Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Olfaktoriske Behaviors analyseret ved Computer sporing af Published: August 20, 2016 doi: 10.3791/54346
Automatic Translation
1, 2, 1
1The Solomon H. Snyder Department of Neuroscience, Center for Sensory Biology, Johns Hopkins University School of Medicine, 2MRC Clinical Sciences Center, Imperial College London

Abstract

En central udfordring i neurobiologi er at forstå, hvordan neurale kredsløb fungerer til at guide passende dyreadfærd. Drosophila melanogaster er en fremragende model for sådanne undersøgelser på grund af sin komplekse adfærd, kraftfulde genetiske teknikker og kompakt nervesystem. Laboratorie adfærdsmæssige analyser har længe været anvendt med Drosophila til at simulere egenskaberne af det naturlige miljø og studere de neurale mekanismer bag de tilsvarende adfærd (f.eks phototaxis, kemotaksi, sensorisk indlæring og hukommelse) 1-3. Med den seneste tilgængeligheden af store samlinger af transgene Drosophila linjer, mærke specifikke neurale delmængder, har adfærdsmæssige analyser taget på en fremtrædende rolle at forbinde neuroner med adfærd 4-11. Alsidige og reproducerbare paradigmer sammen med de underliggende beregningsmæssige rutiner for dataanalyse, er uundværlige for hurtige test af kandidat flueliner med forskellige genotypes. Særligt anvendelige er opsætninger, som er fleksible i antallet af testede dyr, varighed eksperimenter og art præsenterede stimuli. Assayet af valg bør også generere reproducerbar data, der er let at erhverve og analysere. Her præsenterer vi en detaljeret beskrivelse af et system og protokol for analyse adfærdsmæssige reaktioner i Drosophila flyver i en stor fire-field arena. Opsætningen anvendes her til at analysere svarene fra fluer til en enkelt olfaktoriske stimulus; men den samme opsætning modificeres at teste flere olfaktoriske, visuelle eller optogenetic stimuli, eller en kombination af disse. Den olfaktometer setup registrerer aktiviteten af ​​flyve befolkninger reagerer på lugte, og anvendes beregningsmæssige analysemetoder til at kvantificere flyve adfærd. De indsamlede data analyseres for at få en hurtig udlæsning af en eksperimentel løb, som er afgørende for en effektiv dataindsamling og optimering af eksperimentelle betingelser.

Introduction

Evnen til at tilpasse sig og reagere på det eksterne miljø er afgørende for overlevelsen af ​​alle dyr. Et dyr har brug for at undgå farer, opsøge mad og finde hjælpere, og lære af tidligere erfaringer. Sensoriske systemer fungerer til at modtage en række stimuli, såsom visuelle, kemiske og mechanosensory, og sende disse signaler til det centrale nervesystem fortolkes og dekodes. Hjernen derefter dirigerer passende motoriske adfærd baseret på den opfattede miljø, såsom søgning efter føde eller flugt fra et rovdyr. Forstå, hvordan sansesystemer finde den eksterne verden, og hvordan hjernen afkoder og dirigerer beslutninger, er en stor udfordring i neurobiologi.

Drosophila melanogaster er et kraftfuldt modelsystem til at undersøge, hvordan neurale kredsløb guide adfærd. Udover at være enkelt og billigt at vedligeholde, Drosophila udviser mange forskelligartede og komplekse stereotype adfærd, men gøre det med en Compact nervesystem på omkring 100.000 neuroner. Kraftige genetiske teknikker eksisterer for at manipulere Drosophila genomet, og tusindvis af transgene linjer er blevet genereret, som selektivt og reproducerbart mærke de samme delmængder af neuroner 10-13. Disse transgene linjer kan anvendes til selektivt at manipulere aktiviteten af ​​de mærkede neuroner (aktivere eller inhibere), og disse manipulationer kan anvendes til at undersøge, hvordan neurale funktioner guide adfærd.

Flere adfærdsmæssige assays er blevet udviklet til at studere forskellige Drosophila adfærd. Drosophila, ligesom mange dyr, bruge deres lugtesans til at styre mange adfærdsmæssige valg, såsom at finde mad, finde hjælpere, og undgå farer. Lugtesansen er derfor en god sensorisk system til at undersøge, hvordan eksterne stimuli registreres og fortolkes af et dyrs nervesystem til at guide passende valg. Som sådan har en række assays blevet udviklet til undersøgelTing larvestadiet og voksne olfaktoriske adfærd. Traditionelt blev olfaktoriske adfærd i Drosophila analyseret ved en to-choice T-labyrint paradigme, som kan anvendes til analyse af medfødte og lært olfaktoriske adfærd 3. I denne analyse er omkring 50 fluer givet et valg mellem to rør: et rør indeholder omhandlede duft, og den anden indeholder en kontrol lugtstof (normalt lugt opløsningsmiddel). Fluerne er givet en fastsat periode til at træffe et valg, og så antallet af fluer, der er i de forskellige kamre tælles. Selvom T-labyrint er et simpelt assay til mange eksperimenter, er der flere begrænsninger. For eksempel er olfaktoriske adfærd måles på kun ét tidspunkt, og forskellige valg foretaget før dette tidspunkt kasseres. Tilsvarende er de individuelle adfærd af fluerne i populationen forsømt. Derudover T-labyrinten kræver manuel tælling af fluer, som kunne indføre fejl. Endelig, da der kun er to målte valg, dettereducerer den statistiske effekt ofte kræves for at registrerer små adfærdsændringer. Et alternativ til en to-choice T-labyrint er en fire-kvadrant (fire-field) olfaktometer 14-18. I dette assay dyr undersøge en arena, hvor hver af de fire hjørner af arenaen er fyldt med en potentiel kilde til odorized luft. Arenaen har en rynket stjerne facon at maksimere dannelsen af ​​fire eksperimentelt definerede lugt kvadranter. Hvis lugt leveres i et af hjørnerne er den indeholdt kun i denne ene kvadrant. De adfærd af dyrene kan spores som de kommer ind og forlader lugt kvadrant, og let i forhold til deres adfærd i de tre kontrolpunkter kvadranter. De fire-kvadrant olfaktometer assay dermed optegnelser rumlig og tidsmæssig adfærdsmæssige respons på lugt stimuli over en stor eksperimentel arena.

