Comportamenti olfattive analizzati da Computer di monitoraggio di<em> Drosophila</em> In un Olfattometro quattro quadranti
Summary
We describe here a behavioral setup and data analysis method for assaying olfactory responses of up to 100 vinegar flies (Drosophila melanogaster). This system may be used with single or multiple olfactory stimuli, and adaptable for optogenetic activation or silencing of neuronal subsets.
Abstract
Una sfida chiave in neurobiologia è capire come i circuiti neurali funzionano per guidare i comportamenti appropriati su animali. Drosophila melanogaster è un sistema eccellente modello per tali indagini a causa dei suoi comportamenti complessi, potenti tecniche genetiche, e del sistema nervoso compatto. Laboratorio analisi comportamentale sono da tempo utilizzati con Drosophila per simulare le proprietà dell'ambiente naturale e studiare i meccanismi neurali alla base dei comportamenti corrispondenti (ad es fototassi, chemiotassi, l'apprendimento sensoriale e memoria) 1-3. Con la recente disponibilità di grandi collezioni di linee di Drosophila transgeniche che un'etichetta specifica sottoinsiemi neurali, test comportamentali hanno assunto un ruolo di primo piano per collegare i neuroni con i comportamenti 4-11. paradigmi versatili e riproducibili, insieme con le routine di calcolo alla base per l'analisi dei dati, sono indispensabili per test rapidi di linee di volo candidati con varie Genotypes. Particolarmente utili sono configurazioni che sono flessibili in numero di animali esaminati, la durata degli esperimenti e la natura degli stimoli presentati. Il dosaggio di scelta dovrebbe generare dati riproducibile che è facile da acquisire ed analizzare. Qui, presentiamo una descrizione dettagliata di un sistema e protocollo per saggiare risposte comportamentali di Drosophila vola in una grande arena quattro campi. La messa a punto è qui utilizzato per saggiare le risposte di mosche a un singolo stimolo olfattivo; Tuttavia, la stessa impostazione può essere modificata per testare olfattiva multipla, stimoli visivi o optogenetic, o una combinazione di questi. La configurazione olfattometro registra l'attività delle popolazioni di mosca che rispondono agli odori, e metodi di analisi computazionali vengono applicate per quantificare i comportamenti mosca. I dati raccolti vengono analizzati per ottenere una rapida lettura su una corsa sperimentale, che è essenziale per la raccolta di dati efficiente e l'ottimizzazione delle condizioni sperimentali.
Introduction
La capacità di adattarsi e rispondere all'ambiente esterno è critico per la sopravvivenza di tutti gli animali. Un animale ha bisogno di evitare i pericoli, cercare cibo e trovare i compagni, e imparare dalle esperienze precedenti. sistemi sensoriali funzione di ricevere una varietà di stimoli, come visiva, chimiche e meccanosensoriali, e inviare questi segnali al sistema nervoso centrale per interpretare e decodificato. Il cervello dirige quindi comportamenti motori appropriati in base all'ambiente percepito, come la ricerca di cibo o di fuga da un predatore. Capire come sistemi sensoriali rilevano il mondo esterno, e come il cervello decodifica e dirige le decisioni, è una sfida importante in neurobiologia.
Drosophila melanogaster è un sistema potente modello per indagare come neurale comportamenti circuiti di guida. Oltre ad essere semplice e poco costoso da mantenere, Drosophila presentano molti comportamenti diversi e complessi stereotipati, ma farlo con un compact sistema nervoso di circa 100.000 neuroni. Esistono tecniche genetiche potente per manipolare il genoma di Drosophila, e migliaia di linee transgeniche sono stati generati che selettivamente e riproducibile etichettare gli stessi sottoinsiemi di neuroni 10-13. Queste linee transgeniche possono essere utilizzati per manipolare selettivamente l'attività dei neuroni marcati (attivare o inibire), e queste manipolazioni possono essere utilizzati per studiare come neurale comportamenti funzioni di guida.
