Abstract
신경 생물학의 핵심 과제는 인해 복잡한 행동, 강력한 유전자 기술, 컴팩트 신경계에 적절한 동물의 행동을 안내합니다. 초파리 melanogaster의이 같은 조사를위한 훌륭한 모델 시스템 작동 방법 신경 회로 이해하는 것입니다. 실험실 행동 분석은 장기 (예 : phototaxis, 화성, 감각 학습과 기억) 1-3 대응 행동의 기초가되는 신경 메커니즘을 자연 환경의 특성을 시뮬레이션하고 연구하는 초파리와 함께 사용되어왔다. 특정 신경 하위 집합 레이블을 형질 전환 초파리 라인의 큰 컬렉션의 최근 가용성, 행동 분석은 행동 4-11과 뉴런을 연결하는 중요한 역할을 수행하고있다. 함께 데이터 분석을위한 기본 계산 루틴 다양하고 재현성 패러다임은 다양한 genotyp와 후보 플라이 라인의 빠른 테스트를 위해 필수적이다에스. 특히 유용한 실험 동물, 실험 기간 및 제출 자극의 자연의 수가 유연한 설정입니다. 선택의 분석은 수집 및 분석이 용이 재현 데이터를 생성한다. 여기서는 초파리의 행동 반응을 분석하기위한 시스템 및 프로토콜의 상세한 설명은 많은 네 상 경기장에 날아간 제시한다. 설정은 하나의 후각 자극에 파리의 응답을 분석하기 위해 여기에 사용된다 그러나, 동일한 설치 여러 후각, 시각적 또는 optogenetic 자극, 또는 이들의 조합을 테스트하기 위해 변형 될 수있다. 후각 설정은 냄새에 반응 플라이 집단의 활동을 기록하고 전산 분석 방법은 비행 행동을 정량화 적용됩니다. 수집 된 데이터는 효율적인 데이터 수집 및 실험 조건의 최적화에 필수적인 실험 실행의 빠른 판독을 얻기 위해 분석된다.
Introduction
외부 환경에 적응하고 반응하는 능력은 모든 동물의 생존에 중요하다. 동물은 위험을 피하기 음식을 찾아 내고 동료를 찾고, 이전의 경험에서 배울 필요가있다. 감각 기관은 시각, 화학적 자극 mechanosensory 같은 다양한 수신 및 해석되고 디코딩 될 중추 신경계에이 신호를 전송하는 기능. 뇌는 그러한 음식을 구하고 또는 육식 동물에서 탈출로 인식 환경에 따라 적절한 모터 행동을 지시한다. 감각 기관이 외부 세계를 감지하고 뇌가 디코딩하고 의사 결정을 지시하는 방법, 신경 생물학의 주요 과제는 얼마나 이해.
초파리 melanogaster의 방법 신경 회로 가이드 행동을 조사하기위한 강력한 모델 시스템입니다. 유지 보수가 간단하고 저렴한되고 게다가, 초파리는 많은 다양하고 복잡한 틀에 박힌 행동을 전시, 아직 COMPAC으로 이렇게약 10 만 뉴런의 신경 시스템에서 t. 강력한 유전 기술은 초파리 게놈을 조작하기위한 존재하고, 유전자 변형 라인의 수천 선택적으로 재현 뉴런 10-13의 동일한 하위 집합을 라벨 것을 생성되었습니다. 이러한 형질 전환 라인들은 선택적으로 표지 된 뉴런 (활성화 또는 억제)의 활성을 조작 할 수 있으며, 이러한 조작 방식은 신경 기능 설명서 거동을 조사하기 위해 사용될 수있다.
여러 행동 분석은 다양한 초파리의 행동을 연구하기 위해 개발되었다. 초파리, 많은 동물처럼, 같은 음식을 찾는 동료를 발견하고, 위험을 피할 수 많은 행동 선택을 안내하는 냄새의 감각을 사용합니다. 후각 따라서 외부 자극을 감지하고 적절한 선택을 안내하는 동물의 신경계에 의해 해석하는 방법을 조사에 대한 좋은 감각 시스템입니다. 이와 같이, 세이의 숫자 investiga 개발되어왔다팅의 애벌레와 성인 후각 행동. 전통적으로, 초파리의 후각 행동은 타고난 시금에 사용 후각 행동 3을 배울 수있는 두 개의 선택 T-미로 패러다임에 의해 분석 하였다. 이 분석에서, 약 50 개의 파리 튜브 사이에서 선택을 주어진 하나 관 해당 냄새를 포함하고 다른 하나는 제어 취제 (일반적으로 악취 용매)를 포함한다. 초파리는 선택을 위해 설정된 시간 기간을 부여하고 다른 방에있는 파리의 수를 카운트한다. T 개의 미로는 많은 실험에 대한 간단한 분석이지만, 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 예를 들어, 후각 행동은 하나의 시점에서 측정되고,이 시점 전에 만들어진 다른 선택은 폐기된다. 마찬가지로, 인구 내에서 파리의 개별 행동은 무시된다. 또한, T-미로는 에러를 도입 할 수 파리 수동 계산을 필요로한다. 마지막으로, 두 측정 선택이 존재하기 때문에, 본종종 미묘한 행동 변화를 감지하는 데 필요한 통계 전력을 줄일 수 있습니다. 두 선택 T 미로의 대안은 4 분면 (네 필드) 후각 14-18이다. 이 분석에서, 동물은 경기장의 네 모서리의 각이 odorized 공기의 잠재적 인 소스로 가득되는 경기장을 탐구한다. 경기장은 네 실험적으로 정의 냄새 사분면의 형성을 극대화 할 수있는 들이랑 키스를 한거 별 모양이 있습니다. 냄새가 그 코너 중 하나에 공급 된 경우에만 해당 사분면에 포함된다. 동물의 행동은 세 가지 제어 사분면에서 자신의 행동에 비해 쉽게 입력하고 냄새 사분면을 떠날로 추적 될 수 있습니다. 네 사분면 후각 분석 따라서 레코드 많은 실험 아레나 위에 악취 자극 시공간적 행동 반응.