De fire-kvadrant olfaktometer blev først udviklet af Pettersson et al. 15 og Vet et al. 17 for at undersøge olfabrikken adfærdsmæssige reaktioner enkelte parasitiske Hymenoptera. Faucher et al. 18 og Semmelhack og Wang 16 tilpasset opsætningen til at overvåge olfaktoriske reaktioner af individuelle Drosophila. De fire-kvadrant olfaktometer er lige følsomme over for tiltrækkende og frastødende responser, giver mulighed for en bred vifte af test lugtstoffer og betingelser. Brugerdefineret-skriftlig flue tracking software, der er udviklet af Alex Katsov 19 og i øjeblikket vedligeholdt af Julian Brown (nærmere beskrevet i Materials), indført yderligere fordele til nyere implementeringer af fire-kvadrant olfaktometer 14,20-23. Det er nu muligt at analysere op til 100 fluer samtidigt ved høj rumlig (27,5 pixels / cm) og tidsmæssige (30 billeder pr sekund) opløsning, som gør det muligt at ekstrahere forskellige parametre, såsom position, hastighed og acceleration af fluer på noget tidspunkt. Dette gør det muligt undersøgelser af dynamikken i de fluer 'adfærdsmæssige reaktioner på lugte 20 Materialer tabel), den samme konfiguration tillader fleksible sporing perioder og kan anvendes til at spore fluer i op til 24 timer ved at tage billeder med en lavere rammehastighed. Denne mulighed blev brugt til at studere æglæggende adfærd af fluer og sammenligne deres kropsstillinger med ovipositional præferencer 14. De fire-field olfaktometer kan også anvendes til at studere reaktioner multimodal (f.eks olfaktoriske og visuelle) stimuli, eller at kombinere optogenetic 9 eller thermogenetic 21 stimulation med præsentationer af sensoriske stimuli. Endvidere den høje tidsopløsning tillader udvinding af baner for hver enkelt flue i ensemblet datasæt. Derfor metoden tillader undersøgelse olfaktoriske guidet population adfærd og også individuelle sociale interaktioner. De data, der genereres af dette assay er robuste og meget reproducerbar, tillader anvendelse af de fire-field olfaktometer for adfærdsmæssige skærme.

Vi beskriver her setup forsamling for en fire-kvadrant olfaktometer. Vi demonstrerer yderligere dens anvendelse i analyse olfaktoriske attraktion som reaktion på æble cider eddike og frastødning som reaktion på meget koncentreret ethyl propionat. Endelig beskriver vi og give eksempel kode for analysen af ​​de registrerede flue sporingsdata.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Opsætning Assembly

  1. Fremstilling den stjerneformede arena (19,5 cm 19,5 cm med 0,7 cm) ud af polytetrafluorethylen (PTFE) i henhold til de medfølgende tegning (supplerende materialer, SupplementalSketch_StarShapedArena.pdf). Arenaen kan fremstilles af en kommerciel eller en brugerdefineret facilitet.
  2. Erhverve to glasplader (20,25 cm x 20,25 cm med en tykkelse på 2 mm), og bore et hul (~ 0,7 cm i diameter) præcist i midten af ​​en af ​​glaspladerne under anvendelse af en diamant-belagt borekrone.
  3. Fremstilling en lystæt adfærd boks til den adfærdsmæssige arena. Også fremstille en lystæt kamera afkrydsningsfeltet for den infrarøde CCD-videokamera i henhold til de medfølgende tegninger (supplerende materialer, SupplementalSketch_LightTightBox.pdf). Kasserne kan fremstilles af en kommerciel eller en brugerdefineret facilitet.
  4. Monter klimaanlægget enhed på den bageste væg og LED arrays på sidevæggene af adfærden kassen. Placer temperaturfølereni adfærden boksen gennem en sidehul til tidstro temperatur feedback og justering (se figur 1 og 2 for detaljer).
  5. Fastgør IR-filter og cirkulær polarisator til kameraet, og montere enheden i kameraet kassen. Adfærden kasse og kamera kasse er adskilt af en glasrude for en bedre temperaturstyring af adfærden boksen (se figur 1 og 2 for detaljer).
  6. Slut Infrarød CCD-kamera til et kamera adapter. Tilslut kameraet adapteren til en USB konverter. Tilslut USB konverter til en USB-port på computeren for dataopsamling.
  7. Installere driveren til videokonverteren på computeren i henhold til producentens anvisninger. Eventuelt installere billedbehandling software leveret af producenten af ​​USB video konverter til at få adgang til en bredere vifte af kameraindstillinger og erhvervelse parametre.
  8. Forbind klimaanlægget enhed (gennem "output"På bagsiden af ​​temperatur controller) og temperaturen sonde (via" termoelement "på bagsiden af ​​temperaturregulator) til temperaturregulatoren. Placer sonden i adfærd feltet.
    Bemærk: styresystem Temperaturen i vores layout er stand til at opretholde kassen temperatur mellem 18 ° C og 30 ° C. Højere eller lavere temperaturer kan være nyttige for thermogenetic (dTrpA1, TrpM8 eller shibire ts) eksperimenter for at manipulere neuronal aktivitet eller hæmmer synaptisk transmission. For de fleste eksperimenter, holdes temperaturen ved 25 ° C.
  9. Saml lugt leveringssystem i de følgende trin (se figur 1B for detaljerede diagrammer og tilslutning fittings):
    1. Brug lufttryksregulatoren at kontrollere luften input fra den centrale luftsystem. Tilslut et carbon luftfilter (fyldt med trækul) til trykregulatoren at rense luften fra den centrale air system.
    2. Saml Strømningsstyresystem bestående af flere kanaler, der reguleres af høj opløsning flowmeter rør.
    3. Forbind udgangen fra carbon luftfilter det flowmeter rør via en manifold som vist i figur 1B og 2F. Direkte output af flowmeter rør gennem elektronisk styrede 3-vejs magnetventiler til at regulere, hvis ren luft forlader flowmålere er bortvist i rummet eller indgået skræddersyede lugt kamre 24.
    4. Installere solenoideventilen styreenhed ifølge producentens manual.
  10. Installer elektroniske luftmængdemåler ved at tilslutte den til en datafangstudstyr (DAQ) og en strømforsyning i overensstemmelse med producentens vejledning. Installer DAQ interface software til at kontrollere ens flow i hver kvadrant af arenaen før hver eksperiment.

