трассера в разбавленном растворе PBS были готовы. Образцы смешивали с н - октанол, центрифугировали и впоследствии аликвоты для определения концентрации активности в обеих фазах. Значения активности и последующее вычисление logD их приведены в таблице 3. Среднее значение logD составляет 3,54 ± 0,08.
Рисунок 1. 1 Н-ЯМР - спектр EOB-DTPA. < / сильный> Спектр был записан в D 2 O на 400,1 МГц. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. 13 С {1} H ЯМР спектр EOB-DTPA. Спектр был записан в D 2 O на 100,6 МГц. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3. МС EOB-DTPA (ионизация электрораспылением (ESI), метанол, отрицательный режим).54334fig3large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4. 1 H-ЯМР - спектр Ga [EOB-DTPA]. Спектр был записан в D 2 O на 400,1 МГц. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 5. 13 С {1} H ЯМР спектр Ga [EOB-DTPA]. Спектр был записан в D 2 O на 100,6 МГц. Пожалуйста , нажмите ее е, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6. МС Ga [EOB-DTPA] (ESI, метанол, отрицательный режим), наряду с детальным изображением изотопного рисунка молекулярного пика. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 7. Представитель ВЭЖХ хроматограмма образца 68 Ga [EOB-DTPA] , содержащий в части несогласованных 68 Ga, зафиксированный с помощью детектора радиоактивности. Нескоординированное 68 Ga имеет среднее время удерживания 2,1 мин, в то время как Tracer обнаруживается на уровне 2,8 мин ,целевых = "_blank"> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 8. Представитель ВЭЖХ хроматограмма стандартного вещества Ga [EOB-DTPA], а обнаруженный в UV-VIS канала при 220 нм. Время удерживания холодного стандарта составляет 2,7 мин. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы просмотреть увеличенное цифра.
Рисунок 9. Изображение 68 эффективности Ga-мечение EOB-DTPA. Выход маркировки , как определено с помощью ВЭЖХ на графике как функцию от концентрации EOB-DTPA (22-29 МБк начальной активности, рН 3,8-40,0, 5 мин, RT). Стандартное отклонение изображается погрешностями. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 10. Представитель ТСХ хроматограмма выявления различных 68 видов Ga. Образец 68 Ga [EOB-DTPA] в разбавленной PBS (концентрации фосфата 5,5 мМ, рН 7,4) анализировали после 110 минут инкубации. Примерное распределение коллоидно 68 Ga (R F = 0), 68 Ga [EOB-DTPA] (R F = 0,5) и свободный 68 Ga (R F = 1,0) на 70 мм ТСХ пластине , как обнаружено посредством радиоактивной сканера ТСХ представил. Учеты Распад исправлены. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы увидеть увеличеннуюверсия этой фигуры.
Рисунок 11. Определения остойчивости 68 Ga [EOB-DTPA] в различных средах. Распад исправленные, стандартизированный процент неповрежденной трассирующими , как определено с помощью ТСХ, изображается как функция времени. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть большую версию этой фигуры ,
Таблица 1. Результаты ЯМР спектроскопии, МС и элементный анализ , проведенный для EOB-DTPA и Ga [EOB-DTPA]. Относительные интенсивности пиков МС приведены в%, назначение пиков приведены в квадратных скобках. Elemental значения CHN были рассчиты ваютсясчитанная для C 23 H 33 N 3 O 11 · H 2 O (EOB-DTPA) и (NH 4) 0,75 H 1,25 [C 23 H 28 GaN 3 O 11] · 2H 2 O (Ga [EOB-DTPA]).
Таблица 2. Определение устойчивости 68 Ga [EOB-DTPA] в различных средах. РКП 68 Ga [EOB-DTPA] в СМИ A, B и C определяли с помощью тонкослойной хроматографии при заданных временных точках. Состав образцов приведен в процентах в% от копира / свободного 68 Ga / коллоидных 68 Ga. Процент неповрежденной трассирующими стандартизирован как отношение RCP т / RCP 0. RCP 0 является соответствующая RCP меченого атома при Т = 0 мин.