Molteplici test comportamentali sono stati sviluppati per lo studio dei vari comportamenti di Drosophila. Drosophila, come molti animali, usano il loro senso dell'olfatto per guidare molte scelte comportamentali, come trovare cibo, trovare compagni, ed evitando i pericoli. L'olfatto è quindi un buon sistema sensoriale per indagare come gli stimoli esterni vengono rilevati e interpretati dal sistema nervoso di un animale per guidare scelte appropriate. Come tale, un certo numero di saggi sono stati sviluppati per investigating larvale e comportamenti olfattive adulti. Tradizionalmente, i comportamenti olfattive in Drosophila sono stati analizzati da una a due scelta paradigma T-labirinto, che può essere utilizzato per saggiare innata e comportamenti appresi olfattive 3. In questo saggio, a circa 50 mosche sono date una scelta tra due tubi: un tubo contiene l'odore in questione e l'altro contiene un odorizzante di controllo (di solito il solvente odore). Le mosche sono dati un determinato periodo di tempo per fare una scelta, e quindi il numero di mosche che si trovano nelle varie camere sono contati. Sebbene il T-labirinto è un semplice saggio per molti esperimenti, ci sono diverse limitazioni. Ad esempio, i comportamenti olfattivi sono misurati in un solo punto di tempo e differenti scelte effettuate prima di questo punto di tempo vengono scartati. Allo stesso modo, i singoli comportamenti delle mosche all'interno della popolazione sono trascurate. Inoltre, il T-maze richiede conteggio manuale di mosche, che potrebbe introdurre errori. Infine, poiché ci sono solo due scelte misurati, questoriduce la potenza statistica spesso richiesto per rilevare cambiamenti comportamentali sottili. Un'alternativa a due scelta T-labirinto è un quattro quadranti (quattro campi) olfattometro 14-18. In questo test, gli animali esplorano un'arena in cui ciascuno dei quattro angoli del campo è riempito con una potenziale sorgente di aria odorizzata. Lo stadio ha una forma increspata stella per ottimizzare la formazione di quattro quadranti odore sperimentalmente definiti. Se l'odore è fornito in uno degli angoli, allora è contenuto solo in quella quadrante. I comportamenti degli animali possono essere monitorati in quanto entrano ed escono dal quadrante odore e facilmente rispetto al loro comportamento nei tre quadranti di controllo. Il saggio olfattometro a quattro quadranti, quindi, record risposta comportamentale spaziale e temporale agli stimoli odore oltre una grande arena sperimentale.
Il olfattometro a quattro quadranti è stato sviluppato da Pettersson et al. 15 e Vet et al. 17 per indagare sulla OLfabbrica risposte comportamentali dei singoli Imenotteri parassiti. Faucher et al. 18 e Semmelhack e Wang 16 adattato il setup per monitorare le risposte olfattive dei singoli Drosophila. Il olfattometro a quattro quadranti è altrettanto sensibile alle risposte attrazione e di repulsione, consentendo una vasta gamma di odoranti e condizioni di prova. Custom-scritto software di monitoraggio fly, sviluppato da Alex Katsov 19 e attualmente mantenuto da Julian Brown (descritto nei materiali), ha introdotto ulteriori vantaggi per le implementazioni più recenti dei quattro quadranti olfattometro 14,20-23. È ora possibile saggiare fino a 100 mosche contemporaneamente ad alta spaziale (27,5 pixel / cm) e temporale (30 fotogrammi al secondo) risoluzione, che consente l'estrazione di vari parametri, quali la posizione, velocità e accelerazione di mosche in qualsiasi punto nel tempo. Ciò consente indagini sulle dinamiche di risposte comportamentali delle mosche 'agli odori 20 </sup>. Va notato, tuttavia, che l'identità di mosche individuali all'interno della popolazione durante l'intero periodo di monitoraggio non viene mantenuta. Invece, ogni traccia volo viene registrata per la durata di due tracce mosca non si intersecano. A quel punto, le nuove tracce vengono assegnate dopo le mosche divergono. Incorporando altri software di video-cattura (dettagliato nella tabella Materials), la stessa configurazione consente periodi di monitoraggio flessibile e può essere utilizzato per monitorare le mosche per un massimo di 24 ore, prendendo le immagini ad un frame rate inferiore. Questa opzione è stata utilizzata per studiare i comportamenti di deposizione delle uova di mosche e confrontare le loro posizioni del corpo con le preferenze ovipositional 14. Il olfattometro a quattro campo può essere usato anche per studiare le risposte a multimodali (ad esempio, olfattivi e visivi) stimoli, o combinare optogenetic 9 o 21 thermogenetic stimolazione con presentazioni di stimoli sensoriali. Inoltre, l'alta risoluzione temporale permette l'estrazione di traiettorie for ogni singolo volo nel set di dati insieme. Pertanto, il metodo permette di indagine in comportamenti di popolazione olfattive-guidato e anche singoli interazioni sociali. I dati generati da questo test sono robusti e altamente riproducibili, consentendo l'uso del olfattometro quattro campi per schermi comportamentali.