2. Olfaktoriske Stimuli Forberedelse

  1. Forbered 5 lugtant kamre 24, som består af en plastik ydre beholder, glas indvendige beholder, en skræddersyet PTFE låg indsats, original beholder låg med centrale del fjernet, og to en-vejs ventiler.
    Bemærk: En O-ring omkring PTFE låg kunne bruges til at forhindre luftlækage fra lugt kammeret under lugt perfusion. Se figur 1 for skematisk og figur 2 for billeder af kamrene.
  2. Brug fire lugtstof kamre til kontrol opløsningsmidler, og et kammer for en test lugtstof. Fyld glasbeholdere med 1.000 pi opløsningsmiddel eller lugtstof fortynding (test lugtstoffer + passende opløsningsmidler, bland grundigt før eksperimenter), placer beholderen glas inde i tilsvarende plastik kammer (ikke løber ud væsken ind i plastik kammer) og stram låget . Sørg for altid at bruge en ren kammer til test lugtstof og kontroller opløsningsmidler.
    Bemærk: Olfaktoriske attraktion kan udløses af 1/16 fortynding af æble cider eddike (5% surhedsgrad) i water. I modsætning hertil kan olfaktoriske frastødning adfærd studeres ved anvendelse af en 10% fortynding af ethylpropionat i mineralolie. Kontrol stimuli i disse tilfælde er lugt- kamre med ren mineralsk olie.

3. Fly Forberedelse

  1. Rear fluer på standard cornmeal medium. Placer 30 mandlige og 30 kvindelige forældrenes fluer i en standard flaske, og lad dem lægge æg i 5 dage ved 25 ° C eller stuetemperatur.
  2. For hvert forsøg, indsamle nyligt eclosed (<1 dag gammel) 25 mandlige og 25 kvindelige flyver under korte CO 2 anæstesi.
  3. Hold fluer i et hætteglas med standard flue medium i 2-4 dage.
  4. 40-42 timer før forsøget, overføre fluerne uden CO 2 bedøvelse   til et hætteglas med ~ 10 ml 1% agarosegel. Dette vil holde fluerne befugtet uden mad, hvilket bidrager til at øge deres bevægelsesaktivitet.
    Bemærk: Mere end 90% af fluerne skal overleve sult. Nogle genotyper er mindre helbrededin, og kan ikke gøre det gennem en 40 timers sult. I de tilfælde, kortere perioder såsom 24-28 timer er acceptable, men bør være det samme for alle forsøgsbetingelser og gentagelser.

4. adfærdsmæssige reaktioner på attraktive og Repellent Lugtstoffer

  1. Tænd for temperatur controller og sæt den til 25 ° C.
  2. Tilslut lugtstof kamre (kontrol og test lugtstoffer) ved at indsætte slangen til udløbet af lugtstof kammer og til push-to-connect montering på adfærden kassen.
  3. Kontrollér flowet i hver kvadrant ved hjælp af luftstrømmen meter for at sikre, at kontrol og lugtstof luftstrømme er lig med 100 ml / min.
  4. Rengør PTFE flyve arena og glaspladerne med 70% ethanol 2-3 gange og give dem mulighed for fuldt ud at lufttørre (~ 3-4 min).
  5. Anbringer glaspladerne til arenaen med klemmer.
  6. Transfer fluer uden CO 2 bedøvelse ind i arenaen gennem hullet i en af glaspladerne. Aftis de overførslen, placere en cirkulær maske på hullet for at forhindre fluer i at undslippe.
    Bemærk: CO 2 anæstesi har vist sig at påvirke Drosophila adfærd 25 og bør ikke anvendes inden 24 timer af en adfærdsmæssig eksperiment.
  7. Placer arenaen med fluer i det lystæt kammer, forbinde de fire kontrol luftstrømme ved at forbinde slangen fastgjort til push-to-connect montering på adfærden boksen til arenaen hjørner, lukke døren af ​​kammeret og vente 10- 15 min for at lade fluerne akklimatisere sig det nye miljø. Hvis det er muligt, skal du skifte lysene ud i det rum, hvor der udføres forsøgene, for at undgå mulig minimal lys lækage, der kan skævhed den eksperimentelle resultat.
  8. Kør en 5-10 min kontroleksperiment, hvori fluer er udsat for 4 kontrol luftstrømme.
  9. Analyser af data med det samme (se Dataanalyse nedenfor) for at sikre, at fluerne er fordelt jævnt i arenaen, og Type Indeks er tættil 0. Dette trin er vigtigt, da det bekræfter, at der ikke er nogen ukontrollerede kilder til præference eller unddragelse som arena (lys lækker udefra, ujævn fordeling temperatur, ujævn arena, lugt forurening, etc.). Hvis fluerne er ujævnt fordelt, eller deres bevægelsesaktivitet er lav, kassere fluerne, rengøre arenaen igen (Trin 4.4) og bruge en ny batch af fluer til at gentage eksperimentet.
  10. Slut test lugtstof kammer til opsætningen ved at tænde de 3-vejs ventiler eller re-tilslutte stikket rør.
  11. Kør test eksperiment i 5-10 min og analysere dataene som diskuteret i afsnit 5 nedenfor (også se reference 14 og figur 3). Optagelser længere end 20 min kan resultere i datafiler, som kan være vanskelige at beregningsmæssigt proces. Hvis der ønskes længere eksperimenterende indspilninger, hurtigt stoppe og re-start tracking program. Dette resulterer i en ~ 10 sek kløft mellem eksperimentelle optagelser.
  12. Discard fluer.
  13. Clean arena og glasplader med 70% ethanol (Trin 4.4), og udskift stik rør i lystæt kabinet. For at fremskynde eksperimenter, kan en ny ren arena bruges og beskidt arena rengøres, mens de udfører eksperimentelle kørsler.
  14. Køre et andet eksperiment med en ny batch af fluer, hvis det kræves. Hvis der køre flere eksperimenter på samme dag, meget forsigtig for at sikre, at ingen lugtstof efterlades i systemet fra en tidligere testkørsel. Dette er normalt ikke et problem med lave koncentrationer af lugtstoffer eller med CO 2, men der kan være behov for stærkt koncentrerede stimuli op til en 24 timers mellemrum mellem eksperimentelle kørsler. Derudover kan alle rør efter flow-rør udskiftes, hvis der er mistanke odorant kontaminering under kontrolforsøg. Lad altid den tørre luft på mellem forsøgene til løbende at skylle systemet

5. Data Analysis

Bemærk: Den foreslåede flue erhvervelse sporing Software (nærmere beskrevet i Materials), sporer fluer i realtid under erhvervelse, og gemmer tidsstemplet og koordinater for alle registrerede fluer i * .dat format. Vi har udviklet en skræddersyet Matlab rutine til at konvertere data til en Matlab format, og for at analysere dataene. Kode eksempler er tilvejebragt i supplerende materiale, men detaljerne for gennemførelsen vil afhænge af den software, der bruges til dataopsamling.