네 개의 사분면 후각이 먼저 Pettersson이 등. (15)와 수의사 등에 의해 개발되었다. (17)을 올 조사개별 기생 벌목의 공장 행동 반응. FAUCHER 등. 18 Semmelhack과 왕 (16)는 개별 초파리의 후각 반응을 모니터링하기 위해 설치 적응. 네 개의 사분면 후각 테스트 취기 및 조건의 넓은 범위를 허용, 매력과 반발 응답에 동일하게 민감하다. 사용자가 작성한 비행 추적 소프트웨어, 알렉스 Katsov (19)에 의해 개발 된 현재 (재료에 자세히 설명) 줄리안 브라운에 의해 유지는 네 사분면의 후각 14,20-23의 최신 구현에 추가적인 장점을 소개했다. 높은 공간에서 동시에 (100) 파리 (27.5 픽셀 / cm) 등 어떤 시점에서 위치, 속도 및 파리의 가속 등의 다양한 매개 변수를 추출 허용 해상도, 시간 (초당 30 프레임)까지 분석 할 수있게되었습니다. 이 냄새 20 파리 '행동 반응의 역학에 대한 조사를 할 수 있습니다 (재료 표 상세한) 다른 비디오 캡처 소프트웨어를 포함함으로써, 동일한 구성은가요 추적 기간을 허용하고 더 낮은 프레임 레이트로 이미지를 고려하여 최대 24 시간 동안 파리를 추적하는데 사용될 수있다. 이 옵션은 파리의 알을 낳는 행동을 연구하고 ovipositional 환경 (14) 자신의 신체 위치를 비교하는 데 사용되었다. 네 개의 필드 후각 또한 복합 응답을 연구하는 (예 후각 시각)의 자극을 사용할 수도 있고, 감각 자극의 프레젠테이션 optogenetic 9 thermogenetic 21 자극을 결합. 또한, 높은 시간 해상도의 궤적의 추출을 허용 FO앙상블 데이터 세트의 R 각각의 비행. 따라서,이 방법은 후각 유도 인구 행동과 개별 사회적 상호 작용에 대한 조사를 할 수 있습니다. 이 분석에 의해 생성 된 데이터는 행동 스크린의 네 개의 필드 후각을 사용할 수있게 견고하고 높은 재현성이다.
우리는 4 사분면의 후각 여기를 설치 어셈블리를 설명합니다. 우리는 더 고농도 에틸 프로 피오 네이트의 질문에 답변 사과 사이다 식초와 반발에 대한 응답으로 후각 매력을 분석에서의 사용을 보여줍니다. 마지막으로 설명하고 기록 플라이 추적 데이터의 분석을위한 예시적인 코드를 제공한다.
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Protocol
1. 설치 조립
- 제공된 도면 (보충 자료, SupplementalSketch_StarShapedArena.pdf)에 따라 폴리 테트라 플루오로 에틸렌 (PTFE) 중 별 모양의 경기장 (0.7 cm 19.5 cm 19.5 cm)를 생산하고 있습니다. 경기장은 상용 또는 사용자 정의 기능에 의해 제조 될 수있다.
- 두 개의 유리 플레이트 (2mm 두께의 20.25 cm 의해 20.25 cm)을 획득하고, 정밀 다이아몬드로 피복 된 드릴 비트를 사용하여 유리판 중 하나의 중심 (~ 지름 0.7 cm)에 구멍을 드릴.
- 행동 경기장에 대한 빛을 꽉 행동 상자를 생산하고 있습니다. 또한 제공되는 도면 (부자재, SupplementalSketch_LightTightBox.pdf)에 따른 적외선 CCD 비디오 카메라를 광 타이트 박스 카메라 제조. 상자는 상용 또는 사용자 정의 기능에 의해 제조 될 수있다.
- 후벽과 동작 상자의 측벽에 LED 어레이에 관한 공기 조화 장치를 탑재. 온도 프로브를 배치실시간 온도 피드백 및 조정을위한 측면 구멍을 통해 동작 상자에 (도 1 및 자세한 내용은 2 참조).
- 카메라에 IR 필터와 원 편광판을 부착하고 카메라 상자에 어셈블리를 장착합니다. 동작 상자와 카메라 상자가 행동 상자의 더 나은 온도 제어 (자세한 내용은 그림 1과 2 참조) 유리 창으로 구분됩니다.
- 카메라 어댑터에 적외선 CCD 카메라를 연결합니다. 의 USB 컨버터에 카메라 어댑터를 연결합니다. 데이터 수집 용 컴퓨터의 USB 포트에 USB 컨버터를 연결한다.
- 제조업체의 지시에 따라 컴퓨터에서 비디오 변환기에 대한 드라이버를 설치한다. 선택적으로, 카메라 설정 및 획득 파라미터들의 넓은 범위에 액세스하기 위해 USB 비디오 변환기의 제조자에 의해 제공된 화상 처리 소프트웨어를 설치한다.
- 출력 "을 통해 공기 조화 유닛 (연결온도 컨트롤러 온도 컨트롤러의 후면)에 열전대 ''를 통해 온도 조절기의 뒷면)와 온도 탐침 (ON ". 동작 상자에 프로브를 놓는다.
참고 : 우리의 배치의 온도 제어 시스템은 18 ℃와 30 ℃ 사이 박스 온도를 유지시킬 수있다. 높거나 낮은 주위 온도는 신경 세포의 활동을 조작하거나 시냅스 전달을 억제하는 실험 thermogenetic (dTrpA1, TRPM8 또는 shibire TS)에 유용 할 수 있습니다. 대부분의 실험에서, 온도는 25 ° C에 유지된다. - (상세 회로도 및 연결 피팅 그림 1B 참조) 다음 단계에 냄새 전달 시스템을 조립 :
- 중앙 에어 시스템에서 공기의 입력을 제어하기 위해 공기 압력 조정기를 사용한다. 중심 (A)로부터 공기를 정화 압력 레귤레이터 (숯 가득) 탄소 공기 필터 연결적외선 시스템.
- 고해상도 유량계 관에 의해 조절 다양한 채널로 구성된 유동 제어 장치를 조립한다.
