Introduction
시험관 내에서 조직, 기관 또는 시스템의 연구는 다세포 유기체를 포함하는 여러 세포 아형 사이에 존재하는 매우 복잡한 관계를 단순화하기위한 시도이다. 실제로, 시험 관내 연구는 가능한 하나의 세포 집단에 대한 자세한 이해를 취득 할 수 있습니다. 1) 쉽게 휴대 환경을 조작 할 수 2) 능력 세포 상호 작용을 감소하고, : 시험 관내 실험에서 수행의 두 가지 장점이 있습니다. 따라서, 이러한 두 가지 장점이 허용 한 연구진은 전체 유기체 외부 영향의 결과를 조절하는 능력에 이르는, 생체 내에서 특정한 유형의 세포의 행동을 예측한다. 그런 의미에서, 체외 세포 배양은 종종 기초 및 응용 생명 과학을 연결하는 다리로 작동합니다. 그럼에도 불구하고, 시험 관내에서 작동하는 여러 단점도 있는데, 가장 중요한 특정 예약 생리적으로 거하여되는 것을관찰 된 표현형의 알 관련성. 실제로, 하나의 세포 유형은 용기에서 배양하면, 배양은 다양한 범위까지 상실, 다른 세포 유형, 조직과 기원의 유기체 및 앵커 내에서 체액 환경에 기여와의 세포 간 연결 이를 활성화 조직 세포 기능에 중요한 때로 특정 입체 구조를 유지한다.
세포 간 관계의 문제가 혼합 된 배양 기술의 개발에 의해 해결되었다. 이 방법에서, 두 개 이상 세포 집단은 동일한 배양 용기에서 함께 성장시킨다. 그러나 이러한 혼합 문화는 중요한 불편을 부담. 한편, 일부 세포 아형 물리적 기원 조직으로 서로 상호 작용하지 않는 분비 가용성 인자 수용체 근처로 유지 분비 통신에만 의존. 이것은 근위 사이토 카인 신호에 따라 여러 가지 염증 과정의 경우입니다. 혼합 C에서ultures 물리적 상호 작용을 피할 수 있고 불가능 변경된 결과를 얻을 수있는 세포 - 세포 접촉의 부재 분비 통신 연구를 만든다. 한편, 혼합 집단 내에서 세포의 특정 해석을 달성하기 위해서는 상당히 결과에 미치는 영향을 거친 분리 기술의 사용없이 실행할 수 없게된다.
이러한 중요한 문제를 해결하기 위해, 조정 배지를 사용 실형 문화 분비 신호 전달 연구를 허용하는 기술이 개발되고있다. 이 방법은 세포의 다른 집단을 함유 한 웰 세포 유형, 따라서 에어컨 명명 된 배지 상등액의 전송을 요구한다. 그러나 중요한 단점은 단명 한 분자가 셀의 두번째 집단의 웰에 전송되는 조정 된 배지에서 충분히 생존하지 않는다는 것이다. 심지어 수명이 긴 분자는 크게 인해 확산에 시간이 지남에 희석됩니다. 또한, 두 세포인구는 단방향 통신 분비보다는 활성 쌍방향 통신에 참여한다. 이것은 그들이 체내에 존재하는 정확한 다세포 관계를 재현에서 중요한 피드백 신호의 부재로 이끈다.
결과적으로 더 나은 관내 셀룰러 환경에서의 생체 내 조건에서 일본어를 시뮬레이션 할 필요성에 의해 구동 세포 배양 기술의 여러 발전은 수년 동안 실현되어왔다. 가장 중요한 발전 중 하나는 1953 년 Grobstein 의해 처음 사용 된 세포 배양을 구획화를위한 미세 다공성 막과 투과성 지지체의 사용이었다 1. 이러한 투과성 지지체는 다수의 세포 유형을 수용하고 사용하기 년간 맞추어왔다 여러 가지 응용 프로그램입니다. 현재, 이러한 지원은 멀티 웰 조직 배양 접시에서 또는 새로운 Circu에 우물에서 휴식을 설계 속이 빈 삽입 존재LAR 요리. 공동 배양 시스템에서, 삽입이 잘 반면, 하나의 셀 유형을 포함하거나 요리는 체액 환경 (그림 1)에 세포의 서로 다른 두 집단의 기여를 연구 할 수 있도록, 다른 세포 인구를 포함한다. 그 결과, (혀끝의 분비 또는 신호 수신 대 기저) 세포 극성 따라서 혼합 문화와 에어컨 매체 기술을 통해 삽입 공동 문화 시스템에게 중요한 이점을 부여, 보존됩니다. 멤브레인 재료의 몇 가지 유형이 사용할 수있는 가장 일반적인 것 인 폴리 에스테르 (PET), 폴리 카보네이트 (PC) 또는 콜라겐 코팅 폴리 테트라 플루오로 에틸렌 (PTFE)가 0.4 μm의 12.0 ㎛의 범위의 상이한 기공 크기에 존재. 재료 및 기공 크기의이 품종에 한정되지 사용하는 다음에 대해 서로 다른 수준에서 그들을 실용적 광학 특성, 막 두께 및 세포 부착과 관련된 변수 기능을 발휘 삽입의 스펙트럼을 제공합니다 :
-studying세포 분화, 배아 발달, 종양 전이 및 투과 막을 통해 chemotaxic 분석에 의해 상처 수리;
상피 또는 내피 단일 층을 통해 전송을 평가하여 약물의 침투를 -evaluating은 투과성 지원에 배양하고;
-performing 세포 공동 배양은 세포 - 세포 접촉이없는 수용성 분비 인자에 의해 유도 된 세포 변조 동작을 분석한다.