Descriviamo qui il gruppo di installazione per un olfattometro a quattro quadranti. Dimostriamo ulteriormente il suo uso in saggiare attrazione olfattiva in risposta ad aceto di mele e repulsione in risposta a propionato di etile altamente concentrata. Infine, descriviamo e fornire codice di esempio per l'analisi dei dati di rilevamento fly registrati.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il olfattometro a quattro campi qui descritto è un sistema comportamentale versatile per studiare le risposte olfattive di grandi popolazioni di wild-type e mutante Drosophila mosche. Ogni esperimento prende ~ 1 ora (tra cui l'installazione, prove sperimentali, e pulizia), e 4-6 esperimenti può essere eseguita di routine di ogni giorno. Un tipico saggio usando 40-50 mosche per 5 minuti produce circa 450.000 monitorati punti dati per l'analisi. La configurazione descritta può anche essere utilizzato, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Terry Shelley for manufacturing the fly arena and the light-tight enclosure, Liz Marr for help with fly stock maintenance, and Xiaojing Gao and Junjie Luo for help with the Matlab code used for data analysis. We thank Johan Lundström at the Monell Chemical Senses Center for demonstrating his odor delivery setup. This work was supported by grants from the Whitehall Foundation (CJP) and NIH NIDCD (R01DC013070, CJP).
Materials
| Air delivery system | (Quantity needed) | ||
| Tubing and connectors | |||
| Thermoplastic NPT(F) Manifolds | Cole-Parmer, IL, USA | R-31522-31 | 1 |
| Hex reducing nipple (1/4MNPT->1/8MNPT) | McMaster-Carr, IL, USA | 5232T314 | 1 |
| Tubing (ID:1/8) | McMaster-Carr, IL, USA | 5108K43 | 50Ft |
| Tubing (ID:1/16) | McMaster-Carr, IL, USA | 52355K41 | 100Ft |
| Barbed tube fittings | McMaster-Carr, IL, USA | 5117K71 | 1pack |
| Push-to-connect tube fittings | McMaster-Carr, IL, USA | 5779K102 | 4 |
| Barbed Tube Fittings (1/4MNPT->1/8BF) | McMaster-Carr, IL, USA | 5463K439 | 1 pack (10) |
| Barbed Tube Fittings (1/8MNPT->1/8BF) | McMaster-Carr, IL, USA | 5463K438 | 2 pack (10) |
| Barbed Tube Fittings (1/8MNPT->1/16BF) | McMaster-Carr, IL, USA | 5463K4 | 2 pack (10) |
| Barbed Tube Fittings (1/4MNPT->1/4BF) | McMaster-Carr, IL, USA | 5670K84 | 1 |
| Hex head plug | McMaster-Carr, IL, USA | 48335K152 | 1 |
| Air pressure regulator, air filter and flowmeters | (Quantity needed) | ||
| Labatory gas drying unit | W A HAMMOND DRIERITE CO LTD, OH, USA | Model: L68-NP-303; stock #26840 | 1 |
| Multitube frames for 150-mm flowtubes | Cole-Parmer, IL, USA | R03215-30 | 1 |
| Multitube frames for 150-mm flowtubes | Cole-Parmer, IL, USA | R03215-76 | 1 |
| 150-mm flowtubes | Cole-Parmer, IL, USA | R-03217-15 | 9 |
| Valve Cartridge | Cole-Parmer, IL, USA | R-03218-72 | 9 |
| Precision Air regulator | McMaster-Carr, IL, USA | 6162K13 | 1 |
| Soleniod valves | Automate Scientific, Berkeley, CA | 02-10i | 4 |
