Olfaktoriske Behaviors analyseret ved Computer sporing af<em> Drosophila</em> I en fire-kvadrant olfaktometer
Summary
We describe here a behavioral setup and data analysis method for assaying olfactory responses of up to 100 vinegar flies (Drosophila melanogaster). This system may be used with single or multiple olfactory stimuli, and adaptable for optogenetic activation or silencing of neuronal subsets.
Abstract
En central udfordring i neurobiologi er at forstå, hvordan neurale kredsløb fungerer til at guide passende dyreadfærd. Drosophila melanogaster er en fremragende model for sådanne undersøgelser på grund af sin komplekse adfærd, kraftfulde genetiske teknikker og kompakt nervesystem. Laboratorie adfærdsmæssige analyser har længe været anvendt med Drosophila til at simulere egenskaberne af det naturlige miljø og studere de neurale mekanismer bag de tilsvarende adfærd (f.eks phototaxis, kemotaksi, sensorisk indlæring og hukommelse) 1-3. Med den seneste tilgængeligheden af store samlinger af transgene Drosophila linjer, mærke specifikke neurale delmængder, har adfærdsmæssige analyser taget på en fremtrædende rolle at forbinde neuroner med adfærd 4-11. Alsidige og reproducerbare paradigmer sammen med de underliggende beregningsmæssige rutiner for dataanalyse, er uundværlige for hurtige test af kandidat flueliner med forskellige genotypes. Særligt anvendelige er opsætninger, som er fleksible i antallet af testede dyr, varighed eksperimenter og art præsenterede stimuli. Assayet af valg bør også generere reproducerbar data, der er let at erhverve og analysere. Her præsenterer vi en detaljeret beskrivelse af et system og protokol for analyse adfærdsmæssige reaktioner i Drosophila flyver i en stor fire-field arena. Opsætningen anvendes her til at analysere svarene fra fluer til en enkelt olfaktoriske stimulus; men den samme opsætning modificeres at teste flere olfaktoriske, visuelle eller optogenetic stimuli, eller en kombination af disse. Den olfaktometer setup registrerer aktiviteten af flyve befolkninger reagerer på lugte, og anvendes beregningsmæssige analysemetoder til at kvantificere flyve adfærd. De indsamlede data analyseres for at få en hurtig udlæsning af en eksperimentel løb, som er afgørende for en effektiv dataindsamling og optimering af eksperimentelle betingelser.
Introduction
Evnen til at tilpasse sig og reagere på det eksterne miljø er afgørende for overlevelsen af alle dyr. Et dyr har brug for at undgå farer, opsøge mad og finde hjælpere, og lære af tidligere erfaringer. Sensoriske systemer fungerer til at modtage en række stimuli, såsom visuelle, kemiske og mechanosensory, og sende disse signaler til det centrale nervesystem fortolkes og dekodes. Hjernen derefter dirigerer passende motoriske adfærd baseret på den opfattede miljø, såsom søgning efter føde eller flugt fra et rovdyr. Forstå, hvordan sansesystemer finde den eksterne verden, og hvordan hjernen afkoder og dirigerer beslutninger, er en stor udfordring i neurobiologi.
Drosophila melanogaster er et kraftfuldt modelsystem til at undersøge, hvordan neurale kredsløb guide adfærd. Udover at være enkelt og billigt at vedligeholde, Drosophila udviser mange forskelligartede og komplekse stereotype adfærd, men gøre det med en Compact nervesystem på omkring 100.000 neuroner. Kraftige genetiske teknikker eksisterer for at manipulere Drosophila genomet, og tusindvis af transgene linjer er blevet genereret, som selektivt og reproducerbart mærke de samme delmængder af neuroner 10-13. Disse transgene linjer kan anvendes til selektivt at manipulere aktiviteten af de mærkede neuroner (aktivere eller inhibere), og disse manipulationer kan anvendes til at undersøge, hvordan neurale funktioner guide adfærd.
