We describe here a behavioral setup and data analysis method for assaying olfactory responses of up to 100 vinegar flies (Drosophila melanogaster). This system may be used with single or multiple olfactory stimuli, and adaptable for optogenetic activation or silencing of neuronal subsets.
तंत्रिका जीव विज्ञान में एक प्रमुख चुनौती समझने के लिए कैसे तंत्रिका सर्किट इसकी जटिल व्यवहार, शक्तिशाली आनुवंशिक तकनीक, और कॉम्पैक्ट तंत्रिका तंत्र के कारण उचित पशु व्यवहार मार्गदर्शन करने के लिए। ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर इस तरह की जाँच के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल प्रणाली है कार्य करते हैं। प्रयोगशाला व्यवहार assays लंबे (जैसे phototaxis, chemotaxis, संवेदी सीखने और स्मृति) 1-3 ड्रोसोफिला के साथ इस्तेमाल किया गया है प्राकृतिक वातावरण के गुणों का अनुकरण और इसी व्यवहार अंतर्निहित तंत्रिका तंत्र का अध्ययन करने के लिए। ट्रांसजेनिक ड्रोसोफिला लाइनों है कि विशिष्ट तंत्रिका सबसेट लेबल के बड़े संग्रह के हाल ही में उपलब्धता के साथ, व्यवहार assays व्यवहार 4-11 साथ न्यूरॉन्स से जोड़ने के लिए एक प्रमुख भूमिका पर ले लिया है। बहुमुखी और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य मानदंड, एक साथ डेटा विश्लेषण के लिए अंतर्निहित कम्प्यूटेशनल दिनचर्या के साथ, विभिन्न genotyp साथ उम्मीदवार उड़ लाइनों के तेजी से परीक्षण के लिए अपरिहार्य हैंतों। विशेष रूप से उपयोगी setups कि परीक्षण जानवरों, प्रयोगों की अवधि और प्रस्तुत उत्तेजनाओं की प्रकृति की संख्या में लचीला कर रहे हैं। पसंद की परख भी प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य डेटा हासिल करने और विश्लेषण करने के लिए आसान है कि उत्पन्न करनी चाहिए। यहाँ, हम एक प्रणाली और ड्रोसोफिला के व्यवहार प्रतिक्रियाओं परख करने की क्रिया के लिए प्रोटोकॉल के एक विस्तृत वर्णन एक बड़े चार क्षेत्र के क्षेत्र में मक्खियों प्रस्तुत करते हैं। सेटअप एक भी घ्राण प्रोत्साहन के लिए मक्खियों की प्रतिक्रियाओं परख करने के लिए यहाँ प्रयोग किया जाता है; हालांकि, एक ही सेटअप एकाधिक घ्राण, दृश्य या optogenetic उत्तेजनाओं, या इनमें से एक संयोजन का परीक्षण करने के लिए संशोधित किया जा सकता है। olfactometer सेटअप odors के लिए जवाब मक्खी आबादी की गतिविधि रिकॉर्ड, और कम्प्यूटेशनल विश्लेषणात्मक तरीकों मक्खी व्यवहार यों को लागू कर रहे हैं। एकत्र आंकड़ों एक प्रायोगिक रन है, जो कुशल डेटा संग्रह और प्रयोगात्मक शर्तों के अनुकूलन के लिए आवश्यक है की एक त्वरित पढ़ने के लिए बाहर पाने के लिए विश्लेषण कर रहे हैं।
अनुकूल है और बाहरी वातावरण के लिए प्रतिक्रिया करने की क्षमता सभी जानवरों के अस्तित्व के लिए महत्वपूर्ण है। एक जानवर खतरों से बचने के लिए, खाना बाहर की तलाश और साथियों मिल जाए, और पिछले अनुभवों से सीख की जरूरत है। संवेदी प्रणाली में इस तरह के दृश्य, रासायनिक और mechanosensory के रूप में उत्तेजनाओं की एक किस्म प्राप्त करते हैं, और केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के लिए इन संकेतों को भेजने की व्याख्या की और डीकोड किया जा करने के लिए कार्य करते हैं। मस्तिष्क तो उपयुक्त मोटर इस तरह के भोजन के लिए foraging या एक शिकारी से बचने के रूप में माना जाता पर्यावरण पर आधारित व्यवहार, निर्देशन। समझ कैसे संवेदी प्रणाली बाहरी दुनिया का पता लगाने के लिए, और कैसे मस्तिष्क डीकोड और फैसलों का निर्देशन, तंत्रिका जीव विज्ञान में एक बड़ी चुनौती है।
ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर जांच कैसे तंत्रिका सर्किट गाइड व्यवहार के लिए एक शक्तिशाली मॉडल प्रणाली है। सरल और सस्ता बनाए रखने के लिए किया जा रहा है इसके अलावा, ड्रोसोफिला कई विविध और जटिल टकसाली व्यवहार प्रदर्शन, अभी तक एक कॉम्पैक्ट साथ ऐसा करते हैं100,000 के बारे में न्यूरॉन्स के तंत्रिका तंत्र टी। शक्तिशाली आनुवंशिक तकनीक ड्रोसोफिला जीनोम से छेड़छाड़ के लिए मौजूद हैं, और ट्रांसजेनिक लाइनों के हजारों उत्पन्न किया गया है कि चुनिंदा और reproducibly न्यूरॉन्स 10-13 का एक ही सबसेट लेबल। ये ट्रांसजेनिक लाइनों चुनिंदा लेबल न्यूरॉन्स (सक्रिय या रोकना) की गतिविधि में हेरफेर करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और इन जोड़तोड़ कैसे तंत्रिका कार्यों गाइड व्यवहार की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
एकाधिक व्यवहार assays विभिन्न ड्रोसोफिला व्यवहार का अध्ययन करने के लिए विकसित किया गया है। ड्रोसोफिला, कई जानवरों की तरह है, जैसे, खाना खोजने साथियों को खोजने, और खतरों से बचने के रूप में कई व्यवहार विकल्प, मार्गदर्शन के लिए गंध की उनकी भावना का उपयोग करें। ओल्फैक्शन इसलिए जांच कैसे बाहरी उत्तेजनाओं का पता चला और एक जानवर के तंत्रिका तंत्र द्वारा व्याख्या उचित विकल्प मार्गदर्शन करने के लिए कर रहे हैं के लिए एक अच्छा संवेदी प्रणाली है। जैसे, assays के एक नंबर investiga के लिए विकसित किया गया हैटिंग लार्वा और वयस्क घ्राण व्यवहार। परंपरागत रूप से, ड्रोसोफिला में घ्राण व्यवहार एक दो विकल्प टी भूलभुलैया प्रतिमान है, जो जन्मजात परख करने की क्रिया के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और घ्राण व्यवहार 3 सीखा द्वारा यत्न कर रहे थे। इस परख में, के बारे में 50 मक्खियों दो ट्यूबों के बीच एक विकल्प दिया जाता है: एक ट्यूब प्रश्न में गंध होती है और अन्य एक नियंत्रण odorant (आमतौर पर गंध विलायक) शामिल हैं। मक्खियों एक विकल्प बनाने के लिए समय का एक निर्धारित अवधि के लिए दिया जाता है, और फिर मक्खियों कि अलग-अलग कक्षों में हैं की संख्या में गिने जाते हैं। हालांकि टी भूलभुलैया कई प्रयोगों के लिए एक सरल परख है, वहाँ कई सीमाएं हैं। उदाहरण के लिए, घ्राण व्यवहार केवल एक ही समय बिंदु पर मापा जाता है, और विभिन्न इस समय बिंदु से पहले किए गए विकल्पों खारिज कर रहे हैं। इसी तरह, आबादी के भीतर मक्खियों के अलग-अलग व्यवहार उपेक्षित रहे हैं। इसके अलावा, टी भूलभुलैया मक्खियों के मैनुअल गिनती, जो त्रुटियों को पेश हो सकता है की आवश्यकता है। अंत में, वहाँ के बाद से केवल दो मापा विकल्प हैं, इसअक्सर सूक्ष्म व्यवहार में बदलाव का पता लगाने के लिए आवश्यक सांख्यिकीय शक्ति कम कर देता है। एक दो विकल्प टी भूलभुलैया के लिए एक वैकल्पिक एक चार चतुर्थ भाग (चार क्षेत्र) olfactometer 14-18 है। इस परख में, जानवरों के एक क्षेत्र है जिसमें क्षेत्र के चार कोनों में से प्रत्येक odorized हवा का एक संभावित स्रोत से भर जाता है का