התנהגויות חוש הריח assayed ידי מעקב ממוחשב של<em> תסיסנית</em> בתוך אולפקטומטר ארבעה-רביע
Summary
We describe here a behavioral setup and data analysis method for assaying olfactory responses of up to 100 vinegar flies (Drosophila melanogaster). This system may be used with single or multiple olfactory stimuli, and adaptable for optogenetic activation or silencing of neuronal subsets.
Abstract
אתגר מרכזי בנוירוביולוגיה הוא להבין כיצד מעגלים עצביים לתפקד להנחות התנהגויות בעלי חיים מתאימות. תסיסנית היא מערכת מודל מצוינת עבור חקירות כאלה בשל ההתנהגויות המורכבות שלה, טכניקות גנטיות חזקות, ומערכת עצבים קומפקטית. מבחני התנהגות מעבדה כבר זמן רב בשימוש עם תסיסנית לדמות תכונות של הסביבה הטבעית לחקור את המנגנונים העצביים שבבסיס את ההתנהלויות (למשל phototaxis, chemotaxis, למידה חושית וזיכרון) 1-3. עם הזמינות האחרונות של אוספים גדולים של קווי תסיסנית מהונדס כי תווית תת עצביים ספציפיים, מבחני התנהגות לקחו על תפקיד בולט לקשר נוירונים עם התנהגויות 4-11. פרדיגמות צדדית לשחזור, יחד עם השגרה חישובית הבסיסית לניתוח נתונים, הן הכרחיות עבור בדיקות מהירות של קווים לטוס מועמד עם genotyp השונהes. שימושי במיוחד הם setups גמישים במספר לחיות ניסוי, משך הניסויים והטבע בגירויים מוצגים. את assay של בחירה צריך גם להפיק נתונים לשחזור כי הוא קל לרכוש ולנתח. כאן, אנו מציגים תיאור מפורט של מערכת ופרוטוקול עבור assaying תגובות התנהגותיות של תסיסנית זבובים בתוך זירת ארבעה שדה גדולה. ההתקנה משמשת כאן assay תגובות של זבובים לגירוי חוש ריח יחיד; עם זאת, אותה התכנית ההתקנה עשויה להיות שונה כדי לבדוק הרחה מרובה, גירויים חזותיים או optogenetic, או שילוב של אלה. התקנת אולפקטומטר מתעדת את הפעילות של אוכלוסיות זבוב להגיב לריחות, ושיטות אנליטיות חישובית מוחלות לכמת התנהגויות זבוב. הנתונים הנאספים מנותחים לקבל לקריאה מתוך מהירה של ריצת ניסיוני, אשר הינה הכרחית עבור איסוף נתונים יעיל אופטימיזציה של תנאי הניסוי.
Introduction
היכולת להסתגל ולהגיב הסביבה החיצונית היא קריטית להישרדות של כל בעלי החיים. בעל חיים צריכים למנוע סכנות, לחפש מזון למצוא בנות זוג, וללמוד מניסיונם הקודם. מערכות חושיות לתפקד לקבל מגוון של גירויים, כגון חזותי, כימי mechanosensory, ולשלוח אותות אלה למערכת העצבים המרכזית צורך לפרש מפוענח. המוח ואז מפנה התנהגויות מוטוריות המתאים בהתבסס על הסביבה הנתפסת, כגון תר אחר מזון או לברוח טורף. הבנה כיצד מערכות חושיות לזהות את העולם החיצוני, וכיצד המוח מפענח ומפנה החלטות, הוא אתגר גדול בנוירוביולוגיה.
תסיסנית היא מערכת מודל עוצמה על חקירת התנהגויות מדריך מעגלים עצביים איך. מלבד היותו פשוט וזול יותר לתחזק, תסיסנית תערוכה רבות התנהגויות מגוונות ומורכבות סטריאוטיפיות, עדיין עושה זאת עם compact מערכת העצבים של כ 100,000 נוירונים. טכניקות גנטיות עצמה קיימות מניפולציה של הגנום תסיסנית, ואלף קווים מהונדסים נוצרו כי סלקטיבי reproducibly לתייג אותה תת הקבוצות של נוירונים 10-13. קווים מהונדסים אלה יכולים לשמש כדי לתפעל את הפעילות באופן סלקטיבי של נוירונים שכותרתו (להפעיל או לעכב), ואת המניפולציות האלה יכולים לשמש כדי לחקור התנהגויות מדריך פונקציות איך עצבי.
