Introduction
El estudio de los tejidos, órganos o sistemas in vitro es un intento de simplificar las muy complejas relaciones existentes entre los varios subtipos celulares que comprenden organismos multicelulares. De hecho, los estudios in vitro hacen posible adquirir una comprensión detallada de las poblaciones de células individuales. Hay dos ventajas principales de la realización de los experimentos in vitro: 1) la reducción de las interacciones celulares, y 2) la capacidad de manipular fácilmente el entorno celular. Científicos Por lo tanto, estas dos ventajas han permitido a predecir el comportamiento de determinados tipos de células in vivo, dando lugar a la capacidad de regular los resultados de las influencias extrínsecas en organismos completos. En ese sentido, el cultivo in vitro de células de frecuencia funciona como un puente que conecta las ciencias básicas y aplicadas de vida. No obstante, hay también varias desventajas de trabajar in vitro, el más importante siendo que una determinada reserva habite en el fisiológicaal pertinencia de fenotipos observados. De hecho, cuando un solo tipo de células se cultiva en un recipiente, la cultura pierde, en diversa medida, sus conexiones célula-célula con otros tipos de células, su contribución al medio ambiente humoral del tejido y el organismo de origen, y las anclas dentro el tejido que le permitió mantener una estructura tridimensional determinada veces crucial para la función celular.
La cuestión de relaciones célula-célula ha sido abordado por el desarrollo de técnicas de cultivo mixto. En este método, dos o más poblaciones de células se cultivan conjuntamente en el mismo recipiente de cultivo. Sin embargo, estos cultivos mixtos tienen inconvenientes importantes. Por un lado, algunos subtipos de células no interactúan físicamente con otros en el tejido de origen y se basan únicamente en las comunicaciones paracrinos sufridas por factores solubles secretadas y los receptores cercanos. Este es el caso para varios procesos inflamatorios que dependen de la señalización de citoquinas proximal. En c mixtaultures, interacciones físicas son inevitables y hacen imposible el estudio de las comunicaciones paracrinos en la ausencia de contactos célula-célula que puede producir resultados alterados. Por otra parte, la consecución de las interpretaciones de células específicas dentro de una población mixta se vuelve inviable sin el uso de técnicas de separación duras que podrían afectar significativamente los resultados.
Para resolver estos problemas importantes, el uso de medios acondicionados se ha desarrollado como una técnica que permite a las culturas compartimentados y el estudio de señalización paracrina. Este método requiere la transferencia del sobrenadante de un tipo de célula, media llamada así acondicionado, a los pocillos que contienen otra población de células. Sin embargo, una desventaja importante es que las moléculas de vida corta no sobreviven el tiempo suficiente en el medio condicionado para ser transferidos a los pocillos de la segunda población de células. Incluso moléculas de larga vida se diluirán en gran medida con el tiempo debido a la difusión. Además, tanto celularpoblaciones sólo participan en la comunicación paracrina unidireccional en lugar de en la comunicación bidireccional activo. Esto conduce a la ausencia de señalización de realimentación que es de vital importancia en la recreación de las relaciones multicelulares precisos tal como existen en vivo.
Como consecuencia de ello y conducido por la necesidad de simular mejor el original en condiciones in vivo en el entorno celular in vitro, varios avances en técnicas de cultivo celular se han alcanzado en los últimos años. Uno de los avances más importantes ha sido el uso de soportes permeables con membranas microporosas para compartimentar cultivos de células, que se utilizan por primera vez por Grobstein en 1953 1. Tales soportes permeables se han adaptado durante los años para dar cabida a numerosos tipos de células y para ser utilizado en varias aplicaciones diferentes. Hoy en día, estos soportes existen insertos como huecos que están diseñados para descansar en los pozos de una placa de cultivo de tejidos de múltiples pocillos o en circuplatos lar. En un sistema de co-cultivo, el inserto contiene un tipo de célula, mientras que el pozo o plato contiene la otra población celular, lo que permite el estudio de la contribución de las dos poblaciones diferentes de células en su entorno humoral (Figura 1). Como resultado, la polaridad celular (basolateral vs secreción apical o recepción de la señal) se conserva, lo que confiere sistemas de inserción de co-cultivo una ventaja importante sobre cultivos mixtos y técnicas de medio acondicionado. Existen varios tipos de materiales de membrana están disponibles, los más comunes son de poliéster (PET), policarbonato (PC) o colágeno recubierto de politetrafluoroetileno (PTFE), y existen en diferentes tamaños de poro que van de 0,4 micras a 12,0 micras. Estas variedades de materiales y tamaños de poro ofrecen un espectro de insertos que ejercen funciones variables relevantes a las propiedades ópticas, espesor de la membrana celular y la adhesión que los hacen práctica a diferentes niveles para los siguientes usos no se limitan a:
-estudiandola diferenciación celular, el desarrollo embrionario, la metástasis tumoral y la reparación de heridas mediante ensayos quimiotácticas a través de membranas permeables;
-Evaluar la penetración del fármaco mediante la evaluación de su transporte a través de monocapas epiteliales o endoteliales cultivadas en soportes permeables, y;
-Realizar de células co-cultivos para analizar las modulaciones de comportamiento de las células inducidas por factores solubles secretadas en ausencia de contacto célula-célula.