. Таблица 3. Определение logD Decay скорректированного значения 0 А, Х из трех аликвот (х = 1, 2, 3) удаляют из каждой фазы (W: водный, O: N октанол) образца. Все мероприятия приведены в имп. LogD вычисляется, как описано в разделе 5 протокола. Эксперимент повторяли дважды.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
EOB-DTPA , доступен через многоступенчатого синтеза 33а , но может также быть изолированы от доступных контрастных веществ , содержащих gadoxetic кислоту. С этой целью центральный Gd (III), ион может быть осажден с избытком щавелевой кислоты. После удаления Gd (III) оксалата и щавелевой кислоты лиганд может быть выделен осаждением в холодной воде при рН 1,5. Тем не менее, в целях повышения урожайности хроматографии на колонке фильтрата может выполняться вместо или в качестве процедуры последующей деятельности. Любой метод дает аналитически чистый лиганд в общем объеме выходами 70% (цифры 1-3, Таблица 1).
Мы обнаружили , что для того , чтобы изолировать Ga [EOB-DTPA] доведением рН с раствором аммиака является предпочтительным по сравнению с использованием гидроксида натрия, так как побочный продукт хлорида аммония может быть удален из очень гидрофильной остатка через сублимации. При вышеуказанных условиях этот процесс происходит медленноеLY. Так как не-незначительное количество хлорида по-прежнему обнаруживаются через пять дней, оставшаяся соль вымывается с метанолом. Хотя эта Обогащение процедура приводит к частичной потере Ga [EOB-DTPA], продукт получали в аналитической чистоты с общим выходом 46% (фиг.4-6, Таблица 1). Для выделения обоих EOB-DTPA и его Ga (III), комплекс, использование обращенно-фазовой хроматографии следует рассматривать в качестве альтернативного способа очистки, в особенности, так как разложение силикагеля, скорее всего, при использовании сильно полярных растворителей.
Процесс маркировки EOB-DTPA требуется использование высокой чистоты растворителей, химических веществ и безметаллический оборудование , чтобы избежать присутствия конкурирующих ионов металлов, в связи с 68 Ga присутствует в наномолярными количествах (2 МБк 68 Ga в 1,75 мл образца равной концентрации нуклидов 0,14 нМ). Маркировку EOB-DTPA до 68 Ga происходит при рН 3,8-4,0 в течение пяти минутУтес при комнатной температуре. Исследования по эффективности Ga-маркировка 68 требуют определения выхода маркировки при сохранении условий проведения реакции рН, температуры и времени реакции, а также началом активности 68 Ga постоянной или в оправданных диапазоне. Для каждой точки данных (т.е. концентрация лиганда) эксперимент должен быть выполнен по крайней мере , три раза , чтобы обеспечить приемлемый уровень достоверности, так как концентрации как лиганда и 68 Ga очень низкий , а выход маркировки поэтому чувствительны даже незначительные отклонений условия реакции. Например, как 68 Ga элюата возрастов, аликвоты увеличения объема должны быть сняты , чтобы обеспечить постоянную начальную активность, таким образом , требуя возрастающих объемов буфера. Кроме того, старение элюата приводит к увеличению концентрации продукта распада 68 Zn, который сам по себе может выступать в качестве конкурента для 68 Ga, таким образом , негативно сказывается на labelinг коэффициент полезного действия . 13,34,35 Практически количественная маркировка 22-29 МБк 68 Ga достигается при вышеуказанных условиях с количеством EOB-DTPA ≥ 0,7 мкг (рисунок 9), с содержанием свободного 68 Ga ≤ 2% и около 5 % коллоидного 68 Ga , присутствующих в образцах.
В то время как ВЭЖХ при условии , превосходное базовое разделение свободного 68 Ga и 68 Ga [EOB-DTPA], он не подходит для обнаружения коллоидного 68 Ga. Поэтому мы выбрали TLC для определения RCP во время измерения стабильности, в котором 68 Ga требовалось количественное трансферрина или связанной с белком. Мы нашли базовое разделение приемлемое для этой цели (Рисунок 10); Тем не менее, использование хроматографии или фильтрации методов Вытеснительная 15,36 для удаления коллоидных фракций, с последующим анализом методом ВЭЖХ, можно было бы рассматривать в качестве альтернативы. 68 Ga комплекс демонстрирует более сильную RETention на пластинах ТСХ (R F = 0,3) , если образец извлекают непосредственно из раствора маркировки , в отличие от образцов при физиологическом значении рН (R F = 0,5). Мы полагаем, это наблюдение может быть объяснено различными протонирования состояний комплекса.