| Solenoid valve controller | ValveLink 8.2, Automate Scientific, Berkeley, CA | 01-18 | 1 |
| Electronic flow meter | Honeywell | AWM3100V | 1 |
| DAQ (NI USB-6009, National Instruments) and a | National Instruments | NI USB-6009 | 1 |
| Power supply | Extech Instruments | 382200 | 1 |
| Odor chambers | |||
| Polypropylene Wide Mouth jar 2oz; 60ml | Nalgene | 562118-0002 | At least 5 are required per experiment, but a separate chamber is required for each dillution of each odorant. Available at Container Store, part #635114) |
| Glass odor chamber, 0.25 oz | Sunburst Bottle | LB4B | At least 5 are required per experiment |
| "In" valve for odor chamber | Smart Products, Inc., CA, USA | 214224PB-0011S000-4074 | 1 of these parts is used per odor chamber but they need to be replaced frequently |
| "Out" valve for odor chamber | Smart Products, Inc., CA, USA | 224214PB-0011S000-4074 | 1 of these parts is used per odor chamber but they need to be replaced frequently |
| O ring | RT Dygert International, MN, USA | AS568-029 Buna-N O-R | 1 pack (100) |
| Fly arena, camera and behavior boxes | (Quantity needed) | ||
| Behavior and camera box material | Interstate plastics, CA, USA | ABS black extruded (https://www.interstateplastics.com/Abs-Black-Extruded-Sheet-ABSBE~~ST.php) | 1803 sq inch |
| Teflon for fly arena and odor chamber inserts, 3/8" thick, 12"x12" | McMaster-Carr, IL, USA | 8545K27 | 1 |
| Glass plates, 1/8" Thick, 9"x 9" | McMaster-Carr, IL, USA | 8476K191 | 2 |
| Dual action thermoelectric controller | WAtronix Inc, CA, USA | DA12V-K-0 | 1 |
| IR LED array | Advanced Illumination, Rochester, VT, USA | AL4554-88024, PS24-TL | 2 LED arrays and one power supply |
| Air conditioner Unit | Melcor Store | MAA280T-12 | 1 |
| Imaging system | (Quantity needed) | ||
| Cosmicar/Pentax C21211TH (12.5mm F/1.4) C-mount Lens | B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA | PEC21211 KP | 1 |
| CCXC-12P05N Interconnect Cable | B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA | SOCCXC12P05N | 1 |
| DC-700 Camera Adapter | B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA | SODC700 | 1 |
| B+W 40,5 093 IR filter | B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA | 65-072442 | 1 |
| TiFFEN 40.5mm Circular polarizer | Amazon | 1 | |
| IR Videocamera | Industrial Vision Source, FL, USA | Sony XC-EI50 (SY-XC-E150) | 1 |
| USB video converter | The Imagingsource, NC, USA | DFG/USB2-It | 1 |
| iFlySpy2 (fly tracking software) | Julian Brown, Stanford, Calfornia: julianrbrown@gmail.com | iFlySpy2 | 1 |
| IC Capture 2.2 software | The Imagingsource, NC, USA (http://www.theimagingsource.com/en_US/products/software/iccapture/) | ||
| Miscellaneous | (Quantity needed) | ||
| Dremel rotary tool | Dremel, Racine, WI, USA | Dremel 8000-03 | 1 |
| Diamond-coated drill bits for glass cutting | Available from various suppliers; MSC industrial Supply Co, Melville, NY | 90606328 | 1 |
References
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