Introduction
L'étude des tissus, des organes ou des systèmes in vitro est un essai de simplifier les relations complexes qui existent entre les sous - types cellulaires différents qui comprennent des organismes multicellulaires. En effet, des études in vitro permettent d'acquérir une compréhension détaillée des populations de cellules isolées. Il y a deux principaux avantages de la conduite des expériences in vitro: 1) réduit les interactions cellulaires, et 2) la capacité de manipuler facilement l'environnement cellulaire. Par conséquent, ces deux avantages ont permis aux scientifiques de prédire le comportement des types cellulaires spécifiques in vivo, conduisant à la capacité de réguler les résultats des influences extrinsèques dans des organismes entiers. En ce sens, la culture in vitro de cellules dans fonctionne souvent comme un pont reliant les sciences fondamentales et appliquées vie. Néanmoins, il y a aussi plusieurs inconvénients du travail in vitro, le plus important étant qu'une certaine réserve peut demeurer dans le physiologiqueal pertinence des phénotypes observés. En effet, quand un seul type de cellule est cultivée dans un récipient, la culture perd, à des degrés divers, ses connexions cellule-cellule avec d'autres types de cellules, sa contribution à l'environnement humorale du tissu et de l'organisme d'origine, et les ancres au sein le tissu qui lui a permis de faire respecter une structure tridimensionnelle particulière, parfois crucial pour la fonction cellulaire.
La question des relations cellule-cellule a été adressée par le développement des techniques de culture mixtes. Dans ce procédé, deux ou plusieurs populations de cellules sont cultivées dans le même récipient de culture. Cependant, ces cultures mixtes portent des inconvénients importants. D'une part, certains sous-types de cellules n'interagissent pas physiquement avec l'autre dans le tissu d'origine et reposent uniquement sur les communications paracrines soutenues par des facteurs solubles sécrétés et récepteurs à proximité. Tel est le cas pour plusieurs processus inflammatoires qui dépendent de la signalisation des cytokines proximale. Dans mixte cULTURES, les interactions physiques sont inévitables et il est impossible d'étudier les communications paracrines en l'absence de contacts cellule-cellule qui peut donner des résultats modifiés. D'autre part, la réalisation des interprétations spécifiques de cellules à partir d'une population mixte devient impossible sans l'utilisation de techniques de séparation difficiles qui pourraient affecter de manière significative les résultats.
Pour résoudre ces questions importantes, l'utilisation des médias conditionnés a été développé comme une technique permettant des cultures compartimentées et l'étude de la signalisation paracrine. Cette méthode nécessite le transfert du surnageant d'un type de cellule, le milieu conditionné ainsi nommé, aux puits contenant une autre population de cellules. Mais un inconvénient important est que les molécules de courte durée ne survivent pas assez longtemps dans le milieu conditionné à être transféré dans les puits de la seconde population de cellules. Même les molécules longue durée de vie sera grandement dilué au fil du temps en raison de la diffusion. En outre, les deux cellulespopulations ne participent à la communication paracrine unidirectionnel plutôt que dans une communication bidirectionnelle active. Cela conduit à l'absence de signaux de rétroaction qui est essentielle pour recréer les relations exactes pluricellulaires tels qu'ils existent in vivo.
En conséquence , et entraînée par la nécessité de mieux simuler l'original dans des conditions in vivo dans l'environnement cellulaire in vitro, de nombreux progrès dans les techniques de culture cellulaire ont été réalisées au cours des années. L' un des progrès les plus significatifs a été l'utilisation de supports perméables avec des membranes microporeuses pour compartimenter des cultures de cellules, utilisées pour la première fois par Grobstein en 1953 1. De tels supports perméables ont été adaptés au fil des ans pour accueillir de nombreux types de cellules et à utiliser dans plusieurs applications différentes. Aujourd'hui, ces supports existent comme des inserts creux qui sont conçus pour reposer dans les puits d'une plaque de culture tissulaire multipuits ou circuplats lar. Dans un système de co-culture, l'insert contient un type de cellule tandis que le puits ou l'autre plat contient population cellulaire, ce qui permet d'étudier la contribution de deux populations différentes de cellules de leur environnement humorale (figure 1). En conséquence, la polarité cellulaire (basolatérale ou apicale contre la sécrétion réception du signal) est conservé, ce qui confère ainsi des systèmes de co-culture insérer un avantage important par rapport aux cultures mixtes et des techniques milieu conditionné. Plusieurs types de matériaux de membrane sont disponibles, les plus courantes étant du polyester (PET), le polycarbonate (PC) ou du collagène revêtu de polytétrafluoroéthylène (PTFE), et ils existent en différentes tailles de pores allant de 0,4 um à 12,0 um. Ces variétés de matériaux et de tailles des pores offrent un spectre d'inserts exerçant des caractéristiques variables pertinentes aux propriétés optiques, l'épaisseur de la membrane et l'adhérence des cellules qui les rendent pratiques à différents niveaux pour les utilisations suivantes sans s'y limiter:
-étudierla différenciation cellulaire, le développement embryonnaire, la métastase tumorale et la réparation des plaies par des dosages chimiotactiques à travers des membranes perméables;
-evaluating la pénétration du médicament en évaluant leur transport à travers des monocouches épithéliales ou endothéliales cultivées sur des supports perméables, et;
cellules co-cultures -Exécution pour analyser les modulations du comportement cellulaire induite par des facteurs solubles sécrétés en l'absence de contact cellule-cellule.