이 문서의 목적은 삽입 공 배양 시스템을 이용한 세포 - 세포 접촉이없는 분비 가용성 인자에 의해 매개되는 세포 변화를 평가하는 상술 한 제 기능을 수행하기 위해 일반적인 방법론 지침을 설명하는 것이다. 연구의 여러 다른 필드는 세포 집단에서 분비 된 가용성 인자의 영향에 관련된 질문에 대답하기 위해 삽입 공 배양 시스템을 사용한다. 다양한 수준에서 세포 행동을 조절 실제로 분비 신호는 모든 조직에서 관련입니다및 삽입 공 배양 시스템을 만드는 시스템은이 분야의 발전을 위해 불가결. 반대로, 그 신호 전달을 확인할 수있는 인서트의 사용은 직접 세포 - 세포 접촉이 아닌 분비 요인이다. 인서트의 가장 중요한 용도 중 하나는 분비 된 사이토 카인의 효과는 다양한 면역 세포에서 평가되는 플레이어 염증 연구 2-14이다. 특히, 중추 신경계 (CNS) 염증의 연구는 더 크게 신경 염증 15-21 구동 뉴런 및 미세 아교 세포의 분비 독특한 역할을 정의 할 수있는 삽입 공 배양 과정에서 이익이있다. 이러한 시스템은 또한 감소 시키거나 염증성 인자 22-26의 분비를 억제하는 능력에 의존하여 분자의 항 염증 가능성을 연구하기 위해 고안되었다. 연구 메커니즘, 특히 암 27-31 관련된 혈관 32-34과 inflammati의 기초종양의 35-42에, 또한 삽입 공동 문화 시스템에서 도움이됩니다. 또한, 수용성 요소는 분화와 여러 연구가 특정 필드 43-50에서 질문에 답 삽입을 사용한 구동 과정에서 가장 중요하다. 중추 신경계에서 신경 조직으로 보는 것은 매우 제한된 갱신 전위 neurotrophism 연구를 가지며, 신경은 근본적인 널리 공존 배양 시스템 51-56 줄기 세포의 사용에 의해 확보되어왔다. 또한, 삽입은 신장 57, 58, 내피 상호 작용과 혈관 신생 59-62, 세포 사멸 비만과 대사 증후군 22,23,66-67에 63 ~ 65, 염증 신호, 내이 머리 세포 보호 등 다양한 분야에 활용된다 68,69, 심지어 곰팡이 독성 (70, 71) 및 기생충학 72, 73입니다.
이 문서에서는 experim을 설정하기 위해 일반적인 방법 론적 지침을 제공합니다삽입 공 배양 시스템을 사용하여 분비 된 가용성 인자에 의해 매개되는 세포 변화를 평가보기 이비인후과. 특히, 우리는 신경 세포의 공동 문화와 신경 염증성 과정을 공부하고 자신의 용도에 우리의 관심을 초점을 맞출 것이다. 파일럿을 가능하게 삽입 실험의 매우 넓은 스펙트럼을 감안할 때,이 세포 배양 기술의 모든 측면을 다루 견딜 수있다. 예를 들어, 특정 프로토콜은 삽입 공 배양 방법의 구체적인 이해를 제공하는 상세하게 설명 리포 폴리 사카 라이드 (LPS)에 의해 분비되는 사이토 카인의 효과 PC12 신경 세포에 대한 N9의 미세 아교 세포를 부활 측정.
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Protocol
NB는 : 포유류 세포 배양에 필요한 다음 각 단계를 층류 후드에서 멸균 조건 하에서 수행되어야한다. 또한, 최적의 무균 세포 배양에 대한 일반적인 가이드 라인, 적용 예., 팁 언제든지 그들이 교차 오염을 초래할 시각 세포의 양을 줄일 수있다 폐기 적절 전체 미디어 변경을 수행하지만 부드럽게 교반 할 때, 공기에 노출 될 세포 현탁액은 또한, 삽입 특수 처리가 필요 plasticware의 친절 등 자신의 균일 한 피펫을 보장합니다. 인서트를 조작 할 때마다 먼저, 쉽게 눈물 때문에 실험을 위태롭게 할 수있는 깨지기 쉬운 멤브레인을 만지지 마십시오. 멤브레인을 관통하거나 부착 세포를 해리 위험이 있으므로 또한, 상기 세포 배양 배지의 진공 흡인을 수행하기에 적합하지 않다. 다음으로, 삽입 따라서,주의 때 모 이용해야는 멀티 웰 조직 배양 판에 느슨하게 걸고plasticware을 ving 또는 부착 세포를 해리 피하기 위해 피펫 팅 할 때. 큰 기공 크기를 갖는 인서트를 사용할 때, 세포 배양 배지 따라서, 빈번하게 액체의 레벨을 모니터하는 것이 중요하다 멤브레인을 통해 스며 가능성이있다. 마지막으로, 다음과 같은 프로토콜이 부착 세포에 대한 설계 및 서스펜션 세포에 적합하기 위해 약간의 수정을 요구된다는 점에 유의.
삽입 공동 배양 실험을 실시 1. 일반 지침
- 삽입에 시드 셀 타입 # 1
- 자신의 포장에서 삽입을 풀다.
- 적절한 크기의 빈 멀티 웰 조직 배양 플레이트에 삽입을 배치합니다. 핀셋을 사용하여 삽입물의 맨 가장자리, 그래서 그립을 수행합니다.
- 부착을 개선하고 부착 세포의 확산, 파종 전에 세포 배양 배지로 삽입 상태로. 이를 위해, 세포 배양 mediu과 멤브레인의 전체 표면을 덮마이크로 피펫을 사용하고 있습니다.
참고 : 필요한만큼의 삽입에 대해이 작업을 수행합니다. - 접시에 뚜껑을 교체하고 동일한 조건에서 적어도 1 시간 또는 O / N 부화 (일반적으로 37 ° C, 5 ~ 10 %의 CO 2).
- 삽입물이 조절 될 때, 마이크로 피펫을 사용하여 세포 배양 배지를 모두 제거한다. 사용 된 매체를 폐기하십시오.
- 멀티 웰 플레이트와 같은 방법으로 새로운 세포 배양 배지에서 종자 세포 유형 # 1. 이를 위해 마이크로 피펫으로 세포 현탁액의 적절한 양을 그리고 인서트 내의 액체를 분배.
참고 : 필요한만큼 삽입을 준비합니다. - 모든 인서트를 파종 한 후, 부드럽게 고르게 세포를 분산시키기 위해 앞뒤로 좌우 판 바위. 이것은 셀 인서트의 중심에 증가 할 수있는 바와 같이, 원형 운동을 피한다.