В пробирке определения устойчивости 68 Ga трассеров обычно проводят в PBS 15,17 или альтернативных буферных системах , имитирующих физиологический рН 37, а также в растворах , содержащих апо- трансферрина 37, который является основным конкурентом 68 Ga в крови, или в сыворотка крови человека 15,17. В наших опытах добавление раствора гидроксида натрия 0,1 М в PBS требовалось, чтобы отрегулировать рН образцов до 7,4. Мы не могли утверждать , что концентрация фосфата влияет на скорость деградации, так как в экспериментах на стабильность в растворах различной концентрации фосфата (0,8 мМ и 5,5 мМ (А)) давала не-reproduCible результаты. Тем не менее, мы обнаружили , что раствор В, содержащий апо -transferrin (1,6 мг / мл, которая находится в диапазоне от нормального содержания в плазме 38) и 0,8 мМ фосфата (крови человека , как правило , проявляет уровень фосфата 0,8-1,5 мМ 39,40 ), вызывает разложение со скоростью , сравнимой с наблюдаемым в сыворотке крови человека (с). В растворах переменного тока, после 185 мин содержание коллоидных 68 Ga увеличилось примерно на 24%, в то время как в растворе А содержание свободного 68 Ga увеличился на 11%, 17% в растворе В и 27% в растворе С (таблица 2 ). Тот факт , что 68 Ga образуются в результате разложения трассирующей преимущественно присутствуют в виде свободного 68 Ga в отличие от коллоидный или белком 68 Ga в В и С может быть из - за насыщения трансферрина или сравнительно низкой скоростью связывания трансферрина.
Для прогнозирования распределения трейсеры ткани н- октанол / вода раздела входе коэффициентыP или распределения коэффициентов logD можно определить как отношение концентрации активности в обеих фазах. По определению, параметр logD не проводит различий между несколькими веществами, присутствующими в среде, что делает его пригодным для наших экспериментов из-за возможности различных протонированных состояний трассера, а также его разложение в водной фазе. Для определения logD путем экстракции водной среды, как правило , забуференной PBS для имитации условий в крови. 17,43-45 Для выше причинам мы использовали разбавленных PBS, экспонирование концентрации фосфата и 0,8 мМ физиологическом рН. После экстракции н октанол и центрифугирования, удаление нескольких аликвот из одной фазы позволяет неточностей , вызванных пипеткой быть уменьшена. Благодаря концентрации очень низкой активности в н- октанол следует быть осторожным , чтобы избежать перекрестного загрязнения с водной фазой и обеспечить количественный перенос в отдельном флаконе. Distribкоэффициенты, определяемые социологическое загрязнение этой процедуры были воспроизводимы, и в то время как они позволяют для грубой оценки липофильности, прямое сравнение с LOGP Б-га [EOB-DTPA] не представляется возможным. Из - за специфики Gd [EOB-DTPA] в результате чего в первую очередь не от липофильности, а его гепатобилиарная поглощения дополнительные эксперименты в живых предметов или клеток будет необходимо представить более подробную информацию о биораспределении, а также стабильность в естественных условиях 68 Ga [EOB -DTPA]. В целом, применение в качестве агента визуализации для перфузии и ранней гепатобилиарной фазы можно себе представить.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| primovist | Bayer | - | 0.25 M |
| gallium(III) chloride | Sigma-Aldrich Co. | 450898 | |