Le but de cet article est de décrire les lignes directrices méthodologiques générales pour remplir la troisième fonction indiquée ci-dessus, qui est d'évaluer les changements cellulaires médiées par des facteurs solubles sécrétés en l'absence de contact cellule-cellule en utilisant un système de co-culture insert. Plusieurs domaines de recherche différents utilisent des systèmes insert de co-culture, afin de répondre à des questions pertinentes à l'effet de facteurs solubles sécrétés sur les populations de cellules. En effet, la signalisation paracrine qui module le comportement cellulaire à différents niveaux est pertinent dans tous les tissuset les systèmes, ce qui rend les systèmes de co-culture insertion indispensable pour assurer des progrès dans ces domaines. A l'inverse, l'utilisation d'inserts peut confirmer que la transduction du signal se fait par le contact direct de cellule à cellule, et non par des facteurs sécrétés. L' une des utilisations les plus importantes des inserts est dans les études de l' inflammation 2-14 où l'effet de cytokines sécrétées est évaluée à différents acteurs cellulaires de l' immunité. En particulier, l'étude de l' inflammation dans le système nerveux central (SNC) a grandement profité des études insert de co-culture, qui ont permis de mieux définir les rôles paracrines distincts de neurones et les microglies dans neuroinflammation 15-21 conduite. Ces systèmes ont été conçus aussi pour étudier le potentiel anti-inflammatoire des molécules repose sur leur capacité à réduire ou à inhiber la sécrétion de facteurs pro-inflammatoires 22-26. La recherche portant sur le cancer 27-31, en particulier les mécanismes sous - jacents de l' angiogenèse 32-34 et inflammatisur 35-42 dans la tumorigenèse, bénéficie également de systèmes insert de co-culture. En outre, des facteurs solubles sont de première importance dans les processus qui conduisent la différenciation et plusieurs études ont utilisé des inserts pour répondre aux questions dans ce domaine particulier 43-50. Dans le SNC, car le tissu neural possède un potentiel de renouvellement très limité, l'étude de la neuroprotection et neurotrophism est fondamental et a été largement assurée par l'utilisation de cellules souches dans des systèmes de co-culture 51-56. En outre, les inserts sont également utilisés dans les domaines aussi variés que la néphrologie 57,58, les interactions endothéliales et l' angiogénèse 59-62, 63-65 signalisation de l' apoptose, l' inflammation dans l' obésité et le syndrome métabolique 22,23,66-67, l' oreille interne de protection des cellules ciliées 68,69, et même dans la virulence des champignons 70,71 et parasitologie 72,73.
Cet article propose des lignes directrices méthodologiques générales afin de mettre en place un expériment en vue d'évaluer les modifications cellulaires médiées par des facteurs solubles sécrétés en utilisant un système de co-culture insert. En particulier, nous allons nous concentrer notre attention sur cellules nerveuses co-cultures et leurs utilisations dans l'étude de processus de neuroinflammatoire. Compte tenu de la très vaste éventail d'expériences qui insère permettre au pilote, il est insupportable pour couvrir tous les aspects de cette technique de culture cellulaire. A titre d'exemple, un protocole spécifique pour mesurer les effets des cytokines sécrétées par le lipopolysaccharide (LPS) -activated microglie N9 sur les cellules PC12 neuronales seront détaillées, offrant une compréhension concrète de la méthodologie insert co-culture.
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Protocol
NB: Chacune des étapes suivantes doivent être effectuées dans des conditions stériles sous une hotte à flux laminaire tel que requis pour la culture cellulaire de mammifère. En outre, les lignes directrices générales pour la culture optimale des cellules stériles appliquent, par exemple., En écartant des conseils chaque fois qu'ils peuvent conduire à la contamination croisée, ce qui réduit la quantité de cellules de temps sont exposés à l'air lors de l' exécution des changements de médias entiers, correctement , mais en remuant doucement tout suspensions cellulaires pour assurer leur pipetage homogène, etc. de plus, les inserts sont une sorte de plasticware qui nécessitent un traitement spécial. Tout d'abord, chaque fois que les inserts sont manipulés, évitez de toucher la membrane fragile, qui se déchire facilement et pourrait donc compromettre l'expérience. En outre, il ne convient pas pour effectuer l'aspiration du milieu de culture cellulaire, car il existe un risque de perforation de la membrane ou dissociant les cellules adhérentes. Ensuite, inserts pendre dans la plaque de culture tissulaire multipuits et, par conséquent, la prudence doit être employée lorsque moVing l'plasticware ou lors du pipetage pour éviter dissociant des cellules adhérentes. En outre, quand on utilise des inserts avec de grandes tailles de pores, il est possible que le milieu de culture cellulaire suinte à travers la membrane et, par conséquent, il est important de contrôler fréquemment le niveau de liquide. Enfin, notez que le protocole suivant est conçu pour les cellules adhérentes et nécessite des modifications mineures afin d'être adapté pour des cellules en suspension.
1. Lignes directrices générales pour la conduite insertion des expériences de co-culture
- Semis type de cellule n ° 1 à inserts
- Déballer les inserts de leur emballage.
- Placer les inserts dans un multipuits plaque de culture de tissu vide de la bonne dimension. Pour ce faire, saisir le bord supérieur de l'insert en utilisant des pinces.
- Pour améliorer la fixation et la propagation des cellules adhérentes, conditionner les plaquettes avec un milieu de culture cellulaire avant l'ensemencement. Pour ce faire, couvrir toute la surface de la membrane avec culture cellulaire medium à l'aide d'une micropipette.
NOTE: Pour ce faire, pour autant inserts au besoin. - Replacer le couvercle sur la plaque et incuber pendant au moins 1 heure ou O / N dans les mêmes conditions (généralement 37 ° C, 5 à 10% de CO 2).
- Lorsque les inserts sont conditionnés, retirer la totalité du milieu de culture cellulaire en utilisant une micropipette. Jeter le moyen utilisé.
- Graine type cellulaire # 1 dans du milieu frais de culture cellulaire de la même manière que dans une plaque multipuits. Pour ce faire, tirer un volume approprié de la suspension cellulaire avec une micropipette et distribuer le liquide dans l'insert.
