Summary
Un procedimiento para el aislamiento de EOB-DTPA y la posterior formación de complejos con Ga naturales (III) y 68 Ga se presenta en este documento, así como un análisis exhaustivo de todos los compuestos y las investigaciones sobre el etiquetado de eficiencia, la estabilidad in vitro y el octanol / agua coeficiente de distribución del complejo radiomarcado.
Abstract
Se demuestra un método para el aislamiento de EOB-DTPA (3,6,9-triaza-3,6,9-tris (carboximetil) -4- (etoxibencil) ácido -undecanedioic) de su Gd (III) y los protocolos para la preparación de su novela no radiactivo, es decir, Ga naturales (III), así como radiactivo 68 complejo Ga. El ligando así como el Ga (III) se caracterizaron por espectroscopia de resonancia magnética nuclear (NMR), espectrometría de masas y análisis elemental. 68 Ga se obtuvo por un método de elución estándar de A / 68 generador de Ga 68 Ge. Los experimentos para evaluar la eficiencia de 68 Ga-etiquetado de EOB-DTPA a pH 3,8-4,0 se llevaron a cabo. Establecido de radio técnicas de análisis de TLC (cromatografía en capa fina) y HPLC radio (cromatografía líquida de alto rendimiento) se utilizaron para determinar la pureza radioquímica del trazador. Como una primera investigación de lipofilia los 68 Ga trazadores 'el octanol / agua distribution coeficiente de 68 especies Ga presentes en una solución de pH 7,4 se determinó por un método de extracción. medidas de estabilidad in vitro del trazador en diversos medios a pH fisiológico se realizaron, revelando diferentes tasas de descomposición.
Introduction
Gadoxetato, un nombre común para el complejo de Gd (III) del ligando EOB-DTPA 1, es un agente de contraste utilizado con frecuencia en la imagen hepatobiliar resonancia magnética (MRI). 2,3 Debido a su captación específica por los hepatocitos del hígado y alto porcentaje de excreción hepatobiliar que permite la localización de las lesiones focales y los tumores hepáticos. 2-5 Sin embargo, ciertas limitaciones de la técnica de resonancia magnética (por ejemplo, la toxicidad de los agentes de contraste, la aplicabilidad limitada en pacientes con claustrofobia o de metal implantes), invitan a una herramienta de diagnóstico alternativo .
La tomografía por emisión de positrones (PET) es un método de formación de imágenes molecular, en el que se administra una pequeña cantidad de una sustancia radiactiva (trazador), en la que su distribución en el cuerpo es registrada por un escáner de PET. 6 PET es un método dinámico que permite una alta resolución espacial y temporal de las imágenes, así como la cuantificación de los resultados, sin tener quehacer frente a los efectos secundarios de los agentes de contraste de MRI. El valor informativo de la información obtenida metabólica puede incrementarse aún más mediante la combinación con los datos anatómicos recibidas de los métodos de imagen adicionales, como más comúnmente alcanzada por híbrido de imágenes mediante tomografía computarizada (TC) en los escáneres PET / CT.
La estructura química de un trazador adecuado para el PET debe incluir un isótopo radiactivo que actúa como emisor de positrones. Los positrones tienen una corta vida, ya que casi inmediatamente se aniquilan con los electrones de las capas atómicas de los tejidos circundantes. Por aniquilación dos fotones gamma 511 keV con dirección opuesta de movimiento son emitidos, que se registran por el escáner de PET. 7,8 Para formar un trazador, núclidos PET pueden estar unidos covalentemente a una molécula, como es el caso de 2-desoxi- 2- [18F] fluoroglucose (FDG), el trazador PET utilizado más ampliamente. 7 Sin embargo, un nucleido también puede formar enlaces de coordinación a uno o varios ligandos (por ejemplo,, [68 Ga] -DOTATOC 9,10) o aplicarse en forma de sales inorgánicas disueltas (por ejemplo, [18 F] fluoruro de sodio 11). En total, la estructura del trazador es crucial ya que determina su comportamiento biodistribución, metabolismo y excreción.
A nucleido PET adecuado debe combinar características favorables, como la energía de positrones conveniente y disponibilidad, así como una vida media adecuada para la investigación prevista. El 68 Ga nucleido se ha convertido en una fuerza esencial en el campo de PET en las últimas dos décadas. 12,13 Esto es principalmente debido a su disponibilidad a través de un sistema de generador, lo que permite el etiquetado en el lugar independientemente de la proximidad de un ciclotrón. En un generador, la madre nucleido 68 Ge se absorbe en una columna de la que el nucleido hijo 68 Ga se eluye y posteriormente la etiqueta a un quelante adecuado. 6,14 Desde el 68 Ga nucleido existe como un trivalcación ent al igual que Gd (III) 10,13, quelantes EOB-DTPA con 68 Ga vez produciría un complejo con la misma carga total negativa como gadoxetato. De acuerdo con ello, que el 68 Ga trazador podría combinar una especificidad hepática característica similar con la idoneidad para la formación de imágenes PET. Aunque gadoxetato es comprado y administrado como sal disódica, en el siguiente contexto nos referiremos a ella como Gd [EOB-DTPA] y para el complejo no radiactivo Ga (III) como Ga [EOB-DTPA], o 68 Ga [ EOB-DTPA] en el caso del componente radiomarcado en aras de la conveniencia.