  1. Læg de rå data. Opret en rumlig maske, der følger konturerne af arenaen og anvende masken til de rå data for at fjerne alle datapunkter, der falder uden for arenaen, da de repræsenterer støj (figur 4A, supplerende kodeks MaskSpatialFiltering.m, Score.m, DrawCircularMask. m).
  2. Fjern alle datapunkter, der bevæger sig med en hastighed under 0,163 cm / s længere end 3s, da disse data vil sandsynligvis være støj eller genereret af ikke-bevægelige fluer (figur 4B, supplerende kodeks TemporalFiltering.m).
  3. Visualiser resterende datapunkter ved at plotte dem alle på én gang eller som enkelte baner (Figur 3, supplerende kodeks SingleTrajectoryViewer.m).
    Bemærk: Placeringen af ​​lugt grænser i de fire-feltet sandsynligvis afhænger af en række faktorer, såsom karakteristika for hver lugtstof og luftmængde, der bruges. For eksempel vil meget volatile lugtstoffer sandsynligvis fylde lugt kvadrant mere fuldstændigt end mindre flygtige lugtstoffer. Det er således sandsynligt, at hver lugtstof kan udvise lidt forskellige lugt grænser. Anvendelsen af ​​en photoionization detektor til at måle lugt grænser kan være problematisk, som det anvender et vakuum til at prøve luft fra et bestemt sted, og så forstyrrer lugtstoffet koncentration ved at stedet. Ikke desto mindre kan lugt grænserne hurtigt estimeres på grundlag flyve adfærdsmæssige data. For eksempel kan en lugt grænse baseret på akkumulerede flyve spor som reaktion på forskellige lugte tydeligt ses i figur 3C og 3D.
  4. Calculate en attraktion indeks til at bestemme, om kontrolforsøg genererer ingen præference respons, og også at få adgang til reaktion på et lugtstof (eller optogenetic 9) stimulus. For at beregne en Type Index (AI), bruge den sidste 5 min af en kontrol eller test optagelse. For at få et mål for tiltrækning, der falder mellem en (absolut tiltrækning) og -1 (absolut frastødning), er følgende formel bruges til at beregne AI:
    ligning 1
    hvor N test er antallet af datapunkter i testen kvadrant, N-kontrol er det gennemsnitlige antal datapunkter i de tre kontrolpunkter kvadranter. Denne foranstaltning er intuitivt som ingen præference ville være angivet ved nær nul værdier. Det gør dog ikke korrekt angive, hvilken del af det samlede antal af fluer, der er placeret i lugtstoffet kvadrant. For at opnå dette mål, kan en Procent Index (PI) anvendes:
    ligning 2 hvor N test er antallet af datapunkter i testen kvadrant, og N samlede tal er det samlede antal datapunkter i alle fire kvadranter. Denne formel giver en foranstaltning, der falder mellem 0 og 1, med 0,25 svarende til ingen adfærdsmæssige præference (figur 3E og 4C, supplerende kodeks AttractionIndex.m).
  5. Kør 5-10 gentagelser af hver eksperimentel betingelse, ved anvendelse af en ny gruppe af fluer til hver gentagelse. Sammenlign attraktion indekser mellem betingelser eller imod kontrol ved hjælp af Kolmogorov-Smirnov ikke-parametrisk test (Figur 3F, kstest2 funktion i Matlab).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De fire-kvadrant olfaktometer assay optegnelser og analyserer de walking aktiviteter mange fluer over en stor adfærdsmæssig rum. Lugtstoffer kan indføres i de luft-strømme, der kommer ind et, to, tre eller alle fire kvadranter. I fravær af lugt, vil fluerne frit bevæge sig mellem alle fire kvadranter. Denne adfærd er afgørende for at observere, da det tyder på, at un-forsætlige fordomme ikke er blevet indført i analysen. Disse fordomme kan omfatte lys, temperatursvingninger, forskelle i luftstrømmen, eller lugt forureninger. Figur 3B viser de adfærdsmæssige reaktioner på de fire-kvadrant olfaktometer af 25 mandlige og 25 kvindelige flyver til tørre luft. Et enkelt fly-spor fra de indsamlede data er også fremhævet i figur 3B, og viser, at denne flue var udforske hele adfærdsmæssige arena. Tiltrækningen index score (AI) for alle de analyserede spor over 5-min testperiode er tæt på 0, indicating manglende tiltrækning til lugt kvadrant. Tilsvarende er andelen indeks (PI) af eksperimentet er 0,24, hvilket indikerer, at fluer fordeles ligeligt selv i alle fire kvadranter i 5-min testperiode.

De fire-field adfærdsmæssige respons på en attraktiv lugtstof er vist i figur 3C. Æble cider eddike indføres i luftstrømmen fra   øverst til venstre lugt kvadrant air-stream ved at placere en 6,25% fortynding af æble cider eddike i testen lugt kammer. De indsamlede flyve spor vist i gråt viser, at de fleste fluer indsamler i denne lugt kvadrant, og ikke længere udforske alle fire kvadranter. En enkelt farvet flue spor viser, at når en flue kommer ind i æble cider eddike lugt-kvadrant, det har en tendens til at forblive i det attraktive lugt kvadrant. AI på 0,94 for eksperimentet er tæt på en indikerer en stærk tiltrækning til denne lugtstof. PI på 0,92 viser, at 92% af fluerne remained i lugt kvadrant i den betragtede periode.

De fire-field adfærdsmæssige reaktion på en frastødende lugtstof er vist i figur 3D. En 10% fortynding af lugtstoffet ethylpropionat anbragt i en lugt kammer blev anvendt som lugt kilde til øverste venstre luftstrøm. De stor samling flyve spor for den analyserede eksperiment demonstrerer undgåelse af lugt kvadrant, der tyder på lugt-styrede frastødning. En enkelt farvet flue spor viser, at en flue, da den kom ind i lugt kvadrant, hurtigt vendte sig bort for at undgå lugt kvadrant. AI af -0,68 er mindre end 0, hvilket indikerer frastødning, og er tæt på -1, der indikerer en stærk frastødende lugtstof respons. PI på 0,06 til eksperimentet viser, at kun 6% (sammenlignet med ~ 25% under de neutrale lugt forsøgene) af de sporede flyve datapunkter blev fundet i lugt kvadrant i løbet af forsøget.

Figur 3E viser som diagram forholdet mellem AI og PI scoringer, og hvordan disse tal vedrører tiltrækkende eller frastødende adfærd.

De fire-field assay resulterer i robuste og reproducerbare olfaktoriske adfærd. Dette giver mulighed for kvantitative sammenligninger mellem kontrol- og eksperimentelle betingelser, som vist i figur 3F, og også muliggør identifikation af subtile olfactory svar, der afviger fra neutralitet.

Som opnås data ved høj rumlig og tidsmæssig opløsning, er det muligt at studere en række faktorer af adfærdsmæssige reaktioner, såsom baner af enkelte fluer (som vist i figur 3), samt karakterisere forskellige aktivitetsniveauer dynamik fluerne i en lugt felt (fx ændringer i retning og hastighed 19,20).