NOTE: Préparer autant inserts au besoin. - Après l'ensemencement tous les inserts, secouez légèrement la plaque à gauche et à droite, puis en arrière afin de répartir les cellules uniformément. Évitez de faire des mouvements circulaires, car cela provoquerait des cellules d'accumuler dans le centre des inserts.
- Placer le couvercle sur la plaque et incuber comme indiqué par conformément aux exigences cellulaires (habituellement 37 ° C, 5-10% de CO
- Semis type de cellule n ° 2 dans des plaques de culture tissulaire multipuits
- Seed type de cellule # 2 dans un milieu de culture cellulaire frais conformément à la section 1.
- Préparer autant de puits selon les besoins pour le nombre d'insertions. Balancer la plaque comme dans l'étape 1.1.7) pour faire en sorte que les cellules sont réparties de façon uniforme dans les puits.
- Placer le couvercle sur la plaque et incuber dans les mêmes conditions (généralement 37 ° C, 5 à 10% de CO 2).
- moyen Rafraîchissant dans des inserts
- À l'aide d'une micropipette, retirer une partie ou la totalité du milieu de culture cellulaire, dans les inserts contenant du type de cellule n ° 1. Jeter le moyen utilisé.
- Dessinez un volume approprié de milieu de culture de cellules fraîches. reposer doucement la pointe sur la paroi interne de l'insert et passer lentement le milieu de culture cellulaire.
- Placez le couvercle sur la plaque et incuber comme à l'étape 1.1.4.
- moyen Rafraîchissant dans des plaques de culture tissulaire multipuits
- En utilisant un Micropipette, retirer une partie ou la totalité du milieu de culture cellulaire dans les puits contenant des cellules de type N ° 2. Jeter le moyen utilisé.
- Dessinez un volume approprié de milieu de culture de cellules fraîches. Reste la pointe sur la paroi intérieure du puits et distribuer lentement le milieu de culture cellulaire.
- Placer le couvercle sur la plaque et incuber selon les protocoles de culture de cellules préalablement établies.
- Transférer des inserts contenant le type de la cellule n ° 1 sur des plaques de culture tissulaire multipuits contenant du type de cellule # 2.
REMARQUE: Effectuez cette étape lorsque les deux types de cellules ont atteint le stade de croissance approprié.- Avant de transférer les inserts dans les puits, apporter des modifications moyennes nécessaires, comme décrit précédemment dans les étapes 1.3) et 1.4).
NOTE: A ce stade, il est important de distribuer les volumes appropriés de médias dans les deux compartiments tel que spécifié par les instructions du fabricant d'insertion. - En utilisant des pinces, saisir le bord supérieur d'un insert contenant des cellules Type # 1 et placez-le doucement dans le puits approprié contenant un type de cellule 2 #.
- Après le transfert de tous les inserts, vérifier la présence de bulles d'air sous la membrane des inserts.
NOTE: Les bulles d'air empêchent tout échange à travers la membrane de l'insert et peuvent mettre en péril l'ensemble de l'expérience. - Si des bulles d'air sont présentes, soulever très doucement l'insert des puits à l'aide de pinces et de replonger dans le milieu de culture cellulaire. Les bulles vont disparaître. Si elles sont encore présentes, essayez doucement plongeant inserts retour dans le milieu de culture cellulaire à un angle.
NOTE: Ne pas frapper ou remuer des inserts pour éviter dissociant des cellules adhérentes. - Après avoir retiré toutes les bulles d'air et de vérifier que les volumes des médias dans les deux compartiments, placez le couvercle sur la plaque et incuber.
- Avant de transférer les inserts dans les puits, apporter des modifications moyennes nécessaires, comme décrit précédemment dans les étapes 1.3) et 1.4).
- médias rafraîchissantes dans un système de co-culture
NOTE: Bien que la membrane permet facilement les échanges de médias entre l'insert et le bien, rafraîchissant le moyen se fait enles deux compartiments puisque le temps nécessaire pour atteindre l'équilibre dans les compartiments supérieur et inférieur par diffusion seul peut être assez long.- moyen Rafraîchissant dans des inserts contenant type de cellule # 1 se fait de la même manière que dans l'étape 1.3).
- Pour rafraîchir dans les puits contenant type de cellule # 2 moyen, faites glisser doucement l'insert sur le côté pour créer un espace suffisamment large pour accueillir une pointe de pipette. Actualiser le moyen comme à l'étape 1.4).
- Vérifier la présence de bulles d'air et vérifier les volumes que par étapes 1.5.3) par 1.5.5).
Exemple 2: mesurer les effets des cytokines sécrétées par les cellules microgliales activées par le LPS N9 sur les cellules PC12 neuronales
REMARQUE: Les étapes suivantes sont conçues pour flacon spécifique, bien et tailles plat. Toutefois, le protocole peut être personnalisé pour toutes les dimensions de plasticware. Pour les médias et la composition voir tableau Matériaux.
- Ensemencement et la différenciation des cellules PC12 en multides plaques de culture tissulaire
- Milieu de culture cellulaire PC12 routine chaud, PC12 milieu de différenciation et de la trypsine-EDTA dans un bain d'eau à 37 ° C.
- Utiliser les cellules PC12 à 60-80% de confluence d'un 2 flacon de 75 cm.
- 15 mm avec une pipette Pasteur, effectuer l'aspiration de la totalité du milieu de culture cellulaire dans le flacon.
- Rincer délicatement la monocouche cellulaire avec 5 ml de tampon phosphate salin stérile et éliminer le liquide avec une pipette Pasteur. Veillez à ne pas dissocier les cellules à cette étape.
- Recouvrir la monocouche de cellules avec 3 ml de trypsine-EDTA et laisser incuber pendant 2-3 minutes à 37 ° C.
- Veiller à ce que toutes les cellules sont décollées sous un microscope. Si très peu de cellules sont flottantes, incuber pendant une période plus longue pour un maximum de 5 min.