- 도 1b 및도 2F에 도시 된 바와 같이 매니 폴드를 통해 유량계 튜브 탄소 공기 필터의 출력을 연결한다. 플로우 미터를 떠나 깨끗한 공기를 실내로 방출 또는 주문 제작 냄새 챔버 (24)에 입력하면 조절하는 전자 제어 3 방향 솔레노이드 밸브를 통해 유량계 튜브의 출력을.
- 제조업체의 설명서에 따라 솔레노이드 밸브 컨트롤러를 설치합니다.
- 데이터 수집 장치 (DAQ) 및 제조자의 설명서에 따른 전원 공급 장치에 연결하여 전자 공기 유량계를 설치한다. 모든 실험 전에 경기장의 각 사분면에 동일한 유량을 확인하기 위해 DAQ 인터페이스 소프트웨어를 설치합니다.
2. 후각 자극 준비
- 5 냄새를 준비플라스틱 외부 용기로 구성 개미 챔버 (24)는 중앙 부분 유리 내부 용기, 사용자 정의 만든 PTFE 뚜껑 삽입, 원래의 용기 뚜껑을 제거하고, 두 개의 단방향 밸브.
주 : PTFE 덮개 주위에 O 링 악취 관류시 악취 챔버로부터 공기 누설을 방지하기 위해 사용될 수있다. 회로도 및 챔버의 사진을 그림 2는 그림 1을 참조하십시오. - 용매 컨트롤에 대한 네 취제 챔버 및 테스트 취제에 대해 하나의 챔버를 사용합니다. (철저하게 실험을하기 전에 혼합, 테스트 취기 + 적절한 용제) 용매 또는 취제 희석 1,000 μL와 유리 용기를 채우 해당 플라스틱 챔버 내부의 유리 용기를 배치 (플라스틱 챔버로 액체를 밖으로 유출하지 않음)와 뚜껑을 조 . 항상 시험 취제 용매 컨트롤 클린 챔버를 사용하십시오.
참고 : 강한 매력이 w 사과 사과 식초 (5 % 산도)의 1/16 희석에 의해 유발 될 수있다ater에. 대조적으로, 후각 반발 동작 광유 에틸 프로 피오 네이트의 10 % 희석을 이용하여 연구 될 수있다. 이러한 경우에 제어 자극 순수 미네랄 오일 냄새 실 수 있습니다.
3. 비행 준비
- 후면 표준 옥수수 가루 매체에 날아갑니다. 30 남성과 표준 병 (30) 여성 부모의 파리를 배치하고 25 ° C 또는 상온에서 5 일 동안 알을 낳기 수 있습니다.
- 각 실험, 새로 eclosed 부담 (<일일 세) 25 남성과 25 여성 짧은 CO 2 마취 파리.
- 2~4일 표준 플라이 매체와 유리 병에 파리를 유지합니다.
- 40 ~ 42 시간 실험하기 전에, CO없이 2 마취를 파리를 전송 ~ 10 ㎖의 1 % 아가 로즈 젤을 유리 병에 관한 것이다. 이것은 그들의 운동 활성을 증가시키는 데 도움이 음식없이 가습 파리를 유지합니다.
주 : 파리의 90 % 이상이 기아 생존해야한다. 일부 유전자형 치유 작은네은과 40 시간의 기아를 통해 그것을 만들 수 없습니다. 이러한 경우, 예컨대 24-28 시간과 같은 짧은 기간이 허용되어 있지만, 모든 실험 조건 반복에 대해 동일하게 유지되어야한다.
매력적이고 구충제 냄새 물질 4. 행동 응답
- 온도 컨트롤러로 전환하고 25 ° C를 설정합니다.
- 취제 챔버의 콘센트에 튜브를 삽입하여과에 취제 챔버 (제어 및 테스트 냄새 물질)를 연결 푸시 - 투 - 연결 동작 상자에 피팅.
- 제어 및 방향제 공기 스트림 / 분 100ml로 같다고 확인하기 위해 공기 유량계를 사용하여 각 사분면의 유량을 확인한다.
- 완전히 건조 공기 (~ 3 ~ 4 분)가 PTFE 플라이 경기장 및 70 % 에탄올 2 ~ 3 회와 유리 접시를 청소하고에이를 수 있습니다.
- 클램프와 함께 경기장에 유리 판을 부착합니다.
- 전송이 마취 유리판 중 하나에있는 구멍을 통해 경기장에 CO없이 날아갑니다. 선미어 전송은 탈출 파리를 방지하기 위해 구멍에 원형 메쉬를 배치합니다.
주 : CO 2 마취 초파리 동작 (25)에 영향을 미치는 것으로 밝혀졌다 및 행동 실험 24 시간 내에 사용되지 않아야한다. - 빛 꽉 챔버에 파리로 무대를 배치, 경기장 코너에 행동 상자 피팅 - 연결 푸시에 부착 된 튜브를 연결하여 4 개의 제어 공기 흐름을 연결, 챔버의 문을 닫고 10을 기다립니다 15 분 파리가 새로운 환경에 순응 할 수 있습니다. 가능하면, 바이어스 실험 결과를 수도 가능한 최소한의 빛의 누출을 방지하기 위해, 실험이 수행되는 방에 불을 끄고.
- 파리 4 제어 기류에 노출되는 5-10 분 대조 실험을 실행.
- , 파리가 무대에서 균일하게 분포되어 있는지 확인합니다 (아래 데이터 분석 섹션 참조) 즉시 데이터를 분석하고 매력이 지수는 가까이이 경기장 내 환경 설정 또는 회피 전혀 조절되지 않는 소스 (예를 들어, 외부, 불균일 한 온도 분포가 고르지 경기장, 냄새 오염 등으로부터 누출 된 광)이 없는지 확인으로 0이 단계는 필수적이다. 파리가 불평등하게 분포하거나 운동 활성이 낮은 경우, 파리를 버리고 다시 경기장을 청소 (4.4 단계)와 실험을 반복 파리의 새로운 배치를 사용합니다.
- 3 방향 밸브 또는 커넥터 튜브를 재 연결에 전환하여 설정하기 위해 시험 취제 챔버를 연결한다.