El propósito de este artículo es describir las pautas metodológicas generales para cumplir con la tercera función se ha indicado anteriormente, que consiste en evaluar los cambios celulares mediadas por factores solubles secretadas en ausencia de contacto célula-célula utilizando un sistema de inserción de co-cultivo. Varios campos diferentes de investigación hacen uso de los sistemas de inserción de co-cultivo con el fin de responder a las preguntas relacionadas con el efecto de factores solubles secretadas en las poblaciones de células. De hecho, la señalización paracrina que modula el comportamiento celular en varios niveles es pertinente en todos los tejidosy sistemas, lo que hace que los sistemas de co-cultivo de inserción indispensable para garantizar los avances en estos campos. Por el contrario, el uso de insertos puede confirmar que la transducción de señales es por contacto directo célula-célula y no por factores secretados. Uno de los usos más importantes de inserciones en los estudios es la inflamación 2-14, donde se evalúa el efecto de las citoquinas secretadas en varios jugadores celulares de la inmunidad. En particular, el estudio de la inflamación en el sistema nervioso central (SNC) se ha beneficiado enormemente de los estudios de inserción de co-cultivo, que han permitido a definir mejor las funciones paracrinas distintos de neuronas y la microglia en la conducción de la neuroinflamación 15-21. Estos sistemas también se diseñaron para estudiar el potencial anti-inflamatorio de moléculas que se basa en su capacidad para reducir o inhibir la secreción de factores pro-inflamatorias 22-26. Investigaciones relacionadas con el cáncer de 27 a 31, en particular, los mecanismos de la angiogénesis 32-34 y inflammati subyacenteen 35-42 en la tumorigénesis, también se beneficia de los sistemas de inserción de co-cultivo. Por otra parte, los factores solubles son de gran importancia en los procesos que conducen a la diferenciación y varios estudios han utilizado inserciones para responder preguntas en ese campo en particular 43-50. En el SNC, ya que el tejido neural tiene un potencial de renovación muy limitado, el estudio de neurotrophism y neuroprotección es fundamental y ha sido ampliamente asegurada por el uso de células madre en los sistemas de co-cultivo de 51-56. Además, las inserciones también se utilizan en campos tan diversos como la nefrología 57,58, interacciones endoteliales y la angiogénesis 59-62, 63-65 apoptosis de señalización, la inflamación en la obesidad y el síndrome metabólico 22,23,66-67, oído interno de protección de las células ciliadas 68,69, e incluso en la virulencia de hongos 70,71 y 72,73 parasitología.
En este artículo se ofrece pautas metodológicas generales con el fin de establecer un experiment a la vista de la evaluación de los cambios celulares mediadas por factores solubles secretadas utilizando un sistema de inserción de co-cultivo. En particular, nos centraremos nuestra atención en las células nerviosas co-cultivos y sus usos en el estudio de procesos neuroinflammatory. Dado el amplio espectro de los experimentos que se inserta hacer posible proyectos piloto, es insoportable para cubrir todos los aspectos de esta técnica de cultivo celular. A modo de ejemplo, un protocolo específico para medir los efectos de las citoquinas secretadas por lipopolisacárido (LPS), activado microglia N9 en las células PC12 neuronales se detallará, que ofrece una comprensión concreta de la metodología de inserción de co-cultivo.