| water (deionized) | - | - | tap water deionizing equipment by Auma-Tec GmbH |
| hydrochloric acid 12 M | VWR | 20252.29 | |
| sodium hydroxide | Polskie Odczynniki Chemiczne S.A. | 810925429 | |
| oxalic acid | Sigma-Aldrich Co. | 75688 | |
| ethyl acetate | Brenntag GmbH | 10010447 | |
| silica gel | Merck KGaA | 1.10832.9025 | Geduran Si 60 0.063-0.2 mm |
| TLC silica gel 60 F254 | Merck KGaA | 1.16834.0001 | |
| methanol | VWR | 20903.55 | |
| ethanol | Brenntag GmbH | 10018366 | |
| eiethylether | VWR | 23807.468 | stored over KOH plates |
| ammonia solution (25%) | VWR | 1133.1 | |
| pH electrode | VWR | 662-1657 | |
| stirring and heating unit | Heidolph | 505-20000-00 | |
| pump | Ilmvac GmbH | 322002 | |
| frit | - | custom design | |
| NMR spectrometer | Bruker Coorporation | - | Ultra Shield 400 |
| mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific Inc. | - | |
| elemental analyser | Hekatech GmbH Analysentechnik | - | EuroVector EA 3000 CHNS |
| deuterated water D2O | euriso-top | D214 | 99.90% D |
| Material/Equipment required for labeling procedures | |||
| 68Ge/68Ga generator | ITG Isotope Technologies Garching GmbH | A150 | |
| pump and dispenser system | Scintomics GmbH | - | Variosystem |
| hydrochloric acid 30% (suprapur) | Merck KGaA | 1.00318.1000 | |
| water (ultrapur) | Merck KGaA | 1.01262.1000 | |
| sodium chloride (suprapur) | Merck KGaA | 1.06406.0500 | |
| sodium acetate (suprapur) | Merck KGaA | 1.06264.0050 | |
| glacial acetic acid (suprapur) | Merck KGaA | 1.00066.0250 | |
| sodium citrate dihydrate | VEB Laborchemie Apolda | 10782 | >98.5% |
| PS-H+ Cartridge (S) | Macherey-Nagel | 731867 | Chromafix |
| apo-Transferrin | Sigma-Aldrich Co. | T2036 | |
| PBS buffer (tablets) | Sigma-Aldrich Co. | 79382 | |
| human serum | Sigma-Aldrich Co. | H4522 | from human male AB plasma |
| flasks, columns, etc. | custom design | ||
| pH electrode | Knick Elektronische Messgeräte GmbH & Co. KG | 765-Set | |
| binary pump (HPLC) | Hewlett-Packard | G1312A (HP 1100) | |
| UV Vis detector (HPLC) | Hewlett-Packard | G1315A (HP 1100) | |
| radioactive detector (HPLC) | EGRC Berthold | ||
| HPLC C-18-PFP column | Advanced Chromatography Technologies Ltd. | ACE-1110-1503/A100528 | |
| HPLC glass vials | GTG Glastechnik Graefenroda GmbH | 8004-HP-H/i3µ | |
| pipette | Eppendorf | - | |
| plastic vials | Sarstedt AG & Co. | 6542.007 | |
| plastic vials | Greiner Bio-One International GmbH | 717201 | |
| activimeter | MED Nuklear-Medizintechnik Dresden GmbH | - | Isomed 2010 |
| tweezers | custom design | ||
| incubator | Heraeus Instruments GmbH | 51008815 | |
| vortex mixer | Fisons | - | Whirlimixer |
| centrifuge | Heraeus Instruments GmbH | 75003360 | |
| gamma well counter | MED Nuklear-Medizintechnik Dresden GmbH | - | Isomed 2100 |
| water for chromatography | Merck KGaA | 1.15333.2500 | |
| acetonitrile for chromatography | Merck KGaA | 1.00030.2500 | |
| trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | 91707 | |
| TLC radioactivity scanner | raytest Isotopenmessgeräte GmbH | B00003875 | equipped with beta plastic detector |
References
- Weinmann, H. J., et al. A new lipophilic gadolinium chelate as a tissue-specific contrast medium for MRI. Magn. Reson. Med. 22, 233-237 (1991).
- Stroszczynski, C., et al. Aktueller Stand der MRT-Diagnostik mit leberspezifischen Kontrastmitteln. Radiologe. 44, 1185 (2004).