Para evaluar su aplicabilidad como trazadores para PET, complejos de metales radiactivos deben ser examinados extensamente in vitro, in vivo o ex vivo experimentos primero. Para determinar la idoneidad para un problema médico respectivo, diversas características tales como el comportamiento de rastreo biodistribución y perfil de eliminación, la estabilidad, la especificidad de órgano y célula o tissue captación necesita ser investigado. Debido a su carácter no invasivo, determinaciones in vitro se realizan a menudo antes de los experimentos in vivo. En general se reconoce que DTPA y sus derivados son de la idoneidad limitada como quelantes para 68 Ga debido a estos complejos que carecen de inercia cinética, lo que resulta en la descomposición comparativamente rápida cuando se administra in vivo. 14-20 Esto es causado principalmente por apo- transferrina actúa como una competidor para 68 Ga en el plasma. Sin embargo, se determinó este nuevo trazador en relación con su posible aplicación en imágenes hepatobiliar, en el que la información de diagnóstico puede proporcionarse en cuestión de minutos después de la inyección 3,4,21-23, con lo que no necesariamente requieren estabilidad trazador a largo plazo. Con este fin hemos aislado EOB-DTPA de gadoxetato e inicialmente realizó la formación de complejos con Ga natural (III), que existe como mezcla de dos isótopos estables, 69 Ga y 71 68 Ga. Se utilizaron los métodos elaborarse y evaluarse simultáneamente su idoneidad para determinar la eficiencia de 68 Galabeling EOB-DTPA y para investigar la lipofilia del nuevo trazador 68 Ga y su estabilidad en diferentes medios.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Preparación de EOB-DTPA y Ga [EOB-DTPA]
Precaución: Por favor, consulte a todas las hojas de datos de seguridad de materiales (MSDS) correspondientes de los disolventes orgánicos, ácidos y alcalinos utilizados antes de su uso. Realizar todos los pasos en una campana de extracción y el uso de equipo de protección personal (gafas de seguridad, guantes, bata de laboratorio).
- Aislamiento de EOB-DTPA de gadoxetato
- Ponga 3 ml de solución inyectable gadoxetic ácido 0,25 M en un matraz. Añadir 500 mg (5,6 mmol) de ácido oxálico a la solución agitada.
- Después de agitar durante 1 h, se filtra la suspensión a través de una frita usando presión reducida. Lavar el residuo tres veces con 3 ml de agua, respectivamente.
- Combinar los filtrados acuosos y equipar la solución con un electrodo de pH. Añadir ácido clorhídrico 12 M al filtrado hasta que el pH es de aproximadamente -0,1.
- Se elimina el disolvente a vacío para dar un residuo incoloro. Almacenar en atmósfera de gas inerte.
- Lavar el residuo a fondo (al menos tresveces) con acetato de etilo para eliminar el exceso de ácido oxálico. Secar el residuo al vacío.
- Se vuelve a disolver el residuo en 2 ml de agua a temperatura ambiente y después enfriar la solución en un baño de hielo. Sin retirar el baño de hielo, añadir 0,5 M de hidróxido de sodio acuoso gota a gota solución hasta la formación de un sólido incoloro que se observa pegajosa.
- Eliminar el agua por decantación. Se lava el sólido dos veces más con 1 ml de agua fría. Se seca el sólido al vacío para producir la primera fracción de producto.
- Aislar una fracción de segundo producto de las fracciones combinadas de agua decantada a través de cromatografía en columna (sílice, metanol / agua 4/1). 24 Se elimina el disolvente a vacío.
- Si el sólido así obtenido no es blanco puro, disolver en 1 ml de agua, añadir 10 ml de etanol y, posteriormente, 10 ml de éter dietílico para precipitar el producto. Se filtra a través de una frita usando presión reducida y se seca al vacío.
- Combinarambas fracciones sólidas de EOB-DTPA y realizar espectroscopia NMR, 25 de espectrometría de masas 26 y 27 elementales análisis.
- Síntesis de Ga [EOB-DTPA]
PRECAUCIÓN: sólido cloruro de tienda Ga (III) en una atmósfera inerte seca, ya que al contacto con el aire, la humedad o la descomposición de grasa se lleva a cabo, lo que resulta en vapores corrosivos y formación de impurezas de color amarillo, marrón o negro.- Preparar una solución 0,11 M de stock de la disolución de 1,94 g (11,0 mmol) de cloruro de Ga (III) en 100 ml de agua. Diluir 1 ml de solución de amoniaco acuoso al 25% con 4 ml de agua.
- Disolver 80 mg (0,15 mmol) de EOB-DTPA en un matraz en 10 ml de agua. Si es necesario, calentar el disolvente para lograr la disolución completa.
- Añadir 1,4 ml (0,15 mmol) de la solución de cloruro de stock Ga (III). Equipar el matraz con un agitador y electrodo de pH. Añadir una solución de amoníaco diluido gota a gota acuosa hasta que el pH de la solución es de aproximadamente 4,1. Se agita a rotemperatura om para 30 min.
- Se elimina el disolvente a vacío. Coloque el residuo en un matraz, equipado con un stillhead con un cuello lateral central y paralelo. Equipar el cuello central con un dedo de refrigeración y la del lateral del cuello con una salida de la bomba de vacío
- Calentar el residuo bajo presión reducida (125 ° C, 0,6 mbar). Periódicamente eliminar el cloruro de amonio sublimada (visible como revestimiento blanco de la superficie de cristal) del dedo de refrigeración y todavía cabeza, así como de las partes superiores del matraz con un paño ligeramente húmedo. Continuar el proceso hasta que no hay formación visible de nuevo sublimado.
- Para eliminar las trazas finales de cloruro de amonio lavar el residuo tres veces con 0,5 ml de metanol caliente, respectivamente. Se seca el residuo incoloro a vacío. Realizar espectroscópicos de RMN, espectrometría de masas 25 26 y 27 elementales análisis.
2. Procedimiento general de etiquetado
PRECAUCIÓN: Todas las exexperimentos que incluyen el contacto directo o indirecto con sustancias radiactivas deben llevarse a cabo únicamente por personal capacitado. Por favor, utilice el equipo de protección adecuado. Recoger los residuos radiactivos por separado y almacenar y disponer de acuerdo con la normativa vigente.
- La elución del generador
Se utilizó un Ge / 68 Ga generador de 40 mCi 68 con el nucleido madre obligado como óxido de sílice en dodecil-3,4,5-trihidroxibenzoato: Nota. La elución y purificación pueden llevarse a cabo manualmente o, como fue el caso en este procedimiento, como un proceso automatizado combinado usando una bomba peristáltica y la unidad de dispensador.- Se preparan soluciones de 5,5 M, 1,0 M y ácido clorhídrico 0,05 M. Preparar una solución de cloruro de 5,0 M de sodio que contiene 25 l de ácido clorhídrico 5,5 M por ml. Preparar una solución tampón de pH 4,6 mediante la combinación de 4,1 g de acetato de sodio, 1 ml de HCl (30%) y 2,5 ml de ácido acético glacial y diluyendo la mezcla con agua hasta 50 ml.