- 5 ~ 10 분 동안 테스트 실험을 실행하고 아래 섹션 5에 설명 된대로 데이터를 분석 (또한 참조 (14)와 그림 3 참조). 20 분 이상 녹음은 계산 과정 어려울 수있다 데이터 파일이 발생할 수 있습니다. 이상 실험 기록이 요구되는 경우, 신속하게 중지 추적 프로그램을 다시 시작한다. 이 실험 기록 사이 ~ 10 초 간격으로 발생합니다.
- Discar라 파리.
- 청소 분야 및 유리 70 % 에탄올 판 (4.4 단계), 그리고 광 꽉 인클로저 내에서 커넥터 튜브를 교체합니다. 실험을 촉진하기 위해, 새로운 깨끗한 아레나 사용될 수 있으며, 실험을 수행하면서 실행 더티 아레나 세정.
- 필요한 경우, 파리의 새로운 배치로 다른 실험을 실행합니다. 여러 실험을 같은 날에 실행되는 경우, 부 취제는 이전 테스트 실행에서 시스템에 남아되지 않도록 세심한주의를 기울입니다. 이것은 일반적으로 CO 2 냄새 물질 또는 낮은 농도 문제가되지 않지만, 실험 실행 사이의 시간 간격 (24)까지 고도로 집중된 자극이 필요할 수있다. 취제 오염 제어 실험 동안 의심되는 경우 또한, 플로우 튜브 결국 튜브로 대체 될 수있다. 항상 지속적으로 시스템을 플러시 실험 사이에 건조 공기를 남겨
5. 데이터 분석
참고 : 제안 비행 추적 획득 softwar을(재료에 자세히 설명) 전자가 인수하는 동안 실시간으로 파리를 추적하고, 타임 스탬프 및 * .DAT 형식의 모든 감지 파리의 좌표를 저장합니다. 우리는 주문 제작 matlab에 루틴 매트랩 형식으로 데이터를 변환하고 데이터를 분석을 개발했다. 코드 예는 보충 자료에 설치되어 있지만, 구현의 세부 사항은 데이터 수집에 사용되는 소프트웨어에 의존한다.
- 원시 데이터를로드합니다. 경기장의 윤곽을 따라 공간 마스크를 만들고 그들이 소음 (그림 4A, 보조 코드 MaskSpatialFiltering.m, Score.m, DrawCircularMask 대표로 경기장의 밖에있는 모든 데이터 포인트를 제거하기 위해 원시 데이터에 마스크를 적용합니다. 엠).
- 이 데이터는 노이즈 비 이동 파리 (도 4b 보충 코드 TemporalFiltering.m)에 의해 발생 될 가능성이있는 한, 3S보다 오래 0.163 cm / 초 이하의 속도로 이동하는 모든 데이터 요소를 제거한다.
- 남아있는 데이터를 시각화하나의 궤적을 한 번에 그들을 밖으로 음모에 의해 또는 점 (그림 3, 보충 코드 SingleTrajectoryViewer.m).
주 : 네 필드 냄새 경계의 위치는 가능성이 사용되는, 각각의 부 취제의 특성 및 공기 흐름 속도와 같은 요인에 달려있다. 예를 들어, 높은 휘발성 냄새 물질은 가능성이 적은 휘발성 냄새 물질보다 더 완벽하게 냄새 사분면을 채울 것입니다. 따라서 각 방향제 냄새가 약간 다른 경계를 나타낼 수 있음을 보인다. 이는 특정 지점에서 공기를 샘플링하기 위해 진공을 사용하는 등 그 자리에서 취제 농도 방해로 악취 경계를 측정하는 광 이온화 검출기의 사용이 문제가 될 수있다. 그럼에도 불구하고, 악취 경계 빠르게 비행 행동 데이터에 기초하여 추정 될 수있다. 예를 들어, 다른 냄새에 응답하여 누적 플라이 트랙에 기초하여 악취 경계는 명확도 3C 및 3D에 관찰 될 수있다. - 칼대조 실험은 더 선호 응답을 생성하지 여부를 확인하고, 또한, 방향제 (또는 optogenetic 9)의 자극에 대한 반응에 액세스하는 흡착 지수 culate. 매력 지수 (AI)를 계산하기 위해, 제어 또는 테스트 기록의 마지막 5 분을 사용한다. +1 (절대 매력) -1 (절대 반발력) 사이에 떨어진다 인력의 측정치를 얻기 위해, 다음 공식은 AI를 계산하는데 사용된다 :
N 테스트 테스트 사분면에서 데이터 포인트의 수이며, N 제어는 세 가지 제어 사분면에서의 데이터 포인트의 평균이다. 어떤 환경 설정이 제로에 가까운 값으로 표시되지 않을 것 같은이 법안은 직관적이다. 그러나 정확하게 취제 사분면에있는 파리의 총 개수의 비율을 의미하지 않는다. 이 측정 값을 얻으려면 몇 퍼센트 지수 (PI)를 사용할 수있다 :![식 (2)]("/files/ftp_upload/54346/54346eq2.jpg"/>)
N 테스트는 테스트 사분면에서의 데이터 포인트의 수이고, N은 총 네 개의 사분면에있는 데이터 포인트의 총 수이다. 이 수식은 0.25없이 행동 선호 (그림 3E 및 4C, 보충 코드 AttractionIndex.m)에 대응, 0과 1 사이에 해당하는 조치를 제공합니다. - 각 반복에 대한 파리의 새 그룹을 사용하여 각 실험 조건의 5-10 반복을 실행합니다. 콜 모고 로프 - 스 미르 노프 비 파라 메트릭 테스트 (그림 3 층, 매트랩 kstest2 기능)를 사용하여 제어 조건 사이의 나에 대한 매력 지수를 비교합니다.
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Representative Results
네 사분면 후각 분석 기록과는 큰 공간을 통해 다양한 행동 파리 보행 활동을 분석한다. 방향제는 하나, 둘, 셋 또는 네 개의 사분면을 입력 공기 스트림으로 도입 될 수있다. 냄새없는 경우, 파리 자유롭게 네 사분면 사이를 이동한다. 그것이 않은 의도적 인 편견이 분석에 도입되지 않았 음을 나타냅니다으로이 문제가 관찰 중요하다. 이러한 편향은 빛, 온도 변동, 공기 흐름에서의 차이, 또는 악취 오염 물질을 포함 할 수있다.도 3b는 25 남성의 사분면 후각의 행동 반응을 도시 25 암 공기 건조 날아간다. 수집 된 데이터에서 단일 비행 트랙은 그림 3b에 강조,이 비행 전체 행동 분야를 탐구하는 것을 보여줍니다된다. 5 분 테스트 기간 동안 모든 분석 트랙의 매력 지수 점수 (AI)는 indicati, 0에 가까운냄새 사분면에 인력의 부족을 ng를. 마찬가지로 실험의 비율 지수 (PI)는 파리의 5 분의 시험 기간 동안 모든 사분면 사실에도 분포되어 있음을 나타내는, 0.24이다.