- Van Beers, B. E., Pastor, C. M., Hussain, H. K. Primovist, Eovist - what to expect. J. Hepatol. 57, 421-429 (2012).
- Zech, C. J., Herrmann, K. A., Reiser, M. F., Schoenberg, S. O. MR Imaging in Patients with Suspected Liver Metastases: Value of Liver-specific Contrast Agent Gd-EOB-DTPA. Magn. Reson. Med. Sci. 6, 43-52 (2007).
- Leonhardt, M., et al. Hepatic Uptake of the Magnetic Resonance Imaging Contrast Agent Gd-EOB-DTPA: Role of Human Organic Anion Transporters. Drug Metab. Dispos. 38, 1024-1028 (2010).
- Wadas, T. J., Wong, E. H., Weisman, G. R., Anderson, C. Coordinating Radiometals of Copper, Gallium, Indium, Yttrium, and Zirconium for PET and SPECT Imaging of Disease. J. Chem. Rev. 110, 2858-2902 (2010).
- Ametamey, S. M., Honer, M., Schubiger, P. A. Molecular Imaging with PET. Chem. Rev. 108, 1501-1516 (2008).
- Cutler, C. S., Hennkens, H. M., Sisay, N., Huclier-Markai, S., Jurisson, S. S. Radiometals for Combined Imaging and Therapy. Chem. Rev. 113, 858-883 (2013).
- Henze, M., et al. PET Imaging of Somatostatin Receptors Using [68GA]DOTA-D-Phe1-Tyr3-Octreotide: First Results in Patients with Meningiomas. J. Nucl. Med. 42, 1053-1056 (2001).
- Hofmann, M., et al. Biokinetics and imaging with the somatostatin receptor PET radioligand 68Ga-DOTATOC: preliminary data. Eur. J. Nucl. Med. 28, 1751-1757 (2001).
- Blau, M., Nagler, W., Bender, M. A. Fluorine-18: a new isotope for bone scanning. J. Nucl. Med. 3, 332-334 (1962).
- Green, M. A., Welch, M. J. Gallium Radiopharmaceutical Chemistry. Int. J. Radiat. Appl. Instrum. B. 16, 435-448 (1989).
- Rösch, F. Past, present and future of 68Ge/68Ga generators. Appl. Radiat. Isot. 76, 24-30 (2013).
- Liu, S. The role of coordination chemistry in the development of target-specific radiopharmaceuticals. Chem. Soc. Rev. 33, 445-461 (2004).
- Haubner, R., et al. Development of (68)Ga-labelled DTPA galactosyl human serum albumin for liver function imaging. Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging. 40 (68), 1245-1255 (2013).
- Yang, W., Zhang, X., Liu, Y. Asialoglycoprotein Receptor-Targeted Radiopharmaceuticals for Measurement of Liver Function. Curr. Med. Chem. 21, 4-23 (2014).
- Chauhan, K., et al. 68Ga based probe for Alzheimer's disease: synthesis and preclinical evaluation of homodimeric chalcone in β-amyloid imaging. Org. Biomol. Chem. 12, 7328-7337 (2014).
- Chakravarty, R., Chakraborty, S., Dash, A., Pillai, M. R. A. Detailed evaluation on the effect of metal ion impurities on complexation of generator eluted 68Ga with different bifunctional chelators. Nucl. Med. Biol. 40, 197-205 (2013).
- Clevette, D. J., Orvig, C. Comparison of ligands of differing denticity and basicity for the in vivo chelation of aluminum and gallium. Polyhedron. 9, 151-161 (1990).
- Prinsen, K., et al. Development and evaluation of a 68Ga labeled pamoic acid derivative for in vivo visualization of necrosis using positron emission tomography. Bioorg. Med. Chem. 18, 5274-5281 (2010).
- Vogl, T. J., et al. Liver tumors: comparison of MR imaging with Gd-EOB-DTPA and Gd-DTPA. Radiology. 200, 59-67 (1996).
- Reimer, P., et al. Phase II clinical evaluation of Gd-EOB-DTPA: dose, safety aspects, and pulse sequence. Radiology. , 177-183 (1996).