- precondition A la PS-H + cartucho por lavado lentamente con 1 ml de ácido clorhídrico 1,0 M y posteriormente 5 ml de agua.
- Eluir la columna de sílice del generador con 4 ml 0,05 M HCl. 12 carga el 68 Ga eluato en el PS-H + cartucho.
- Enjuague el cartucho con 5 ml de agua y posteriormente se seca con 5 ml de aire. Eluir el 68 Ga desde el cartucho con 1 ml de 5,0 M solución acidificada de cloruro de sodio. 28
- Etiquetado de EOB-DTPA con 68 Ga
- Disolver 1 mg (1,9 mmol) de EOB-DTPA en 1 ml de agua. A partir de esta solución llevará 100 l (0,19 mmol) y se diluye con 9,9 ml de agua para preparar una 19 M (10 mg / ml) solución madre de EOB-DTPA.
- Retire 50 l (que equivale a 22-29 MBq) de la solución que contiene 68 Ga y poner en un vial. Añadir 50 l (0,5 g) de una solución madre 19 mM de EOB-DTPA y 300 l of tampón para elevar el pH a 4,0. Agitar brevemente y se incuba la solución a temperatura ambiente durante 5 min. Retirar una alícuota de 1-5 l y poner a HPLC o análisis de TLC.
- Realizar análisis de HPLC de radio en una fase inversa (RP) C18 columna 29 Usar la siguiente fase móvil:. A - agua / ácido trifluoroacético (99,9% / 0,1%), B - acetonitrilo / ácido trifluoroacético (99,9% / 0,1%), gradiente : 06 min 80% A → 0% A (0,5 ml / min), 610 min 0% A (0,5 ml / min).
- Determinar las intensidades de los picos de las señales de radio de HPLC como área bajo la curva. Calcular el rendimiento de marcado como la pureza radioquímica (RCP) del trazador como sigue:
RCP = A Ga-EOB-DTPA / (A + A Ga Ga-EOB-DTPA) ∙ 100%
Un Ga-EOB-DTPA: área bajo la curva de 68 Ga [EOB-DTPA]
Un Ga: área bajo la curva de la libertad de 68 Ga
3. Eficiencia de etiquetado
- Realizar procedimientos de etiquetado tal como se described en la sección 2. Uso de un rango consistente de inicio de la actividad de 68 Ga eluato, por ejemplo, 22 a 29 MBq (40 a 140 l, dependiendo de la frescura del eluido).
- Añadir la cantidad requerida de solución tampón para ajustar el pH a 3,8 hasta 4,0 (40 a 190 l, dependiendo del volumen de 68 Ga eluato). Añadir la cantidad requerida de solución de ligando (10 a 70 l de una solución 19 mM).
- Añadir las cantidades necesarias de agua para ajustar el volumen general de cada sonda de etiquetado de 1,75 ml. Mezclar bien y dejar reposar la muestra durante 5 min a temperatura ambiente. Realizar análisis de HPLC como se describe en la sección 2 para determinar el rendimiento de marcaje.
- Realizar procedimientos de etiquetado con cantidades de ligando entre 0,1 mg y 0,7 mg en intervalos de 0,1 g. Realizar experimentos por triplicado para cada concentración de ligando. Calcular el rendimiento medio y la desviación estándar.
4. Estabilidad In Vitro
- p generalrocedimiento y preparaciones
- Disolver una tableta de tampón fosfato salino (PBS) en 200 ml de agua desionizada para preparar una solución de PBS con una concentración de fosfato de 10 mM.
- Realizar un etiquetado de 22-29 MBq 68 Ga con 0,5 l de EOB-DTPA solución de reserva, tal como se describe en la sección 2. En función del volumen del eluato 68 Ga, ajustar la cantidad de tampón, como se describe en la sección 3. Se toman muestras de solución de etiquetado que contiene 6-12 MBq de trazador para la realización de medidas de estabilidad.
- Realizar análisis de TLC de radio en placas de aluminio recubiertas de gel de sílice 80 mm usando citrato de sodio acuoso 0,1 M como eluyente y analizar las placas con un escáner de radioactividad TLC. 30 determinar las intensidades de las señales de TLC como área bajo la curva. Calcular la RCP del trazador como sigue:
RCP = A Ga-EOB-DTPA / (A-Ga Ga libre + A-EOB-DTPA + A Ga-coloidal) ∙ 100%
Un Ga-EOB-DTPA: área bajo la curva de 68 Ga [EOB-DTPA]
Un Ga-libre: área bajo la curva de la libertad de 68 Ga
Un Ga-coloidal: área bajo la curva de 68 Ga coloidal - Calcula RCP t / RCP 0 para cada punto de tiempo. Trazar la RCP por lo tanto normalizada vs diferencia de tiempo desde el punto de partida t = 0 min.
RCP t = RCP de 68 Ga [EOB-DTPA] en el punto de tiempo t.
RCP = 0 RCP de 68 Ga [EOB-DTPA] en t = 0 min.
- Estabilidad en solución salina tamponada con fosfato (A)
- A 65 l de solución de etiquetado añadir 150 l de PBS solución madre y 60 l de solución de hidróxido de sodio (0,1 M) para elevar el pH a 7,4. Mezclar bien.
- Retirar una alícuota de 1-5 l para realizar el análisis de TLC ( "punto de partida"). Inmediatamente almacenar la solución en una incubadora a 37 ° C y retirar alícuotas para realizar análisis de TLC en representarAtive puntos de tiempo durante 3 horas.
- Estabilidad frente a un exceso de apo transferrina en PBS (B)
- A 120 l de solución de etiquetado añadir 50 l de PBS solución madre y 430 l de solución de hidróxido de sodio (0,1 M) para elevar el pH a 7,4. Añadir 40 l de una solución de apo transferrina (25 mg / ml). Mezclar bien.