- Ajouter 10 ml de milieu de culture de cellules PC12 de routine afin d'inactiver la trypsine-EDTA.
- Avec une pipette de 10 ml, triturer doucement tout en veillant à ce que la plupart des cellules sont dissociées du fond of flacon. Évitez de créer des bulles d'air dans la suspension cellulaire.
- Avec la même pipette de 10 ml, transférer la suspension cellulaire dans un tube de centrifugation de 50 ml.
- Centrifuger pendant 1 min à 3.200 xg
- Jeter le surnageant avec une pipette Pasteur tout en prenant soin de ne pas perturber le culot.
- Ajouter 10 ml de milieu de culture de cellules PC12 routine avec une pipette de 10 ml.
NOTE: Ce volume peut être ajusté si le culot est anormalement petite ou grande. - Triturer avec la même pipette de 10 ml pour homogénéiser la pastille. Les cellules PC12 agglutiner souvent ensemble pour au moins 20 pipetage et downare nécessaire.
NOTE: Bien que trituration vigoureuse est nécessaire, éviter de créer des bulles d'air dans la suspension cellulaire. - Dans un tube de 1,5 ml, préparer une dilution appropriée de la suspension cellulaire en bleu trypan. Compter les cellules en utilisant un hémocytomètre selon des protocoles établis précédemment 74.
- Dans un tube de 50 ml séparée, séparer la suspension cellulaireavec un milieu de différenciation PC12 pour obtenir une suspension cellulaire diluée appropriée pour l' ensemencement des puits d'une plaque à 24 puits (30 000 ¢ / cm2, 0,6 ml par puits selon le protocole du fabricant).
NOTE: La plaque de 24 puits doit être préalablement revêtu avec du collagène tel que spécifié par des protocoles déjà établis 75. - Distribuer 0,6 ml de la suspension cellulaire par puits à l'aide d'une micropipette.
- Lorsque tous les puits sont ensemencées, la roche la plaque comme à l'étape 1.1.7).
- Pour permettre une bonne différenciation des cellules PC12, incuber les plaques à 24 puits pendant 7-9 jours à 37 ° C en atmosphère humide 5% de CO2 dans un milieu de différenciation CP12 15,16 avant d' effectuer des expériences de co-culture.
- Effectuer des changements de milieu tous les deux jours en enlevant la moitié du liquide et en le remplaçant par un volume égal de milieu de différenciation PC12 frais.
- Ensemencement microglie N9 dans les inserts et le traitement avec le LPS
- Un jour avant d'effectuer les expériences de co-culture, pré-traiter PTFE 0,4 inserts um-pores avec un milieu de culture cellulaire de routine N9 pour optimiser l'adhérence des cellules, en suivant les étapes 1.1.1) par le biais de 1.1.4)
- N9 milieu chaud routine de culture cellulaire et de la trypsine-EDTA dans un bain d'eau à 37 ° C.
- Pendant ce temps, peser environ 10 mg de LPS dans un tube de 1,5 ml pour une utilisation ultérieure.
NOTE: Depuis LPS est une endotoxine pro-inflammatoire puissant et exige des précautions particulières de sécurité, des lunettes, des gants et un respirateur de particules sont fortement recommandés. - Utiliser des cellules N9 à 80-90% de confluence d'un 2 flacon de 75 cm.
- Suivez les étapes 2.1.3) à 2.1.14). Toujours utiliser la routine du milieu de culture cellulaire N9 à la place du milieu de culture des cellules PC12 de routine. A noter également que la microglie N9 n'agglutinent pas ensemble autant que les cellules PC12 font, donc moins pipetage de haut en bas peut être nécessaire à l'étape 2.1.13).
- Dans un tube de 50 ml séparée, séparer la suspension cellulaire avec un milieu de culture cellulaire à N9 obtenir une suspension cellulaire diluée appropriée pour l' ensemencement des inserts destinés à contenir dans des plaques à 24 puits (60.000 ¢ / cm 2, 0,05 ml par insert selon le protocole du fabricant, pour la membrane de surface voir les informations du fabricant).
NOTE: Ces inserts sont déjà revêtus de collagène par le fabricant et sont optimisés pour l'adhésion cellulaire. - Distribuer 0,05 ml de la suspension cellulaire par insertion à l'aide d'une micropipette.
- Lorsque tous les inserts sont ensemencées, basculez la plaque comme à l'étape 1.1.7).
- Effectuer des dilutions en série de LPS en utilisant un milieu de traitement N9 pour obtenir 4 pg / ml, 2 pg / ml et / ml de solutions de travail 1 ug.
- Pipette 0,05 ml de la / ml solution de travail 4 pg dans l'un de l'ensemble des inserts afin de produire une dilution finale de 2 pg / ml.
- Répétez l'étape 2.2.10) pour les deux autres solutions de travail dans différents inserts ensembles, ce qui donne des dilutions finales de 1 pg / ml et 0,5 pg / ml, respectivement.
- Danscubate les plaques contenant les inserts de 24 heures à 37 ° C dans une atmosphère de CO2 à 5% d' humidité pour permettre l' activation des microglies N9 avec du LPS avant d' effectuer les expériences de co-culture.
- Co-culture de cellules PC12 neuronales avec microglie N9
- 7-9 jours de différenciation des cellules PC12, activer les microglies N9 après 24 heures d'incubation avec du LPS par un milieu de traitement chaud et N9 milieu de traitement PC12 dans un bain d'eau à 37 ° C.
- Effectuer un changement de milieu total des microglies N9 comme dans l'étape 1.3), le remplacement de la totalité du support utilisé par 0,1 ml de milieu de traitement N9. Pour ce faire, pour chaque insert.This est nécessaire pour éliminer toute trace de LPS, laissant microglie N9 seulement activés dans les inserts.