- Ba-Ssalamah, A., et al. MRT der Leber. Radiologe. 44, 1170-1184 (2004).
- Scott, R. P. W. Journal of Chromatography Library. 22A, Elsevier Scientific Publishing Co. A137-A160 (1983).
- Reichenbaecher, M., Popp, J. Strukturanalytik organischer und anorganischer Verbindungen. , 1st, B. G. Teubner Verlag. Wiesbaden. (2007).
- Gross, J. H. Mass Spectrometry: A Textbook. , Springer. (2004).
- Ma, T. S., Rittner, R. C. Modern Organic Elemental Analysis. , Marcel Dekker, Inc. (1979).
- Mueller, D., et al. Simplified NaCl Based 68Ga Concentration and Labeling Procedure for Rapid Synthesis of 68Ga Radiopharmaceuticals in High Radiochemical Purity. Bioconjugate Chem. 23, 1712-1717 (2012).
- Roberts, T. R. Radio-column chromatography. Journal of Chromatography Library. 14, 103-132 (1978).
- Roberts, T. R. Radio-thin-layer chromatography. Journal of Chromatography Library. 14, 45-83 (1978).
- Green, M. A., Welch, M. J. Gallium radiopharmaceutical chemistry. Nucl. Med. Biol. 16, 435-448 (1989).
- Notni, J., Plutnar, J., Wester, H. J. Bone-seeking TRAP conjugates: surprising observations and their implications on the development of gallium-68-labeled bisphosphonates. EJNMMI Res. 2, 13 (2012).
- Schmitt-Willich, H., et al. Synthesis and Physicochemical Characterization of a New Gadolinium Chelate: The Liver-Specific Magnetic Resonance Imaging Contrast Agent Gd-EOB-DTPA. Inorg. Chem. 38, 1134-1144 (1999).
- 68Ga generator for positron emission tomography. Zhernosekov, K., Nikula, T. , DE102010037964B3 (2012).
- Simecek, J., Hermann, P., Wester, H. J., Notni, J. How is 68Ga Labeling of Macrocyclic Chelators Influenced by Metal Ion Contaminants in 68Ge/68Ga Generator Eluates? ChemMedChem. 8, 95-103 (2013).
- Baur, B., et al. Synthesis, Radiolabelling and In Vitro Characterization of the Gallium-68-, Yttrium-90- and Lutetium-177-Labelled PSMA Ligand, CHX-A''-DTPA-DUPA-Pep. Pharmaceuticals (Basel). 7, 517-529 (2014).
- Boros, E., et al. RGD conjugates of the H2dedpa scaffold: synthesis, labeling and imaging with 68Ga. Nucl. Med. Biol. 39, 785-794 (2012).
- Beck, W. S. Hematology. , 5th, MIT press. Cambridge, Massachusetts. (1998).
- Patel, V., Morrissey, J. Practical and Professional Clinical Skills. , 1, Oxford University Press Inc. New York. (2001).
- Bartke, A., Constanti, A. Basic Endocrinology. , 1, CRC Press. (1998).
- Bernstein, L. R. Mechanisms of Therapeutic Activity for Gallium. Pharmacol. Rev. 50, 665-682 (1998).
- Clausen, J., Edeling, C. J., Fogh, J. 67Ga Binding to Human Serum Proteins and Tumor Components. Cancer Res. 34, 1931-1937 (1974).
- Dumont, R. A., et al. Novel 64Cu- and 68Ga-Labeled RGD conjugates show improved PET imaging of αvβ3 integrin expression and facile radiosynthesis [Erratum to document cited in CA156:116856. J. Nucl. Med. 52, 1498 (2011).
- Pohle, K., et al. 68Ga-NODAGA-RGD is a suitable substitute for 18F-Galacto-RGD and can be produced with high specific activity in a cGMP/GRP compliant automated process. Nucl. Med. Biol. 39, 777-784 (2012).
- Notni, J., Pohle, K., Wester, H. J. Be spoilt for choice with radiolabelled RGD peptides: Preclinical evaluation of 68 Ga-TRAP(RGD)3. Nucl. Med. Biol. 40, 33-41 (2013).