- Retirar una alícuota de 1-5 l para realizar el análisis de TLC ( "punto de partida"). Inmediatamente almacenar la solución en una incubadora a 37 ° C y retirar alícuotas para realizar análisis de TLC en puntos de tiempo representativos sobre 3 hr.
- Estabilidad en suero humano (C)
- Para 500 l de suero humano añadir 25 l de solución de etiquetado y 45 l de solución de hidróxido de sodio (0,1 M) para elevar el pH a 7,4. Mezclar bien.
- Retirar una alícuota de 1-5 l para realizar el análisis de TLC ( "punto de partida"). Inmediatamente almacenar la solución en una incubator a 37 ° C y retirar alícuotas para realizar análisis por TLC en puntos de tiempo representativos sobre 3 hr.
5. Determinación del coeficiente de distribución LÖGD
- Realizar procedimientos de etiquetado tal como se describe en el apartado 2. 50 l de solución de etiquetado añadir 20 l de PBS solución de reserva y 170 l de solución de hidróxido de sodio (0,1 M) para elevar el pH a 7,4.
- Retirar 200 l de esta solución y ponerla en un frasco de plástico-V. Añadir 200 l de n- octanol. Cerrar el vial y agitar durante 2 min. Centrifugar a continuación la muestra a 1600 xg durante 5 min.
- Retire triplicados de 40 l de la fase de n-octanol y la fase acuosa cada uno y ponerlos en V-viales separados. Tenga cuidado de no mezclar las capas.
- Medir la actividad de cada muestra en un contador gamma bien durante 30 segundos. Para cada muestra de repetir inmediatamente la medición de la misma dos veces y calcular la actividad Ᾱ media t t, W1, Ᾱ t, W2 y Ᾱ t, W3 (tipo de actividades en muestras acuosas) y Ᾱ t, O1, Ᾱ T, O2, T Ᾱ, O3 (actividades en octanol) a lo largo de las respectivas punto de tiempo t de su determinación.
- Definir el punto de la medición de la última muestra como t 0 tiempo. Determinar y hacer una lista? T en min calculando? T = 0 tt. Realizar la corrección de la descomposición de Ᾱ t, utilizando la siguiente fórmula:
Ᾱ 0 = Ᾱ t · 2 (Dt / 68 min). - Calcular Ᾱ 0, W como la media de Ᾱ 0, W1, Ᾱ 0, W2 y Ᾱ 0, W3, así como Ᾱ 0, O como la media de Ᾱ 0, O1, Ᾱ 0, O2 y Ᾱ 0, O3. Calcular logD utilizando la siguiente fórmula:
logD = log [(Ᾱ - Realizar todo el experimento por triplicado y calcular la media logD junto con su desviación estándar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
El ligando EOB-DTPA y Ga no radiactivo (III) se analizaron a través de 1 H y 13 C {1} H espectroscopía de RMN, espectrometría de masas y análisis elemental. Los resultados enumerados en la Tabla 1 y representadas en las figuras 1-6 verificar la pureza de las sustancias.
La elución del generador Ga Ge 68/68 proporcionó soluciones de 400-600 MBq de 68 Ga. Los resultados descritos procedimiento de etiquetado en la formación de la deseada trazador 68 Ga [EOB-DTPA], indican como pico de HPLC de radio que presenta un tiempo de retención de 2,8 min (Figura 7). La comparación con el tiempo de retención del estándar Ga [EOB-DTPA] en el detector UV-vis a 220 nm (2,7 min, Figura 8) confirma etiquetado éxito. Descoordinada 68 Ga se detecta como pico de radio a 2,1 minutos (Figura7). La eficiencia de 68 Ga-etiquetado de EO-BDTPA se investigó mediante la determinación del rendimiento de marcado como una función de la concentración de ligando a través de HPLC (Figura 9). Los rendimientos se determinaron por triplicado y se calcularon las desviaciones estándar.
Dependiendo del pH y la concentración de aniones presentes en la solución, no coordinados o no marcado 68 Ga puede existir en varias especies, por ejemplo, galatos o hidróxido insoluble. 31 El término generalizado "libre 68 Ga" 32 se utiliza para todos no marcado especies en solución excepto el hidróxido, que se denomina generalmente como "coloidal 68 Ga". Bajo las condiciones de análisis descritos, libre de 68 Ga se mueve con el frente del disolvente (Rf = 1,0) en una placa de TLC. Coloidal 68 Ga no se puede detectar a través de HPLC, mientras que en una placa de TLC que aparece como actividaden el origen (R f = 0). Un cromatograma representativo de una placa de TLC se analizaron con un escáner de radioactividad TLC se muestra en la Figura 10. El trazador exhibe diferente comportamiento de retención, dependiendo de si una muestra de solución de etiquetado (pH 3,8 a 4,0, R f = 0,3) o una muestra de fisiológica se analizó pH (R f = 0,5).
Para investigar la estabilidad del trazador, recién marcado 68 Ga [EOB-DTPA] se añadió a las muestras de pH fisiológico, que contiene diluido PBS (fosfato de concentración 5,5 mM, A), el exceso de apo- transferrina (1,6 mg / ml en PBS diluido con una concentración de fosfato de 0,8 mM, B) y suero humano (C), respectivamente. Con el tiempo, se determinó la pureza radioquímica (RCP t) de trazador en las muestras por medio de TLC. El porcentaje de trazador intacto se calculó como la relación de RCP t enlos respectivos puntos de tiempo y RCP 0 en el punto de partida (Tabla 2). Esto fue necesario debido a las soluciones de etiquetado que contienen trazador de diferentes RCP 0 (93-96%). El porcentaje de este modo estandarizado de trazador intacto se representa como una función del tiempo en la Figura 11.
Para la determinación de muestras acuosas logD de trazador en una solución de PBS diluido estaban preparados. Las muestras se mezclaron con n- octanol, se centrifugaron y, posteriormente, se retiraron alícuotas para determinar la concentración de actividad en ambas fases. Los valores de actividad y el posterior cálculo de logD del mismo se muestran en la Tabla 3. El valor medio logD es de 3.54 ± 0.08.