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Protocol
Nota: Cada uno de los siguientes pasos deben realizarse en condiciones estériles en una campana de flujo laminar como se requiere para el cultivo de células de mamíferos. Además, las directrices generales para el cultivo celular estéril óptima se aplican, por ejemplo., Descartando consejos en cualquier momento que pueden dar lugar a la contaminación cruzada, lo que reduce la cantidad de células momento en que se expone al aire cuando se realizan cambios en los medios enteros, adecuadamente, pero con cuidado sin dejar de remover Las suspensiones de células para asegurar su pipeteo homogénea, etc. Por otra parte, las inserciones son un tipo de material de plástico que requieren un manejo especial. En primer lugar, cada vez que se manipulan inserciones, evite tocar la membrana frágil, que desgarra con facilidad y por lo tanto podría poner en peligro el experimento. Además, no es adecuado para llevar a cabo la aspiración por vacío del medio de cultivo celular, ya que hay un riesgo de perforar la membrana o disociar células adherentes. A continuación, los insertos cuelgan libremente en la placa de cultivo de tejidos de múltiples pocillos y, así, se debe tener precaución cuando moving el material de plástico o al pipetear para evitar disociar células adherentes. Además, al usar insertos con grandes tamaños de poro, hay una posibilidad de que el medio de cultivo celular se filtra a través de la membrana y, por lo tanto, es importante controlar frecuentemente el nivel de líquido. Por último, tenga en cuenta que el siguiente protocolo está diseñado para las células adherentes y no requiere modificaciones menores con el fin de ser adecuado para las células en suspensión.
1. Las pautas generales para la realización de inserción experimentos de co-cultivo
- Siembra tipo de célula # 1 en insertos
- Desenvolver los insertos de sus envases.
- Coloque los insertos en una placa de cultivo de tejidos de múltiples pocillos vacíos de la dimensión adecuada. Para ello, agarre el borde superior de la pieza de inserción con unas pinzas.
- Para mejorar la unión y propagación de las células adherentes, acondicionar los insertos con medio de cultivo celular antes de la siembra. Para ello, cubrir toda la superficie de la membrana con mediu cultivo celularM utilizando una micropipeta.
NOTA: Haga esto por el mayor número de inserciones según sea necesario. - Vuelva a colocar la tapa sobre la placa y se incuba durante al menos 1 hora u O / N en las mismas condiciones (por lo general 37 ° C, 5-10% de CO2).
- Cuando están condicionados los insertos, eliminar todo el medio de cultivo celular utilizando una micropipeta. Descartar el medio utilizado.
- tipo de células semilla # 1 en fresco medio de cultivo celular de la misma manera como en una placa de múltiples pocillos. Para ello, extraer un volumen apropiado de la suspensión celular con una micropipeta y dispensar el líquido en el inserto.
NOTA: Preparar el mayor número de inserciones según sea necesario. - Después de sembrar todas las inserciones, mueva suavemente la placa de la izquierda y la derecha, luego hacia atrás y adelante con el fin de distribuir uniformemente las células. Evitar hacer movimientos circulares, ya que esto hará que las células se acumulan en el centro de los insertos.
- Coloque la tapa en la placa e incubar según lo especificado por según los requisitos celulares (por lo general 37 ° C, 5 a 10% de CO
- Siembra tipo de célula # 2 en placas de cultivo de tejidos de múltiples pocillos
- tipo de célula semilla # 2 en el medio de cultivo de células frescas de acuerdo con la Sección 1.
- Preparar como muchos pozos como se requiere para el número de inserciones. Roca la placa como en el paso 1.1.7) para asegurar que las células se distribuyen uniformemente en los pocillos.
- Coloque la tapa en la placa e incubar en las mismas condiciones (por lo general 37 ° C, 5 a 10% de CO 2).
- refrescante en medio de inserciones
- Usando una micropipeta, retirar parte o todo el medio de cultivo celular, en los insertos que contienen el tipo de célula # 1. Descartar el medio utilizado.
- Dibuje un volumen apropiado de medio de cultivo celular fresco. descansar suavemente la punta en la pared interior del inserto y lentamente dispensar el medio de cultivo celular.
- Coloque la tapa en la placa y se incuba como en la etapa 1.1.4.
- medio refrescante en placas de cultivo de tejidos de múltiples pocillos
- El uso de un MICROPIpette, extraer parte o todo el medio de cultivo celular en los pocillos que contienen el tipo de célula # 2. Descartar el medio utilizado.
- Dibuje un volumen apropiado de medio de cultivo celular fresco. Resto de la punta en la pared interior del pozo y lentamente dispensar el medio de cultivo celular.
- Coloque la tapa en la placa e incubar según los protocolos de cultivo de células previamente establecidos.
- La transferencia de insertos que contienen tipo de célula # 1 a las placas de cultivo de tejidos de múltiples pocillos que contienen el tipo de célula # 2.
NOTA: Realice este paso cuando ambos tipos de células han alcanzado la etapa de crecimiento apropiado.- Antes de transferir los insertos en los pozos, hacer los cambios necesarios medianas, como se ha descrito anteriormente en los pasos 1.3) y 1.4).