- 접시에 뚜껑을 놓고 셀룰러 요구 사항 (일반적으로 37 ° C 당, 5 ~ 10 %의 CO에 의해 지정된 품다
- 멀티 웰 조직 배양 플레이트에 파종 세포 유형 # 2
- 제 1 항에있어서, 새로운 세포 배양 배지에서 종자 세포 유형 # 2.
- 인서트의 개수에 필요한만큼의 웰을 준비한다. 세포가 균일하게 우물에 분산되어 있는지 확인하는 단계 1.1.7에서와 같이 플레이트를) 바위.
- 접시에 뚜껑을 놓고 동일한 조건에서 배양 (일반적으로 37 ° C, 5 ~ 10 %의 CO 2).
- 삽입에서 새로 고침 매체
- 마이크로 피펫을 사용하여, 세포 유형 # 1을 포함하는 인서트의 일부 또는 세포 배양 배지를 모두 제거한다. 사용 된 매체를 폐기하십시오.
- 새로운 세포 배양 배지의 적당한 양을 그린다. 부드럽게 삽입 체의 내벽에 팁 나머지 서서히 세포 배양 배지를 분배.
- 접시에 뚜껑을 놓고 단계 1.1.4에 따라 품어.
- 멀티 웰 조직 배양 플레이트에서 새로 고침 매체
- micropi를 사용하여pette는 일부 또는 세포 유형 # 2를 포함하는 웰의 세포 배양 배지를 모두 제거한다. 사용 된 매체를 폐기하십시오.
- 새로운 세포 배양 배지의 적당한 양을 그린다. 웰의 내벽에 팁을 나머지 서서히 세포 배양 배지를 분배.
- 접시에 뚜껑을 배치 이전에 확립 된 세포 배양 프로토콜에 따라 배양한다.
- 세포 유형 # 2을 포함하는 멀티 웰 조직 배양 플레이트에 세포 유형 # 1을 포함한 전송 인서트.
참고 : 두 종류의 세포가 적절한 성장 단계에 도달 한 경우이 단계를 수행합니다.- 이전 단계 1.3) 1.4에 설명 된대로 우물에 삽입을 전송하기 전에), 필요한 매체를 변경합니다.
참고 :이 시점에서,이 삽입 제조업체의 지침에 의해 지정된 두 구획 미디어의 적절한 볼륨을 분배하는 것이 중요하다. - 그립 셀 t를 포함하는 삽입 체의 최상부 에지를 핀셋을 사용하여# 1 타 입 조심스럽게이 해당 잘 포함하는 세포 유형 번호에 넣습니다.
- 모든 인서트를 전송 한 후, 인서트 막 아래에 기포의 존재를 확인한다.
주 : 기포가 인서트의 막을 가로 지르는 모든 교환을 방지하고, 전체 실험을 위태롭게 할 수있다. - 기포가 존재하는 경우, 아주 부드럽게 웰로부터 핀셋 삽입물을 들어 올리고 다시 세포 배양 배지 급락. 거품이 사라집니다. 그들은 여전히 존재한다면, 비스듬히 위로 세포 배양 배지에 침지 부드럽게 삽입 시도.
참고 : 노크 또는 부착 세포를 해리 방지하기 위해 삽입을 저어하지 마십시오. - 모든 기포를 제거하고 양쪽 구획 미디어의 볼륨, 접시에 뚜껑을 배치하고 부화 것을 확인한 후.
- 이전 단계 1.3) 1.4에 설명 된대로 우물에 삽입을 전송하기 전에), 필요한 매체를 변경합니다.
- 공동 배양 시스템에서 새로 고침 미디어
참고 : 막 쉽게 삽입 사이에 미디어 교류를 할 수 있지만 잘, 매체를 새로 고침하는 것은 이루어집니다형 확산에 의해 상부 및 하부 구획실에 평형에 도달하는데 필요한 시간을 보낸 두 구획은 매우 길어질 수있다.- 세포 유형 # 1을 포함하는 인서트 상쾌 중간 단계 1.3)와 동일하게 수행된다.
- 세포 유형 # 2를 포함하는 우물에서 매체를 새로 고치려면 부드럽게 피펫 팁을 수용하기에 충분히 넓은 공간을 만들기 위해 측면에 삽입물을 밀어 넣습니다. ) 단계 1.4에서와 같이 매체를 새로 고칩니다.
- ) 기포의 존재를 확인하고 1.5.5 단계의 1.5.3에 따라 볼륨)를 확인합니다.
예 2 : PC12 신경 세포에 LPS 활성화 N9의 미세 아교 세포에 의해 분비 된 시토 킨의 효과를 측정
참고 : 다음 단계가 아니라 특정 플라스크와 접시 크기를 위해 설계되었습니다. 그러나, 프로토콜은 plasticware 치수에 맞게 사용자 정의 할 수 있습니다. 미디어 및 구성에 대한 자료 표를 참조하십시오.
- 시드 및 복수의 PC12 세포 분화잘 조직 배양 플레이트
- 따뜻한 루틴 PC12 세포 배양액, 37 ° C의 수욕 PC12 분화 배지와 트립신 EDTA.
- 75 ㎠로 플라스크에서 60~80%의 합류에 PC12 세포를 사용합니다.
- 15mm의 파스퇴르 피펫, 플라스크의 전체 세포 배양 배지의 진공 흡입을 수행한다.
- 부드럽게 멸균 인산 완충 생리 식염수 5 ㎖의 세포 단층을 씻어 파스퇴르 피펫으로 액체를 제거합니다. 이 단계에서 세포를 떼어 놓다하지 않도록주의하십시오.
- 트립신 EDTA 3 ㎖와 세포 단층을 덮고 37 ℃에서 2 ~ 3 분 동안 품어.
- 모든 세포는 현미경으로 분리되어 있는지 확인합니다. 소수의 세포가 떠있는 경우 5 분의 최대 장기간 배양한다.
- 트립신 - EDTA를 비활성화하기 위해 루틴 PC12 세포 배양액 10 ㎖를 추가한다.
- 대부분의 세포는 O를 바닥에서 해리되어 있는지 확인하는 동안 10 ml를 피펫으로 부드럽게 씹다플라스크 바. 세포 현탁액에 공기 방울을 생성하지 마십시오.