Det kan ofte være vanskeligt at placere fire-field arena i nøjagtig samme placering for hvert forsøg, især da hyppig rensning af arenaen er påkrævet. Den angivne analyser scripts kompensere for disse små variationer ved først at tilpasse data som vist i figur 4A. I dette tilfælde er formen af ​​de fire-field arena beregnes, og datapunkter, der ligger uden for dette rum fjernes. Disse sporede objekter repræsenterer ofte debris eller refleksioner, der fejlagtigt spores. Da de ikke ligger inden for arenaen og dermed repræsenterer støj, er det vigtigt, at disse datapunkter er fjernet for at forhindre fejlagtige dataanalyser. Tilsvarende er det også vigtigt at fjerne sporede datapunkter, der kan tyde støj eller ikke-bevægelige fluer i arenaen. For at opnå dette, er en analyse script udnyttet (og forudsat her), som fjerner datapunkter, der i det væsentlige ikke bevæger (som vist i figur 4B). Disse datapunkter er normalt i mindretal, men deres tilbageholdelse ville føre til fejl i analyser.

Type indeks og præference index scores kan beregnes efter en indstillet tidsperiode (f.eks ved afslutningen af en 5 min forsøg som vist i figur 3). Det skal dog bemærkes, at eftersom fluer spores med høj rumlig og tidsmæssig opløsning, kunne udføres lignende analyser under hele forsøget. Dette ervist i figur 4C, hvor Type Index og Procent Index scores beregnes i kontinuerlige 10-sec placeringer over det tidsrum. En sådan analyse giver en bedre forståelse af olfaktoriske ændringer, der kan opstå i hele eksperimentet, såsom tilvænning til et lugtstof.

figur 1
Figur 1:. Skematisk af fire-kvadrant olfaktometer (A) Opsætningen adfærd er sammensat af en lugt delivery system, temperaturregulator (ikke afbildet), billedoptagelse systemet (IR LED lys og IR CCD-kamera tilsluttet en computer), fire-kvadrant arena og lystæt adfærd og arena bokse. De røde cirkler udpege de tilsvarende komponenter vist i figur 2. (B) Detaljeret design af lugt delivery system. De grønne tegn repræsenterer forbindelse / konvertering størrelser af fittings. Rør af 1/16 ID og 1/8 OD er ​​mærket med gult mens de 1/8 ID og 1/4 OD er ​​mærket i pink. Forkortelser: IR, infrarød; CF, Compression Fitting; BF, Barbed Fitting, MNPT, Mand National Pipe Thread. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2:. Billeder af det olfaktoriske Assay Setup (A) Wide-field view kamera kasse og adfærd kassen. (B) View inside adfærd boksen. Temperaturføleren, konnektorrør, og IR LED arrays er mærket. (C) Fire-kvadrant arena. (D) Wide-field visning af lugt afgivelsessystem forbundet til adfærd boksen. Kameraet kasse er fjernet for at afsløre CCD-kameraet. (E (F) Eksempel af lugten rør forbundet til manifolden. (G) Høj opløsning strømningsrør regulere luftmængden. (H) Lugten levering slanger og konnektorer nedstrøms flowrørets regulatorer. (I) De magnetventiler regulere, hvis ren luft ledes gennem en lugt kammer eller udvist til rummet. (J) Lugten kamre er forbundet til envejsventiler, og indeholder en indre glasbeholder for lugtstoffet. (K) adfærd boks indeholder uden push-to-connect fittings, der forbinder til lugt levering slangen. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Eksempel data genereret ved hjælp af en fire-felt Lugtesansen Assay (A) Skematisk af de fire-field arena.. (B) Neutrale svar er observeret, når alle fire kvadranter indeholder kun tør luft perfusion. (C) Seværdighed svar på en 6,25% fortynding af æble cider eddike perfunderet fra den øverste venstre kvadrant. (D) frastødning adfærd udløst af 10% ethylpropionat. I figur 2B-2D er en enkelt bane fra den erhvervede data plottet. En farve gradient anvendes til at betegne tidsforløbet for optagelse, med blå og røde farver er starten og slutningen af ​​optagelserne, hhv. (E) Sammenligning af Type Index (AI) og procentdelen Index (PI). (F) Gennemsnitligt AI er af 3- 6 eksperimenter med ingen lugt (Control), æble cider eddike (ACV) og 10% Ethyl propionat (EP). Fejlsøjler indikerer SEM. Statistisk forskel blev vurderet ved Kolmogorov-Smirnov test. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4
Figur 4:. Eksempel data genereret af dataanalysen Steps (A) Spatial filtrering af data, der udføres af MaskSpatialFiltering.m at fjerne datapunkter, der falder uden for arenaen. Røde cirkler viser de første positioner af de kredse, der bruges til at definere grænserne for arenaen. Sorte cirkler er de endelige holdninger, erhvervet ved at montere cirklen skitserer til data (grå skraverede område inden for fire-felt). Røde prikker og sorte pilespidser indikerer datapunkter, der vil blive fjernet fra datasættet efter denne filtreringstrinnet. (B) Temporal filtrering af data, udført af TemporalFiltering.m. Denne filtrering trin fjerner datapunkter, der bevæger sig meget slowly eller slet ikke, da de er tilbøjelige til at blive genereret af ikke-bevægelige fluer eller ved snavs / refleksioner fra arenaen. En rød prik omgivet af en stiplet rød boks angiver positioner ~ 6.000 datapunkter med identiske koordinater, der vil blive fjernet af denne filtrering trin. (C) Type Index (AI) og Procent Index (PI), beregnet i 10 sek siloer over de sidste 5 minutter af et eksperiment fra AttractionIndex.m. Temporal profiler af disse indekser indeholder oplysninger om dynamikken i adfærdsmæssige reaktioner og kan anvendes til detaljeret analyse af adfærd. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De fire-field olfaktometer beskrevet her er et alsidigt adfærdsmæssige system til at studere de olfaktoriske responser af store populationer af vildtype og mutant Drosophila fluer. Hvert eksperiment tager ~ 1 time (herunder opsætning, eksperimentelle kørsler, og rengøring), og 4-6 eksperimenter kan rutinemæssigt udføres hver dag. Et typisk assay under anvendelse af 40-50 fluer i 5 minutter genererer ca. 450.000 spores datapunkter til analyse. Den beskrevne konfiguration kan også anvendes, med mindre modifikationer, for at overvåge bevægelserne af andre insekter eller insektlarver som reaktion på olfaktoriske eller andre sensoriske stimuli over en tidsperiode, der spænder fra min til dage. De fire-kvadrant-assay er følsom over for virkningerne af både tiltrækkende og frastødende stimuli. De fleste lugtstoffer generere attraktion indekser (AI) mellem -0,9 og 0,9 (ligning 1). En AI i området fra +0,5 til +1 betegner stærk tiltrækning adfærd fluerne til stimuli, hvorimod AI i området fra -0,5 til -1 erudløst af stærke afskrækningsmidler. Generelt bør en neutral reaktion fra kontrol lugte (tør luft, befugtet luft, mineralolie) falder mellem 0,1 og -0,1. AI ændrer ofte gennem hele testen eksperimentet, hvilket afspejler den tid fluer kræver at gå ind i de lugtstof Fjer, indledende tiltrækning og stigning på bevægeapparatet aktivitet over en roman stimulus, og den endelige desensibilisering som reaktion på stimulus. Pre-test kontrolforsøg er afgørende, og skal udføres omhyggeligt for at sikre, at fluer blev fordelt ensartet i arenaen i fravær af den ønskede stimulus.