Figura 1. espectro de 1H-RMN de EOB-DTPA. < / strong> El espectro se registró en D2O a 400,1 MHz. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. 13 C {1} H-RMN espectro de EOB-DTPA. El espectro se registró en D2O a 100,6 MHz. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. MS de EOB-DTPA (ionización por electrospray (ESI), metanol, modo negativo).54334fig3large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. espectro de 1H-RMN de Ga [EOB-DTPA]. El espectro se registró en D2O a 400,1 MHz. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5. 13 C {1} H-RMN espectro de Ga [EOB-DTPA]. El espectro se registró en D2O a 100,6 MHz. Por favor, haga clic en ella e para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6. MS de Ga [EOB-DTPA] (ESI, metanol, modo negativo), junto con una descripción detallada del patrón de isótopos del pico molecular. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7. Representante HPLC cromatograma de una muestra de 68 Ga [EOB-DTPA] que contiene en partes no coordinada 68 Ga, como se registra por el detector de radioactividad. Descoordinado 68 Ga exhibe un tiempo de retención de 2,1 min, mientras que se detecta el marcador en 2,8 min .target = "_ blank"> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 8. Representante HPLC cromatograma de la sustancia patrón Ga [EOB-DTPA], como se detecta en el canal UV-vis a 220 nm. El tiempo de retención del estándar de frío es de 2,7 minutos. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 9. Representación de 68 eficiencia Ga-etiquetado de EOB-DTPA. El rendimiento de marcado tal como se determina a través de HPLC se representa como una función de la concentración de EOB-DTPA (22-29 MBq actividad de partida, pH 3,8-40,0, 5 min, RT). La desviación estándar se representa mediante barras de error. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 10. Representante TLC cromatograma revelando diferentes 68 especies Ga. Una muestra de 68 Ga [EOB-DTPA] en PBS diluido (concentración de fosfato 5,5 mM, pH = 7,4) se analizó después de 110 minutos de incubación. Distribución ejemplar de coloidal 68 Ga (R f = 0), 68 Ga [EOB-DTPA] (R f = 0,5) y libre de 68 Ga (R f = 1,0) en una placa de TLC 70 mm como detectado por un escáner de radioactividad TLC es presentada. Que cuenta son la descomposición corregida. Por favor, haga clic aquí para ver una mayorversión de esta figura.
Figura 11. Determinaciones de estabilidad de 68 Ga [EOB-DTPA] en diferentes medios de comunicación. La decadencia corregido, porcentaje normalizado de trazador intacta como se determina mediante TLC, se representa como una función del tiempo. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura .
Tabla 1. Resultados de RMN espectroscópica, MS y análisis elementales realizadas por EOB-DTPA y Ga [EOB-DTPA]. Relativas intensidades de los picos de EM se dan en%, misiones a los picos se dan entre corchetes. CHN valores elementales fueron calcuRELAClONADAS para C 23 H 33 N 3 O 11 · H 2 O (EOB-DTPA) y (NH 4) 0,75 H 1,25 [C 23 H 28 GaN 3 O 11] · 2H 2 O (Ga [EOB-DTPA]).
Tabla 2. Determinación de estabilidad de 68 Ga [EOB-DTPA] en diferentes medios de comunicación. El RCP de 68 Ga [EOB-DTPA] en los medios A, B y C se determinó mediante TLC en los puntos de tiempo dados. La composición de las muestras se da como porcentajes en% del trazador / libre de 68 Ga / 68 Ga coloidales. El porcentaje de trazador intacta está estandarizado como proporción de RCP t / RCP 0. RCP 0 es el respectivo RCP del trazador en t = 0 min.
. Tabla 3. Determinación de logD Decay corrigió valores alpha 0, X de tres alícuotas (x = 1, 2, 3) retirado de cada fase (W: acuosa, O: n-octanol) de una muestra. Todas las actividades se dan en cpm. LÖGD se calcula como se describe en la sección 5 del protocolo. El experimento se repitió dos veces.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
EOB-DTPA es accesible a través de una síntesis de múltiples pasos 33, pero puede muy bien ser aislado a partir de agentes de contraste que contienen disponibles gadoxetato. Para este propósito, el ion central Gd (III) se puede precipitar con un exceso de ácido oxálico. Después de retirar Gd oxalato (III) y ácido oxálico el ligando puede ser aislado mediante precipitación en agua fría a pH 1,5. Sin embargo, con el fin de mejorar los rendimientos de cromatografía en columna del filtrado se puede realizar en lugar o como un procedimiento de seguimiento. Cualquiera de estos métodos se obtiene el ligando analíticamente puro en los rendimientos totales de 70% (figuras 1 a 3, Tabla 1).
Hemos encontrado que con el fin de aislar Ga [EOB-DTPA] ajustando el pH con solución de amoníaco es ventajoso en comparación con el uso de hidróxido de sodio, ya que el cloruro de amonio subproducto puede eliminarse del residuo muy hidrófilos a través de la sublimación. En las condiciones mencionadas anteriormente se lleva a cabo este proceso lentoLy. Desde cantidades no despreciables de cloruro eran todavía detectable después de cinco días, la sal remanente se lavó con metanol. Aunque este trabajo en marcha procedimiento da lugar a la pérdida parcial de Ga [EOB-DTPA], se obtuvo el producto en la pureza analítica con un rendimiento global del 46% (Figuras 4-6, Tabla 1). Para el aislamiento de ambos EOB-DTPA y su Ga (III), el uso de la cromatografía de fase inversa se debe considerar como un método alternativo de purificación, sobre todo porque la descomposición de gel de sílice es probable cuando el uso de disolventes altamente polares.
El proceso de etiquetado de EOB-DTPA requiere el uso de alta pureza disolventes, productos químicos y equipos libre de metal para evitar la presencia de iones metálicos de la competencia, debido a 68 Ga estar presente en cantidades nanomolares (2 MBq de 68 Ga en una muestra de 1,75 ml igual a una concentración de nucleidos de 0,14 nM). Etiquetado de EOB-DTPA a 68 Ga se produce a un pH de 3,8 a 4,0 dentro de los cinco minnutos a temperatura ambiente. Las investigaciones sobre la eficiencia Ga-etiquetado 68 requieren determinación del rendimiento de marcaje, manteniendo las condiciones de reacción de pH, temperatura y tiempo de reacción, así como a partir de la actividad de 68 Ga constante o en un rango justificable. Para cada punto de datos (es decir, la concentración de ligando) el experimento debe realizarse al menos tres veces para proporcionar un nivel de confianza razonable, ya que las concentraciones tanto de ligando y 68 Ga son muy bajos y el rendimiento de marcaje, por tanto, sensibles incluso a pequeñas desviaciones de la condiciones de reacción. Por ejemplo, como los 68 Ga eluato edades, alícuotas de aumento de volumen tienen que ser retiradas para proporcionar una actividad de partida constante, lo que requiere cada vez mayores volúmenes de tampón. Además, el envejecimiento de los resultados de eluato en concentraciones crecientes de la Zn producto de desintegración 68, que en sí mismo puede actuar como un competidor para 68 Ga, por lo tanto afectar negativamente Labeling eficiencia. 13,34,35 etiquetado Prácticamente cuantitativa de 22-29 MBq 68 Ga se consigue en las condiciones mencionadas anteriormente, con cantidades de EOB-DTPA ≥ 0,7 g (Figura 9), con contenidos de libre 68 Ga ≤ 2% y aproximadamente 5 % de coloidal 68 Ga presentes en las muestras.
Mientras HPLC proporcionó la separación de línea de base superior libre de 68 Ga Ga y 68 [EOB-DTPA], no es adecuado para detectar coloidal 68 Ga. Por lo tanto, elegimos TLC para determinar la RCP durante las mediciones de estabilidad, en el que la cuantificación de la transferrina o unido a proteína se requiere 68 Ga. Encontramos separación de línea de base aceptable para este fin (Figura 10); sin embargo, el uso de cromatografía de filtración o métodos de exclusión de tamaño 15,36 para eliminar fracciones coloidales, seguido por análisis de HPLC, podrían considerarse como alternativas. El complejo Ga 68 exhibe una fuerte retención sobre placas de TLC (Rf = 0,3) si la muestra es retirada directamente de solución de etiquetado en oposición a las muestras a pH fisiológico (R f = 0,5). Sugerimos esta observación podría explicarse por los diferentes estados de protonación del complejo.
En las determinaciones de estabilidad in vitro de 68 trazadores Ga se realizan generalmente en PBS 15,17 o sistemas tampón alternativas que imitan el pH fisiológico 37, así como en soluciones que contienen apo-transferrina 37, que es el principal competidor para 68 Ga en la sangre, o 15,17 suero humano. En nuestros experimentos se requiere la adición de solución de hidróxido de sodio 0,1 M a PBS para ajustar el pH de las muestras a 7,4. No hemos podido afirmar que la concentración de fosfato influye en la velocidad de degradación, ya que los experimentos de estabilidad en soluciones de diferente concentración de fosfato (0,8 mM y 5,5 mM (A)) dio no reproduResultados cible. Sin embargo, hemos encontrado que una solución B, que contiene apo transferrina (1,6 mg / ml, que está dentro del alcance del contenido de plasma normal 38) y fosfato 0,8 mM (sangre humana generalmente exhibe un nivel de fosfato de 0,8 a 1,5 mM 39,40 ), provoca la descomposición a una velocidad comparable a la observable en el suero humano (C). En las soluciones de CA, después de 185 minutos el contenido del coloidal 68 Ga se había incrementado en un 24%, mientras que el contenido de la libertad de 68 Ga se había incrementado en un 11% en la solución A, 17% en la solución B y el 27% en la solución C (Tabla 2 ). El hecho de que 68 Ga formado por descomposición trazador es predominantemente presente como libre de 68 Ga en oposición a coloidal o unido a proteína 68 Ga en B y C puede ser debido a la saturación de transferrina o las tasas de unión a transferrina comparativamente lentas.
Para predecir una distribución tisular trazadores n- partición octanol / agua log coeficientesP o distribución coeficientes logD pueden ser determinados como la relación de concentraciones de actividad en las dos fases. Por definición, el parámetro logD no diferencia entre múltiples especies presentes en un medio, que lo hace adecuado para nuestros experimentos debido a la posibilidad de diferentes estados de protonación del trazador así como su descomposición en la fase acuosa. Para determinar logD por extracción del medio acuoso es generalmente tamponada con PBS para imitar las condiciones de la sangre. 17,43-45 Por razones mencionadas anteriormente hemos utilizado diluido PBS, que presenta una concentración de fosfato de 0,8 mM y el pH fisiológico. Después de la extracción con n-octanol y centrifugación, la eliminación de varias alícuotas de la misma fase permite inexactitudes causadas por pipeteado a reducirse. Debido a las muy bajas concentraciones de actividad en octanol uno debe tener cuidado para evitar la contaminación cruzada con la fase acuosa y para asegurar la transferencia cuantitativa en un vial separado. distribcoeficientes ution determinados por este procedimiento fueron reproducibles, y al mismo tiempo que permiten una estimación aproximada de la lipofilia, una comparación directa con un logP de Gd [EOB-DTPA] no es posible. Debido a la especificidad de Di-s [EOB-DTPA] resultante no principalmente de lipofilia sino que serían necesarios para proporcionar información más amplia sobre la biodistribución, así como la estabilidad in vivo de 68 Ga [EOB su captación hepatobiliar experimentos adicionales en los sujetos o las células vivas DTPA]. En total, una aplicación como agente de imagen para la perfusión y la fase temprana hepatobiliar es imaginable.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| primovist | Bayer | - | 0.25 M |
| gallium(III) chloride | Sigma-Aldrich Co. | 450898 | |
| water (deionized) | - | - | tap water deionizing equipment by Auma-Tec GmbH |
| hydrochloric acid 12 M | VWR | 20252.29 | |
| sodium hydroxide | Polskie Odczynniki Chemiczne S.A. | 810925429 | |
| oxalic acid | Sigma-Aldrich Co. | 75688 | |
| ethyl acetate | Brenntag GmbH | 10010447 | |
| silica gel | Merck KGaA | 1.10832.9025 | Geduran Si 60 0.063-0.2 mm |
| TLC silica gel 60 F254 | Merck KGaA | 1.16834.0001 | |
| methanol | VWR | 20903.55 | |
| ethanol | Brenntag GmbH | 10018366 | |
| eiethylether | VWR | 23807.468 | stored over KOH plates |
| ammonia solution (25%) | VWR | 1133.1 | |
| pH electrode | VWR | 662-1657 | |
| stirring and heating unit | Heidolph | 505-20000-00 | |
| pump | Ilmvac GmbH | 322002 | |
| frit | - | custom design | |
| NMR spectrometer | Bruker Coorporation | - | Ultra Shield 400 |
| mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific Inc. | - | |
| elemental analyser | Hekatech GmbH Analysentechnik | - | EuroVector EA 3000 CHNS |
| deuterated water D2O | euriso-top | D214 | 99.90% D |
| Material/Equipment required for labeling procedures | |||
| 68Ge/68Ga generator | ITG Isotope Technologies Garching GmbH | A150 | |
| pump and dispenser system | Scintomics GmbH | - | Variosystem |
| hydrochloric acid 30% (suprapur) | Merck KGaA | 1.00318.1000 | |
| water (ultrapur) | Merck KGaA | 1.01262.1000 | |
| sodium chloride (suprapur) | Merck KGaA | 1.06406.0500 | |
| sodium acetate (suprapur) | Merck KGaA | 1.06264.0050 | |
| glacial acetic acid (suprapur) | Merck KGaA | 1.00066.0250 | |
| sodium citrate dihydrate | VEB Laborchemie Apolda | 10782 | >98.5% |
| PS-H+ Cartridge (S) | Macherey-Nagel | 731867 | Chromafix |
| apo-Transferrin | Sigma-Aldrich Co. | T2036 | |
| PBS buffer (tablets) | Sigma-Aldrich Co. | 79382 | |
| human serum | Sigma-Aldrich Co. | H4522 | from human male AB plasma |
| flasks, columns, etc. | custom design | ||
| pH electrode | Knick Elektronische Messgeräte GmbH & Co. KG | 765-Set | |
| binary pump (HPLC) | Hewlett-Packard | G1312A (HP 1100) | |
| UV Vis detector (HPLC) | Hewlett-Packard | G1315A (HP 1100) | |
| radioactive detector (HPLC) | EGRC Berthold | ||
| HPLC C-18-PFP column | Advanced Chromatography Technologies Ltd. | ACE-1110-1503/A100528 | |
| HPLC glass vials | GTG Glastechnik Graefenroda GmbH | 8004-HP-H/i3µ | |
| pipette | Eppendorf | - | |
| plastic vials | Sarstedt AG & Co. | 6542.007 | |
| plastic vials | Greiner Bio-One International GmbH | 717201 | |
| activimeter | MED Nuklear-Medizintechnik Dresden GmbH | - | Isomed 2010 |
| tweezers | custom design | ||
| incubator | Heraeus Instruments GmbH | 51008815 | |
| vortex mixer | Fisons | - | Whirlimixer |
| centrifuge | Heraeus Instruments GmbH | 75003360 | |
| gamma well counter | MED Nuklear-Medizintechnik Dresden GmbH | - | Isomed 2100 |
| water for chromatography | Merck KGaA | 1.15333.2500 | |
| acetonitrile for chromatography | Merck KGaA | 1.00030.2500 | |
| trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | 91707 | |
| TLC radioactivity scanner | raytest Isotopenmessgeräte GmbH | B00003875 | equipped with beta plastic detector |
References
- Weinmann, H. J., et al. A new lipophilic gadolinium chelate as a tissue-specific contrast medium for MRI. Magn. Reson. Med. 22, 233-237 (1991).
- Stroszczynski, C., et al. Aktueller Stand der MRT-Diagnostik mit leberspezifischen Kontrastmitteln. Radiologe. 44, 1185 (2004).
- Van Beers, B. E., Pastor, C. M., Hussain, H. K. Primovist, Eovist - what to expect. J. Hepatol. 57, 421-429 (2012).
- Zech, C. J., Herrmann, K. A., Reiser, M. F., Schoenberg, S. O. MR Imaging in Patients with Suspected Liver Metastases: Value of Liver-specific Contrast Agent Gd-EOB-DTPA. Magn. Reson. Med. Sci. 6, 43-52 (2007).
- Leonhardt, M., et al. Hepatic Uptake of the Magnetic Resonance Imaging Contrast Agent Gd-EOB-DTPA: Role of Human Organic Anion Transporters. Drug Metab. Dispos. 38, 1024-1028 (2010).
- Wadas, T. J., Wong, E. H., Weisman, G. R., Anderson, C. Coordinating Radiometals of Copper, Gallium, Indium, Yttrium, and Zirconium for PET and SPECT Imaging of Disease. J. Chem. Rev. 110, 2858-2902 (2010).
- Ametamey, S. M., Honer, M., Schubiger, P. A. Molecular Imaging with PET. Chem. Rev. 108, 1501-1516 (2008).
- Cutler, C. S., Hennkens, H. M., Sisay, N., Huclier-Markai, S., Jurisson, S. S. Radiometals for Combined Imaging and Therapy. Chem. Rev. 113, 858-883 (2013).
- Henze, M., et al. PET Imaging of Somatostatin Receptors Using [68GA]DOTA-D-Phe1-Tyr3-Octreotide: First Results in Patients with Meningiomas. J. Nucl. Med. 42, 1053-1056 (2001).
- Hofmann, M., et al. Biokinetics and imaging with the somatostatin receptor PET radioligand 68Ga-DOTATOC: preliminary data. Eur. J. Nucl. Med. 28, 1751-1757 (2001).
- Blau, M., Nagler, W., Bender, M. A. Fluorine-18: a new isotope for bone scanning. J. Nucl. Med. 3, 332-334 (1962).
- Green, M. A., Welch, M. J. Gallium Radiopharmaceutical Chemistry. Int. J. Radiat. Appl. Instrum. B. 16, 435-448 (1989).