पता लगाएं। क्षेत्र एक puckered सितारा आकार चार प्रयोगात्मक परिभाषित गंध quadrants के गठन को अधिकतम करने के लिए है। गंध कोनों तब से एक में आपूर्ति की जाती है, तो यह केवल यह है कि एक चक्र में निहित है। जानवरों के व्यवहार तीन नियंत्रण quadrants में उनके व्यवहार की तुलना में पता लगाया जा सकता है के रूप में वे प्रवेश और गंध चतुर्थ भाग छोड़ देते हैं, और आसानी से। चार चतुर्थ भाग olfactometer परख इस प्रकार के रिकॉर्ड एक बड़ी प्रयोगात्मक के मैदान से ज्यादा गंध उत्तेजनाओं को स्थानिक और लौकिक व्यवहार प्रतिक्रिया।
चार चतुर्थ भाग olfactometer पहले से Pettersson एट अल। 15 और पशु चिकित्सक एट अल विकसित किया गया था। 17 राजभाषा जांच करने के लिएकारखाने व्यक्ति परजीवी कलापक्ष के व्यवहार प्रतिक्रियाओं। Faucher एट अल। 18 और Semmelhack और वांग 16 व्यक्ति ड्रोसोफिला की घ्राण प्रतिक्रियाओं पर नजर रखने के लिए सेटअप अनुकूलित। चार चतुर्थ भाग olfactometer परीक्षण odorants और स्थितियों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए अनुमति देने के लिए भी उतना ही आकर्षक और प्रतिकारक प्रतिक्रियाओं के प्रति संवेदनशील है। कस्टम लिखा मक्खी ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर, एलेक्स Katsov 19 से विकसित की है और वर्तमान में जूलियन ब्राउन (सामग्री में विस्तृत) द्वारा बनाए रखा, चार चतुर्थ भाग olfactometer 14,20-23 के और अधिक हाल के कार्यान्वयन के लिए अतिरिक्त लाभ की शुरुआत की। अब यह उच्च स्थानिक पर 100 मक्खियों एक साथ (27.5 पिक्सल / सेमी) और अस्थायी समाधान है, जो इस तरह की स्थिति, किसी भी समय बिंदु पर गति और मक्खियों के त्वरण के रूप में विभिन्न मापदंडों निकालने की अनुमति देता है (प्रति सेकंड 30 फ्रेम) तक की परख के लिए संभव है। इस odors से 20 मक्खियों 'व्यवहार प्रतिक्रियाओं की गतिशीलता की जांच के लिए सक्षम बनाता है </s> अप। यह ध्यान दिया जाना चाहिए, हालांकि, यह है कि पूरे ट्रैकिंग अवधि के दौरान जनसंख्या के भीतर व्यक्तिगत मक्खियों की पहचान नहीं बनाए रखा है। इसके बजाय, प्रत्येक मक्खी ट्रैक के रूप में लंबे समय के रूप में दो फ्लाई पटरियों एक दूसरे को काटना नहीं है के लिए दर्ज की गई है। जो बिंदु पर, नई पटरियों मक्खियों हट के बाद आवंटित कर रहे हैं। अन्य वीडियो पर कब्जा सॉफ्टवेयर (सामग्री तालिका में विस्तृत) को शामिल करके, एक ही विन्यास लचीला ट्रैकिंग अवधि के लिए अनुमति देता है और एक कम फ्रेम दर पर छवियों को लेने के द्वारा अप करने के लिए 24 घंटे के लिए मक्खियों को ट्रैक करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। यह विकल्प मक्खियों के अंडे बिछाने व्यवहार का अध्ययन करने और ovipositional वरीयताओं 14 के साथ उनके शरीर की स्थिति की तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। चार-क्षेत्र olfactometer भी संवेदी उत्तेजनाओं की प्रस्तुतियों के साथ optogenetic 9 या 21 thermogenetic उत्तेजना गठबंधन करने के लिए बहुविध करने के लिए प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है (जैसे घ्राण और दृश्य) उत्तेजनाओं, या। इसके अलावा, उच्च अस्थायी समाधान के लिए प्रक्षेप पथ की निकासी की अनुमति देता हैआर पहनावा डेटा सेट में प्रत्येक व्यक्ति मक्खी। इसलिए, विधि घ्राण निर्देशित आबादी व्यवहार और भी अलग-अलग सामाजिक संबंधों की जांच की अनुमति देता है। इस परख द्वारा उत्पन्न डेटा व्यवहार स्क्रीन के लिए चार-क्षेत्र olfactometer के उपयोग की अनुमति के लिए मजबूत और अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य हैं।