Hyppigste årsager til rumlig bias fluer i arenaen er: ujævne luftstrømme, muligvis på grund afbrudt slange eller utilstrækkeligt fastspændt glasplader den stjerneformede arena (i vores erfaring, fluer er i stand til at påvise forskelle i luftstrømmen af ​​så lidt som 15 ml / min); ujævn temperaturfordeling på tværs af arenaen, der kan forbedres ved at indstilleklimaanlægget enhed for at generere svagere og mere diffus luftstrøm og / eller længere før overtagelsen periode (~ 20 min) for at sikre jævn temperatur på arenaen; minimal lys lækage gennem temperatursonden åbning, der kan reduceres ved at forsegle åbningen med sort tape; resterende lugt i arenaen eller i luften delivery system, i hvilket tilfælde setup (arena, flowrør, fittings af lystæt kabinet, osv) skal rengøres grundigt og lov til at tørre i flere dage eller udskiftes, hvis det er muligt.

Vedligeholdelse af olfaktoriske udstyr er vigtig for pålidelige og ensartede resultater. Push-to-connect beslag på den adfærd boksen og luftindtag og indervægge arenaen skal rengøres med ethanol efter hver eksperiment, hvis der anvendes stærke lugte, og fik lov at tørre helt. Glaspladerne skal vaskes tre gange med en 70% ethanol, hvilket er normalt tilstrækkeligt at fjerne tilbageværende lugt og snavs fra pladerne, men hexan er nyttigfjerne organisk forbindelse deponeret af fluer (f.eks feromoner bestående af lange carbonhydridkæder). Sæbe er generelt ikke anbefales, da det som regel indeholder aromatiske komponenter, som ville påvirke olfaktoriske adfærd. Adfærden boksen bør forblive tilsluttet til de tørre luftindtag mellem eksperimenter (f.eks natten over) for at lette fjernelse af resterende lugte fra systemet.

Hvis lokomotorisk aktivitet af fluerne er lav, kan de genererer for få datapunkter, hvilket ofte resulterer i en støjende og variabel Type Index. Længere sult og optagetider kan bidrage til at løse dette problem. Hvis der derimod fluerne er syge, 24-28 timer af sult ville generelt være tilstrækkelig til forøgelse bevægelsesevne aktivitet, så længe det er konsistent hele eksperimenter. Der er en fin balance mellem at opretholde en sund tilstand af fluerne og stigende bevægelse. 40 timers sult kan anvendes som udgangspunkt, og senere modificeret somnødvendig baseret på de eksperimentelle resultater. Seværdighed Indexes vil være noget påvirket af varigheden af ​​sult, derfor er det vigtigt at sulte alle forsøgsdyr for samme periode for at undgå forstyrrende effekter af sult tid. Længere sult gange normalt gør frastødende reaktioner svagere (tættere på 0), og attraktive reaktioner stærkere. Tør luft kontrol luftstrømme tendens til at udtørre fluer, og bør ikke anvendes i mere end 40 min.

De fire-kvadrant olfaktometer kan anvendes til at studere reaktioner af enkelte 16,18 eller flere fluer til en enkelt stimulus eller at studere valg præference mellem stimuli. For eksempel kunne forskellige lugte skal anvendes i hver af de fire kvadranter. Dette kunne også anvendes til at bestemme reaktionerne på lugt-blandinger ved at undersøge grænserne for lugt-kvadranter. Det skal bemærkes, at selv om tracking system tillader individuelle spor, der skal isoleres fra de indsamlede data, er detmuligt, at enkelte fluer kan opføre sig anderledes, når analyseres som del af en gruppe, end når de er testet alene. For eksempel udviser grupper af fluer øget lugt-styrede frastødning på grund af fysiske interaktioner mellem fluer 26. Sporingssystemet og layout kan også tilpasses til anvendelse i ikke-olfaktoriske assays. Rammerne assay kan nemt rumme en LED-array 9 for optogenetic stimulation, eller en termisk plade 27 for thermogenetics. Systemet kan også være indrettet til at undersøge adfærdsmæssige valg af en tidsskala af mange timer, for eksempel for at studere æglægning adfærd 14. I dette tilfælde erhvervelse frame rate skal justeres for at undgå dannelsen af ​​store datafiler, og en kilde til fugtighed og substrat (1% agarosegel) skal tilvejebringes som æglægning substrat.

En begrænsning af denne opsætning er, at fluerne spores som IR-reflekterende objekter i og under Arena-hvis ethvert element af en optogenetic ellerthermogenetic eksperiment afspejler IR, de irrelevante datapunkter bliver nødt til at blive fjernet i efterbehandlingen. I øjeblikket er det heller ikke muligt at filme fluer på en rumlig opløsning, der giver forskellige fluer at være konstant skelnes, men dette kan forbedres i fremtiden ved hjælp af mere avancerede videokameraer. En anden begrænsning af det nuværende system er, at bevægelsen af ​​fluer er begrænset til to dimensioner for at fremme walking adfærd, og vil forhindre olfaktoriske-inducerede reaktioner flyrejse.

Det skal bemærkes, at yderligere automatiserede assays også er blevet udviklet for at undersøge olfaktoriske adfærd af enkelte eller grupper af fluer. Den mest lignende design til analysen beskrevet her er en metode udviklet af Beshel og Zhong 28. I dette assay er svarene fra ~ 30 fluer overvåges i en lille cirkulær arena (ca. en fjerdedel området af de fire-field arena), hvori lugt leveres fra 1 ud af 4 lugt havne langs arenaen wall, og fjernes gennem et hul i midten af ​​det cirkulære arena. Udover en mindre arena, andre design forskelle omfatter adfærd, der udføres under lysforhold, og lugtstoffer primært koncentreret tæt på lugt-porte (i stedet for hele lugtstof kvadrant som anvist af de rynket vægge fire-field arena). Ikke desto mindre, den cirkulære arena er en egnet fremgangsmåde til screening olfaktoriske responser af fluer, og kunne tilpasses fluen sporing design beskrevet her.