- 동일한 10 ㎖ 피펫, 50 mL의 원심 분리 튜브에 세포 현탁액을 전송.
- 3,200 XG에서 1 분 동안 원심 분리기
- 펠렛을 방해하지 않도록주의하면서 파스퇴르 피펫으로 상층 액을 버린다.
- 10 ml의 피펫 루틴 PC12 세포 배양액 10 ㎖를 추가한다.
참고 : 펠렛이 비정상적으로 작거나 큰 경우이 볼륨을 조정할 수 있습니다. - 펠렛을 균질화 같은 10 ㎖ 피펫 씹다. PC12 세포는 자주 피펫 팅 적어도 20 있도록 함께 덩어리 필요 downare.
주 : 격렬한 분쇄하여 필요하지만, 세포 현탁액에 기포를 생성하지 않도록. - 1.5 ㎖의 튜브에 트리 판 블루 세포 현탁액의 적절한 희석액을 준비한다. 이전에 설정된 프로토콜 (74)에 따라 혈구를 사용하여 세포를 계산합니다.
- 별도의 50 ㎖ 튜브에 세포 현탁액을 분할PC12 분화 배지로 24 웰 플레이트에서 (30,000 ¢ / cm 2, 잘 제조사의 프로토콜에 따라 당 0.6 ml)에 우물을 시드의 희석 세포 현탁액의 적절한을 얻었다.
주 : 미리 설정된 프로토콜 (75)에 의해 규정 된 24 웰 플레이트는 이전 콜라겐으로 코팅되어야한다. - 웰 마이크로 피펫 당 세포 현탁액 0.6 mL를 배포.
- 모든 우물이 시드되면) 단계 1.1.7에서와 같이 판 바위.
- PC12 세포의 적절한 분화 공동 배양 실험을 수행하기 전에 PC12 분화 배지 (15, 16)의 5 % CO 2 습한 대기 중에서 37 ℃에서 7-9일 대한 24 웰 플레이트를 부화 허용한다.
- 액의 절반을 제거하고 신선한 PC12 분화 배지 동일 부피로 교체하여 매일 매체 변화를 수행한다.
- 인서트에 N9 미세 아교 세포를 파종 및 LPS로 처리
- 하루 공동 배양 실험을 수행하기 전에, 1.1.4 내지 1.1.1 단계)에 따라 세포 접착 성을 최적화 루틴 N9 세포 배양 배지와 PTFE 0.4 μm의 세공 삽입 전 처리)
- 37 ° C의 물 중탕에서 따뜻한 루틴 N9 세포 배양 배지와 트립신 EDTA.
- 한편, 나중에 사용하기 위해 1.5 ㎖의 튜브에 LPS의 약 10 mg의 무게.
참고 : LPS는 강력한 염증성 독소이며, 특히 안전주의 사항, 안경, 장갑을 필요로하고, 미립자 인공 호흡기를 적극 권장하고 있기 때문에. - 75 ㎠로 플라스크에서 80-90%의 합류에 N9 세포를 사용합니다.
- ) 2.1.14 스텝 2.1.3)을 따릅니다. 항상 루틴 N9 세포 배양액 대신 루틴 PC12 세포 배양 배지를 사용한다. 또한) N9의 미세 아교 세포가 많은 PC12 세포처럼 함께 그렇게 적은 피펫을 응집하지 않고 아래 단계 2.1.13에서해야 할 수도 있습니다.
- 별도의 50 mL의 튜브, N9 세포 배양 배지에서 세포 현탁액 O로 분할24 웰 플레이트에 개최하도록 설계 삽입 (60,000 ¢ / cm 2, 제조사의 프로토콜에 따라 삽입 당 0.05 ㎖를, 막 표면 영역에 대한 제조업체의 정보를 참조) 시드에 적합한 희석 세포 현탁액 btain.
참고 :이 삽입은 이미 제조 업체 콜라겐으로 코팅하고, 세포 부착에 최적화되어 있습니다. - 마이크로 피펫을 사용하여 인서트 당 세포 현탁액 0.05 mL를 배포.
- 모든 삽입이 시드되면) 단계 1.1.7에서와 같이 판 바위.
- 4 μg의 2 μg의 / ㎖ / ㎖, 1 μg의가 / ㎖ 작업 용액을 얻었다 N9 처리 매체를 이용하여 LPS의 연속 희석을 수행한다.
- 피펫 0.05 μg의 2 / ㎖의 최종 희석액을 수득하기 위해 하나의 인서트의 세트 내의 4 μg의 / ㎖ 작업 용액의 용액.
- 다른 세트 인서트의 다른 두 작업 솔루션을위한 단계를 반복 2.2.10), / ㎖ 및 0.5 μg의 / 각각 ml로 1 μg의 최종 희석을 얻었다.
- 에서공동 배양 실험을 수행하기 전에 LPS와 N9의 미세 아교 세포의 활성화를 허용하기 위해 5 % CO 2 습한 분위기에서 37 ° C에서 24 시간 동안 삽입물을 함유하는 판을 cubate.
- 공동 배양 된 미세 아교 세포로 N9 PC12 신경 세포
- PC12 세포를 분화 7-9일에서 37 ° C의 물을 욕조에 따뜻한 N9 처리 매체와 PC12 처리 매체에 의해 LPS와 배양 24 시간 후 N9의 미세 아교 세포를 활성화합니다.
- N9 처리 매체의 0.1 ml로 전체 사용되는 매체를 교체, 단계 1.3)에서와 같이 N9의 미세 아교 세포에 대한 총 매체 변경을 수행합니다. 모든 insert.This에 대해이 작업을 수행하면 삽입 만 활성화 N9의 미세 아교 세포를 떠나, LPS의 모든 흔적을 제거 할 필요가있다.
- ) 단계 1.4에서와 같이 신경 PC12 세포에 대한 총 매체 변경을 수행합니다. 5 % CO 2 습한 분위기에서 37 ℃에서 24 시간 또는 48 시간에 대한 N9-PC12 공동 배양)을 150 단계에서와 같이 24 웰 플레이트에 삽입물을 전송 .Incubate.
- 24 후시간이나 48 시간이 뜨는 및 / 또는 세포 독성, 효소 면역 분석법을위한 세포 (ELISA), 웨스턴 블롯, 또는 기타 분석 수확.
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Representative Results
삽입 공 배양 시스템의 사용은 CNS의 다른 세포 분비 플레이어 사이의 관계를 보여주는 신경 염증성 과정의 연구에 특히 적절하다. 중추 신경계에서 면역은 휴식 분지의 상태 (그림 2A)에서 자신의 환경을 모니터링하고 감지 방해 할 수있는 미세 아교 세포라는 거주자 세포에 의해 주로 수행되는 수 문제가 적절한 신경 기능 76-78에 필요한 매우 귀중한 항상성. 아메바 모양 (그림 2B)와 세포 인구의 곱셈의 채용 특징 소교 활성화, 같은 사이토 카인과 같은 염증성 매개 물질의 방출 다음 microgliosis (그림 3)라고 신경 염증 (79)의 주요 부분을 구성한다 . 사이토 카인의 방출은 유해한 공격에 대해 신경 세포를 보호하는 고귀한 목적을 제공하고 클입니다엘리 모니터링. 신경 염증이 엄격한 제어를 탈출 때, 그것은 파괴적인 성격을 채택하고 심각하게 CNS 부상을 입을 수 있습니다. 신경 조직은 매우 제한된 연장 가능성을 가지고 진대의 CNS는 자동 파괴 염증성 반응에 더욱 민감하다. 크로스 토크를 공부, 즉 신경 세포와 미세 아교 세포 신경 염증의 기본 메커니즘을 해명에 필수적이다 사이에 존재합니다. 혼합 문화와는 달리, 삽입 공동 문화 시스템은 독성 효과를 생성하고, 어느 것이 영향을 받고있는 세포 인구 식별하기 위해 조사를 할 수 있습니다.
여기서, 신경 성장 인자 7~9일 차별화 된 PC12 세포에서 신경 염증 유래 가용성 인자 quantifyingthe 유해 효과를 목표로 LPS 활성화 N9의 미세 아교 세포와 공동 배양 하였다. N9 미세 아교 세포가 삽입에 시드 동안 이렇게하려면 신경 PC12 세포를 24 웰 플레이트에서 배양 하였다. N9의 microgli(A)는 LPS, 그람 음성 세균의 외막에 포함 된 매우 강력한 염증성 독소로 24 시간 동안 처리 하였다. LPS는 따라서 불멸화 세포주 쥐의 미세 아교 N9 80, 81를 포함하여 면역 이펙터 세포의 다양한 강력한 염증 반응을 유도 수신자 같은 4 수용체를 활성화하는 것으로 알려져있다. 다음 대표적인 결과는 LPS로 활성화 N9의 미세 아교 세포가 집단 (도 3) 증가 및 인터루킨 -6 (IL-6), 인터페론 감마 (IFN-γ)과 같은 수용성 염증성 사이토 카인을 분비하는 경향이 있음을 보여 쉽게 공동 배양 인서트의 막 횡단 및 하부 구획실에 성장 PC12 신경 세포에 대한 독성 손상을 일으킬 종양 괴사 인자 알파 (TNF-α).
PC12 신경 세포를 함유하는 웰에 LPS 활성화 N9의 미세 아교 세포를 전송하기 전에 제일 우려 그쪽을 확인한 것으로 이루어진다PC12에서 t 것은 제대로 구분됩니다. 세븐 하루 차별화 된 PC12 세포는 때때로 자신이 정맥류를 (그림 4) 표시 여러 긴 신경 돌기를 돌출 된 평평한 세포체로 명백한 신경 세포의 표현형을 전시한다. 이 검사를 수행 한 후, LPS의 신선한 배지가 결여 함유 N9 소교 인서트 분화 PC12을 함유하는 웰에 전달 될 수있다. 사이토 카인을 측정하기 위해, 락트산 탈수소 방출 15,16뿐만 아니라 ELISA 15에 기초하여 24 시간 또는 48 시간, 수확 하부 구획 및 세포 독성 분석에서의 상등액의 잠복기 후에 수행된다. 참으로 투과 막 교차하고 그 PC12 세포의 표면에 수용체를 활성화 할 수있는 사이토 카인을 측정하기 위해 아래 칸에 뜨는을 수확하는 것이 중요하다. 결과는 상부 구획으로부터 LPS 활성화 N9의 미세 아교 세포가 투여 량 및 시간 의존적 CYT를 생성 함을 입증낮은 구획 (그림 5)에서 설정 한 차별화 된 신경 PC12 세포에 otoxic 효과. 0.5 μg의 / ㎖ LPS 상태 현저하지만 아닌 24 시간 또는 48 시간 째에 세포 독성. 세포 독성 수준을 2 μg의 / ㎖ LPS 48 시간 조건에서 거의 100 %에 도달하는 것으로 하였다. 또한, 결과 표시하는 염증성 사이토 카인 IL-6, 독성 관찰과 동시에 상층 증가 IFN-γ 및 TNF-α의 농도. 특히, IL-6 농도는 유의도 크게 48 시간 (그림 6) 후 사이토 카인의 수준을 올려 수익률 LPS의 1 ㎍ / ㎖의 반면, 만 2 μg의 / ㎖의 상태에 따라 24 시간 후에 증가한다. 미세 아교 세포는 그들이 용액 1 μg의 / 2 μg의 / ㎖로 처리하고, 24 시간 또는 48 시간 (도 7) 중 하나에 대한 분화 된 신경 세포의 PC12 세포와 함께 배양 될 때 상당히 증가하게 하부 구획실 도달 IFN-γ를 분비한다. 0.5 μg의 / ㎖LPS 상태가 다시 한번 유의 IFN-γ 수준을 증가시키지 않는다. 마지막으로, 아래 칸에서 TNF-α 농도는 ELISA에 의해 정량화하고, 거의 제어 조건 (그림 8)보다 더 중요 일곱 배, 가장 미세 아교 세포의 LPS의 활성화에 의해 증강 될 도달 수준을 발견했다. 특히, 모두 24 시간과 48 시간의 배양 기간은 상층 액에서 TNF-α 수준의 중요한 증가를 일으켰습니다. 그러나, 1 μg의 / ㎖ LPS 상태는 48 시간 후 TNF-α 수준의 상당한 증가를 수득 하였다. 전반적으로, 이러한 결과는 분비되는 염증성 사이토 카인 적어도 LPS 상이한 농도로 활성화 된 미세 아교 세포와 함께 24 시간 또는 48 시간 배양 기간을 거쳐 분화 된 신경 세포의 PC12 세포에서 관찰되는 세포 독성 효과를 부분적으로 책임이 있음을 보여준다.
보여왔다 LPS 활성화 된 미세 아교 N9 및 PC12 세포의 공존 배양 시스템을 삽입신경 염증의 연구와 그것을 방해하는 전략을 정교화에 특히 유용합니다. 우리 그룹은 최근에 세포 배양에서 성장 LPS 활성화 N9의 미세 아교 차례로 인서트 (15, 16)의 미세 공을 횡단하여 신경 성장 인자 분화 된 PC12 세포의 사멸을 유도하는 염증성 사이토 카인의 전시 증가 전사를 삽입하는 것으로 나타났다. 동일한 패러다임에서, 상기 폴리 페놀 화합물 레스베라트롤 (0.1 μM, 3 시간)와 소교 인구의 전처리 후, 카스파 제 -3 활성을 차단에 의해 프로 - 염증성 사이토 카인의 전사 및 분화 된 신경 세포의 PC12 세포 따라서 저지 아폽토시스를 방지 , DNA 절단. 다른 그룹은 또한 N9-PC12 공동 배양 26 비타민 E의 신경 보호 효과를 보여 주었다. N9-PC12 공동 배양 외에 다른 불멸화 세포주 또는 일차 배양은 신경 염증의 맥락에서 사용되어왔다. 예를 들어,쥐의 미세 아교 BV2 세포 라인은 명백하게 그 항염증제 전위 (17)에 의해 매개 된 폴리 페놀 루테 올린의 항 - 아폽토시스 효과를 표시하는 인간 신경 아세포종 SH-SY5Y 세포와 공동 배양 하였다. 뿐만 아니라, 부상 PC12 세포에 의해 활성화 된 미세 아교 BV2는 중간 엽 줄기 세포 (18) 항 - 세포 사멸 효과를 발휘하는 것으로 나타났다. 상호 신호는 기본 차 미세 아교 세포의 신경이 주 소뇌 과립 뉴런 (19)에 부여 된 항 세포 사멸 기전에 중요한 것으로 입증되었다. 또한, 차 해마 뉴런이었다 공동 배양 시스테인 교환 및 시냅스 기능 (20)의 이후의 약화에 의해 글루타메이트의 방출을 평가하기 위해 분비 아밀로이드 전구체 단백질에 의해 활성화 된 미세 아교 세포로 기본. 마지막으로, 한 그룹은 또한 신호 fractalkine하는 기본 해마 신경 세포와 관련된 기본 미세 아교 세포 사이에 존재하는 크로스 토크, 케모카인 구조적으로 EXPRES을 보여 주었다미세 아교 세포 수용체 (21)의 표면에서 발견되는 CNS에서 신경 세포로 나오지.
삽입 공동 문화 시스템의 그림 1 도식 표현. 상단 구획은 하나의 세포 유형과 혀끝의 체액 환경을 보유하고있는 인서트로 구성되어있다. 하부 격실은 제 2 셀 타입을 포함하는 웰 또는 접시로 구성된다. 삽입은 멀티 웰 조직 배양 접시 또는 접시의 가장자리에 달려있다. 삽입은 아래 성장하는 세포 집단을 접촉하지 않도록 그냥 잘 바닥 위에 놓여하도록 설계되었습니다. 상기 하부 구획에서 상기 매체는 제 1 셀 타입 및 제 2 셀 타입의 선 단면의 기저 표면 모두와 접촉한다. 큰 VERS을 보려면 여기를 클릭하세요이 그림의 이온.
도 N9의 미세 아교 2. 현미경 사진. 삽입물 (A) 미처리 쉬고 N9의 미세 아교 그들이 적극적으로 환경을 모니터링 할 수 있도록 분지 세포 형태를 나타낸다. (B) 24 시간 표시 활성화 된 표현형의 전형 아메바 모양에 대한 리포 폴리 사카 라이드 (LPS)로 처리 삽입에 N9의 미세 아교 세포. 이 현미경은 단지 그림 4. 스케일 줄에 도시 된 바와 같이 차별화 된 PC12 세포를 포함하는 우물이 활성화 N9의 미세 아교 세포를 포함하는 인서트를 전송하기 전에 찍은 = 25 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 분화 된 PC12 신경 세포의 현미경 사진 4.. 칠일 신경 성장 인자 분화 된 PC12 신경 세포는 신경 돌기 길이 및 정맥류 명백 뉴런 표현형을 나타낸다. 이 현미경은 단지 그림 2. 규모 표시 줄에 그림과 같이 활성화 N9의 미세 아교 세포를 포함하는 인서트를 전송하기 전에 찍은 = 25 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
리포 폴리 사카 라이드의 그림 5. 세포 독성 효과 (LPS)는 차별화 된 신경 PC12 세포에 미세 아교 세포를 부활.N9의 미세 아교 세포를 24 시간 동안 다른 농도의 LPS로 활성화 한 후, 24 시간 또는 48 시간 동안 분화 된 PC12 신경 세포를 함유하는 웰에 옮겼다. 세포 독성은 하부 구획의 상등액에서 수행 젖산 탈수소 방출 분석을 이용하여 평가 하였다. 군 사이에 유의 한 차이는 Windows 용 인스 탯 그래프 패드 프로그램 Tukey에의 사후 분석, 버전 3.06 (; www.graphpad.com 샌디에고, CA) 다음 변량 분석에 의해 확인 하였다. 6 웰 고려 된 3 독립적 실험의 평균 ± 표준 오차를 의미로 95 % 신뢰 구간에서 분석 된 모든 데이터는, 표현된다. 별표가 처리 및 제어 조건 (*** p <0.001) 사이의 통계적 차이를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
I 그림 6. 농축 -6- nterleukin (IL은-6) 리포 폴리 사카 라이드 (LPS)에 의해 N9 활성화 다음 상청액. N9 미세 아교 세포는 24 시간 동안 LPS 다른 농도로 활성화 한 후, 차별화 신경 PC12 세포를 함유하는 웰에 옮겨 24 시간 또는 48 시간. 상기 하부 구획의 상청액에서 IL-6의 농도는 ELISA를 이용하여 평가 하였다. 군 사이에 유의 한 차이는 Windows 용 인스 탯 그래프 패드 프로그램 Tukey에의 사후 분석, 버전 3.06 (; www.graphpad.com 샌디에고, CA) 다음 변량 분석에 의해 확인 하였다. 6 웰 고려 된 3 독립적 실험의 평균 ± 표준 오차를 의미로 95 % 신뢰 구간에서 분석 된 모든 데이터는, 표현된다. 별표 치료 및 콘 간의 통계적 차이를 나타낸다트롤 조건 (*** p <0.001, ** p <0.01 * P는 <0.05). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
리포 폴리 사카 라이드 (LPS)에 의해 N9 활성화 다음 상등액 인터페론 감마 (IFN-γ)의도 7 농축. N9 미세 아교 세포는 24 시간 동안 LPS 다른 농도로 활성화 한 후 24 시간 동안 분화 된 신경 세포의 PC12 세포를 함유하는 웰에 옮겼다 또는 48 시간. 상기 하부 구획의 상등액 중 IFN-γ의 농도는 ELISA를 이용하여 평가 하였다. 군 사이에 유의 한 차이는 그래프 패드 인스 탯 프로그램 Tukey에의 사후 분석, 버전 3.06,이어서 변량 분석에 의해 확인했다윈도우 (; www.graphpad.com 샌디에고, CA)에 대한. 6 웰 고려 된 3 독립적 실험의 평균 ± 표준 오차를 의미로 95 % 신뢰 구간에서 분석 된 모든 데이터는, 표현된다. 별표 처리 및 제어 상태 사이에 통계적 차이를 나타냅니다 (** p <0.01 * P는 <0.05). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
리포 폴리 사카 라이드 (LPS)에 의해 N9 활성화 다음 상등액에서 종양 괴사 인자 알파 (TNF-α)의도 8 농축. N9 미세 아교 세포는 24 시간 동안 LPS 다른 농도로 활성화하고 차별화 신경 PC12 세포를 함유하는 웰에 옮겼다 24 시간 또는 48 시간. TNF-α낮은 구획의 상층 액의 농도는 ELISA를 사용하여 평가 하였다. 군 사이에 유의 한 차이는 Windows 용 인스 탯 그래프 패드 프로그램 Tukey에의 사후 분석, 버전 3.06 (; www.graphpad.com 샌디에고, CA) 다음 변량 분석에 의해 확인 하였다. 6 웰 고려 된 3 독립적 실험의 평균 ± 표준 오차를 의미로 95 % 신뢰 구간에서 분석 된 모든 데이터는, 표현된다. 별표가 처리 및 제어 조건 (*** p <0.001) 사이의 통계적 차이를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
모든 삽입 공동 문화 시스템 실험의 가장 중요한 단계는 실제로 사용하기에 적합한 인서트를 선택하는 거. 공극 크기 및 막 재료 시드 될 세포 형태 및 실험 목적을 고려 잊지 않고 철저한 고려되어야한다. 예를 들어, chemotaxic 분석은 세포 - 세포 접촉이없는 수용성 분비 인자에 의해 유도 된 세포 행동 변조를 분석하는 세포 공동 배양보다 공막의 동일한 유형을 사용할 수있다. 세포의 이동 및 세포 - 세포 접촉을 배제하기 위해, 세포 이동을 허용하기 이전에 대한 더 큰 것, 그리고 후자 작은 것 : 그러나, 실험의 두 종류의 서로 다른 기공 크기를 필요로한다. 세포 - 세포 접촉이없는 분비 가용성 인자에 의해 매개되는 세포 변화의 평가를 들어, 0.4 ㎛의 3 ㎛, 크기는 통과하지만 고에서 가장 세포를 방지하기 위해 그들이 단백질과 같은 큰 분자를 허용로서 보통 적절한 기공 그래서. 막재료는 주로 세포의 종류에 따라 상기 기술은 세포 배양 프로토콜의 마지막에 사용된다. 그들은 명확하지만 콜라겐 지지체가 처리 될 필요 부착 세포 문제가 될 수있는 코팅되지 않으므로 간단히 PET 막은 양호한 셀 가시성을 제공한다. 그들은 또한 좋은 광학적 특성과 함께, 조직 학적 연구에 이상적, 고정 제에 최고의 내 화학성을 가지고있다. 그들은 반투명 콜라겐 코팅되지 않기 한편, PC 막은 불량한 세포 가시성을 제공한다. 그러나 이러한 세공의 밀도 및 높은 기공 크기의 가장 다양한 유용성을 갖는다. 전용 셀의 시각화가 현미경으로 설명 할 수 젖어도하지만 마지막으로, PTFE 멤브레인은 분명하다. 주요한 이점으로, 그들은 또한 그들이 약간 두껍게 만드는 코팅 콜라겐된다. 콜라겐과 PET 또는 PC 멤브레인 삽입물을 코팅하는 기공을 막을 수 있고 사실상 수용성의 흐름을 방해 할 수 있음을 유의해야RS. 어떤 경우에, 대부분의 삽입 제조 적절한 삽입을 선택하는 연구를 지원하는 광범위한 가이드를 제공한다. 우리의 특정 패러다임에서 PC12 세포 도금 밀도, 미디어, 혈청 농도, 분화 일, LPS 활성화의 일, LPS의 농도와 플라스크의 코팅의 선택은 이러한 공동 문화 시스템 (15)와 함께 작업 년에 걸쳐 최적화 된 16. 주목할 상기 삽입물 N9의 미세 아교 세포의 도금 밀도 때문에, 공 배양을 개시하는 순간에 40-50% 합류를 구하여하기 위해 60,000 ¢은 / cm 2로 선택하고, 그들 자신의 활성화시에 곱하는 공간을 수득 LPS에 의해. 또한 네이티브 PC12 유지 보수를위한 플라스크에 L- 라이신에 의해 콜라겐을 대체하는 등 만족스러운 결과를 얻을 수있다 최적화 된 기타 조건.
결과의 지속성을 증가시키기 위해, 여러 가지 제어를 수행 할 수있다. 그 수용성 요인을 증명하려고 할 때직접 세포 - 세포 연락처 및 에어컨 매체 실험을 낸 혼합 문화 병렬로 관찰 된 효과에 대한 책임을 실시해야한다. 또한, 항체를 활용하여 특정 분비 인자 인식되는 분비 효과에 대한 책임이있는 분자를 식별하는데 도움을 중화한다. 가능하면, 수용체 또는 수용체의 정확한 신원이 활성화되고 정확하게 그것의 신호 전달 경로의 일부를 차단. 분자는 예컨대 전술 한 실시 예에서와 같이 제 2 셀 타입과 공동 배양 실험을하기에 앞서 하나의 세포 집단을 활성화하기 위해 사용되는 경우, 고려 시스템의 분자가 존재하는 것이 중요하다. 첫 번째 옵션으로, 매체 전체가 분자 전체 시스템에서 존재하지 않는 것을 보장하기 위해 공동 배양 실험 전에 변경되어야한다. 단독 분자하기 위해 제 2 셀 타입과 함께 배양된다 번째 옵션으로, 조건이 추가되어야제 세포 유형의 부재에서의 효과를 평가한다. 두번째 세포 유형의 분자의 영향이없는 경우, 공동 배양 실험을하기 전에 매체를 변경할 필요가 없을 것이다. 두 세포 유형은 동일한 세포 배양 배지에서 성장하지 않는 경우 마찬가지로, 유사한 조치가 배지 조성의 차이는 하나 이상의 다른 세포 집단에 영향을주지 않도록하기 위해주의해야한다. 두 매체가 처음에 삽입 막에 의해 분리되지만, 확산 그들이 더 이상 배양 기간 동안 혼합 할 수 있도록 바인딩됩니다. 또, 몇 가지 문제가 가용성 인자 수용체 관계 비정상적인 중단으로부터 발생할 수있다. 에러 여러 요인 중에서도 효소 분해의 과도한 사용과 혈청 중요한 농도의 존재는 세포 표면 수용체를 방해 할 수있다. 삽입 공 배양 시스템에서 에러의 다른 원인을 포함하지만) (1)과 같은 셀의 전체를 제거하는 등의 부적절한 세포 배양 기술을 한정되지건조 세포를 일으키는 동시에 너무 많은 웰에서 배양 배지, 2) 삽입 멤브레인을 밀봉하고 치근단 - 분비되는 분자를 방지 할 책임도 삽입 컨 플루 언트 된 단층은 상기 하부 구획에 도달하고, 3) 잘못 조절 생리 학적으로 관련이없는 결과 나 영향의 유무에 최고의 가용성 요소의 과다 또는 과소 발현의 원인 세포 합류.
삽입 공동 문화의 하나의 시나리오가 여기에 제시된 동안,이 매우 다양한 기술을 활용하는 여러 가지 방법이 있습니다. 여기서, 하나의 세포 유형에서, 웰에 삽입 전사시에, 제 2 셀 타입의 동작에 영향을 가용성 인자의 분비를 유도 할 책임 분자로 사전 처리 하였다. 숨은 처리 중 하나 또는 모두 세포 집단의 취약성 증가 또는 저항을 검출하도록 분리 전에 공동 배양 시스템에서 함께 양쪽 세포 유형을 배양하는 것도 가능하다. 호가장 기본적인 형태를 고려할 때 Wever에게는,이 기술은 기저 분비 왕복 시그널링을 평가하기위한 목적으로, 임의의 처리없이 함께 배양 된 세포의 두 집단을 사용할 수있다.
이 기술의 중요한 한계는 반응성 산소 종 매우 단명 한 분자 실체 상부 구획실 및 하부 구획실 (82) 하나에서 성장하는 세포 집단을 분리하는 거리가 생존하지 않는다는 것이다. 공동 배양 기술에서의 최근의 발전은 마이크로 근접 83 개의 세포 집단을 유지할 수 미세 배양 용 기재를 사용함으로써이 문제에 응답하려고 시도하고있다. 이러한 변경 및 양방향 시그널링 인구 특정 검출 등의 삽입 공 배양 시스템의 장점을 모두 보유 외에도이 미세 화면 수도 D 전에 없었다 단거리 상호 작용의 검출을 입증했다거리에서 용해 인자의 붕괴로 인해 etectable. 이 세포 배양 플랫폼은 세포의 공동 문화의 최신 혁신과 해명 이전에 간과 한 셀 사이의 메커니즘을 신호 도움을 약속드립니다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI-1640 medium | Sigma | R8755 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham | Sigma | D6421 | Warm in 37 °C water bath before use, must be supplemented with 0.365 gm/L L-glutamine |
| Horse serum | ATCC | 30-2040 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Fetal bovine serum | MultiCell | 80350 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Nerve Growth Factor-7S from murine submaxillary gland | Sigma | N0513 | Reconstitute the lyophilized powder in a solution of buffered saline or tissue culture medium containing 0.1–1.0% bovine serum albumin or 1-10% serum |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma | T3924 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli 055:B5 | Sigma | L2880 | Toxic |
| Cell culture inserts for use with 24-well plates | BD Falcon | 353095 | 0.4 μm pores |
| 24-well plates | TrueLine | TR5002 | Coat with collagen before use |
| Routine PC12 cell culture medium | Routine N9 cell culture medium | ||
| - 85% RPMI medium | - 90% DMEM-F12 medium | ||
| - 10% heat-inactivated horse serum | - 10% heat-inactivated horse serum | ||
| - 5% heat-inactivated fetal bovine serum | |||
| PC12 differentiation medium | N9 treatment medium | ||
| - 99% RPMI medium | - 99% DMEM-F12 medium | ||
| - 1% heat-inactivated fetal bovine serum | - 1% heat-inactivated fetal bovine serum | ||
| - 50 ng/mL nerve growth factor | |||
| PC12 treatment medium | |||
| - 99% RPMI medium | |||
| - 1% heat-inactivated fetal bovine serum |
References
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