हम यहाँ एक चार चतुर्थ भाग olfactometer के लिए जमाव विधानसभा का वर्णन है। हम आगे अत्यधिक ध्यान केंद्रित एथिल propionate के जवाब में एप्पल साइडर सिरका और प्रतिकर्षण के जवाब में घ्राण आकर्षण परख करने की क्रिया में इसके उपयोग का प्रदर्शन। अंत में, हम वर्णन और दर्ज मक्खी ट्रैकिंग डेटा के विश्लेषण के लिए उदाहरण कोड प्रदान करते हैं।
चार-क्षेत्र olfactometer यहाँ वर्णित जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती ड्रोसोफिला मक्खियों की बड़ी आबादी की घ्राण प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए एक बहुमुखी व्यवहार प्रणाली है। प्रत्येक प्रयोग (सेटअप, प्?…
The authors have nothing to disclose.
We thank Terry Shelley for manufacturing the fly arena and the light-tight enclosure, Liz Marr for help with fly stock maintenance, and Xiaojing Gao and Junjie Luo for help with the Matlab code used for data analysis. We thank Johan Lundström at the Monell Chemical Senses Center for demonstrating his odor delivery setup. This work was supported by grants from the Whitehall Foundation (CJP) and NIH NIDCD (R01DC013070, CJP).
Air delivery system | (Quantity needed) | ||
Tubing and connectors | |||
Thermoplastic NPT(F) Manifolds | Cole-Parmer, IL, USA | R-31522-31 | 1 |
Hex reducing nipple (1/4MNPT->1/8MNPT) | McMaster-Carr, IL, USA | 5232T314 | 1 |
Tubing (ID:1/8) | McMaster-Carr, IL, USA | 5108K43 | 50Ft |
Tubing (ID:1/16) | McMaster-Carr, IL, USA | 52355K41 | 100Ft |
Barbed tube fittings | McMaster-Carr, IL, USA | 5117K71 | 1pack |
Push-to-connect tube fittings | McMaster-Carr, IL, USA | 5779K102 | 4 |
Barbed Tube Fittings (1/4MNPT->1/8BF) | McMaster-Carr, IL, USA | 5463K439 | 1 pack (10) |
Barbed Tube Fittings (1/8MNPT->1/8BF) | McMaster-Carr, IL, USA | 5463K438 | 2 pack (10) |
Barbed Tube Fittings (1/8MNPT->1/16BF) | McMaster-Carr, IL, USA | 5463K4 | 2 pack (10) |
Barbed Tube Fittings (1/4MNPT->1/4BF) | McMaster-Carr, IL, USA | 5670K84 | 1 |
Hex head plug | McMaster-Carr, IL, USA | 48335K152 | 1 |
Air pressure regulator, air filter and flowmeters | (Quantity needed) | ||
Labatory gas drying unit | W A HAMMOND DRIERITE CO LTD, OH, USA | Model: L68-NP-303; stock #26840 | 1 |
Multitube frames for 150-mm flowtubes | Cole-Parmer, IL, USA | R03215-30 | 1 |
Multitube frames for 150-mm flowtubes | Cole-Parmer, IL, USA | R03215-76 | 1 |
150-mm flowtubes | Cole-Parmer, IL, USA | R-03217-15 | 9 |
Valve Cartridge | Cole-Parmer, IL, USA | R-03218-72 | 9 |
Precision Air regulator | McMaster-Carr, IL, USA | 6162K13 | 1 |
Soleniod valves | Automate Scientific, Berkeley, CA | 02-10i | 4 |
Solenoid valve controller | ValveLink 8.2, Automate Scientific, Berkeley, CA | 01-18 | 1 |