매력적인 취제에 네 개의 필드 행동 응답은 그림 3C에 표시됩니다. 애플 사이다 식초는의 공기 흐름에 도입 테스트 냄새 챔버로 사과 사이다 식초의 6.25 % 희석을 배치하여 냄새 사분면 공기 흐름을 왼쪽 상단. 회색으로 표시 수집 된 비행 트랙은 대부분의 파리는이 냄새 사분면에 수집 함을 입증, 더 이상 네 사분면을 탐색합니다. 하나의 색깔 비행 트랙은 비행 사과 사이다 식초 냄새 사분면를 입력하면, 그것은 매력적인 냄새 사분면에 남아있는 경향이 있음을 보여준다. 실험을위한 0.94의 AI는이 취제에 강한 매력을 나타내는 1에 가깝습니다. 0.92의 PI는 파리의 92 %가 r에 있음을 나타냅니다분석 기간 동안 악취 사분면 emained.
방수제 취제 다음 4 필드 행동 반응은도 3d에 도시되어있다. 냄새 챔버 내에 배치 취제 에틸 프로 피오 네이트의 10 % 희석 좌상 공기 스트림 냄새 공급원으로 사용 하였다. 분석 실험의 덩어리로 만들어진 플라이 트랙 냄새 사분면의 방지, 냄새 유도 반발의 암시를 보여줍니다. 하나의 색깔 비행 트랙은 신속하게, 냄새 사분면을 입력 한 비행, 냄새 사분면을 피하기 위해 멀리 온 것을 알 수있다. -0.68의 AI는 척력을 나타내고있는, 0 미만이고, 강한 불쾌한 취기 응답 -1 부근 나타낸다. 실험에 0.06의 PI는 추적 비행 데이터 포인트 (중립 악취 실험 ~ 25 %와 비교) 6 % 실험에 걸쳐 악취 사분면에 발견 된 것을 암시한다.
지수도 3e는 AI와 PI 점수 간의 관계도이다. 더욱 유익 할 수 있으며, 이러한 방법은 매력적인 번호 또는 척력 동작에 관한 것이다.
네 개의 필드 분석은 견고하고 재생 가능한 후각 행동을 초래한다. 이는도 3f에 도시 된 바와 같이, 제어 및 실험 조건 사이의 양적 비교를 허용하고, 또한 미묘한 olfactor의 식별을 가능하게중립에서 벗어나는 Y 응답.
데이터가 높은 공간 및 시간 해상도를 얻을 수있다 더욱이, 그것의 파리의 다른 활동 역학 (도 3 참조)와 같은 단일 플라이의 궤적으로서 행동 반응의 여러 요인들을 연구뿐만 아니라, 특성화시킬 수있다 냄새 필드 (예를 들면, 방향 및 속도의 변화 (19, 20)).
종종 경기장을 자주 청소가 필요 특히 때문에, 각 실험에 대한 정확한 동일한 위치에 네 개의 필드 경기장을 배치하기가 어려울 수 있습니다. 제공된 스크립트는도 4a에 도시 된 바와 같이, 먼저 데이터를 피팅함으로써 이러한 약간의 변화를 보상 분석한다. 이 경우, 네 개의 필드 경기장의 형상이 산출되고,이 공간 외부에있는 데이터 포인트가 제거된다. 이 추적 개체는 종종 뎁을 나타냅니다RIS 또는 잘못 추적 반사. 그들은 경기장 내에 있어야하므로 노이즈를 표현하지 않는 한, 이들 데이터 포인트가 잘못된 데이터 분석 막을 제거하는 것이 중요하다. 마찬가지로, 노이즈 또는 경기장에서 파리 비 이동 나타낼 수 추적 된 데이터 요소를 제거하는 것이 중요하다. 이를 위해 분석 스크립트 (도 4b에 도시 된 바와 같이) 실질적으로 이동하지 않는 데이터 요소를 제거하는 이용 (및 여기에 제공)된다. 이러한 데이터 포인트는 소수 보통, 아직 보존 분석에 오류가 발생할 것입니다.
매력 지수 선호 지수 점수가 설정된 시간주기 이후 계산 될 수있다 (예를 들면 5 분 실험의 마지막에도 3에 도시 된 바와 같이). 이는 초파리 높은 시공간 해상도를 추적하기 때문에, 유사한 분석은 실험에 걸쳐 수행 될 수 있다는 점에 유의해야한다. 이것은도 4c에 도시 된 흡착 지수 백분율 점수 지수는 시간주기에 걸쳐 연속 10 초 빈들에서 계산된다. 이러한 분석은 이러한 취제에 습관화와 실험을하는 동안 발생할 수있는 후각 변화, 더 잘 감상 할 수 있습니다.