מבחני התנהגות נפוצים פותחו ללימוד התנהגויות תסיסנית שונות. תסיסנית, כמו בעלי חיים רבים, להשתמש בחוש הריח שלהם להדרכת בחירות התנהגותיים רבות, כגון מציאת מזון, מציאת בני זוג, לבין הימנעות סכנות. Olfaction לכן מערכת חושית טובה חוקר כיצד לגירויים חיצוניים מזוהים ופורשו על ידי מערכת העצבים של בעלי חי להנחות בחירות מתאימות. ככזה, מספר מבחני פותחו עבור investigaזחל טינג והתנהגויות הרחה מבוגרת. באופן מסורתי, התנהגויות ההרחה תסיסנית היו assayed ידי פרדיגמת שתי הבחירה T-מבוך, אשר ניתן להשתמש בהם עבור assaying מולד למדו התנהגויות ההרחה 3. ב assay זה, כ -50 זבובים מקבלים בחירה בין שני צינורות: צינור אחד מכיל את הריח מדובר והשני מכיל odorant מלא (בדרך כלל ממס הריח). הזבובים ניתנים לתקופה קצובה של זמן לעשות בחירה, ולאחר מכן את מספר הזבובים הנמצאים בתאים השונים נספר. למרות T-המבוך הוא assay פשוט עבור ניסויים רבים, ישנם מספר מגבלות. לדוגמא, התנהגויות הרחה נמדדות רק בנקודת זמן אחת, ואת האפשרויות שונות שנעשו לפני נקודת זמן זו מבוטלות. בדומה לכך, התנהגויות הפרט של הזבובים בתוך האוכלוסייה מוזנחות. בנוסף, T-המבוך דורש ספירה ידנית של זבובים, אשר עשוי להציג שגיאות. לבסוף, שכן יש רק שתי אפשרויות מדודות, זהמקטין את הכח הסטטיסטי נדרש לעתים קרובות כדי לזהות שינויי התנהגותיים עדינים. חלופת מבוך T ושתיים בחירה היא של ארבעה רביעים (ארבעה-שדה) אולפקטומטר 14-18. ב assay זה, חיות לחקור זירה שבה כל אחת מארבע הפינות של הזירה מתמלאת מקור פוטנציאלי של אוויר odorized. הזירה יש צורת כוכב המכווץ על מנת למקסם את ההיווצרות של ארבעה רביעי ריח מוגדרים באופן ניסיוני. אם ריח מסופק באחת הפינות ואז הוא מוכל רק באותה ברבע אחד. ההתנהגויות של בעלי החיים ניתן לעקוב כפי שהוא להיכנס ולצאת ברבעים הריח, ובקלות לעומת התנהגותם הרביעים המלאים השלושה. את assay אולפקטומטר הארבעה ברבע ובכך רשום בתגובה במרחב ובזמן התנהגותיות לגירויי הריח פני זירה ניסיונית גדולה.
אולפקטומטר ארבע ברבע פותחה לראשונה על ידי Pettersson et al. 15 Vet et al. 17 לחקור את olתגובות מפעל התנהגותיים של דבוראים טפילים פרט. Faucher et al. 18 Semmelhack וואנג 16 התאימו את ההגדרה כדי לפקח על התגובות חוש הריח של תסיסנית הפרט. אולפקטומטר הארבעה ברבע רגיש לא פחות לתגובות אטרקטיביות ודוחות, המאפשר מגוון רחב של בדיקה ניחוחי ותנאים. תוכנת מעקב-אישית בכתב זבוב, שפותחה על ידי אלכס Katsov 19 ומתוחזק כיום על ידי ג'וליאן בראון (המפורטים חומרים), הציג יתרונות נוספים למימושים עדכנית יותר של אולפקטומטר ארבע ברבע 14,20-23. עכשיו זה אפשרי כדי assay עד 100 זבובים בו זמנית מרחבית גבוהה (27.5 פיקסלים / ס"מ) ובזמן (30 פריימים לשנייה) רזולוציה, המאפשר חילוץ פרמטרים שונים, כגון מיקום, מהירות ותאוצה של זבובים בכל נקודת זמן. זה מאפשר חקירות הדינמיקה של תגובות התנהגותיות "הזבובים לריחות 20 </sעד>. יצוין, עם זאת, כי זהותו של זבובים בודדים בתוך האוכלוסייה בתקופת המעקב כולו אינו נשמר. במקום זאת, כל מסלול זבוב נרשם עוד שני מסלולי זבוב לא מצטלבים. בנקודה זו, שירים חדשים מוקצים לאחר הזבובים לסטות. על ידי שילוב תוכנה לכיד וידאו אחר (המפורטים חומרי טבלה), אותה התצורה מאפשרת תקופות מעקב גמישות ויכולה לשמש למעקב אחר זבובים עד 24 שעות על ידי לקיחת תמונות בקצב מסגרת נמוכה. אפשרות זו שמשה ללמוד התנהגויות הטלה של זבובים ולהשוות תנוחות הגוף שלהם עם העדפות ovipositional 14. אולפקטומטר ארבעה השדה עשוי לשמש גם כדי ללמוד תגובות מולטימודליות (למשל חוש ריח וחזותי) גירויים, או לשלב optogenetic 9 או thermogenetic 21 גירוי עם מצגות של גירויים חושיים. יתר על כן, הרזולוציה הגבוהה הזמנית מאפשרת המיצוי של מסלולי FOr כל זבובי פירות בערכת הנתונים האנסמבל. לכן, השיטה מאפשרת חקירת התנהגויות אוכלוסיית הרחה מודרכת גם אינטראקציות חברתיות פרט. הנתונים שנוצרו על ידי assay זה הם חזקים מאוד לשחזור, המאפשרים את השימוש אולפקטומטר ארבעת שדה למסכים התנהגותי.