Electronic flow meter | Honeywell | AWM3100V | 1 |
DAQ (NI USB-6009, National Instruments) and a | National Instruments | NI USB-6009 | 1 |
Power supply | Extech Instruments | 382200 | 1 |
Odor chambers | |||
Polypropylene Wide Mouth jar 2oz; 60ml | Nalgene | 562118-0002 | At least 5 are required per experiment, but a separate chamber is required for each dillution of each odorant. Available at Container Store, part #635114) |
Glass odor chamber, 0.25 oz | Sunburst Bottle | LB4B | At least 5 are required per experiment |
"In" valve for odor chamber | Smart Products, Inc., CA, USA | 214224PB-0011S000-4074 | 1 of these parts is used per odor chamber but they need to be replaced frequently |
"Out" valve for odor chamber | Smart Products, Inc., CA, USA | 224214PB-0011S000-4074 | 1 of these parts is used per odor chamber but they need to be replaced frequently |
O ring | RT Dygert International, MN, USA | AS568-029 Buna-N O-R | 1 pack (100) |
Fly arena, camera and behavior boxes | (Quantity needed) | ||
Behavior and camera box material | Interstate plastics, CA, USA | ABS black extruded (https://www.interstateplastics.com/Abs-Black-Extruded-Sheet-ABSBE~~ST.php) | 1803 sq inch |
Teflon for fly arena and odor chamber inserts, 3/8" thick, 12"x12" | McMaster-Carr, IL, USA | 8545K27 | 1 |
Glass plates, 1/8" Thick, 9"x 9" | McMaster-Carr, IL, USA | 8476K191 | 2 |
Dual action thermoelectric controller | WAtronix Inc, CA, USA | DA12V-K-0 | 1 |
IR LED array | Advanced Illumination, Rochester, VT, USA | AL4554-88024, PS24-TL | 2 LED arrays and one power supply |
Air conditioner Unit | Melcor Store | MAA280T-12 | 1 |
Imaging system | (Quantity needed) | ||
Cosmicar/Pentax C21211TH (12.5mm F/1.4) C-mount Lens | B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA | PEC21211 KP | 1 |
CCXC-12P05N Interconnect Cable | B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA | SOCCXC12P05N | 1 |
DC-700 Camera Adapter | B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA | SODC700 | 1 |
B+W 40,5 093 IR filter | B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA | 65-072442 | 1 |
TiFFEN 40.5mm Circular polarizer | Amazon | 1 | |
IR Videocamera | Industrial Vision Source, FL, USA | Sony XC-EI50 (SY-XC-E150) | 1 |
USB video converter | The Imagingsource, NC, USA | DFG/USB2-It | 1 |
iFlySpy2 (fly tracking software) | Julian Brown, Stanford, Calfornia: julianrbrown@gmail.com | iFlySpy2 | 1 |
IC Capture 2.2 software | The Imagingsource, NC, USA (http://www.theimagingsource.com/en_US/products/software/iccapture/) | ||
Miscellaneous | (Quantity needed) | ||
Dremel rotary tool | Dremel, Racine, WI, USA | Dremel 8000-03 | 1 |
Diamond-coated drill bits for glass cutting | Available from various suppliers; MSC industrial Supply Co, Melville, NY | 90606328 | 1 |