Flere adfærdsmæssige assays er blevet udviklet til at studere forskellige Drosophila adfærd. Drosophila, ligesom mange dyr, bruge deres lugtesans til at styre mange adfærdsmæssige valg, såsom at finde mad, finde hjælpere, og undgå farer. Lugtesansen er derfor en god sensorisk system til at undersøge, hvordan eksterne stimuli registreres og fortolkes af et dyrs nervesystem til at guide passende valg. Som sådan har en række assays blevet udviklet til undersøgelTing larvestadiet og voksne olfaktoriske adfærd. Traditionelt blev olfaktoriske adfærd i Drosophila analyseret ved en to-choice T-labyrint paradigme, som kan anvendes til analyse af medfødte og lært olfaktoriske adfærd 3. I denne analyse er omkring 50 fluer givet et valg mellem to rør: et rør indeholder omhandlede duft, og den anden indeholder en kontrol lugtstof (normalt lugt opløsningsmiddel). Fluerne er givet en fastsat periode til at træffe et valg, og så antallet af fluer, der er i de forskellige kamre tælles. Selvom T-labyrint er et simpelt assay til mange eksperimenter, er der flere begrænsninger. For eksempel er olfaktoriske adfærd måles på kun ét tidspunkt, og forskellige valg foretaget før dette tidspunkt kasseres. Tilsvarende er de individuelle adfærd af fluerne i populationen forsømt. Derudover T-labyrinten kræver manuel tælling af fluer, som kunne indføre fejl. Endelig, da der kun er to målte valg, dettereducerer den statistiske effekt ofte kræves for at registrerer små adfærdsændringer. Et alternativ til en to-choice T-labyrint er en fire-kvadrant (fire-field) olfaktometer 14-18. I dette assay dyr undersøge en arena, hvor hver af de fire hjørner af arenaen er fyldt med en potentiel kilde til odorized luft. Arenaen har en rynket stjerne facon at maksimere dannelsen af fire eksperimentelt definerede lugt kvadranter. Hvis lugt leveres i et af hjørnerne er den indeholdt kun i denne ene kvadrant. De adfærd af dyrene kan spores som de kommer ind og forlader lugt kvadrant, og let i forhold til deres adfærd i de tre kontrolpunkter kvadranter. De fire-kvadrant olfaktometer assay dermed optegnelser rumlig og tidsmæssig adfærdsmæssige respons på lugt stimuli over en stor eksperimentel arena.
De fire-kvadrant olfaktometer blev først udviklet af Pettersson et al. 15 og Vet et al. 17 for at undersøge olfabrikken adfærdsmæssige reaktioner enkelte parasitiske Hymenoptera. Faucher et al. 18 og Semmelhack og Wang 16 tilpasset opsætningen til at overvåge olfaktoriske reaktioner af individuelle Drosophila. De fire-kvadrant olfaktometer er lige følsomme over for tiltrækkende og frastødende responser, giver mulighed for en bred vifte af test lugtstoffer og betingelser. Brugerdefineret-skriftlig flue tracking software, der er udviklet af Alex Katsov 19 og i øjeblikket vedligeholdt af Julian Brown (nærmere beskrevet i Materials), indført yderligere fordele til nyere implementeringer af fire-kvadrant olfaktometer 14,20-23. Det er nu muligt at analysere op til 100 fluer samtidigt ved høj rumlig (27,5 pixels / cm) og tidsmæssige (30 billeder pr sekund) opløsning, som gør det muligt at ekstrahere forskellige parametre, såsom position, hastighed og acceleration af fluer på noget tidspunkt. Dette gør det muligt undersøgelser af dynamikken i de fluer 'adfærdsmæssige reaktioner på lugte 20 </sop>. Det skal dog bemærkes, at identiteten af individuelle fluer i befolkningen under hele sporing periode ikke opretholdes. I stedet er hver flue track registreret, så længe som to flyve spor ikke skærer hinanden. På hvilket tidspunkt er nye numre tildeles efter fluerne divergerer. Ved at inkorporere andre video-fanger software (detaljeret i Materialer tabel), den samme konfiguration tillader fleksible sporing perioder og kan anvendes til at spore fluer i op til 24 timer ved at tage billeder med en lavere rammehastighed. Denne mulighed blev brugt til at studere æglæggende adfærd af fluer og sammenligne deres kropsstillinger med ovipositional præferencer 14. De fire-field olfaktometer kan også anvendes til at studere reaktioner multimodal (f.eks olfaktoriske og visuelle) stimuli, eller at kombinere optogenetic 9 eller thermogenetic 21 stimulation med præsentationer af sensoriske stimuli. Endvidere den høje tidsopløsning tillader udvinding af baner for hver enkelt flue i ensemblet datasæt. Derfor metoden tillader undersøgelse olfaktoriske guidet population adfærd og også individuelle sociale interaktioner. De data, der genereres af dette assay er robuste og meget reproducerbar, tillader anvendelse af de fire-field olfaktometer for adfærdsmæssige skærme.