En alternativ fremgangsmåde er at samtidigt overvåge aktiviteten af ​​mange enkelt fluer som reaktion på lugte. I Flywalk analysen, er individuelle fluer placeret i små rør, og deres svar spores når lugtstoffer perfunderes gennem røret 29,30. Ændringer i fremad- eller bagudrettet eller ændringer i hastigheder, kan anvendes til at måle, om et lugtstof er generelt tiltrækkende eller frastødende. Dette assay, som de fire-field assay sporer automatisk flue movements, og så kan bruges til hurtigt at måle olfaktoriske svar på en bred vifte af lugte. Men i modsætning til fire-feltet, komplekse motoriske dynamik, såsom bane dreje vinkler og potentielle sociale interaktioner, savnet, måske i Flywalk analysen optagelse.

Automatisk sporing af enkelt walking fluer er også blevet tilpasset til en T-labyrint assay 31,32. I dette assay er fluer placeret i små kamre i hvilke lugte perfunderes fra hver ende af kammeret, og udgang via en port i midten af ​​kammeret. Positionerne af fluerne også automatisk spores. This efterligner, på en enkelt flue skala, en T-labyrint ramme. I kombination med optogenetics har dette assay blevet særligt velegnet til analyse neurale kredsløb medierer olfaktoriske indlæring og hukommelse, og kan også anvendes til at måle de olfaktoriske præferencer enkelt fluer. Svarende til Flywalk, det kan ikke overvåge komplekse aktivitet dynamik, der kan opstå over større rumlige områder, Som dem, der opstår i løbet af fødevarebårne søger 14, eller handlinger, der forekommer kun i flyve befolkninger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Air delivery system  (Quantity needed)
Tubing and connectors
Thermoplastic NPT(F) Manifolds Cole-Parmer, IL, USA R-31522-31 1
Hex reducing  nipple (1/4MNPT->1/8MNPT) McMaster-Carr, IL, USA 5232T314 1
Tubing (ID:1/8) McMaster-Carr, IL, USA 5108K43 50 Ft
Tubing (ID:1/16) McMaster-Carr, IL, USA 52355K41 100 Ft
Barbed tube fittings McMaster-Carr, IL, USA 5117K71 1 pack
Push-to-connect tube fittings McMaster-Carr, IL, USA 5779K102 4
Barbed Tube Fittings (1/4MNPT->1/8BF) McMaster-Carr, IL, USA 5463K439 1 pack (10)
Barbed Tube Fittings (1/8MNPT->1/8BF) McMaster-Carr, IL, USA 5463K438 2 pack (10) 
Barbed Tube Fittings (1/8MNPT->1/16BF) McMaster-Carr, IL, USA 5463K4 2 pack (10) 
Barbed Tube Fittings (1/4MNPT->1/4BF) McMaster-Carr, IL, USA   5670K84 1
Hex head plug McMaster-Carr, IL, USA 48335K152 1
Air pressure regulator, air filter and flowmeters (Quantity needed)
Labatory gas drying unit W A HAMMOND DRIERITE CO LTD, OH, USA Model: L68-NP-303; stock #26840 1
Multitube frames for 150 mm flowtubes Cole-Parmer, IL, USA R03215-30 1
Multitube frames for 150 mm flowtubes Cole-Parmer, IL, USA R03215-76 1
150 mm flowtubes Cole-Parmer, IL, USA R-03217-15 9
Valve Cartridge Cole-Parmer, IL, USA R-03218-72 9
Precision Air regulator McMaster-Carr, IL, USA 6162K13 1
Soleniod valves Automate Scientific, Berkeley, CA 02-10i 4
Solenoid valve controller ValveLink 8.2, Automate Scientific, Berkeley, CA 01-18 1
Electronic flow meter Honeywell AWM3100V 1
DAQ (NI USB-6009, National Instruments) and a  National Instruments NI USB-6009 1
Power supply Extech Instruments 382200 1
Odor chambers
Polypropylene Wide Mouth jar 2 oz; 60 ml Nalgene 562118-0002 At least 5 are required per experiment, but a separate chamber is required for each dillution of each odorant. Available at Container Store, part #635114)
Glass odor chamber, 0.25 oz Sunburst Bottle LB4B At least 5 are required per experiment 
"In" valve for odor chamber Smart Products, Inc., CA, USA 214224PB-0011S000-4074 1 of these parts is used per odor chamber but they need to be replaced frequently
"Out" valve for odor chamber Smart Products, Inc., CA, USA 224214PB-0011S000-4074 1 of these parts is used per odor chamber but they need to be replaced frequently
O ring RT Dygert International, MN, USA AS568-029 Buna-N O-R 1 pack (100)
Fly arena, camera and behavior boxes (Quantity needed)
Behavior and camera box material Interstate plastics, CA, USA ABS black extruded (https://www.interstateplastics.com/Abs-Black-Extruded-Sheet-ABSBE~~ST.php) 1803 sq inch
Teflon for fly arena and odor chamber inserts, 3/8" thick, 12" x 12" McMaster-Carr, IL, USA 8545K27  1
Glass plates, 1/8" Thick, 9" x 9" McMaster-Carr, IL, USA 8476K191  2
Dual action thermoelectric controller WAtronix Inc, CA, USA DA12V-K-0 1
IR LED array Advanced Illumination, Rochester, VT, USA AL4554-88024, PS24-TL 2 LED arrays and one power supply
Air conditioner Unit Melcor Store  MAA280T-12 1
Imaging system (Quantity needed)
Cosmicar/Pentax C21211TH (12.5 mm F/1.4) C-mount Lens B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA PEC21211 KP 1
CCXC-12P05N Interconnect Cable B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA SOCCXC12P05N 1
DC-700 Camera Adapter B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA SODC700 1
B+W 40,5 093 IR filter B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA 65-072442 1
TiFFEN 40.5 mm Circular polarizer Amazon 1
IR Videocamera Industrial Vision Source, FL, USA Sony XC-EI50 (SY-XC-E150) 1
USB video converter The Imagingsource, NC, USA DFG/USB2-It 1
iFlySpy2 (fly tracking software) Julian Brown, Stanford, Calfornia: julianrbrown@gmail.com iFlySpy2 1
IC Capture 2.2 software The Imagingsource, NC, USA (http://www.theimagingsource.com/en_US/products/software/iccapture/)
Miscellaneous (Quantity needed)
Dremel rotary tool Dremel, Racine, WI, USA Dremel 8000-03  1