그림 1. 네 사분면 후각 도식은 (A)가 동작 설정이 냄새 전달 시스템으로 구성되며, 온도 제어 시스템 (도시 된되지 않음), 영상 획득 시스템 (IR은 컴퓨터에 연결된 조명, 적외선 CCD 카메라 LED) 네 사분면 경기장과 빛을 꽉 행동과 경기장 상자. 빨간 원은도 2 (B)에 도시 된 대응 구성 요소 악취 전달 시스템의 상세한 설계를 나타낸다. 녹색 문자 F의 연결 / 변환 크기를 나타냅니다ittings. 1/16 ID 및 1/8 OD의 튜브는 1/8 ID 및 1/4 OD의 그 분홍색으로 표시되어 반면 노란색으로 표시되어 있습니다. 요약 : IR, 적외선; CF, 압축 피팅; BF, 철 피팅, MNPT, 남자 국립 파이프 스레드. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 :. 후각 분석 설정의 사진 (A) 카메라 상자와 행동 상자의 넓은 필드보기. 동작 상자 안에 (B)보기. 온도 프로브, 커넥터 튜브 및 적외선 LED 어레이가 표시되어 있습니다. (C) 네 사분면 경기장. (D) 동작 박스에 접속 악취 전달 시스템의 넓은 필드보기. 카메라 박스는 CCD 카메라를 공개하기 위해 제거되었다. (E (F) 실시 예. (G) 고해상도 유동관의 공기 흐름을 조절한다. (H) 유동관 조절기 하류의 냄새 전달 튜브 및 커넥터. 깨끗한 공기는 냄새 챔버를 통과 또는 실내에 배출되는 경우 (I) 솔레노이드 밸브를 조절한다. (J) 냄새 챔버는 일방향 밸브에 연결하고, 부 취제에 대한 내부 유리 용기를 포함한다. (K)가 동작 상자가 냄새 전달 튜브에 연결하는 외부 푸시 - 투 - 연결 피팅이 포함되어 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 :. 예 데이터 데이터 분석 단계에서 생성 MaskSpatialFiltering.m에 의해 수행되는 데이터의 (A) 공간 필터링은 경기장 밖에있는 데이터 포인트를 제거합니다. 레드 원은 경기장의 경계를 정의하는 데 사용되는 원의 초기 위치를 표시합니다. 검은 원은 원 피팅에 의해 획득 된 최종 위치에서, 데이타 (네 필드 내부의 음영 지역을 회색)에 대해 설명한다. 빨간 점과 검은 색 화살촉이 필터링 단계 후 데이터 세트에서 제거됩니다 데이터 포인트를 나타냅니다. TemporalFiltering.m 의한 (B)의 데이터를 시간적 필터링. 이러한 여과 공정은 매우 SLO 이동할 데이터 요소를 제거wly 또는 전혀, 그들은 움직이지 않는 파리 또는 경기장에서 먼지 / 반사에 의해 생성 될 가능성이있다. 점선 빨간색 상자에 둘러싸여 빨간색 점은이 여과 공정에 의해 제거됩니다 동일한 좌표 ~ 6,000 데이터 포인트의 위치를 나타냅니다. (C) 매력 지수 (AI)와 AttractionIndex.m에 의한 실험의 마지막 5 분 동안 10 초 쓰레기통에서 계산 된 비율 지수 (PI). 이러한 지수를 임시 프로필 행동 반응의 역학에 대한 정보를 포함하고 행동의 상세한 분석을 위해 사용될 수있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기에 설명 된 네 개의 필드 후각은 야생형과 돌연변이 초파리는 파리의 큰 인구의 후각 반응을 연구하기위한 다양한 행동 시스템입니다. 각각의 실험은 (설정, 실험 실행, 청소 포함) ~ 1 시간 소요되며, 4-6 실험은 일상적으로 매일 수행 할 수 있습니다. 5 분 동안 40-50 초파리를 이용한 전형적인 분석은 약 450,000 분석을 위해 데이터 포인트를 추적 생성한다. 설명 된 구성은 또한 분의 일까지의 기간에 걸쳐 후각에 응답하여 또는 다른 감각 자극에 다른 곤충 또는 곤충 애벌레의 움직임을 모니터링하기 위해, 약간의 수정과 함께 사용될 수있다. 네 사분면 분석은 매력적이고 혐오 자극 모두의 영향에 민감합니다. 대부분의 취기는 -0.9과 0.9 (식 1) 사이의 매력 지수 (AI)를 생성합니다. +0.5 +1까지의 범위에있는 반면, AI는 AI -1 -0.5의 범위에있어서, 자극 파리 강하게 흡착 동작을 의미강한 방충제에 의해 트리거. 일반적으로, 제어에 의해 악취 중립 응답 (건조 공기를 가습 공기 광유) +0.1 및 -0.1의 범위 내의 것이다. 인공 지능은 종종 파리가 취제 깃털, 초기 매력과 새로운 자극으로 운동 활성의 증가와 자극에 대한 응답으로 최종 탈감작에 걸어하는 데 필요한 시간을 반영 테스트 실험의 과정을 통해 변경합니다. 사전 테스트 제어 실행은 필수이고, 플라이가 원하는 자극의 부재 하에서 분야에서 균일하게 분포 된 것을 확인하기 위해 신중하게 수행되어야한다.
경기장에서 파리의 공간 바이어스의 가장 흔한 원인은 다음과 같습니다 우리의 경험에서, 파리처럼 조금의 공기 흐름의 차이를 감지 할 수있는 가능성으로 인해 연결이 끊긴 튜브에 고르지 않은 공기 흐름, 또는 별 모양의 경기장 부적절하게 고정 유리판 ( 15 ml / 분); 설정함으로써 개선 될 수있는 분야에 걸쳐 불균일 한 온도 분포공기 조화 장치는 경기장의 온도에도 보장 약하고 더 확산 공기 흐름 및 / 또는 더 긴 미리 획득주기 (~ 20 분)를 생성하는 단계; 검은 테이프와 개구부를 밀봉함으로써 감소 될 수있는 온도 프로브 개구를 통해 최소한의 빛샘; 경기장이나 설치 (아레나 flowtubes는 광 단단한 인클로저 등의 피팅)이 완전히 세척되고 건조시킨다 며칠 동안 또는 가능한 교체 할 필요가있는 경우에, 공기 공급 시스템에서의 잔류 냄새.
후각 장비의 유지 보수 안정적이고 일관성있는 결과를 위해 중요하다. 푸시 - 투 - 연결 동작 상자 공기 흡입구와 홀의 내벽 피팅 강한 냄새가 사용되는 경우 모든 실험 후, 에탄올로 세척하고 완전히 건조되도록한다. 유리판은 판의 잔류 냄새와 먼지를 제거하는 것이 충분 70 % 에탄올로 3 회 세정되어야하지만 헥산 유용파리에 의해 증착 된 유기 화합물을 제거 (예, 페로몬 긴 탄화수소 사슬로 이루어진). 그것은 일반적으로 후각 행동에 영향을 미치는 방향족 성분을 포함하고 있기 때문에 비누는 일반적으로 권장되지 않습니다. 동작 박스는 시스템으로부터 잔류 악취의 제거를 용이하게 실험의 건조 공기 흡입구 (예 : 밤새)에 연결된 상태를 유지한다.
파리의 운동 활성이 낮은 경우, 종종 시끄러운 가변 매력 지수 너무 적은 결과 데이터 요소를 생성 할 수있다. 이상 기아 및 기록 시간이 문제를 해결하는 데 도움이된다. 파리가 아픈 경우는 대조적으로, 기아의 24 ~ 28 시간은 일반적으로 그것이 실험 전반에 걸쳐 일관성으로 운동 활동을 강화하기위한 충분할 것이다. 파리의 건강한 상태를 유지하고 운동을 증가 사이의 좋은 균형이있다. 40 시간 기아 시작점으로서 사용하고, 나중에 수정 될 수도실험 결과에 기초하여 필요. 매력 인덱스 다소 따라서 기아시의 교란 효과를 피하기 위해 동일한 시간 동안 모든 실험 동물을 굶 필수적이다 기아 기간에 의해 영향을받을 것이다. 긴 기아 시간은 일반적으로 매력적인 응답이 강한 (0에 가까운) 반발 응답이 약한 확인하고. 건조 공기 제어 기류는 파리를 건조하는 경향이 있고, 40 분 이상 사용되지 않아야한다.
네 사분면 후각은 하나의 자극 (16, 18)에 하나 또는 여러 개의 파리의 반응을 연구하거나 자극 사이의 선택 순위를 연구하는데 이용 될 수있다. 예를 들어, 다른 냄새 네 사분면 각각에 사용될 수있다. 이것은 또한 악취 사분면의 영역을 검사하여 냄새의 혼합물에 대한 응답을 결정하기 위해 사용될 수있다. 이 추적 시스템은 각각의 트랙이 수집 된 데이터로부터 분리 될 수 있더라도, 그것이 주목해야한다수 그들이 혼자 테스트 때보다 그룹의 일부로 분석 할 때 개별 파리가 다르게 동작 할 수있다. 예를 들어, 파리의 그룹으로 인해 파리 (26) 사이의 물리적 상호 작용으로 냄새를 유도 반발력을 증가 나타낸다. 추적 시스템 및 레이아웃은 비 후각 분석법에 사용하기 위해 구성 될 수있다. 분석 프레임 워크는 쉽게 optogenetic 자극, 또는 thermogenetics에 대한 열 플레이트 (27)에 대한 LED 어레이 (9)를 수용 할 수 있습니다. 이 시스템은 또한 예 알을 낳는 동작 (14)을 연구하기 위해 많은 시간을 시간 스케일의 행동의 선택을 연구하기 위해 적응 될 수있다. 이 경우에, 획득 프레임 레이트가 큰 데이터 파일들의 생성, 습도, 기판 (1 % 아가 로스 겔)의 소스를 방지하도록 조절 될 필요가 알을 낳는 기재로서 제공 될 필요가있다.
이 설정의 제한은 파리에와 arena- 아래에 물체를 적외선은 반사로 추적되는 경우는 optogenetic의 요소 또는thermogenetic 실험 IR는 관련성이없는 데이터 포인트는 후 처리 동안 제거 될 필요가 반영한다. 현재 서로 다른 파리 연속적으로 구별 될 수 있도록 공간 해상도에서 파리를 촬영하는 것이 가능하지 않지만 이는 고급 비디오 카메라를 이용하여 미래에 개선 될 수있다. 현재 시스템의 또 다른 제한은 파리의 움직임이 도보 행동을 촉진하기 위해 두 가지 차원으로 제한되며, 후각에 의한 비행 반응을 방지 할 수 있다는 것입니다.
추가적인 자동화 된 분석이 또한 파리 후각 하나의 행동 또는 그룹을 조사하기 위해 개발되었다는 것을 주목해야한다. 여기에 기재된 분석에 가장 유사한 디자인 및 Beshel 종 (28)에 의해 개발 된 방법이다. 이 분석에서, 30 ~ 파리의 반응은 작은 원형 경기장에서 모니터링 냄새가 경기장 WA 따라 1 ~ 4의 냄새 포트로부터 전달되는 (네 개의 필드 경기장의 약 분기 지역)LL 및 원형 무대의 중앙에 구멍을 통해 제거 하였다. 작은 경기장 외에도 다른 디자인의 차이는 주로 (대신 네 개의 필드 경기장의 이랑 벽의 지시에 따라 취제 사분면에 걸쳐의) 냄새 포트에 가까운 집중 조명 조건에서 수행되는 행동 및 냄새 물질을 포함한다. 그럼에도 불구하고, 원형 경기장 파리 후각 반응 스크리닝에 적합한 방법이고, 여기에 설명 된 플라이 추적하도록 설계 될 수있다.
다른 방법을 동시에 냄새에 응답하여 다수의 단일 플라이의 활동을 모니터링한다. Flywalk 분석에서, 개별 파리는 작은 튜브에 넣고, 냄새 물질이 튜브 (29, 30)를 관류 할 때 그들의 반응은 추적됩니다. 속도에서 앞으로 또는 반대 방향으로의 변화, 또는 변경, 취제는 일반적으로 매력 또는 반발 경우 측정하기 위해 이용 될 수있다. 이 분석은 네 가지 필드의 분석과 같은 자동 플라이 m 트랙ovements 등을 신속하게 악취 넓은 범위 후각 반응을 측정 할 수있다. 그러나, 네 개의 필드와는 달리, 이러한 궤도 선회 각도 전위 사회적 상호 작용과 같은 복잡한 운동 역학은 어쩌면 Flywalk 분석 녹음 놓쳤다.