- Effectuer un changement de milieu total des cellules PC12 neuronales comme dans l'étape 1.4). Transférer les inserts dans les plaques à 24 puits comme dans l' étape 1.5) .Incubate la N9-PC12 co-cultures pendant 24 heures ou 48 heures à 37 ° C dans une atmosphère de CO2 à 5% humide.
- après 24h ou 48 h, récolte le surnageant et / ou les cellules pour la cytotoxicité, dosage immuno-enzymatique (ELISA), Western blot, ou d'autres essais.
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Representative Results
L'utilisation de systèmes de co-culture insert est particulièrement pertinente dans l'étude des processus neuro-inflammatoires qui mettent en valeur les relations paracrines entre les différents acteurs cellulaires du système nerveux central. Immunité dans le SNC est réalisée principalement par les cellules résidentes appelées microglies qui surveillent leur environnement dans leur état de repos ramifiées (Figure 2A) et sont capables de perturbations de détection qui pourrait troubler l'homéostasie très précieux nécessaire pour la fonction neuronale 76-78. Activation de la microglie, caractérisé par l'adoption d'une forme amiboïde (figure 2B) et la multiplication de la population cellulaire appelée microgliose (Figure 3), suivie par la libération de médiateurs pro-inflammatoires tels que les cytokines, constitue l'aspect principal de la neuroinflammation 79 . La libération de cytokines sert le noble but de protéger les neurones contre les assauts nocifs et est closely surveillé. Toutefois, lorsque neuroinflammation échappe ce contrôle serré, il adopte une nature destructrice et peut blesser gravement le système nerveux central. Etant donné que les tissus nerveux ont un potentiel de renouvellement très limité, le système nerveux central est d'autant plus sensibles à de telles réponses inflammatoires auto-destructeur. L'étude de la diaphonie, qui existe entre les neurones et les microglies est impératif pour élucider les mécanismes sous-jacents de la neuroinflammation. Contrairement à des cultures mixtes, les systèmes insert de co-culture permettent à l'enquêteur d'identifier quelle cellule population génère les effets toxiques et que l'on est affecté.
Ici, les cellules PC12 différenciées pour 7-9 jours avec le facteur de croissance des nerfs ont été co-cultivées avec des LPS-activés microglie N9 dans le but de quantifyingthe effets nocifs des facteurs solubles inflammation dérivés sur les neurones. Pour ce faire, les cellules neuronales PC12 ont été cultivées dans des plaques à 24 puits pendant la microglie N9 ont été ensemencées dans des inserts. N9 microgliun ont été traités pendant 24 heures avec LPS, une endotoxine pro-inflammatoire très puissant compris dans les membranes externes des bactéries gram-négatives. LPS est connu pour activer le récepteur de type Toll 4 provoquant ainsi une réponse inflammatoire solide dans une grande variété de cellules effectrices immunitaires, y compris la lignée cellulaire immortalisée de souris N9 microglie 80,81. Les résultats représentatifs suivants montrent que les microglies N9 activées par le LPS ont tendance à augmenter la population (figure 3) et à sécréter des cytokines pro-inflammatoires solubles, tels que l' interleukine-6 (IL-6), l' interféron gamma (IFN-γ) , et facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-α), qui traverse facilement la membrane des inserts de co-culture et causer des dommages cytotoxiques pour les cellules PC12 croissance neuronale dans le compartiment inférieur.
La principale préoccupation avant de transférer les microglies N9 activés par le LPS dans les puits contenant les cellules PC12 de neurones consiste à confirmer that le PC12 sont bien différenciées. Les cellules PC12 différenciées de sept jours doivent présenter des phénotypes neuronaux évidentes, comme un corps cellulaire plat, qui projette plusieurs longs neurites parfois se montrant varicosités (Figure 4). Une fois ce point de contrôle est effectué, inserts microgliales N9 contenant du milieu frais dépourvu de LPS peuvent être transférés dans les puits contenant PC12 différenciées. Après une période d'incubation de 24 h ou 48 h, le surnageant dans le compartiment inférieur est récolté et un dosage de cytotoxicité, sur la base de lactate déshydrogénase libération 15,16, ainsi qu'un test ELISA 15 pour mesurer les cytokines sont effectuées. Il est important de récolter le surnageant dans le compartiment inférieur afin de mesurer les cytokines qui ont effectivement traversé la membrane perméable et qui peuvent activer les récepteurs à la surface des cellules PC12. Les résultats démontrent que les microglies N9 activés par le LPS provenant du compartiment supérieur génèrent une cyt dose et dépendante du tempsotoxic effet sur les cellules PC12 différenciées neuronales fixés dans le compartiment inférieur (figure 5). Le 0,5 pg / ml LPS condition est cependant pas significativement cytotoxique à 24 h ou 48 h. Les niveaux de cytotoxicité ont été trouvées pour atteindre près de 100% dans les 2 pg / ml de LPS 48 condition d'une heure. Par ailleurs, les résultats montrent que la concentration de cytokines pro-inflammatoires IL-6, IFN-y et TNF-a dans le surnageant augmente en même temps que la cytotoxicité observée. Plus précisément, les concentrations d' IL-6 sont significativement augmentés après 24 heures seulement pour le / ml état 2 ug, tandis que 1 pg / ml de LPS a également des rendements élevés de manière significative les niveaux de cytokine après 48 heures (figure 6). Microglies sécrètent de l' IFN-γ qui atteint le compartiment inférieur d'une manière sensiblement augmenté quand ils sont traités avec 1 pg / ml et 2 pg / ml et sont mises en incubation avec des cellules PC12 neuronales différenciées pour soit 24 h , soit 48 h (figure 7). 0,5 pg / mlétat LPS une fois de plus ne pas augmenter les taux d'IFN-y de manière significative. Enfin, les concentrations de TNF-a dans le compartiment inférieur ont été quantifiées par ELISA et se sont révélés être le plus augmentée par l' activation de la microglie LPS, atteignant des niveaux presque sept fois plus importante que la condition de contrôle (figure 8). En particulier, les deux périodes de 24 h et 48 h d'incubation ont provoqué des augmentations importantes dans les niveaux de TNF-α dans le surnageant. Cependant, le 1 pg / ml de LPS a abouti à l'état d'une augmentation significative des taux de TNF-α seulement après 48 heures. Dans l'ensemble, ces résultats montrent que les cytokines pro-inflammatoires sécrétées sont au moins en partie responsable des effets cytotoxiques observés dans les cellules PC12 neuronales différenciées après une période d'incubation de 24 h ou 48 h avec les microglies activées par différentes concentrations de LPS.
Insérez les systèmes de co-culture de cellules microgliales et PC12 N9 LPS-activés ont été montrés pourêtre particulièrement utile dans l'étude de la neuroinflammation et dans l'élaboration de stratégies visant à contrecarrer. Notre groupe a récemment montré que le LPS activé microglie N9 cultivé en culture cellulaire inserts présentent une transcription accrue de cytokines pro-inflammatoires, qui à son tour induisent l' apoptose des cellules PC12 de facteurs différenciés croissance des nerfs en croisant les micropores de l'insert 15, 16. Dans le même paradigme, le prétraitement de la population microgliales avec le resveratrol composé polyphénolique (0,1 uM, 3 h) empêche la transcription des cytokines pro-inflammatoires et de l'apoptose ainsi empêché de cellules PC12 neuronales différenciées en bloquant la caspase-3 activation et, par la suite , clivage de l'ADN. Un autre groupe a également démontré les effets neuroprotecteurs de la vitamine E dans un N9-PC12 co-culture 26. En plus de la N9-PC12 co-cultures, les différentes lignées de cellules immortalisées ou des cultures primaires ont également été utilisés dans le contexte de la neuro-inflammation. Par exemple, lelignée de cellules microgliales BV2 de murine a été co-cultivées avec des cellules SH-SY5Y de neuroblastome humain pour montrer l'effet anti-apoptotique de la lutéoline polyphénolique apparemment à médiation par le potentiel anti-inflammatoire 17. En outre, la microglie BV2 activés par les cellules PC12 blessées ont été montrées pour exercer des effets anti-apoptotiques dans les cellules souches mésenchymateuses 18. La signalisation réciproque a été démontré être important dans les mécanismes anti-apoptotiques sous - jacent neuroprotection microglie primaire conférée à des neurones granulaires du cervelet primaires 19. En outre, les neurones hippocampiques primaires ont été co-cultivées avec des cellules microgliales primaires activés par amyloïdes sécrété de protéine précurseur afin d'évaluer la libération de glutamate par échange de cystéine et l'affaiblissement ultérieur de la fonction synaptique 20. Enfin, un groupe a également montré la diaphonie qui existe entre les neurones hippocampiques primaires et les microglies primaires relatives à fractalkine de signalisation, une chimiokine expres constitutivementsed par les neurones du système nerveux central dont le récepteur se trouve sur la surface de la microglie 21.
Figure 1. Représentation schématique d'un système de co-culture insert. Le compartiment supérieur est composé de l'insert qui contient un type de cellule et son environnement humorale apicale. Le compartiment inférieur est constitué d'un puits ou un plat contenant le second type de cellule. L'insert repose sur les bords de la plaque de culture de tissus à cavités multiples ou plat. L'insert est conçu pour se situer juste au-dessus du fond du puits afin de ne pas toucher la population de cellules en croissance ci-dessous. Le milieu dans le compartiment inférieur est en contact à la fois avec la surface de base du premier type de cellule et la surface apicale du second type de cellule. S'il vous plaît cliquer ici pour voir un plus grand version de ce chiffre.
Figure 2. microphotographies de microglies N9. (A) non traitées au repos microglie N9 en inserts présentent une morphologie cellulaire ramifiées leur permettant de surveiller activement leur environnement. (B) microglie N9 en inserts traités avec le lipopolysaccharide (LPS) pour 24 affichage h une forme amiboïde typique du phénotype activé. Cette microphotographie a été prise juste avant de transférer l'insert contenant ces microglies N9 activés dans les puits contenant des cellules PC12 différenciées comme illustré dans la barre d'échelle Figure 4. = 25 pm. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. microphotographies de cellules PC12 neuronales différenciées. Sept jours NGF différenciées des cellules PC12 neuronales montrent phénotypes neuronaux évidents tels que longs neurites et varicosités. Cette microphotographie a été prise juste avant de transférer les inserts contenant les microglies N9 activés comme illustré dans la barre d'échelle Figure 2. = 25 pm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
La Figure 5. Effet cytotoxique de lipopolysaccharide (LPS) sur les microglies activés par les cellules PC12 neuronales différenciées.microglie N9 ont été activés avec différentes concentrations de LPS pendant 24 heures, puis transférées dans les puits contenant les cellules PC12 différenciées neurones pendant 24 h ou 48 h. La cytotoxicité a été évaluée en utilisant un dosage de libération de lactate déshydrogénase réalisée sur le surnageant du compartiment inférieur. Des différences significatives entre les groupes ont été déterminées par une analyse de variance, suivie par post-hoc de l'analyse de Tukey avec le programme GraphPad Instat, la version 3.06 pour Windows (San Diego, CA; www.graphpad.com). Toutes les données, analysées à l'intervalle de confiance de 95%, sont exprimés sous forme de moyenne ± erreur type de la moyenne de 3 expériences indépendantes dans lesquelles 6 puits ont été examinés. Les astérisques indiquent les différences statistiques entre le traitement et le contrôle condition (*** p <0,001). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 6. Concentration de i nterleukin-6 (IL-6) dans le surnageant après l' activation N9 par le lipopolysaccharide (LPS). Microglie N9 ont été activés avec différentes concentrations de LPS pendant 24 heures, puis transférées dans les puits contenant les cellules PC12 neuronales différenciées pour 24 h ou 48 h. Les concentrations d'IL-6 dans le surnageant du compartiment inférieur ont été évaluées en utilisant un test ELISA. Des différences significatives entre les groupes ont été déterminées par une analyse de variance, suivie par post-hoc de l'analyse de Tukey avec le programme GraphPad Instat, la version 3.06 pour Windows (San Diego, CA; www.graphpad.com). Toutes les données, analysées à l'intervalle de confiance de 95%, sont exprimés sous forme de moyenne ± erreur type de la moyenne de 3 expériences indépendantes dans lesquelles 6 puits ont été examinés. Les astérisques indiquent les différences statistiques entre le traitement et la conétat de commande (*** p <0,001, ** p <0,01 et * p <0,05). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 7. Concentration de l' interféron gamma (IFN-γ) dans le surnageant après l' activation N9 par le lipopolysaccharide (LPS). Microglie N9 ont été activés avec différentes concentrations de LPS pendant 24 heures, puis transférées dans les puits contenant les cellules PC12 neuronales différenciées pendant 24 h ou 48 heures. Les concentrations d'IFN-y dans le surnageant du compartiment inférieur ont été évaluées en utilisant un test ELISA. Des différences significatives entre les groupes ont été déterminées par une analyse de variance, suivie par post-hoc de l'analyse de Tukey avec le programme GraphPad Instat, la version 3.06pour Windows (San Diego, CA; www.graphpad.com). Toutes les données, analysées à l'intervalle de confiance de 95%, sont exprimés sous forme de moyenne ± erreur type de la moyenne de 3 expériences indépendantes dans lesquelles 6 puits ont été examinés. Les astérisques indiquent les différences statistiques entre la condition de traitement et de contrôle (** p <0,01 et * p <0,05). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 8. La concentration du facteur alpha de nécrose tumorale (TNF-α) dans le surnageant après l' activation N9 par le lipopolysaccharide (LPS). Microglie N9 ont été activés avec différentes concentrations de LPS pendant 24 heures, puis transférées dans les puits contenant les cellules PC12 neuronales différenciées pour 24 h ou 48 h. TNF-αLes concentrations dans le surnageant du compartiment inférieur ont été évaluées en utilisant un test ELISA. Des différences significatives entre les groupes ont été déterminées par une analyse de variance, suivie par post-hoc de l'analyse de Tukey avec le programme GraphPad Instat, la version 3.06 pour Windows (San Diego, CA; www.graphpad.com). Toutes les données, analysées à l'intervalle de confiance de 95%, sont exprimés sous forme de moyenne ± erreur type de la moyenne de 3 expériences indépendantes dans lesquelles 6 puits ont été examinés. Les astérisques indiquent les différences statistiques entre le traitement et le contrôle condition (*** p <0,001). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
L'étape la plus critique de toute expérience du système insert co-culture réside effectivement dans le choix de l'insert approprié à utiliser. La taille des pores et le matériau de la membrane doivent être prises en compte en profondeur, sans oublier de considérer le type de cellules qui seront ensemencées et le but de l'expérience. Par exemple, des dosages chimiotactiques peuvent utiliser le même type de membrane que les co-cultures cellulaires pour analyser les modulations du comportement cellulaire induite par des facteurs solubles sécrétés en l'absence de contact cellule-cellule. Cependant, les deux types d'expérimentations nécessitent différentes tailles de pores plus grandes: pour le premier, pour permettre la migration des cellules, et plus petits pour celui-ci, pour empêcher la migration des cellules et le contact cellule-cellule. Pour l'évaluation des modifications cellulaires médiées par des facteurs solubles sécrétés en l'absence de contact cellule-cellule, des dimensions de pores de 0,4 um ou 3 um sont généralement appropriés, car ils permettent aux grosses molécules telles que les protéines, à traverser mais empêchent la plupart des cellules de faire alors. Membranematériau dépend en grande partie du type de cellule et les techniques à utiliser à la fin du protocole de culture cellulaire. En bref, les membranes de PET offrent une bonne visibilité sur les cellules car ils sont clairs, mais ne sont pas recouvertes de collagène, ce qui peut être un problème pour les cellules adhérentes requis pour le support à traiter. Ils ont également la meilleure résistance chimique aux fixateurs qui, aux côtés de leurs bonnes propriétés optiques, les rend idéales pour des études histologiques. D'autre part, les membranes de PC offrent une visibilité médiocre des cellules car elles sont translucides et ne sont pas revêtues de collagène. Cependant, elles possèdent la plus grande densité de pores et de la disponibilité le plus diversifié de tailles de pores. Enfin, les membranes en PTFE sont clairs lorsqu'ils sont mouillés, mais seulement permettre la visualisation de la cellule présente dans le microscope. Comme un avantage majeur, ils sont revêtues de collagène, ce qui les rend aussi un peu plus épais. Il est important de noter que l'enrobage des inserts en PET ou PC avec la membrane de collagène peut obstruer les pores et empêcher le passage de facto solublers. Dans tous les cas, la plupart des fabricants d'insertion offrent des guides complets pour aider les chercheurs à choisir l'insert approprié. Dans notre paradigme spécifique, les choix de densité de placage, les médias, la concentration sérique, jours de différenciation, les jours d'activation LPS, les concentrations de LPS, et le revêtement de flacons pour les cellules PC12 ont été optimisés au cours des années de travail avec ces systèmes de co-culture 15 , 16. Remarquable, la densité de placage de la microglie N9 dans les inserts a été choisie à 60 000 ¢ / cm2 afin d'obtenir 40-50% de confluence au moment du commencement de la co-culture et, par conséquent, pour leur donner de l' espace à se multiplier sur leur activation par le LPS. D'autres conditions lorsque optimisés peuvent également donner des résultats satisfaisants, comme la substitution du collagène par la L-lysine dans les flacons destinés à l'entretien de PC12 natif.
Afin d'accroître la durabilité des résultats, plusieurs contrôles différents peuvent être effectuées. En essayant de prouver que des facteurs solublessont responsables des effets observés, les cultures mixtes manifestant contact cellule-cellule directe et des expériences de milieu conditionné devraient être menées en parallèle. De plus, en utilisant des anticorps pour neutraliser un facteur sécrété spécifique permettra d'identifier la molécule responsable de l'effet paracrine qui est perçu. Lorsque cela est possible, de bloquer un récepteur ou une partie de sa voie de signalisation pour identifier l'identité exacte du récepteur activé. Si une molécule est utilisée pour activer une population cellulaire avant l'expérience de co-culture avec un second type de cellule, comme dans l'exemple décrit précédemment, il est important de prendre en considération la présence de la molécule dans le système. Selon la première option, le support doit être entièrement changé avant l'expérience de co-culture, afin de s'assurer que la molécule est absente du système total. En tant que deuxième option, une condition doit être ajoutée lorsque la molécule seul est mis en incubation avec le second type de cellule, afin deévaluer son effet en l'absence du premier type de cellule. S'il n'y a pas d'effet de la molécule sur le deuxième type de cellule, il n'y aura pas besoin de changer le milieu avant l'expérience de co-culture. De même, si les deux types de cellules ne sont pas cultivées dans le même milieu de culture cellulaire, les mêmes précautions doivent être prises pour faire en sorte que les différences dans la composition du milieu ne touchent pas l'un ou l'autre population de cellules. Bien que les deux médias seront séparés par la membrane d'insertion dans un premier temps, la diffusion est lié à veiller à ce qu'ils se mélangent sur des périodes d'incubation plus longues. En outre, plusieurs problèmes peuvent résulter de la perturbation aberrante des relations facteur-récepteur soluble. Parmi plusieurs causes d'erreur, l'utilisation excessive de la dissociation enzymatique et la présence de concentrations importantes de sérum peuvent interférer avec les récepteurs de surface cellulaire. D'autres causes d'erreur dans les systèmes de co-culture insert comprennent, mais sans s'y limiter 1) les techniques de culture de cellules irrégulières, telles que la suppression de la totalité de la cellulemilieu de culture dans un trop grand nombre de puits en même temps, provoquant des cellules à sec, 2) une monocouche qui est trop agglomérée dans l'insert, responsable de la fermeture de la membrane d'insert et empêchant les molécules apicale sécrétées pour atteindre le compartiment inférieur, et 3) déréglé confluence des cellules, ce qui provoque une expression sur- ou sous-facteurs solubles conduisant à des résultats physiologiquement pertinents ou absence de tout effet.
Bien qu'un seul scénario d'insert co-culture a été présenté ici, il y a de nombreuses façons de faire usage de cette technique très polyvalent. Ici, un type de cellule a été prétraitée avec une molécule responsable de l'induction de la sécrétion d'un facteur soluble qui, lors du transfert de l'insert de puits, influe sur le comportement du second type de cellule. Il est également possible d'incuber les deux types de cellules en même temps dans un système de co-culture avant de les séparer pour détecter la vulnérabilité accrue ou une résistance à des populations cellulaires ou les deux à un traitement ultérieur. However, lorsque l'on considère sa forme la plus rudimentaire, cette technique peut faire usage de deux populations de cellules incubées ensemble sans aucun traitement, dans le but d'évaluer la signalisation réciproque paracrine basale.
La limitation la plus importante de cette technique est que les entités moléculaires très courte durée de vie tels que les espèces réactives de l' oxygène ne survivent pas à la distance qui sépare la population de cellules en croissance dans le compartiment supérieur et celui dans le compartiment inférieur 82. Les derniers développements dans les techniques de co-culture a tenté de répondre à ce problème en utilisant un substrat de culture capable de maintenir microfabriqué deux populations cellulaires à proximité micrométrique 83. En plus de roulement tous les avantages des systèmes insert co-culture, telles que la détection spécifique de la population des changements et de la signalisation bidirectionnelle, cet écran microfabriqué a également été démontrée pour rendre possible la détection des interactions à courte portée qui n'étaient pas avant detectable en raison de la décomposition des facteurs solubles sur des distances. Cette plate-forme de culture cellulaire est la dernière innovation en matière de co-culture de cellules et promet d'aider à démêler les mécanismes entre les cellules qui ont été négligés avant de signaler.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI-1640 medium | Sigma | R8755 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham | Sigma | D6421 | Warm in 37 °C water bath before use, must be supplemented with 0.365 gm/L L-glutamine |
| Horse serum | ATCC | 30-2040 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Fetal bovine serum | MultiCell | 80350 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Nerve Growth Factor-7S from murine submaxillary gland | Sigma | N0513 | Reconstitute the lyophilized powder in a solution of buffered saline or tissue culture medium containing 0.1–1.0% bovine serum albumin or 1-10% serum |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma | T3924 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli 055:B5 | Sigma | L2880 | Toxic |
| Cell culture inserts for use with 24-well plates | BD Falcon | 353095 | 0.4 μm pores |
| 24-well plates | TrueLine | TR5002 | Coat with collagen before use |
| Routine PC12 cell culture medium | Routine N9 cell culture medium | ||
| - 85% RPMI medium | - 90% DMEM-F12 medium | ||
| - 10% heat-inactivated horse serum | - 10% heat-inactivated horse serum | ||
| - 5% heat-inactivated fetal bovine serum | |||
| PC12 differentiation medium | N9 treatment medium | ||
| - 99% RPMI medium | - 99% DMEM-F12 medium | ||
| - 1% heat-inactivated fetal bovine serum | - 1% heat-inactivated fetal bovine serum | ||
| - 50 ng/mL nerve growth factor | |||
| PC12 treatment medium | |||
| - 99% RPMI medium | |||
| - 1% heat-inactivated fetal bovine serum |
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