- Rösch, F. Past, present and future of 68Ge/68Ga generators. Appl. Radiat. Isot. 76, 24-30 (2013).
- Liu, S. The role of coordination chemistry in the development of target-specific radiopharmaceuticals. Chem. Soc. Rev. 33, 445-461 (2004).
- Haubner, R., et al. Development of (68)Ga-labelled DTPA galactosyl human serum albumin for liver function imaging. Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging. 40 (68), 1245-1255 (2013).
- Yang, W., Zhang, X., Liu, Y. Asialoglycoprotein Receptor-Targeted Radiopharmaceuticals for Measurement of Liver Function. Curr. Med. Chem. 21, 4-23 (2014).
- Chauhan, K., et al. 68Ga based probe for Alzheimer's disease: synthesis and preclinical evaluation of homodimeric chalcone in β-amyloid imaging. Org. Biomol. Chem. 12, 7328-7337 (2014).
- Chakravarty, R., Chakraborty, S., Dash, A., Pillai, M. R. A. Detailed evaluation on the effect of metal ion impurities on complexation of generator eluted 68Ga with different bifunctional chelators. Nucl. Med. Biol. 40, 197-205 (2013).
- Clevette, D. J., Orvig, C. Comparison of ligands of differing denticity and basicity for the in vivo chelation of aluminum and gallium. Polyhedron. 9, 151-161 (1990).
- Prinsen, K., et al. Development and evaluation of a 68Ga labeled pamoic acid derivative for in vivo visualization of necrosis using positron emission tomography. Bioorg. Med. Chem. 18, 5274-5281 (2010).
- Vogl, T. J., et al. Liver tumors: comparison of MR imaging with Gd-EOB-DTPA and Gd-DTPA. Radiology. 200, 59-67 (1996).
- Reimer, P., et al. Phase II clinical evaluation of Gd-EOB-DTPA: dose, safety aspects, and pulse sequence. Radiology. , 177-183 (1996).
- Ba-Ssalamah, A., et al. MRT der Leber. Radiologe. 44, 1170-1184 (2004).
- Scott, R. P. W. Journal of Chromatography Library. 22A, Elsevier Scientific Publishing Co. A137-A160 (1983).
- Reichenbaecher, M., Popp, J. Strukturanalytik organischer und anorganischer Verbindungen. , 1st, B. G. Teubner Verlag. Wiesbaden. (2007).
- Gross, J. H. Mass Spectrometry: A Textbook. , Springer. (2004).
- Ma, T. S., Rittner, R. C. Modern Organic Elemental Analysis. , Marcel Dekker, Inc. (1979).
- Mueller, D., et al. Simplified NaCl Based 68Ga Concentration and Labeling Procedure for Rapid Synthesis of 68Ga Radiopharmaceuticals in High Radiochemical Purity. Bioconjugate Chem. 23, 1712-1717 (2012).
- Roberts, T. R. Radio-column chromatography. Journal of Chromatography Library. 14, 103-132 (1978).
- Roberts, T. R. Radio-thin-layer chromatography. Journal of Chromatography Library. 14, 45-83 (1978).
- Green, M. A., Welch, M. J. Gallium radiopharmaceutical chemistry. Nucl. Med. Biol. 16, 435-448 (1989).
- Notni, J., Plutnar, J., Wester, H. J. Bone-seeking TRAP conjugates: surprising observations and their implications on the development of gallium-68-labeled bisphosphonates. EJNMMI Res. 2, 13 (2012).
- Schmitt-Willich, H., et al. Synthesis and Physicochemical Characterization of a New Gadolinium Chelate: The Liver-Specific Magnetic Resonance Imaging Contrast Agent Gd-EOB-DTPA. Inorg. Chem. 38, 1134-1144 (1999).
- 68Ga generator for positron emission tomography. Zhernosekov, K., Nikula, T. , DE102010037964B3 (2012).
- Simecek, J., Hermann, P., Wester, H. J., Notni, J. How is 68Ga Labeling of Macrocyclic Chelators Influenced by Metal Ion Contaminants in 68Ge/68Ga Generator Eluates? ChemMedChem. 8, 95-103 (2013).
- Baur, B., et al. Synthesis, Radiolabelling and In Vitro Characterization of the Gallium-68-, Yttrium-90- and Lutetium-177-Labelled PSMA Ligand, CHX-A''-DTPA-DUPA-Pep. Pharmaceuticals (Basel). 7, 517-529 (2014).
- Boros, E., et al. RGD conjugates of the H2dedpa scaffold: synthesis, labeling and imaging with 68Ga. Nucl. Med. Biol. 39, 785-794 (2012).
- Beck, W. S. Hematology. , 5th, MIT press. Cambridge, Massachusetts. (1998).
- Patel, V., Morrissey, J. Practical and Professional Clinical Skills. , 1, Oxford University Press Inc. New York. (2001).
- Bartke, A., Constanti, A. Basic Endocrinology. , 1, CRC Press. (1998).
- Bernstein, L. R. Mechanisms of Therapeutic Activity for Gallium. Pharmacol. Rev. 50, 665-682 (1998).
- Clausen, J., Edeling, C. J., Fogh, J. 67Ga Binding to Human Serum Proteins and Tumor Components. Cancer Res. 34, 1931-1937 (1974).
- Dumont, R. A., et al. Novel 64Cu- and 68Ga-Labeled RGD conjugates show improved PET imaging of αvβ3 integrin expression and facile radiosynthesis [Erratum to document cited in CA156:116856. J. Nucl. Med. 52, 1498 (2011).
- Pohle, K., et al. 68Ga-NODAGA-RGD is a suitable substitute for 18F-Galacto-RGD and can be produced with high specific activity in a cGMP/GRP compliant automated process. Nucl. Med. Biol. 39, 777-784 (2012).
- Notni, J., Pohle, K., Wester, H. J. Be spoilt for choice with radiolabelled RGD peptides: Preclinical evaluation of 68 Ga-TRAP(RGD)3. Nucl. Med. Biol. 40, 33-41 (2013).