단일 도보로 파리의 자동 추적은 또한 T-미로 형 분석 (31, 32)에 적용되고있다. 이 분석에서, 냄새가 난다는 챔버의 중앙에 어느 포트를 통해 상기 챔버의 단부 및 출구 관류되는 작은 방에 배치된다. 파리의 위치를 자동으로 추적됩니다. 이 모방, 단일 플라이 규모, T 자 미로 프레임 워크. optogenetics과 함께,이 분석은 특히 학습 및 기억 후각을 매개 신경 회로를 분석하기에 적합하고 있으며, 또한 하나의 파리의 후각 환경을 측정하기 위해 사용될 수있다. 유사은 더 큰 공간 영역에 걸쳐 발생할 수있는 복잡한 활동 역학을 모니터링 할 수 없습니다, Flywalk하기이러한 비행 집단에서만 발생하는 식품을 추구하는 14, 또는 동작 중에 발생하는 것과 같은.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Air delivery system | (Quantity needed) | ||
| Tubing and connectors | |||
| Thermoplastic NPT(F) Manifolds | Cole-Parmer, IL, USA | R-31522-31 | 1 |
| Hex reducing nipple (1/4MNPT->1/8MNPT) | McMaster-Carr, IL, USA | 5232T314 | 1 |
| Tubing (ID:1/8) | McMaster-Carr, IL, USA | 5108K43 | 50 Ft |
| Tubing (ID:1/16) | McMaster-Carr, IL, USA | 52355K41 | 100 Ft |
| Barbed tube fittings | McMaster-Carr, IL, USA | 5117K71 | 1 pack |
| Push-to-connect tube fittings | McMaster-Carr, IL, USA | 5779K102 | 4 |
| Barbed Tube Fittings (1/4MNPT->1/8BF) | McMaster-Carr, IL, USA | 5463K439 | 1 pack (10) |
| Barbed Tube Fittings (1/8MNPT->1/8BF) | McMaster-Carr, IL, USA | 5463K438 | 2 pack (10) |
| Barbed Tube Fittings (1/8MNPT->1/16BF) | McMaster-Carr, IL, USA | 5463K4 | 2 pack (10) |
| Barbed Tube Fittings (1/4MNPT->1/4BF) | McMaster-Carr, IL, USA | 5670K84 | 1 |
| Hex head plug | McMaster-Carr, IL, USA | 48335K152 | 1 |
| Air pressure regulator, air filter and flowmeters | (Quantity needed) | ||
| Labatory gas drying unit | W A HAMMOND DRIERITE CO LTD, OH, USA | Model: L68-NP-303; stock #26840 | 1 |
| Multitube frames for 150 mm flowtubes | Cole-Parmer, IL, USA | R03215-30 | 1 |
| Multitube frames for 150 mm flowtubes | Cole-Parmer, IL, USA | R03215-76 | 1 |
| 150 mm flowtubes | Cole-Parmer, IL, USA | R-03217-15 | 9 |
| Valve Cartridge | Cole-Parmer, IL, USA | R-03218-72 | 9 |
| Precision Air regulator | McMaster-Carr, IL, USA | 6162K13 | 1 |
| Soleniod valves | Automate Scientific, Berkeley, CA | 02-10i | 4 |
| Solenoid valve controller | ValveLink 8.2, Automate Scientific, Berkeley, CA | 01-18 | 1 |
| Electronic flow meter | Honeywell | AWM3100V | 1 |
| DAQ (NI USB-6009, National Instruments) and a | National Instruments | NI USB-6009 | 1 |
| Power supply | Extech Instruments | 382200 | 1 |
| Odor chambers | |||
| Polypropylene Wide Mouth jar 2 oz; 60 ml | Nalgene | 562118-0002 | At least 5 are required per experiment, but a separate chamber is required for each dillution of each odorant. Available at Container Store, part #635114) |
| Glass odor chamber, 0.25 oz | Sunburst Bottle | LB4B | At least 5 are required per experiment |
| "In" valve for odor chamber | Smart Products, Inc., CA, USA | 214224PB-0011S000-4074 | 1 of these parts is used per odor chamber but they need to be replaced frequently |
| "Out" valve for odor chamber | Smart Products, Inc., CA, USA | 224214PB-0011S000-4074 | 1 of these parts is used per odor chamber but they need to be replaced frequently |
| O ring | RT Dygert International, MN, USA | AS568-029 Buna-N O-R | 1 pack (100) |
| Fly arena, camera and behavior boxes | (Quantity needed) | ||
| Behavior and camera box material | Interstate plastics, CA, USA | ABS black extruded (https://www.interstateplastics.com/Abs-Black-Extruded-Sheet-ABSBE~~ST.php) | 1803 sq inch |
| Teflon for fly arena and odor chamber inserts, 3/8" thick, 12" x 12" | McMaster-Carr, IL, USA | 8545K27 | 1 |
| Glass plates, 1/8" Thick, 9" x 9" | McMaster-Carr, IL, USA | 8476K191 | 2 |
| Dual action thermoelectric controller | WAtronix Inc, CA, USA | DA12V-K-0 | 1 |
| IR LED array | Advanced Illumination, Rochester, VT, USA | AL4554-88024, PS24-TL | 2 LED arrays and one power supply |
| Air conditioner Unit | Melcor Store | MAA280T-12 | 1 |
| Imaging system | (Quantity needed) | ||
| Cosmicar/Pentax C21211TH (12.5 mm F/1.4) C-mount Lens | B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA | PEC21211 KP | 1 |
| CCXC-12P05N Interconnect Cable | B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA | SOCCXC12P05N | 1 |
| DC-700 Camera Adapter | B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA | SODC700 | 1 |
| B+W 40,5 093 IR filter | B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA | 65-072442 | 1 |
| TiFFEN 40.5 mm Circular polarizer | Amazon | 1 | |
| IR Videocamera | Industrial Vision Source, FL, USA | Sony XC-EI50 (SY-XC-E150) | 1 |
| USB video converter | The Imagingsource, NC, USA | DFG/USB2-It | 1 |
| iFlySpy2 (fly tracking software) | Julian Brown, Stanford, Calfornia: julianrbrown@gmail.com | iFlySpy2 | 1 |
| IC Capture 2.2 software | The Imagingsource, NC, USA (http://www.theimagingsource.com/en_US/products/software/iccapture/) | ||
| Miscellaneous | (Quantity needed) | ||
| Dremel rotary tool | Dremel, Racine, WI, USA | Dremel 8000-03 | 1 |
| Diamond-coated drill bits for glass cutting | Available from various suppliers; MSC industrial Supply Co, Melville, NY | 90606328 | 1 |
References
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