Vi beskriver her setup forsamling for en fire-kvadrant olfaktometer. Vi demonstrerer yderligere dens anvendelse i analyse olfaktoriske attraktion som reaktion på æble cider eddike og frastødning som reaktion på meget koncentreret ethyl propionat. Endelig beskriver vi og give eksempel kode for analysen af de registrerede flue sporingsdata.
Protocol
Representative Results
Discussion
De fire-field olfaktometer beskrevet her er et alsidigt adfærdsmæssige system til at studere de olfaktoriske responser af store populationer af vildtype og mutant Drosophila fluer. Hvert eksperiment tager ~ 1 time (herunder opsætning, eksperimentelle kørsler, og rengøring), og 4-6 eksperimenter kan rutinemæssigt udføres hver dag. Et typisk assay under anvendelse af 40-50 fluer i 5 minutter genererer ca. 450.000 spores datapunkter til analyse. Den beskrevne konfiguration kan også anvendes, med mindre mod…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Terry Shelley for manufacturing the fly arena and the light-tight enclosure, Liz Marr for help with fly stock maintenance, and Xiaojing Gao and Junjie Luo for help with the Matlab code used for data analysis. We thank Johan Lundström at the Monell Chemical Senses Center for demonstrating his odor delivery setup. This work was supported by grants from the Whitehall Foundation (CJP) and NIH NIDCD (R01DC013070, CJP).
Materials
| Air delivery system | (Quantity needed) | ||
| Tubing and connectors | |||
| Thermoplastic NPT(F) Manifolds | Cole-Parmer, IL, USA | R-31522-31 | 1 |
| Hex reducing nipple (1/4MNPT->1/8MNPT) | McMaster-Carr, IL, USA | 5232T314 | 1 |
| Tubing (ID:1/8) | McMaster-Carr, IL, USA | 5108K43 | 50Ft |
| Tubing (ID:1/16) | McMaster-Carr, IL, USA | 52355K41 | 100Ft |
| Barbed tube fittings | McMaster-Carr, IL, USA | 5117K71 | 1pack |
| Push-to-connect tube fittings | McMaster-Carr, IL, USA | 5779K102 | 4 |
| Barbed Tube Fittings (1/4MNPT->1/8BF) | McMaster-Carr, IL, USA | 5463K439 | 1 pack (10) |
| Barbed Tube Fittings (1/8MNPT->1/8BF) | McMaster-Carr, IL, USA | 5463K438 | 2 pack (10) |
| Barbed Tube Fittings (1/8MNPT->1/16BF) | McMaster-Carr, IL, USA | 5463K4 | 2 pack (10) |
| Barbed Tube Fittings (1/4MNPT->1/4BF) | McMaster-Carr, IL, USA | 5670K84 | 1 |
| Hex head plug | McMaster-Carr, IL, USA | 48335K152 | 1 |
| Air pressure regulator, air filter and flowmeters | (Quantity needed) | ||
| Labatory gas drying unit | W A HAMMOND DRIERITE CO LTD, OH, USA | Model: L68-NP-303; stock #26840 | 1 |
| Multitube frames for 150-mm flowtubes | Cole-Parmer, IL, USA | R03215-30 | 1 |
| Multitube frames for 150-mm flowtubes | Cole-Parmer, IL, USA | R03215-76 | 1 |
| 150-mm flowtubes | Cole-Parmer, IL, USA | R-03217-15 | 9 |
| Valve Cartridge | Cole-Parmer, IL, USA | R-03218-72 | 9 |
| Precision Air regulator | McMaster-Carr, IL, USA | 6162K13 | 1 |
| Soleniod valves | Automate Scientific, Berkeley, CA | 02-10i | 4 |
| Solenoid valve controller | ValveLink 8.2, Automate Scientific, Berkeley, CA | 01-18 | 1 |
| Electronic flow meter | Honeywell | AWM3100V | 1 |
| DAQ (NI USB-6009, National Instruments) and a | National Instruments | NI USB-6009 | 1 |
| Power supply | Extech Instruments | 382200 | 1 |
| Odor chambers | |||
| Polypropylene Wide Mouth jar 2oz; 60ml | Nalgene | 562118-0002 | At least 5 are required per experiment, but a separate chamber is required for each dillution of each odorant. Available at Container Store, part #635114) |
| Glass odor chamber, 0.25 oz | Sunburst Bottle | LB4B | At least 5 are required per experiment |
| "In" valve for odor chamber | Smart Products, Inc., CA, USA | 214224PB-0011S000-4074 | 1 of these parts is used per odor chamber but they need to be replaced frequently |
| "Out" valve for odor chamber | Smart Products, Inc., CA, USA | 224214PB-0011S000-4074 | 1 of these parts is used per odor chamber but they need to be replaced frequently |
| O ring | RT Dygert International, MN, USA | AS568-029 Buna-N O-R | 1 pack (100) |
| Fly arena, camera and behavior boxes | (Quantity needed) | ||
| Behavior and camera box material | Interstate plastics, CA, USA | ABS black extruded (https://www.interstateplastics.com/Abs-Black-Extruded-Sheet-ABSBE~~ST.php) | 1803 sq inch |
| Teflon for fly arena and odor chamber inserts, 3/8" thick, 12"x12" | McMaster-Carr, IL, USA | 8545K27 | 1 |
| Glass plates, 1/8" Thick, 9"x 9" | McMaster-Carr, IL, USA | 8476K191 | 2 |
| Dual action thermoelectric controller | WAtronix Inc, CA, USA | DA12V-K-0 | 1 |
| IR LED array | Advanced Illumination, Rochester, VT, USA | AL4554-88024, PS24-TL | 2 LED arrays and one power supply |
| Air conditioner Unit | Melcor Store | MAA280T-12 | 1 |
| Imaging system | (Quantity needed) | ||
| Cosmicar/Pentax C21211TH (12.5mm F/1.4) C-mount Lens | B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA | PEC21211 KP | 1 |
| CCXC-12P05N Interconnect Cable | B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA | SOCCXC12P05N | 1 |
| DC-700 Camera Adapter | B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA | SODC700 | 1 |
| B+W 40,5 093 IR filter | B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA | 65-072442 | 1 |
| TiFFEN 40.5mm Circular polarizer | Amazon | 1 | |
| IR Videocamera | Industrial Vision Source, FL, USA | Sony XC-EI50 (SY-XC-E150) | 1 |
| USB video converter | The Imagingsource, NC, USA | DFG/USB2-It | 1 |
| iFlySpy2 (fly tracking software) | Julian Brown, Stanford, Calfornia: julianrbrown@gmail.com | iFlySpy2 | 1 |
| IC Capture 2.2 software | The Imagingsource, NC, USA (http://www.theimagingsource.com/en_US/products/software/iccapture/) | ||
| Miscellaneous | (Quantity needed) | ||
| Dremel rotary tool | Dremel, Racine, WI, USA | Dremel 8000-03 | 1 |
| Diamond-coated drill bits for glass cutting | Available from various suppliers; MSC industrial Supply Co, Melville, NY | 90606328 | 1 |
References
- Benzer, S. Behavioral mutants of Drosophila isolated by countercurrent distribution. Proc Natl Acad Sci U S A. 58 (3), 1112-1119 (1967).
- Thorpe, W. H. Further studies on pre-imaginal olfactory conditioning in insects. Proc R Soc B. 127 (848), 424-433 (1939).
- Tully, T., Quinn, W. G. Classical conditioning and retention in normal and mutant Drosophila melanogaster. J Comp Physiol A. 157 (2), 263-277 (1985).
- Anholt, R. R., Mackay, T. F. Quantitative genetic analyses of complex behaviours in Drosophila. Nat Rev Genet. 5 (11), 838-849 (2004).
- Vosshall, L. B. Into the mind of a fly. Nature. 450 (7167), 193-197 (2007).
- Wu, M. N., Koh, K., Yue, Z., Joiner, W. J., Sehgal, A. A genetic screen for sleep and circadian mutants reveals mechanisms underlying regulation of sleep in Drosophila. Sleep. 31 (4), 465-472 (2008).
- Dankert, H., Wang, L., Hoopfer, E. D., Anderson, D. J., Perona, P. Automated monitoring and analysis of social behavior in Drosophila. Nat Methods. 6 (4), 297-303 (2009).
- Branson, K., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. High-throughput ethomics in large groups of Drosophila. Nat Methods. 6 (6), 451-457 (2009).
- Aso, Y., et al. Mushroom body output neurons encode valence and guide memory-based action selection in Drosophila. Elife. 3, e04580 (2014).
- Pfeiffer, B. D., et al. Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (28), 9715-9720 (2008).
- Pfeiffer, B. D., et al. Refinement of tools for targeted gene expression in Drosophila. Genetics. 186 (2), 735-755 (2010).
- Venken, K. J., et al. Genome engineering: Drosophila melanogaster and beyond. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. , (2015).
- Diao, F., et al. Plug-and-play genetic access to drosophila cell types using exchangeable exon cassettes. Cell Rep. 10 (8), 1410-1421 (2015).
- Lin, C. C., Prokop-Prigge, K. A., Preti, G., Potter, C. J. Food odors trigger Drosophila males to deposit a pheromone that guides aggregation and female oviposition decisions. Elife. 4, (2015).
- Pettersson, J. An aphid sex attractant. Insect Systematics & Evolution. 1 (1), 63-73 (1970).
- Semmelhack, J. L., Wang, J. W. Select Drosophila glomeruli mediate innate olfactory attraction and aversion. Nature. 459 (7244), 218-223 (2009).
- Vet, L. E. M., Lenteren, J. C. V., Heymans, M., Meelis, E. An airflow olfactometer for measuring olfactory responses of hymenopterous parasitoids and other small insects. Physiological Entomology. 8 (1), 97-106 (1983).
- Faucher, C., Forstreuter, M., Hilker, M., de Bruyne, M. Behavioral responses of Drosophila to biogenic levels of carbon dioxide depend on life-stage, sex and olfactory context. J Exp Biol. 209 (Pt 14), 2739-2748 (2006).
- Katsov, A. Y., Clandinin, T. R. Motion processing streams in Drosophila are behaviorally specialized. Neuron. 59 (2), 322-335 (2008).
- Gao, X. J., et al. Specific kinematics and motor-related neurons for aversive chemotaxis in Drosophila. Curr Biol. 23 (13), 1163-1172 (2013).
- Gao, X. J., Clandinin, T. R., Luo, L. Extremely sparse olfactory inputs are sufficient to mediate innate aversion in Drosophila. PLoS One. 10 (4), e0125986 (2015).
- Ronderos, D. S., Lin, C. C., Potter, C. J., Smith, D. P. Farnesol-detecting olfactory neurons in Drosophila. J Neurosci. 34 (11), 3959-3968 (2014).
- Riabinina, O., et al. Improved and expanded Q-system reagents for genetic manipulations. Nat Methods. 12 (3), 219-222 (2015).
- Lundstrom, J. N., Gordon, A. R., Alden, E. C., Boesveldt, S., Albrecht, J. Methods for building an inexpensive computer-controlled olfactometer for temporally-precise experiments. Int J Psychophysiol. 78 (2), 179-189 (2010).
- Colinet, H., Renault, D. Metabolic effects of CO2 anaesthesia in Drosophila melanogaster. Biology Letters. 8 (6), 1050-1054 (2012).
- Ramdya, P., et al. Mechanosensory interactions drive collective behaviour in Drosophila. Nature. 519 (7542), 233-236 (2015).
- Ofstad, T. A., Zuker, C. S., Reiser, M. B. Visual place learning in Drosophila melanogaster. Nature. 474 (7350), 204-207 (2011).
- Beshel, J., Zhong, Y. Graded encoding of food odor value in the Drosophila brain. J Neurosci. 33 (40), 15693-15704 (2013).
- Steck, K., et al. A high-throughput behavioral paradigm for Drosophila olfaction – The Flywalk. Sci Rep. 2, 361 (2012).
- Thoma, M., Hansson, B. S., Knaden, M. High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm. J. Vis. Exp. (106), (2015).
- Claridge-Chang, A., et al. Writing memories with light-addressable reinforcement circuitry. Cell. 139 (2), 405-415 (2009).
- Parnas, M., Lin, A. C., Huetteroth, W., Miesenbock, G. Odor discrimination in Drosophila: from neural population codes to behavior. Neuron. 79 (5), 932-944 (2013).