אנו מתארים כאן את הרכבת ההתקנה עבור אולפקטומטר של ארבעה רביעים. בנוסף, אנו מראים את השימוש בו מנסה לאמוד משיכה ההרחה בתגובה חומץ תפוחים ודחייה בתגובה propionate אתיל מרוכז מאוד. לבסוף, אנו מתארים ולספק קוד לדוגמא עבור הניתוח של נתוני מעקב זבוב המוקלטים.
Protocol
Representative Results
Discussion
אולפקטומטר ארבע השדה המתוארת כאן הוא מערכת התנהגותית צדדית ללימוד תגובות חוש הריח של אוכלוסיות גדולות של wild-type ו מוטצית תסיסנית זבובים. כל ניסוי לוקח ~ 1 hr (כולל התקנה, ריצות ניסיון, וניקוי), ו 4-6 ניסויים ניתן לבצע באופן שיגרתי בכל יום. Assay טיפוסי באמצעות 40-50 זבובים ב…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Terry Shelley for manufacturing the fly arena and the light-tight enclosure, Liz Marr for help with fly stock maintenance, and Xiaojing Gao and Junjie Luo for help with the Matlab code used for data analysis. We thank Johan Lundström at the Monell Chemical Senses Center for demonstrating his odor delivery setup. This work was supported by grants from the Whitehall Foundation (CJP) and NIH NIDCD (R01DC013070, CJP).
Materials
| Air delivery system | (Quantity needed) | ||
| Tubing and connectors | |||
| Thermoplastic NPT(F) Manifolds | Cole-Parmer, IL, USA | R-31522-31 | 1 |
| Hex reducing nipple (1/4MNPT->1/8MNPT) | McMaster-Carr, IL, USA | 5232T314 | 1 |
| Tubing (ID:1/8) | McMaster-Carr, IL, USA | 5108K43 | 50Ft |
| Tubing (ID:1/16) | McMaster-Carr, IL, USA | 52355K41 | 100Ft |
| Barbed tube fittings | McMaster-Carr, IL, USA | 5117K71 | 1pack |
| Push-to-connect tube fittings | McMaster-Carr, IL, USA | 5779K102 | 4 |
| Barbed Tube Fittings (1/4MNPT->1/8BF) | McMaster-Carr, IL, USA | 5463K439 | 1 pack (10) |
| Barbed Tube Fittings (1/8MNPT->1/8BF) | McMaster-Carr, IL, USA | 5463K438 | 2 pack (10) |
| Barbed Tube Fittings (1/8MNPT->1/16BF) | McMaster-Carr, IL, USA | 5463K4 | 2 pack (10) |
| Barbed Tube Fittings (1/4MNPT->1/4BF) | McMaster-Carr, IL, USA | 5670K84 | 1 |
| Hex head plug | McMaster-Carr, IL, USA | 48335K152 | 1 |
| Air pressure regulator, air filter and flowmeters | (Quantity needed) | ||
| Labatory gas drying unit | W A HAMMOND DRIERITE CO LTD, OH, USA | Model: L68-NP-303; stock #26840 | 1 |
| Multitube frames for 150-mm flowtubes | Cole-Parmer, IL, USA | R03215-30 | 1 |
| Multitube frames for 150-mm flowtubes | Cole-Parmer, IL, USA | R03215-76 | 1 |
| 150-mm flowtubes | Cole-Parmer, IL, USA | R-03217-15 | 9 |
| Valve Cartridge | Cole-Parmer, IL, USA | R-03218-72 | 9 |
| Precision Air regulator | McMaster-Carr, IL, USA | 6162K13 | 1 |
| Soleniod valves | Automate Scientific, Berkeley, CA | 02-10i | 4 |
| Solenoid valve controller | ValveLink 8.2, Automate Scientific, Berkeley, CA | 01-18 | 1 |
| Electronic flow meter | Honeywell | AWM3100V | 1 |
| DAQ (NI USB-6009, National Instruments) and a | National Instruments | NI USB-6009 | 1 |
| Power supply | Extech Instruments | 382200 | 1 |
| Odor chambers | |||
| Polypropylene Wide Mouth jar 2oz; 60ml | Nalgene | 562118-0002 | At least 5 are required per experiment, but a separate chamber is required for each dillution of each odorant. Available at Container Store, part #635114) |
| Glass odor chamber, 0.25 oz | Sunburst Bottle | LB4B | At least 5 are required per experiment |
| "In" valve for odor chamber | Smart Products, Inc., CA, USA | 214224PB-0011S000-4074 | 1 of these parts is used per odor chamber but they need to be replaced frequently |
| "Out" valve for odor chamber | Smart Products, Inc., CA, USA | 224214PB-0011S000-4074 | 1 of these parts is used per odor chamber but they need to be replaced frequently |
| O ring | RT Dygert International, MN, USA | AS568-029 Buna-N O-R | 1 pack (100) |
| Fly arena, camera and behavior boxes | (Quantity needed) | ||
| Behavior and camera box material | Interstate plastics, CA, USA | ABS black extruded (https://www.interstateplastics.com/Abs-Black-Extruded-Sheet-ABSBE~~ST.php) | 1803 sq inch |
| Teflon for fly arena and odor chamber inserts, 3/8" thick, 12"x12" | McMaster-Carr, IL, USA | 8545K27 | 1 |
| Glass plates, 1/8" Thick, 9"x 9" | McMaster-Carr, IL, USA | 8476K191 | 2 |
| Dual action thermoelectric controller | WAtronix Inc, CA, USA | DA12V-K-0 | 1 |
| IR LED array | Advanced Illumination, Rochester, VT, USA | AL4554-88024, PS24-TL | 2 LED arrays and one power supply |
| Air conditioner Unit | Melcor Store | MAA280T-12 | 1 |
| Imaging system | (Quantity needed) | ||
| Cosmicar/Pentax C21211TH (12.5mm F/1.4) C-mount Lens | B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA | PEC21211 KP | 1 |
| CCXC-12P05N Interconnect Cable | B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA | SOCCXC12P05N | 1 |
| DC-700 Camera Adapter | B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA | SODC700 | 1 |
| B+W 40,5 093 IR filter | B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA | 65-072442 | 1 |
| TiFFEN 40.5mm Circular polarizer | Amazon | 1 | |
| IR Videocamera | Industrial Vision Source, FL, USA | Sony XC-EI50 (SY-XC-E150) | 1 |
| USB video converter | The Imagingsource, NC, USA | DFG/USB2-It | 1 |
| iFlySpy2 (fly tracking software) | Julian Brown, Stanford, Calfornia: julianrbrown@gmail.com | iFlySpy2 | 1 |
| IC Capture 2.2 software | The Imagingsource, NC, USA (http://www.theimagingsource.com/en_US/products/software/iccapture/) | ||
| Miscellaneous | (Quantity needed) | ||
| Dremel rotary tool | Dremel, Racine, WI, USA | Dremel 8000-03 | 1 |
| Diamond-coated drill bits for glass cutting | Available from various suppliers; MSC industrial Supply Co, Melville, NY | 90606328 | 1 |
References
- Benzer, S. Behavioral mutants of Drosophila isolated by countercurrent distribution. Proc Natl Acad Sci U S A. 58 (3), 1112-1119 (1967).
- Thorpe, W. H. Further studies on pre-imaginal olfactory conditioning in insects. Proc R Soc B. 127 (848), 424-433 (1939).
- Tully, T., Quinn, W. G. Classical conditioning and retention in normal and mutant Drosophila melanogaster. J Comp Physiol A. 157 (2), 263-277 (1985).
- Anholt, R. R., Mackay, T. F. Quantitative genetic analyses of complex behaviours in Drosophila. Nat Rev Genet. 5 (11), 838-849 (2004).
- Vosshall, L. B. Into the mind of a fly. Nature. 450 (7167), 193-197 (2007).
- Wu, M. N., Koh, K., Yue, Z., Joiner, W. J., Sehgal, A. A genetic screen for sleep and circadian mutants reveals mechanisms underlying regulation of sleep in Drosophila. Sleep. 31 (4), 465-472 (2008).
- Dankert, H., Wang, L., Hoopfer, E. D., Anderson, D. J., Perona, P. Automated monitoring and analysis of social behavior in Drosophila. Nat Methods. 6 (4), 297-303 (2009).
- Branson, K., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. High-throughput ethomics in large groups of Drosophila. Nat Methods. 6 (6), 451-457 (2009).
- Aso, Y., et al. Mushroom body output neurons encode valence and guide memory-based action selection in Drosophila. Elife. 3, e04580 (2014).
- Pfeiffer, B. D., et al. Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (28), 9715-9720 (2008).
- Pfeiffer, B. D., et al. Refinement of tools for targeted gene expression in Drosophila. Genetics. 186 (2), 735-755 (2010).
- Venken, K. J., et al. Genome engineering: Drosophila melanogaster and beyond. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. , (2015).
- Diao, F., et al. Plug-and-play genetic access to drosophila cell types using exchangeable exon cassettes. Cell Rep. 10 (8), 1410-1421 (2015).
- Lin, C. C., Prokop-Prigge, K. A., Preti, G., Potter, C. J. Food odors trigger Drosophila males to deposit a pheromone that guides aggregation and female oviposition decisions. Elife. 4, (2015).
- Pettersson, J. An aphid sex attractant. Insect Systematics & Evolution. 1 (1), 63-73 (1970).
- Semmelhack, J. L., Wang, J. W. Select Drosophila glomeruli mediate innate olfactory attraction and aversion. Nature. 459 (7244), 218-223 (2009).
- Vet, L. E. M., Lenteren, J. C. V., Heymans, M., Meelis, E. An airflow olfactometer for measuring olfactory responses of hymenopterous parasitoids and other small insects. Physiological Entomology. 8 (1), 97-106 (1983).
- Faucher, C., Forstreuter, M., Hilker, M., de Bruyne, M. Behavioral responses of Drosophila to biogenic levels of carbon dioxide depend on life-stage, sex and olfactory context. J Exp Biol. 209 (Pt 14), 2739-2748 (2006).
- Katsov, A. Y., Clandinin, T. R. Motion processing streams in Drosophila are behaviorally specialized. Neuron. 59 (2), 322-335 (2008).
- Gao, X. J., et al. Specific kinematics and motor-related neurons for aversive chemotaxis in Drosophila. Curr Biol. 23 (13), 1163-1172 (2013).
- Gao, X. J., Clandinin, T. R., Luo, L. Extremely sparse olfactory inputs are sufficient to mediate innate aversion in Drosophila. PLoS One. 10 (4), e0125986 (2015).
- Ronderos, D. S., Lin, C. C., Potter, C. J., Smith, D. P. Farnesol-detecting olfactory neurons in Drosophila. J Neurosci. 34 (11), 3959-3968 (2014).
- Riabinina, O., et al. Improved and expanded Q-system reagents for genetic manipulations. Nat Methods. 12 (3), 219-222 (2015).
- Lundstrom, J. N., Gordon, A. R., Alden, E. C., Boesveldt, S., Albrecht, J. Methods for building an inexpensive computer-controlled olfactometer for temporally-precise experiments. Int J Psychophysiol. 78 (2), 179-189 (2010).
- Colinet, H., Renault, D. Metabolic effects of CO2 anaesthesia in Drosophila melanogaster. Biology Letters. 8 (6), 1050-1054 (2012).
- Ramdya, P., et al. Mechanosensory interactions drive collective behaviour in Drosophila. Nature. 519 (7542), 233-236 (2015).
- Ofstad, T. A., Zuker, C. S., Reiser, M. B. Visual place learning in Drosophila melanogaster. Nature. 474 (7350), 204-207 (2011).
- Beshel, J., Zhong, Y. Graded encoding of food odor value in the Drosophila brain. J Neurosci. 33 (40), 15693-15704 (2013).
- Steck, K., et al. A high-throughput behavioral paradigm for Drosophila olfaction – The Flywalk. Sci Rep. 2, 361 (2012).
- Thoma, M., Hansson, B. S., Knaden, M. High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm. J. Vis. Exp. (106), (2015).
- Claridge-Chang, A., et al. Writing memories with light-addressable reinforcement circuitry. Cell. 139 (2), 405-415 (2009).
- Parnas, M., Lin, A. C., Huetteroth, W., Miesenbock, G. Odor discrimination in Drosophila: from neural population codes to behavior. Neuron. 79 (5), 932-944 (2013).