Diamond-coated drill bits for glass cutting Available from various suppliers; MSC industrial Supply Co, Melville, NY 90606328 1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Benzer, S. Behavioral mutants of Drosophila isolated by countercurrent distribution. Proc Natl Acad Sci U S A. 58 (3), 1112-1119 (1967).
  2. Thorpe, W. H. Further studies on pre-imaginal olfactory conditioning in insects. Proc R Soc B. 127 (848), 424-433 (1939).
  3. Tully, T., Quinn, W. G. Classical conditioning and retention in normal and mutant Drosophila melanogaster. J Comp Physiol A. 157 (2), 263-277 (1985).
  4. Anholt, R. R., Mackay, T. F. Quantitative genetic analyses of complex behaviours in Drosophila. Nat Rev Genet. 5 (11), 838-849 (2004).
  5. Vosshall, L. B. Into the mind of a fly. Nature. 450 (7167), 193-197 (2007).
  6. Wu, M. N., Koh, K., Yue, Z., Joiner, W. J., Sehgal, A. A genetic screen for sleep and circadian mutants reveals mechanisms underlying regulation of sleep in Drosophila. Sleep. 31 (4), 465-472 (2008).
  7. Dankert, H., Wang, L., Hoopfer, E. D., Anderson, D. J., Perona, P. Automated monitoring and analysis of social behavior in Drosophila. Nat Methods. 6 (4), 297-303 (2009).
  8. Branson, K., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. High-throughput ethomics in large groups of Drosophila. Nat Methods. 6 (6), 451-457 (2009).
  9. Aso, Y., et al. Mushroom body output neurons encode valence and guide memory-based action selection in Drosophila. Elife. 3, e04580 (2014).
  10. Pfeiffer, B. D., et al. Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (28), 9715-9720 (2008).
  11. Pfeiffer, B. D., et al. Refinement of tools for targeted gene expression in Drosophila. Genetics. 186 (2), 735-755 (2010).
  12. Venken, K. J., et al. Genome engineering: Drosophila melanogaster and beyond. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. , (2015).
  13. Diao, F., et al. Plug-and-play genetic access to drosophila cell types using exchangeable exon cassettes. Cell Rep. 10 (8), 1410-1421 (2015).
  14. Lin, C. C., Prokop-Prigge, K. A., Preti, G., Potter, C. J. Food odors trigger Drosophila males to deposit a pheromone that guides aggregation and female oviposition decisions. Elife. 4, (2015).
  15. Pettersson, J. An aphid sex attractant. Insect Systematics & Evolution. 1 (1), 63-73 (1970).
  16. Semmelhack, J. L., Wang, J. W. Select Drosophila glomeruli mediate innate olfactory attraction and aversion. Nature. 459 (7244), 218-223 (2009).
  17. Vet, L. E. M., Lenteren, J. C. V., Heymans, M., Meelis, E. An airflow olfactometer for measuring olfactory responses of hymenopterous parasitoids and other small insects. Physiological Entomology. 8 (1), 97-106 (1983).
  18. Faucher, C., Forstreuter, M., Hilker, M., de Bruyne, M. Behavioral responses of Drosophila to biogenic levels of carbon dioxide depend on life-stage, sex and olfactory context. J Exp Biol. 209 (Pt 14), 2739-2748 (2006).
  19. Katsov, A. Y., Clandinin, T. R. Motion processing streams in Drosophila are behaviorally specialized. Neuron. 59 (2), 322-335 (2008).
  20. Gao, X. J., et al. Specific kinematics and motor-related neurons for aversive chemotaxis in Drosophila. Curr Biol. 23 (13), 1163-1172 (2013).
  21. Gao, X. J., Clandinin, T. R., Luo, L. Extremely sparse olfactory inputs are sufficient to mediate innate aversion in Drosophila. PLoS One. 10 (4), e0125986 (2015).
  22. Ronderos, D. S., Lin, C. C., Potter, C. J., Smith, D. P. Farnesol-detecting olfactory neurons in Drosophila. J Neurosci. 34 (11), 3959-3968 (2014).
  23. Riabinina, O., et al. Improved and expanded Q-system reagents for genetic manipulations. Nat Methods. 12 (3), 219-222 (2015).
  24. Lundstrom, J. N., Gordon, A. R., Alden, E. C., Boesveldt, S., Albrecht, J. Methods for building an inexpensive computer-controlled olfactometer for temporally-precise experiments. Int J Psychophysiol. 78 (2), 179-189 (2010).
  25. Colinet, H., Renault, D. Metabolic effects of CO2 anaesthesia in Drosophila melanogaster. Biology Letters. 8 (6), 1050-1054 (2012).
  26. Ramdya, P., et al. Mechanosensory interactions drive collective behaviour in Drosophila. Nature. 519 (7542), 233-236 (2015).
  27. Ofstad, T. A., Zuker, C. S., Reiser, M. B. Visual place learning in Drosophila melanogaster. Nature. 474 (7350), 204-207 (2011).
  28. Beshel, J., Zhong, Y. Graded encoding of food odor value in the Drosophila brain. J Neurosci. 33 (40), 15693-15704 (2013).
  29. Steck, K., et al. A high-throughput behavioral paradigm for Drosophila olfaction - The Flywalk. Sci Rep. 2, 361 (2012).
  30. Thoma, M., Hansson, B. S., Knaden, M. High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm. J. Vis. Exp. (106), (2015).
  31. Claridge-Chang, A., et al. Writing memories with light-addressable reinforcement circuitry. Cell. 139 (2), 405-415 (2009).
  32. Parnas, M., Lin, A. C., Huetteroth, W., Miesenbock, G. Odor discrimination in Drosophila: from neural population codes to behavior. Neuron. 79 (5), 932-944 (2013).

Tags

Neuroscience neurobiologi sensorisk biologi lugtstoffer feromoner olfaktoriske adfærd assay Matlab dataanalyse eddike flue motion tracking fire-felt olfaktometer
Olfaktoriske Behaviors analyseret ved Computer sporing af<em&gt; Drosophila</em&gt; I en fire-kvadrant olfaktometer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lin, C. C., Riabinina, O., Potter,… More

Lin, C. C., Riabinina, O., Potter, C. J. Olfactory Behaviors Assayed by Computer Tracking Of Drosophila in a Four-quadrant Olfactometer. J. Vis. Exp. (114), e54346, doi:10.3791/54346 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter