Introduction
in vitroでの組織、器官またはシステムの研究では、多細胞生物を構成するいくつかの細胞のサブタイプの間に存在する非常に複雑な関係を簡略化しようとする試みです。実際、in vitro研究により、単一の細胞集団の詳細な理解を獲得することを可能にします。 1）細胞間相互作用を低減し、かつ容易に細胞環境を操作する2）能力：二つの主要なインビトロ実験で行う利点があります。したがって、これらの2つの利点が、科学者は、生物全体に外因性の影響の結果を調節する能力をもたらす、 インビボで特定の細胞型の挙動を予測することができています。その意味で、in vitroでの細胞培養は、多くの場合、基礎および応用生命科学を結ぶブリッジとして動作します。それにもかかわらず、in vitroでの作業のいくつかの欠点もありますが、最も重要なのは、特定の予約は、生理的に住むことがされていること観察された表現型のアルの関連性。実際には、単一の細胞型は、容器内で成長させた場合、培養物は、様々な程度に、失う、他の細胞型、組織および起源の生物、およびアンカー内から体液環境への貢献との細胞間接続細胞機能のために、時には重要な特定の三次元構造を維持することを可能にし、組織。
細胞間の関係の問題は、混合培養技術の開発によって対処されてきました。この方法では、2つ以上の細胞集団は、同一の培養容器中で一緒に増殖させます。しかし、これらの混合培養物は、重要な不具合を負うものとします。一方で、いくつかの細胞サブタイプは、物理的起源の組織で互いに相互作用しないと分泌可溶性因子と近くの受容体によって持続的なパラクリン通信のみに依存しています。これは、近位のサイトカインシグナル伝達に依存するいくつかの炎症過程の場合です。混合Cでultures、物理的な相互作用は不可避であり、それが不可能変更された結果を得ることができ、細胞 - 細胞接触の不在下でパラクリン通信を研究することを可能にします。一方、混合集団内の細胞特異的な解釈を達成することはかなりの結果に影響を与える可能性があり、過酷な分離技術を使用せずに実現不可能となります。
これらの重要な問題を解決するために、馴化培地の使用は、区画の文化とパラクリンシグナル伝達の研究を可能にする技術として開発されてきました。この方法は、細胞の他の集団を含むウェルに、従って培地馴化名前、一つの細胞型の上清の転送を必要とします。しかし、重要な欠点は短命分子が細胞の第二集団のウェルに転送する馴化培地中で十分に長く生存しないということです。でも寿命の長い分子が大きく拡散による時間をかけて希釈されます。さらに、両方のセル集団は一方向のみパラクリン通信ではなく、アクティブな双方向通信に参加しています。これは、 生体内に存在したように正確な多の関係を再作成に不可欠であるフィードバックシグナル伝達の欠如につながります。
結果として、より良いインビトロ細胞環境におけるインビボ条件で原稿をシミュレートする必要性によって駆動される、細胞培養技術におけるいくつかの進歩が長年にわたって達成されました。最も重要な進歩の一つは、1953年にGrobsteinによって初めて使用される細胞培養物を区画化するための微多孔膜と通気性支持体の使用であった1。このような透過性の支持体は、多数の細胞型に対応するために、使用することが長年にわたって調整されています複数の異なるアプリケーションインチ今日では、これらの支持体は、マルチウェル組織培養プレートまたはcircuのウェルに載るように設計されているように、中空のインサートを存在しますLAR料理。ウェルまたはディッシュが自分の体液性の環境（ 図1）上の細胞の二つの異なる集団の寄与を研究することができ、他の細胞集団が含まれているのに対し、共培養系では、インサートは、1セルタイプが含まれています。その結果、（頂端分泌または信号受信対側底）の細胞極性は、このように、インサート共培養システムを混合培養し、馴化培地技術より重要な利点を付与する、保存されています。膜材料のいくつかの種類は、ポリエステル（PET）、ポリカーボネート（PC）またはコラーゲンコートポリテトラフルオロエチレン（PTFE）が最も一般的なもので入手可能であり、それらは0.4ミクロンから12.0ミクロンの範囲の異なる細孔サイズで存在します。材料および細孔サイズのこれらの種類は、これらに限定されない使用し、以下のためのさまざまなレベルで、それらを実用的に光学特性、膜の厚さと細胞接着に関連する変数の機能を発揮するインサートのスペクトルを提供します。
-studying透過膜を介して、走化性アッセイによる細胞分化、胚発生、腫瘍転移および創傷修復。
透過性の支持体上で培養上皮細胞または内皮単層を通ってそれらの輸送を評価することによって、薬剤の浸透を-evaluating、と。
-performing細胞の共培養は、細胞 - 細胞接触の非存在下で分泌された可溶性因子によって誘導される細胞挙動の変調を分析します。
この論文の目的は、インサート共培養系を用いて、細胞 - 細胞接触の非存在下で分泌された可溶性因子によって媒介される細胞の変化を評価することで、上述した第三の機能を果たすために、一般的な方法論のガイドラインを記述することです。研究のいくつかの異なるフィールドは、細胞の集団に分泌された可溶性因子の影響に関連した質問に答えるために、インサート共培養システムを利用します。実際、さまざまなレベルで細胞の挙動を調節パラクリンシグナル伝達は、全ての組織において適切ですインサート共培養システムを持つシステムでは、これらの分野の進歩を確保するために欠かせません。逆に、そのシグナル伝達を確認することができるインサートの使用は、直接細胞 - 細胞接触によってではなく、分泌された因子によるものです。インサートの最も重要な用途の一つは、炎症の研究分泌されるサイトカインの効果は、免疫の種々の細胞の選手で評価され2-14です。特に、中枢神経系（CNS）の炎症の研究は大きく、より良い神経炎症15-21を駆動におけるニューロンとミクログリアの明確なパラクリン役割を定義することができましたインサート共培養研究から利益を得ています。これらのシステムはまた、炎症誘発因子22〜26の分泌を低減または阻害する能力に依存している分子の抗炎症の可能性を研究するために考案されました。血管新生32-34のメカニズムとinflammati特に癌27-31に関連する研究、腫瘍形成における35-42に、また挿入共培養システムから利益を得ます。また、可溶性因子は、分化を駆動プロセスで最も重要であり、いくつかの研究は、その特定のフィールド43-50で質問に答えるためにインサートを使用しています。 CNSにおいて、神経組織は、非常に限られた再生能力を有しているように見て、neurotrophism及び神経保護の研究は基本的であり、広く共培養システム51-56における幹細胞の使用によって保証されています。また、インサートはまた、腎臓57,58、内皮相互作用及び血管新生59-62、63-65シグナル伝達、アポトーシス、肥満やメタボリックシンドローム22,23,66-67の炎症、内耳有毛細胞の保護といったさまざまな分野で利用されています68,69、さらには菌の病原性70,71と寄生虫72,73インチ
この記事では、experimを設定するために一般的な方法論的なガイドラインを提供していますインサート共培養系を用いて、分泌された可溶性因子によって媒介される細胞の変化を評価した図でENT。特に、我々は神経細胞の共培養し、神経炎症過程を研究する上でのそれらの使用上の注意を焦点を当てます。パイロットに可能に挿入された実験の非常に広大なスペクトルを考えると、この細胞培養技術のあらゆる側面をカバーするために耐え難いです。一例として、特定のプロトコルは、インサート共培養方法の具体的な理解を提供し、詳細に説明するリポ多糖（LPS）によって分泌されるサイトカインの効果は神経PC12細胞上N9ミクログリアを付活測定します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NB：哺乳動物細胞培養のために必要に応じて、以下のステップの各々は、層流フード内で無菌条件下で実施すべきです。また、最適な滅菌細胞培養のための一般的なガイドラインは、適用例 、ヒントいつでも彼らは、交差汚染につながる時間細胞の量を減らすことができるの破棄正しく、メディア全体の変更を行うことなく、静かにすべての攪拌時に空気にさらされていますその均質なピペッティングなどを確保するために細胞懸濁液はまた、インサートは特別な処理を必要とするプラスチック製品の一種です。インサートが操作されたときにまず、簡単に涙ため、実験を危険にさらす可能性が脆弱な膜を、触れないように注意してください。膜を穿孔または接着細胞を解離の危険性があるとしても、細胞培養培地の真空吸引を行うためには適していません。次に、インサートは、マルチウェル組織培養プレートに緩くハングし、したがって、注意が時カ月使用しなければなりませんプラスチック製品をヴィングまたは接着細胞を解離避けるためにピペッティングするとき。大細孔サイズのインサートを使用する場合に加えて、細胞培養培地は、したがって、しばしば液体のレベルを監視することが重要であり、膜を通って浸透し、可能性があります。最後に、以下のプロトコルは、接着細胞用に設計されており、浮遊細胞に適したものにするために若干の変更を必要としていることに注意してください。
インサート共培養実験を行うための1.一般的なガイドライン
- 挿入中の播種細胞型の第1位
- その梱包からの挿入をアンラップ。
- 適切な大きさの空のマルチウェル組織培養プレートにインサートを配置します。これを行うには、グリップピンセットを用いて、インサートの最上端を。
- 付着細胞の付着及び拡散を向上させるために、播種前に細胞培養培地でインサートを条件付けます。そうするために、細胞培養mediu有する膜の表面全体を覆いますマイクロピペットを用いてメートル。
注：必要な数の挿入のためにこれを行います。 - プレートに蓋を交換し、同じ条件下で、少なくとも1時間またはO / Nインキュベート（通常37℃、5〜10％CO 2）。
- インサートが調整されるときに、マイクロピペットを用いて細胞培養培地の全てを除去します。使用した培地を捨てます。
- マルチウェルプレートと同様に、新鮮な細胞培養培地中の種子の細胞型＃1。そうするために、マイクロピペットを用いて細胞懸濁液の適切な量を描き、インサート中の液体を分注します。
注：必要な数の挿入を準備します。 - すべての挿入を播種した後、静かに細胞を均一に分配するために、次に前後に、左右のプレートを揺らし。これは、細胞がインサートの中心部に蓄積する原因となりますよう、円運動を行わないでください。
- 携帯要件（通常37℃、5〜10％CO通りで指定された板の上に蓋を置き、インキュベート
- マルチウェル組織培養プレート中に播種細胞型＃2
- 項1に記載の新鮮な細胞培養培地中の種の細胞型＃2。
- 挿入の数のために必要な数のウェルを準備します。細胞が均等にウェル中に分布していることを確実にするために）ステップ1.1.7のようにプレートを揺らし。
- プレートに蓋を置き、同じ条件下でインキュベートする（通常37℃、5〜10％CO 2）。
- インサートで爽やかミディアム
- マイクロピペットを用いて、細胞型の＃1を含むインサートで、一部または細胞培養培地のすべてを削除します。使用した培地を捨てます。
- 新鮮な細胞培養培地の適切な量を描画します。ゆっくりインサートの内壁に先端を休ませ、ゆっくりと細胞培養培地を分注します。
- プレートに蓋を置き、ステップ1.1.4に従ってインキュベートします。
- マルチウェル組織培養プレート中でさわやかなミディアム
- micropiを使用しましたpette、一部または細胞型の＃2を含むウェルにおける細胞培養培地のすべてを削除します。使用した培地を捨てます。
- 新鮮な細胞培養培地の適切な量を描画します。ウェルの内壁に先端を休ませ、ゆっくりと細胞培養培地を分注します。
- プレートに蓋を置き、以前に確立された細胞培養プロトコルに従ってインキュベートします。
- 細胞型＃2を含むマルチウェル組織培養プレートに細胞タイプ＃1を含むインサートを移します。
注：両方の細胞型は、適切な成長段階に達したときに、この手順を実行します。- ）をウェルへの挿入を転送する前に、以前の手順で説明するように、任意の必要なメディアの変更を行う1.3）と1.4。
注：この時点で、それはインサートメーカーの指示によって指定された両方の区画内のメディアの適切な量を分注することが重要です。 - グリップ、セルTを含むインサートの最端をピンセットを用いてYPE＃1と優しくウェル細胞型＃2を含む適切なに配置します。
- すべての挿入を転送した後、インサートの膜の下に気泡が存在するかどうかを確認。
注：気泡がインサートの膜を横切る任意の交換を防止し、実験全体を危険にさらすことができます。 - 気泡が存在する場合、非常に穏やかによく使用ピンセットからインサートを持ち上げて、細胞培養培地に戻って突入。気泡が消えます。彼らはまだ存在している場合は、角度でバック細胞培養培地への挿入を浸漬優しくしてみてください。
注：ノックや接着細胞を解離回避するために、インサートを攪拌しないでください。 - すべての気泡を除去し、両方の区画内のメディアのボリュームが、プレートに蓋を配置し、インキュベートすることを確認した後。
- ）をウェルへの挿入を転送する前に、以前の手順で説明するように、任意の必要なメディアの変更を行う1.3）と1.4。
- 共培養系でリフレッシュメディア
注：この膜は容易にインサートとの間のメディアの交換を可能にし、よく、培地をリフレッシュすることで行われますが、拡散のみによって上下コンパートメントで平衡に達するのに要する時間が非常に長くすることができるので、両方の区画。- セルタイプの＃1を含むインサートで爽やか媒体はステップ1.3）と同様に行われます。
- セルタイプ＃2を含むウェル中の培地をリフレッシュするには、静かにピペットチップを収容するのに十分な広さのスペースを作成する側に挿入部をスライドさせます。 ）ステップ1.4のようにメディアを更新します。
- ）気泡の有無を確認し、1.5.5を介して手順1.5.3に従ってボリューム）を確認します。
2.例：神経PC12細胞にLPS活性化N9ミクログリアによって分泌されるサイトカインの効果を測定します
注：以下の手順はよく特定のフラスコ、皿のサイズのために設計されています。しかし、このプロトコルは任意のプラスチック製品の寸法に合わせてカスタマイズすることができます。メディアや組成の材料表を参照してください。
- マルチでのPC12細胞を播種し、差別化ウェル組織培養プレート
- 暖かいルーチンPC12細胞培養培地、37℃の水浴中でPC12分化培地およびトリプシン-EDTA。
- 75cm 2のフラスコから60から80までパーセントコンフルエンスでPC12細胞を使用してください。
- 15 mmのパスツールピペットで、フラスコ中の全細胞培養培地の真空吸引を行います。
- 静かに滅菌リン酸緩衝生理食塩水5mlで細胞単層を洗浄し、パスツールピペットで液体を除去します。この段階で細胞を解離しないように注意してください。
- トリプシンEDTA 3mlで細胞単層を覆い、37℃で2~3分間インキュベートします。
- すべての細胞が顕微鏡下で分離されることを確認してください。非常に少数の細胞が浮遊している場合は、5分間の最大のために長い期間インキュベートします。
- トリプシンEDTAを不活性化するために、ルーチンPC12細胞培養培地10mlを加えます。
- ほとんどの細胞は、O底から解離していることを確認しながら10ミリリットルピペットで、穏やかに粉砕しますフラスコF。細胞懸濁液中の気泡を作成しないでください。
- 同じ10mLのピペットを用いて50mlの遠心管に細胞懸濁液を移します。
- 3200×gで1分間遠心操作
- ペレットを乱さないように注意しながらパスツールピペットで上清を捨てます。
- 10ミリリットルピペットでルーチンPC12細胞培養培地の10ミリリットルを追加します。
注：ペレットが非常に小さい、または大きい場合には、この量を調整することができます。 - ペレットを均質化するために、同じ10ミリリットルピペットで粉砕します。 PC12細胞は、多くの場合、ピペッティング少なくとも20ので、一緒に凝集し、必要なdownare。
注：活発摩砕が必要であるが、細胞懸濁液中の気泡を作成しないように。 - 1.5mlチューブでは、トリパンブルー中の細胞懸濁液の適切な希釈を準備します。以前に確立されたプロトコール74に従って血球計数器を用いて細胞を数えます。
- 個別の50mlチューブに、細胞懸濁液を分割PC12分化培地で24ウェルプレートから（3万¢/ cm 2でよく、製造業者のプロトコルに従ってあたり0.6 ml）をウェルに播種するために希釈された細胞懸濁液を適切に得ることができます。
注：以前に確立されたプロトコル75で指定された24ウェルプレートは、以前に、コラーゲンでコーティングされている必要があります。 - よくマイクロピペットを用いて、あたりの細胞懸濁液0.6ミリリットルを配布します。
- 全てのウェルを播種しているとき、）ステップ1.1.7のようにプレートを揺らし。
- PC12細胞の適切な分化は、共培養実験を行う前に、PC12分化培地15,16の5％CO 2の湿潤雰囲気中で37℃で7-9日間、24ウェルプレートをインキュベートすることを可能にします。
- 液体の半分を除去し、新鮮なPC12分化培地の等量それを置き換えることにより、一日おきに培地交換を行います。
- インサートにN9ミクログリアを播種し、LPSで処理します
- 一日の共培養実験を行う前に、1.1.4からステップ1.1.1）以下、細胞接着を最適化するためにルーチンN9細胞培養培地とPTFE0.4μmの細孔インサートを前処理）
- 37℃の水浴中で暖かいルーチンN9細胞培養培地およびトリプシン-EDTA。
- 一方、後で使用するために1.5mlチューブにLPSの約10mgの重量を量ります。
注：LPSが強力な炎症誘発性内毒素であり、特定の安全上の注意、メガネ、手袋、及び粒子状人工呼吸器を必要とするので、強く推奨されています。 - 75cm 2のフラスコから80〜90％のコンフルエンスでN9細胞を使用してください。
- ）2.1.14へのステップ2.1.3）に従います。常にルーチンN9細胞培養培地の代わりに、ルーチンのPC12細胞培養培地を使用します。また、N9ミクログリアが）ので、より少ないピペッティング上下がステップ2.1.13で必要になることがあり、一緒にPC12細胞がそうであるように同じくらいを凝集しないことに注意してください。
- 個別の50mlチューブに、OにN9細胞培養培地で細胞懸濁液を分割24ウェルプレート中で保持するように設計されたインサート（60,000¢/ cm 2で、製造業者のプロトコルに従ってインサートあたりが0.05mL、膜表面積については、メーカーの情報を参照）を播種するための適切な希釈細胞懸濁液btain。
注：これらのインサートは、すでに製造者によって、コラーゲンでコーティングされており、細胞接着のために最適化されます。 - マイクロピペットを用いて、インサートあたりの細胞懸濁液の0.05ミリリットルを配布します。
- すべての挿入がシードされている場合、）ステップ1.1.7のようにプレートを揺らし。
- 4μgの2 / mlの/ mlであり、1μgの/ mlの作業溶液を得るために、N9の処理媒体を用いて、LPSの連続希釈液を実行します。
- ピペットを2μg/ mlの最終希釈を得るために、インサートの1組で4 / mlのワーキング溶液0.05ミリリットル。
- それぞれを1μg/ mlおよび0.5μgの/ mLの最終希釈液を得た異なるセットのインサート内の他の2つの作業のソリューションのための手順を繰り返し2.2.10）。
- に共培養実験を行う前に、LPSとN9ミクログリアの活性化を可能にするために、5％CO 2湿潤雰囲気中で37℃で24時間のインサートを含有するプレートをcubate。
- N9ミクログリアと神経PC12細胞を共培養します
- PC12細胞を分化の7-9日目に、37℃の水浴中で暖かいN9処理媒体とPC12の処理媒体によって、LPSとのインキュベーションの24時間後N9ミクログリアを活性化させます。
- N9の処理媒体の0.1ミリリットルによって全体の使用済み培地を交換し、ステップ1.3）のようにN9ミクログリアの総培地交換を行います。すべてのinsert.Thisのためにこれを行うインサートでのみアクティブN9ミクログリアを残して、LPSの痕跡をすべて削除する必要があります。
- ステップ1.4のように神経PC12細胞の総培地交換を行います）。ステップ1.5のように24ウェルプレートへの挿入を移し）、5％CO 2湿潤雰囲気中で37℃で24時間または48時間N9-PC12の共培養を.Incubate。
- 24後時間または48時間、細胞毒性、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）、ウェスタンブロット、または他のアッセイのために上清および/または細胞を回収。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
インサート共培養システムの使用は、CNSの異なる細胞プレイヤー間パラクリン関係を披露神経炎症プロセスの研究に特に適切です。 CNSにおける免疫は彼らの安静分岐した状態（ 図2A）でその環境を監視し、検知乱れが可能であるミクログリアと呼ばれる常駐細胞によって主に達成される可能性がトラブルの適切な神経機能76-78のために必要な非常に貴重な恒常性。ミクログリアの活性化、アメーバ状の形状（ 図2B）の採用を特徴とした細胞集団の増殖は、サイトカインなどの炎症誘発性メディエーターの放出が続く、小膠細胞（ 図3）と呼ばれるが、神経炎症79の主側面を構成します。サイトカイン放出は、有害な攻撃に対してニューロンを保護する崇高な目的を果たすとCLOSですエリー監視しました。神経炎症は、この厳格な制御をエスケープするときしかし、それは破壊的な性質を採用し、真剣にCNSを傷つけることがあります。神経組織は非常に限られた再生能力を持っている限りは、CNSは、自動破壊的な炎症反応へのすべての影響を受けやすくなります。ニューロンとミクログリアの間に存在するクロストークを、研究することは神経炎症の発症機序の解明に不可欠です。混合培養物とは異なり、共培養システムは、毒性効果を生成していると、どちらが影響されている細胞集団を識別するために調査員を可能に挿入します。
ここでは、神経成長因子で7-9日間分化PC12細胞は、ニューロンの炎症由来の可溶性因子のquantifyingthe有害作用の目的でLPS活性化N9ミクログリアと共培養しました。 N9ミクログリアがインサートに播種しながらこれを行うために、神経PC12細胞を、24ウェルプレートで培養しました。 N9 microgliAは、LPS、グラム陰性菌の外膜に含まれる非常に強力な炎症誘発性内毒素で24時間処理しました。 LPSは、このように、不死化マウス細胞株N9ミクログリア80,81を含む免疫エフェクター細胞、多種多様で強固な炎症反応を誘発するToll様受容体4を活性化することが知られています。以下の代表的な結果は、LPSで活性化したN9ミクログリアは、その集団（ 図3）を大きくすると、インターロイキン6（IL-6）、インターフェロンγ（IFN-γ）とのような水溶性の炎症性サイトカインを分泌する傾向があることを示しています容易に共培養インサートの膜を通過し、下部コンパートメントに成長神経PC12細胞に対する細胞毒性損傷を引き起こし、腫瘍壊死因子α（TNF-α）。
神経PC12細胞を含むウェルにLPS活性化N9ミクログリアを転送する前に、一番の関心事は、股関節を確認することにありますPC12 tを適切に区別されています。 7日間分化したPC12細胞は、それ自体が静脈瘤（ 図4）を表示時には、いくつかの長い神経突起を投影する平坦細胞体、などの明白なニューロン表現型を示すべきです。このチェックポイントが実行されると、LPSの新鮮な培地を欠いを含むN9ミクログリアインサートは、分化PC12を含むウェルに移すことができます。 24時間または48時間のインキュベーション期間の後、下の区画で上清を回収し、細胞毒性アッセイ、乳酸デヒドロゲナーゼ放出15,16、ならびにELISA 15に基づいて、サイトカインを測定するために行われます。実際に透過性膜を横断しており、それは、PC12細胞の表面上の受容体を活性化することができるサイトカインを測定するために、下の区画に上清を収穫することが重要です。結果は、上部コンパートメントからのLPS活性化N9のミクログリアは、用量および時間依存CYTを生成することを実証します下部コンパートメント（ 図5）に設定された分化した神経PC12細胞に対するotoxic効果。 0.5μgの/ mLのLPS条件は、しかし、大幅に24時間または48時間後に細胞毒性ではありません。細胞毒性のレベルを2μg/ mlのLPSで48時間の条件でほぼ100％に達することが判明しました。また、結果は、炎症性サイトカインIL-6、観察された細胞毒性と同時に上清が増加中のIFN-γおよびTNF-αの濃度。具体的には、IL-6濃度が有意にも大幅に48時間（ 図6）後のサイトカインのレベルを上げ利回りLPS1μg/ mlのに対し、わずか2 / mlの条件のための24時間後に増加しています。ミクログリアは、それらが1 / mlのおよび2μg/ mlので処理し、24時間または48時間（ 図7）のいずれかのための分化した神経PC12細胞とともにインキュベートされたときに有意に増加した様式で下部コンパートメントに到達するIFN-γを分泌します。 0.5 / mlのLPS条件は再び著しくIFN-γのレベルを増加させません。最後に、下側区画中のTNF-α濃度を、ELISAによって定量した、ほとんどの約7倍以上の重要な制御状態（ 図8）よりもレベルに達し、小膠細胞のLPS活性化により増強されることが見出されました。具体的には、両方の24時間および48時間のインキュベーション期間は、上清中のTNF-αレベルにおける重要な増加を引き起こしました。しかし、を1μg/ mlのLPSの条件は、48時間後のTNF-αレベルの有意な上昇をもたらしました。全体として、これらの結果は、分泌された炎症性サイトカインは、少なくともLPSの種々の濃度によって活性化ミクログリアで24時間または48時間のインキュベーション期間後に分化神経PC12細胞で観察された細胞傷害性効果のために部分的に関与していることを示しています。
に示されたLPS活性化N9ミクログリアおよびPC12細胞の共培養系を挿入します神経炎症の研究で、それに対抗するための戦略を練り上げる際に特に有用です。我々のグループは、最近16、今度はインサート15の微細孔を交配することによって、神経成長因子、分化したPC12細胞のアポトーシスを誘導する炎症性サイトカインの転写を増加させ、細胞培養で増殖させたLPS活性化N9ミクログリアが展示を挿入することが示されました。同じパラダイムでは、ポリフェノール化合物、レスベラトロール（0.1μM、3時間）でミクログリア人口の前処理は、前炎症性サイトカインの転写を防止し、したがってその後、カスパーゼ3の活性化を遮断によって分化神経PC12細胞のアポトーシスを阻害します、DNA切断。別のグループはまた、N9-PC12共培養26におけるビタミンEの神経保護効果を実証してきました。 N9-PC12の共培養に加えて、別の不死化細胞株または初代培養物はまた、神経炎症の状況において使用されています。例えば、マウスミクログリアBV2細胞株は明らかに、その抗炎症潜在17によって媒介されるポリフェノールルテオリンの抗アポトーシス効果を示すために、ヒト神経芽細胞腫SH-SY5Y細胞と共培養しました。同様に、損傷したPC12細胞によって活性化さBV2ミクログリアは、間葉系幹細胞18内の抗アポトーシス効果を発揮することが示されました。相互シグナリングは一次小脳顆粒ニューロン19に与え初代ミクログリアの神経保護の下にある抗アポトーシス機序に重要であることが実証されました。また、初代海馬神経細胞は、システイン交換とシナプス機能20のその後の弱体化によって、グルタミン酸の放出を評価するために分泌されたアミロイド前駆体タンパク質によって活性化初代ミクログリアと同時培養しました。最後に、一つのグループはまた、ケモカイン恒常EXPRES、シグナリングフラクタルに係る初代海馬神経細胞と初代ミクログリアの間に存在するクロストークを示しました受容体ミクログリア21の表面上に見出されるCNSのニューロンによりsedの。
インサート共培養系の 1 概略 図 。上部コンパートメントは、1つの細胞型とその頂端体液環境を保持しているインサートで構成されています。下の区画は、第二の細胞タイプを含むウェルまたはディッシュから構成されています。インサートは、マルチウェル組織培養プレートまたは皿の縁に載ります。インサートは、以下に増殖する細胞の集団に触れないようにだけウェルの底部の上方に位置するように設計されています。下の区画内の培地は、第1の細胞型および第二の細胞型の先端面の基底面の両方に接触している。 より大きな輸出自主規制を表示するには、こちらをクリックしてください。この図のイオン。
挿入中の図 N9ミクログリアの 2 顕微鏡写真。（A）未処理の休息N9ミクログリアは、彼らが積極的に環境を監視することを可能にする分枝細胞の形態を示します。 （B）24時間表示、活性化表現型の典型的なアメーバ状形状のためのリポポリサッカライド（LPS）で処理されたインサートでN9ミクログリア。この顕微鏡写真は、ちょうど図4に示すように、分化したPC12細胞を含むウェルにこれらの活性化N9ミクログリアを含むインサートを転送する前に撮影された。スケールバー=25μmで。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図 差別神経PC12細胞の 4 顕微鏡写真。七日間神経成長因子、分化した神経PC12細胞は、このような長い神経突起や静脈瘤などの明白なニューロン表現型を示しています。この顕微鏡写真は、ちょうど、図2に描かように活性化N9ミクログリアを含むインサートを転送する前に撮影された。スケールバー=25μmで。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
リポ多糖の 図5. 細胞毒性効果（LPS）は、分化神経PC12細胞にミクログリアを付活。N9ミクログリアは、24時間または48時間分化した神経PC12細胞を含むウェルに移し、24時間LPSの種々の濃度で活性化しました。細胞毒性は、下部コンパートメントの上清に対して行わ乳酸デヒドロゲナーゼ放出アッセイを用いて評価しました。群間の有意差は、Windowsのバージョン3.06（; www.graphpad.comカリフォルニア州サンディエゴ）、グラフパッドINSTATプログラムとTukeyの事後分析に続いて、一元配置分散分析によって確認しました。 6ウェルが考慮された3つの独立した実験からの平均値の±標準誤差を意味する95％信頼区間で分析すべてのデータは、表現されます。アスタリスクは、治療とコントロール状態（*** P <0.001）との間に統計的な差を示している。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
リポ多糖（LPS）によってN9活性化後、上清中の I nterleukin-6（IL-6） の 図6 濃度 。N9ミクログリアは、24時間LPSの種々の濃度で活性化し、次いで分化神経PC12細胞を含むウェルに移しました24時間または48時間。下部コンパートメントの上清中のIL-6濃度は、ELISAを用いて評価しました。群間の有意差は、Windowsのバージョン3.06（; www.graphpad.comカリフォルニア州サンディエゴ）、グラフパッドINSTATプログラムとTukeyの事後分析に続いて、一元配置分散分析によって確認しました。 6ウェルが考慮された3つの独立した実験からの平均値の±標準誤差を意味する95％信頼区間で分析すべてのデータは、表現されます。アスタリスクは、治療と詐欺の間に統計的な差を示しますントロール条件（*** P <0.001、**はp <0.01と* P <0.05）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
リポ多糖（LPS）によってN9活性化後、上清中の インターフェロンγ（IFN-γ） の 図7 濃度は N9ミクログリアを24時間LPSの種々の濃度で活性化し、次いで24時間分化した神経PC12細胞を含むウェルに移しましたまたは48時間。下部コンパートメントの上清中のIFN-γ濃度をELISAを用いて評価しました。群間の有意差を、GraphPad INSTATプログラムとTukeyの事後解析、バージョン3.06に続いて、一元配置分散分析によって確認しました。Windowsの（; www.graphpad.comカリフォルニア州サンディエゴ）のために。 6ウェルが考慮された3つの独立した実験からの平均値の±標準誤差を意味する95％信頼区間で分析すべてのデータは、表現されます。アスタリスクは。（**はp <0.01と* P <0.05）処理と制御状態との間に統計学的な差を示している。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
リポ多糖（LPS）によってN9活性化後、上清中の腫瘍壊死因子α（TNF-α） の 図8 濃度は 、N9ミクログリアを24時間LPSの種々の濃度で活性化し、その後のために分化した神経PC12細胞を含むウェルに移しました24時間または48時間。 TNF-α下部コンパートメントの上清中の濃度を、ELISAを用いて評価しました。群間の有意差は、Windowsのバージョン3.06（; www.graphpad.comカリフォルニア州サンディエゴ）、グラフパッドINSTATプログラムとTukeyの事後分析に続いて、一元配置分散分析によって確認しました。 6ウェルが考慮された3つの独立した実験からの平均値の±標準誤差を意味する95％信頼区間で分析すべてのデータは、表現されます。アスタリスクは、治療とコントロール状態（*** P <0.001）との間に統計的な差を示している。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
任意の挿入共培養系の実験の最も重要なステップは、実際に使用するための適切な挿入を選択する際に宿ります。孔径及び膜材料が播種される細胞の種類および実験の目的を考慮し忘れることなく、十分な考慮しなければなりません。例えば、走化性アッセイは、細胞 - 細胞接触の非存在下で分泌された可溶性因子によって誘導される細胞挙動の変調を分析するために細胞共培養物よりも膜の同じタイプを使用することができます。細胞遊走および細胞 - 細胞接触を防止するために、細胞遊走を可能にするために、前者のために大きいもの、後者のために小さいもの：しかし、実験の両方のタイプは、異なる孔サイズを必要とします。細胞間接触の不在下で分泌された可溶性因子によって媒介される細胞の変化を評価するために、彼らはタンパク質のような大きな分子、を可能として、0.4ミクロンまたは3ミクロンの孔サイズは、通常は適切である、やってからほとんどの細胞を横切るが、防止しますそう。膜材料は、大部分の細胞型および細胞培養プロトコルの終了時に使用される技術に依存します。彼らは明確であるが、コラーゲンサポートは、治療するために必要な接着細胞のための問題になることができ、コーティングされていないように簡単に説明すると、PET膜は、良好な細胞の可視性を提供します。彼らはまた、良好な光学特性と一緒に、組織学的研究のために理想的、固定液に最高の耐薬品性を有しています。彼らは半透明であり、コラーゲンコーティングされていないとして、一方、PC膜は悪い細胞の可視性を提供します。しかし、それらは、細孔の最高密度および孔径の最も多様な利用可能性を有します。最後に、PTFE膜は、湿潤時にクリアされているだけのセルの可視化を顕微鏡で概説ことができます。主な利点として、彼らはまた少し厚めにそれらを作るコーティングされたコラーゲン、です。コラーゲンとPET又はPC膜インサートをコーティングする孔を妨げる可溶性事実上の通過を妨げることができることに留意することが重要なことですRS。いずれにせよ、ほとんどのインサートの製造業者は、適切なインサートを選択する研究者を支援するための総合的なガイドを提供します。私たちの具体的なパラダイムでは、播種密度、メディア、血清中濃度、分化の日、LPS活性化の日、LPSの濃度、およびPC12細胞用フラスコのコーティングの選択肢は、これらの共培養系15での作業の長年にわたって最適化されてきました、16。注目すべきは、挿入中N9ミクログリアの播種密度は、それらの活性化の際に乗算するために彼らにスペースを与えるために、このように、共培養を開始し、の瞬間に百分の40から50コンフルエンスを得るために、60,000¢/ cm 2に選ばれましたLPSによります。最適化された他の条件はまた、天然のPC12の維持のために意図されたフラスコ中で、L-リジンによるコラーゲンに置き換えとして満足な結果をもたらすことができます。
結果の持続性を高めるために、いくつかの異なるコントロールを行うことができます。その可溶性因子を証明しようとすると、直接細胞 - 細胞接触および馴化培地実験を発現混合培養を並行して観察された効果の原因で行われるべきであるています。また、特定の分泌された因子を中和する抗体を利用することは、知覚されるパラクリン効果に関与する分子を同定するのに役立つだろう。可能な場合は、活性化される受容体の正確な身元を特定する受容体またはそのシグナル伝達経路の一部を遮断。分子は、例えば、前述の例のように第二の細胞型と共培養実験の前に一つの細胞集団を活性化するために使用されている場合、それを考慮にシステム内の分子の存在を取ることが重要です。最初のオプションとして、媒体が完全に分子が完全にシステムに存在しないことを確実にするために、共培養実験の前に変更する必要があります。単独の分子がするために、第2の細胞型とインキュベートされる第二の選択肢としては、条件を追加する必要があります第1の細胞型の非存在下でその効果を評価します。第二の細胞型の分子の効果がない場合には、共培養実験の前に、培地を変更する必要はないであろう。両方の細胞型が同一の細胞培養培地中で増殖されていない場合は同様に、同様の注意が培地組成の違いは、1つまたは他の細胞集団に影響を与えないことを確認するために注意しなければなりません。両方のメディアが最初にインサート膜によって分離されるが、拡散は、それらが長いインキュベーション期間にわたって混合することを確実にするためにバインドされています。また、いくつかの問題は、可溶性因子受容体との関係の異常な混乱から生じ得ます。エラーのいくつかの原因の中でも、酵素的解離の過度の使用および血清の重要な濃度の存在は、細胞表面受容体を妨害し得ます。インサート共培養システムにおけるエラーの他の原因としては、1に限定されない）は、細胞の全体を除去するように不適切な細胞培養技術2）インサートメンブレンを密封し、下部コンパートメントに到達するために先端で、分泌された分子を防止するための責任を挿入すぎるコンフルエントである単層、および3）誤調整細胞を乾燥させると同時に、あまりにも多くのウェル中の培地、生理学的に関連性の低い結果または任意の効果の欠如につながる可溶性因子の過剰または過小発現を引き起こす細胞コンフルエンス、。
インサート共培養の一方のみシナリオがここに提示されたが、この非常に多目的な技術を利用する多数の方法があります。ここでは、一つの細胞型は、ウェルに挿入物を移す際に、第二の細胞型の挙動に影響を与える可溶性因子の分泌を誘導する責任分子で前処理しました。不純な治療に、一方または両方の細胞集団の増加脆弱性または抵抗を検出するためにそれらを分離する前に、共培養系で一緒に両方の細胞型をインキュベートすることも可能です。ホーその最も基本的な形を考慮した場合weverは、この技術は、基礎パラクリン逆数シグナリングを評価する目的で、任意の処理をせずに一緒にインキュベートした細胞の2つの集団を利用することができます。
この技術の最も重要な制限は、このような活性酸素種とし て非常に短命の分子実体は、上部コンパートメントと下部コンパートメント82内の1つに成長している細胞集団を分離する距離を生存しないということです。共培養技術における最近の開発は、マイクロ近接83で2つの細胞集団を維持することができる微細加工培養基材を使用することによって、この問題に回答しようとしました。そのような変更および双方向シグナリングの集団特異的検出のような挿入の共培養系の利点の全てを有することに加えて、この微細加工画面も可能Dの前にはなかった短距離相互作用の検出を行うことが実証されました距離で可溶性因子の崩壊に起因するetectable。この細胞培養プラットフォームは、細胞共培養中に最新の技術革新であると前に見落とされた細胞間の情報伝達メカニズム解明に役立つことを約束します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI-1640 medium | Sigma | R8755 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham | Sigma | D6421 | Warm in 37 °C water bath before use, must be supplemented with 0.365 gm/L L-glutamine |
| Horse serum | ATCC | 30-2040 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Fetal bovine serum | MultiCell | 80350 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Nerve Growth Factor-7S from murine submaxillary gland | Sigma | N0513 | Reconstitute the lyophilized powder in a solution of buffered saline or tissue culture medium containing 0.1–1.0% bovine serum albumin or 1-10% serum |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma | T3924 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli 055:B5 | Sigma | L2880 | Toxic |
| Cell culture inserts for use with 24-well plates | BD Falcon | 353095 | 0.4 μm pores |
| 24-well plates | TrueLine | TR5002 | Coat with collagen before use |
| Routine PC12 cell culture medium | Routine N9 cell culture medium | ||
| - 85% RPMI medium | - 90% DMEM-F12 medium | ||
| - 10% heat-inactivated horse serum | - 10% heat-inactivated horse serum | ||
| - 5% heat-inactivated fetal bovine serum | |||
| PC12 differentiation medium | N9 treatment medium | ||
| - 99% RPMI medium | - 99% DMEM-F12 medium | ||
| - 1% heat-inactivated fetal bovine serum | - 1% heat-inactivated fetal bovine serum | ||
| - 50 ng/mL nerve growth factor | |||
| PC12 treatment medium | |||
| - 99% RPMI medium | |||
| - 1% heat-inactivated fetal bovine serum |
References
- Grobstein, C. Morphogenetic interaction between embryonic mouse tissues separated by a membrane filter. Nature. 172 (4384), 869-870 (1953).
- Hoffman, R. A. Intraepithelial lymphocytes coinduce nitric oxide synthase in intestinalepithelial cells. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 278 (6), G886-G894 (2000).
- Zhang, W. C., et al. Regulatory T cells protect fine particulate matter-induced inflammatory responses in human umbilical vein endothelial cells. Mediators Inflamm. 2014, 869148 (2014).
- Vasileiadou, K., et al. alpha1-Acid glycoprotein production in rat dorsal air pouch in response to inflammatory stimuli, dexamethasone and honey bee venom. Exp. Mol. Pathol. 89 (1), 63-71 (2010).
- Talayev, V. Y., et al. The effect of human placenta cytotrophoblast cells on the maturation and T cell stimulating ability of dendritics cells in vitro. Clin. Exp. Immunol. 162 (1), 91-99 (2010).
- Elishmereni, M., et al. Physical interactions between mast cells and eosinophils: a novel mechanism enhancing eosinophil survival in vitro. Allergy. 66 (3), 376-385 (2011).
- Ishihara, Y., et al. Regulation of immunoglobulin G2 production by prostaglandin E(2) and platelet-activating factor. Infect. Immun. 68 (3), 1563-1568 (2000).
- Kranzer, K., Bauer, M., Lipford, G. B., Heeg, K., Wagner, H., Lang, R. CpG-oligodeoxynucleotides enhance T-cell receptor-triggered interferon- gamma production and up-regulation of CD69 via induction of antigen- presenting cell-derived interferon type I and interleukin-12. Immunology. 99 (2), 170-178 (2000).
- Vendetti, S., Chai, J. G., Dyson, J., Simpson, E., Lombardi, G., Lechler, R. Anergic T cells inhibit the antigen-presenting function of dendritic cells. J. Immunol. 165 (3), 1175-1181 (2000).
- Haller, D., Bode, C., Hammes, W. P., Pfeifer, A. M., Schiffrin, E. J., Blum, S. Non-pathogenic bacteria elicit a differential cytokine response by intestinal epithelial cell/leucocyte co-cultures. Gut. 47 (1), 79-87 (2000).
- Dono, M., et al. In vitro stimulation of human tonsillar subepithelial B cells: requirement for interaction with activated T cells. Eur. J. Immunol. 31 (3), 752-756 (2001).
- Yu, Y., et al. Enhancement of human cord blood CD34+ cell-derived NK cell cytotoxicity by dendritic cells. J. Immunol. 166 (3), 1590-1600 (2001).
- Watanabe, T., Tokuyama, S., Yasuda, M., Sasaki, T., Yamamoto, T. Changes of tissue factor-dependent coagulant activity mediated by adhesion between polymorphonuclear leukocytes and endothelial cells. Jpn J. Pharmacol. 86 (4), 399-404 (2001).
- Krampera, M., et al. Bone marrow mesenchymal stem cells inhibit the response of naive and memory antigen-specific T cells to their cognate peptide. Blood. 101 (9), 3722-3729 (2003).
- Bournival, J., Plouffe, M., Renaud, J., Provencher, C., Martinoli, M. G. Quercetin and sesamin protect dopaminergic cells from MPP+-induced neuroinflammation in a microglial (N9)-neuronal (PC12) coculture system. Oxid. Med. Cell. Longev. 2012, 921941 (2012).
- Bureau, G., Longpré, F., Martinoli, M. G. Resveratrol and quercetin, two natural polyphenols, reduce apoptotic neuronal cell death induced by neuroinflammation. J. Neurosci. Res. 86 (2), 403-410 (2008).
- Zhu, L., Bi, W., Lu, D., Zhang, C., Shu, X., Lu, D. Luteolin inhibits SH-SY5Y cell apoptosis through suppression of the nuclear transcription factor-κB, mitogen-activated protein kinase and protein kinase B pathways in lipopolysaccharide-stimulated cocultured BV2 cells. Exp. Ther. Med. 7 (5), 1065-1070 (2014).
- Luo, X., et al. BV2 enhanced the neurotrophic functions of mesenchymal stem cells after being stimulated with injured PC12. Neuroimmunomodulation. 16 (1), 28-34 (2009).
- Polazzi, E., Gianni, T., Contestabile, A. Microglial cells protect cerebellar granule neurons from apoptosis: evidence for reciprocal signaling. Glia. 36 (3), 271-280 (2001).
- Barger, S. W., Basile, A. S. Activation of microglia by secreted amyloid precursor protein evokes release of glutamate by cystine exchange and attenuates synaptic function. J. Neurochem. 76 (3), 846-854 (2001).
- Zujovic, V., Taupin, V. Use of cocultured cell systems to elucidate chemokine-dependent neuronal/microglial interactions: control of microglial activation. Methods. 29 (4), 345-350 (2003).
- Iwashita, M., et al. Valsartan, independently of AT1 receptor or PPARγ, suppresses LPS-induced macrophage activation and improves insulin resistance in cocultured adipocytes. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 302 (3), E286-E296 (2012).
- Oliver, E., et al. Docosahexaenoic acid attenuates macrophage-induced inflammation and improves insulin sensitivity in adipocytes-specific differential effects between LC n-3 PUFA. J. Nutr. Biochem. 23 (9), 1192-1200 (2012).
- Tang, S. Y., Cheah, I. K., Wang, H., Halliwell, B. Notopterygium forbesii Boiss extract and its active constituent phenethyl ferulate attenuate pro-inflammatory responses to lipopolysaccharide in RAW 264.7 macrophages. A "protective" role for oxidative stress. Chem. Res. Toxicol. 22 (8), 1473-1482 (2009).
- De Boer, A. A., Monk, J. M., Robinson, L. E. Docosahexaenoic acid decreases pro-inflammatory mediators in an in vitro murine adipocyte macrophage co-culture model. PLoS One. 9 (1), e85037 (2014).
- Li, Y., Liu, L., Barger, S. W., Mrak, R. E., Griffin, W. S. Vitamin E suppression of microglial activation is neuroprotective. J. Neurosci. Res. 66 (2), 163-170 (2001).
- Brizuela, L., et al. Osteoblast-derived sphingosine 1-phosphate to induce proliferation and confer resistance to therapeutics to bone metastasis-derived prostate cancer cells. Mol. Oncol. 8 (7), 1181-1195 (2014).
- Yuan, L., Chan, G. C., Fung, K. L., Chim, C. S. RANKL expression in myeloma cells is regulated by a network involving RANKL promoter methylation, DNMT1, microRNA and TNFα in the microenvironment. Biochim. Biophys. Acta. 1843, 1834-1838 (2014).
- Krtolica, A., Parrinello, S., Lockett, S., Desprez, P. Y., Campisi, J. Senescent fibroblasts promote epithelial cell growth and tumorigenesis: a link between cancer and aging. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 98 (21), 12072-12077 (2001).
- Lawrenson, K., Grun, B., Benjamin, E., Jacobs, I. J., Dafou, D., Gayther, S. A. Senescent fibroblasts promote neoplastic transformation of partially transformed ovarian epithelial cells in a three-dimensional model of early stage ovarian cancer. Neoplasia. 12 (4), 317-325 (2010).
- Liu, J., et al. BCR-ABL mutants spread resistance to non-mutated cells through a paracrine mechanism. Leukemia. 22 (4), 791-799 (2008).
- Giuliani, N., et al. Proangiogenic properties of human myeloma cells: production of angiopoietin-1 and its potential relationship to myeloma-induced angiogenesis. Blood. 102 (2), 638-645 (2003).
- Gupta, D., et al. Adherence of multiple myeloma cells to bone marrow stromal cells upregulates vascular endothelial growth factor secretion: therapeutic applications. Leukemia. 15 (12), 1950-1961 (2001).
- Anderson, I. C., Mari, S. E., Broderick, R. J., Mari, B. P., Shipp, M. A. The angiogenic factor interleukin 8 is induced in non-small cell lung cancer/pulmonary fibroblast cocultures. Cancer Res. 60 (2), 269-272 (2000).
- Hoechst, B., et al. A new population of myeloid-derived suppressor cells in hepatocellular carcinoma patients induces C4(+)CD25(+)Foxp3(+) T cells. Gastroenterology. 135 (1), 234-243 (2008).
- Karadag, A., Oyajobi, B. O., Apperley, J. F., Russell, R. G., Croucher, P. I. Human myeloma cells promote the production of interleukin 6 by primary human osteoblasts. Br. J. Haematol. 108 (2), 383-390 (2000).
- Garrido, S. M., Appelbaum, F. R., Willman, C. L., Banker, D. E. Acute myeloid leukemia cells are protected from spontaneous and drug- induced apoptosis by direct contact with a human bone marrow stromal cell line (HS-5). Exp. Hematol. 29 (4), 448-457 (2001).
- Heissig, B., Pasternak, G., Horner, S., Schwerdtfeger, R., Rossol, S., Hehlmann, R. CD14+ peripheral blood mononuclear cells from chronic myeloid leukemia and normal donors are inhibitory to short- and long-term cultured colony-forming cells. Leuk. Res. 24 (3), 217-231 (2000).
- Moore, M. B., Kurago, Z. B., Fullenkamp, C. A., Lutz, C. T. Squamous cell carcinoma cells differentially stimulate NK cell effector functions: the role of IL-18. Cancer Immunol Immunother. 52 (2), 107-115 (2003).
- Giuliana, N., et al. Human myeloma cells stimulate the receptor activator of nuclear factor- kappa B ligand (RANKL) in T lymphocytes: a potential role in multiple myeloma bone disease. Blood. 100 (13), 4615-4621 (2002).
- Ye, Z., Haley, S., Gee, A. P., Henslee-Downey, P. J., Lamb, L. S. Jr In vitro interactions between gamma deltaT cells, DC, and CD4+ T cells; implications for the immunotherapy of leukemia. Cytotherapy. 4 (3), 293-304 (2002).
- Zhang, X. M., Xu, Q. Metastatic melanoma cells escape from immunosurveillance through the novel mechanism of releasing nitric oxide to induce dysfunction of immunocytes. Melanoma Res. 11 (6), 559-567 (2001).
- Zhang, M., et al. The differentiation of human adipose-derived stem cells towards a urothelium-like phenotype in vitro and the dynamic temporal changes of related cytokines by both paracrine and autocrine signal regulation. PLoS One. 9 (4), e95583 (2014).
- Qu, C., et al. Chondrogenic differentiation of human pluripotent stem cells in chondrocyte co-culture. Int. J. Biochem. Cell. Biol. 45 (8), 1802-1812 (2013).
- Krassowska, A., et al. Promotion of haematopoietic activity in embryonic stem cells by the aorta-gonad-mesonephros microenvironment. Exp. Cell. Res. 312 (18), 3595-3603 (2006).
- Darcy, K. M., et al. Mammary fibroblasts stimulate growth, alveolar morphogenesis, and functional differentiation of normal rat mammary epithelial cells. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 36 (9), 578-592 (2000).
- Spector, J. A. Co-culture of osteoblasts with immature dural cells causes an increased rate and degree of osteoblast differentiation. Plast. Reconstr. Surg. 109 (2), 631-642 (2002).
- Khanolkar, A., Fu, Z., Underwood, L. J., Bondurant, K. L., Rochford, R., Cannon, M. J. CD4+ T cell-induced differentiation of EBV-transformed lymphoblastoid cells is associated with diminished recognition by EBV-specific CD8+ cytotoxic T cells. J. Immunol. 170 (6), 3187-3194 (2003).
- Fritsch, C. Epimorphin expression in intestinal myofibroblasts induces epithelial morphogenesis. J. Clin. Invest. 110 (11), 1629-1641 (2002).
- Abouelfetouh, A., Kondoh, T., Ehara, K., Kohumra, E. Morphological differentiation of bone marrow stromal cells into neuron-like cells after co-culture with hippocampal slice. Brain Res. 1029 (1), 114-119 (2004).
- Llado, J., Haenggeli, C., Maragakis, N., Snyder, E., Rothstein, J. Neural stem cells protect against glutamate-induced excitotoxicitiy and promote survival of injured motor neurons through the secretion of neurotrophic factors. Mol. Cell. Neurosci. 27 (3), 322-331 (2004).
- Fong, S. P., et al. Trophism of neural progenitor cells to embryonic stem cells: Neural induction and transplantation in a mouse ischemic stroke model. J. Neurosci. Res. 85 (9), 1851-1862 (2007).
- Gordon-Keylock, S. A., et al. Induction of hematopoietic differentiation of mouse embryonic stem cells by an AGM-derived stromal cell line is not further enhanced by overexpression of HOXB4. Stem Cells. 19 (11), 1687-1698 (2010).
- Yang, T., Tsang, K. S., Poon, W. S., Ng, H. K. Neurotrophism of bone marrow stromal cells to embryonic stem cells: noncontact induction and transplantation to a mouse ischemic stroke model. Cell transplant. 18 (4), 391-404 (2009).
- Kim, J. Y., et al. Umbilical cord blood mesenchymal stem cells protect amyloid-β42 neurotoxicity via paracrine. World J. Stem Cells. 4 (11), 110-116 (2012).
- Mauri, M., et al. Mesenchymal stem cells enhance GABAergic transmission in co-cultured hippocampal neurons. Mol. Cell Neurosci. 49 (4), 395-405 (2012).
- Ichikawa, J., et al. Increased crystal-cell interaction in vitro under co-culture of renal tubular cells and adipocytes by in vitro co-culture paracrine systems simulating metabolic syndrome. Urolithiasis. 42 (1), 17-28 (2014).
- Zuo, L., et al. A Paracrine mechanism involving renal tubular cells, adipocytes and macrophages promotes kidney stone formation in a simulated metabolic syndrome environment. J. Urol. 191 (6), 1906-1912 (2014).
- Fan, W., Zheng, J. J., McLaughlin, B. J. An in vitro model of the back of the eye for studying retinal pigment epithelial-choroidal endothelial interactions. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 38 (4), 228-234 (2002).
- Mierke, C. T., Ballmaier, M., Werner, U., Manns, M. P., Welte, K., Bischoff, S. C. Human endothelial cells regulate survival and proliferation of human mast cells. J. Exp. Med. 192 (6), 801-811 (2000).
- Beckner, M. E., Jagannathan, S., Peterson, V. A. Extracellular angio-associated migratory cell protein plays a positive role in angiogenesis and is regulated by astrocytes in coculture. Microvasc. Res. 63 (3), 259-269 (2002).
- Damon, D. H. VSM growth is stimulated in sympathetic neuron/VSM cocultures: role of TGF-beta2 and endothelin. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 278 (2), H404-H411 (2000).
- Anna De Berardinis, M., Ciotti, M. T., Amadoro, G., Galli, C., Calissano, P. Transfer of the apoptotic message in sister cultures of cerebellar neurons. Neuroreport. 12 (10), 2137-2140 (2001).
- Lange-Sperandio, B., Fulda, S., Vandewalle, A., Chevalier, R. L. Macrophages induce apoptosis in proximal tubule cells. Pediatr. Nephrol. 18 (4), 335-341 (2003).
- Vjetrovic, J., Shankaranarayanan, P., Mendoza-Parra, M. A., Gronemeyer, H. Senescence-secreted factors activate Myc and sensitize pretransformed cells to TRAIL-induced apoptosis. Aging Cell. 13 (3), 487-496 (2014).
- Fujiya, A., et al. The role of S100B in the interaction between adipocytes and macrophages. Obesity (Silver Spring). 22 (2), 371-379 (2014).
- Suganami, T., Nishida, J., Ogawa, Y. A paracrine loop between adipocytes and macrophages aggravates inflammatory changes: role of free fatty acids and tumor necrosis factor alpha. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 25 (10), 2062-2068 (2005).
- Yoshida, A., Kitajiri, S., Nakagawa, T., Hashido, K., Inaoka, T., Ito, J. Adipose tissue-derived stromal cells protect hair cells from aminoglycoside. Laryngoscope. 121 (6), 1281-1286 (2011).
- May, L. A., et al. Inner ear supporting cells protect hair cells by secreting HSP70. J. Clin. Invest. 123 (8), 3577-3587 (2013).
- Jarosz, L. M., Deng, D. M., vander Mei, H. C., Crielaard, W., Krom, B. P. Streptococcus mutans competence-stimulating peptide inhibits Candida albicans hypha formation. Eukaryot Cell. 8 (11), 1658-1664 (2009).
- Dagenais, T. R., Giles, S. S., Aimanianda, V., Latgé, J. P., Hull, C. M., Keller, N. P. Aspergillus fumigatus LaeA-mediated phagocytosis is associated with a decreased hydrophobin layer. Infect. Immun. 78 (2), 823-829 (2010).
- Spiliotis, M., Lechner, S., Tappe, D., Scheller, C., Krohne, G., Brehm, K. Transient transfection of Echinococcus multilocularis primary cells and complete in vitro regeneration of metacestode vesicles. Int. J. Parasitol. 38 (8-9), 1025-1039 (2008).
- Scholzen, A., Mittag, D., Rogerson, S. J., Cooke, B. M., Plebanski, M. Plasmodium falciparum-mediated induction of human CD25Foxp3 CD4 T cells is independent of direct TCR stimulation and requires IL-2, IL-10 and TGFbeta. PLoS Pathog. 5 (8), e1000543 (2009).
- Fedoroff, S., Richardson, A. Quantification of Cells in Culture. Protocols for Neural Cell Culture. , 4th ed, Humana. Totowa, NJ. 333-335 (2001).
- Fedoroff, S., Richardson, A. Primary Cultures of Sympathetic Ganglia. Protocols for Neural Cell Culture. , 4th ed, Humana. Totowa, NJ. 88-89 (2001).
- Kreutzberg, G. W. Microglia: a sensor for pathological events in the CNS. Trends Neurosci. 19 (8), 312-318 (1996).
- Hanisch, U. K., Kettenmann, H. Microglia: active sensor and versatile effector cells in the normal and pathologic brain. Nat. Neurosci. 10 (11), 1387-1394 (2007).
- Davalos, D., et al. ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nat. Neurosci. 8 (6), 752-758 (2005).
- Block, M. L., Zecca, L., Hong, J. S. Microglia-mediated neurotoxicity: uncovering the molecular mechanisms. Nat. Rev. Neurosci. 8 (1), 57-69 (2007).
- Qureshi, S. T., Larivière, L., Leveque, G., Clermont, S., Moore, K. J., Gros, P., Malo, D. Endotoxin-tolerant mice have mutations in Toll-like receptor 4 (Tlr4). J. Exp. Med. 189, 615-625 (1999).
- Sabroe, I., Jones, E. C., Usher, L. R., Whyte, M. K., Dower, S. K. Toll-like receptor (TLR)2 and TLR4 in human peripheral blood granulocytes: a critical role for monocytes in leukocyte lipopolysaccharide responses. J. Immunol. 168, 4701-4710 (2002).
- Winterbourn, C. C. Reconciling the chemistry and biology of reactive oxygen species. Nat. Chem. Bio. 4 (5), 278-286 (2008).
- Spencer, K. H., Kim, M. Y., Hughes, C. C., Hui, E. E. A screen for short-range paracrine interactions. Integr. Biol. (Camb). 6 (4), 382-387 (2014).