NOTA: En este punto, es importante para dispensar los volúmenes apropiados de medios de comunicación en ambos compartimentos como se especifica en las instrucciones del fabricante de inserción. - Con unas pinzas, agarre el borde superior de un inserto que contiene células Type # 1 y suavemente lo coloca en el pocillo apropiado que contiene el tipo de célula # 2.
- Después de transferir todas las inserciones, comprobar la presencia de burbujas de aire debajo de la membrana de las inserciones.
NOTA: Las burbujas de aire previenen cualquier intercambio a través de la membrana de la inserción y pueden poner en peligro todo el experimento. - Si hay burbujas de aire, levante suavemente el inserto del pozo utilizando pinzas y sumergirse de nuevo en el medio de cultivo celular. Las burbujas desaparecerán. Si todavía están presentes, trate con suavidad sumergir insertos de nuevo en el medio de cultivo celular en un ángulo.
NOTA: No golpee o revolver insertos no disociar las células adherentes. - Después de la eliminación de todas las burbujas de aire y comprobar que los volúmenes de los medios de comunicación en ambos compartimentos, coloque la tapa en la placa e incubar.
- Antes de transferir los insertos en los pozos, hacer los cambios necesarios medianas, como se ha descrito anteriormente en los pasos 1.3) y 1.4).
- medios refrescantes en un sistema de co-cultivo
NOTA: A pesar de que la membrana permite fácilmente el intercambio de medios entre el inserto y bien y es descanso del medio se realiza enambos compartimentos desde el tiempo requerido para alcanzar el equilibrio en los compartimentos superior e inferior por difusión por sí solo puede ser bastante largo.- medio refrescante en insertos que contienen el tipo de célula # 1 se realiza de la misma manera que en el paso 1.3).
- Para refrescar en los pozos que contienen el tipo de célula # 2 medianas, deslice suavemente el inserto hacia un lado para crear un espacio lo suficientemente amplia como para dar cabida a una punta de pipeta. Refrescar el medio como en el paso 1.4).
- Verificar la presencia de burbujas de aire y verificar los volúmenes como por pasos 1.5.3) a través 1.5.5).
2. Ejemplo: la medición de los efectos de las citoquinas secretadas por microglia N9 activados por LPS en las células PC12 neuronales
NOTA: Los siguientes pasos están diseñados para matraz específica, bien y platos de distintos tamaños. Sin embargo, el protocolo se puede personalizar para cualquier dimensión plasticware. Para los medios de comunicación y la composición ver Tabla de Materiales.
- Siembra y diferenciación de las células PC12 en múltiplesy placas de cultivo de tejidos
- medio de cultivo celular PC12 rutina de calentamiento, PC12 medio de diferenciación y tripsina-EDTA en un baño de agua a 37 ° C.
- Usar las células PC12 a 60-80% de confluencia de un 75 cm 2 matraz.
- Con un 15 mm pipeta Pasteur, lleve a cabo la aspiración por vacío de la totalidad del medio de cultivo celular en el matraz.
- Enjuague suavemente la monocapa de células con 5 ml de solución salina tamponada con fosfato estéril y eliminar el líquido con una pipeta Pasteur. Tenga cuidado de no disociar las células en este paso.
- Cubrir la monocapa de células con 3 ml de tripsina-EDTA y se incuba durante 2 a 3 min a 37 ° C.
- Asegúrese de que todas las células se separan con un microscopio. Si muy pocas células están flotando, se incuba durante un período más largo para un máximo de 5 minutos.
- Añadir 10 ml de medio de cultivo celular PC12 de rutina con el fin de inactivar la tripsina-EDTA.
- Con una pipeta de 10 ml, se tritura suavemente mientras se asegura de que la mayoría de las células se disocian de la parte inferior of matraz. Evitar la creación de burbujas de aire en la suspensión celular.
- Con la misma pipeta de 10 ml, la transferencia de la suspensión celular en un tubo de centrifugación de 50 ml.
- Centrifugar durante 1 min a 3.200 xg
- Descartar el sobrenadante con una pipeta Pasteur, teniendo cuidado de no perturbar el sedimento.
- Añadir 10 ml de medio de cultivo celular PC12 rutina con una pipeta de 10 ml.
NOTA: Este volumen se puede ajustar si la pastilla es inusualmente grande o pequeña. - Se tritura con la misma pipeta de 10 ml para homogeneizar el sedimento. Las células PC12 a menudo se agrupan por lo que al menos el 20 pipeteando arriba y downare necesario.
NOTA: Mientras trituración vigorosa es necesario, evitar la creación de burbujas de aire en la suspensión celular. - En un tubo de 1,5 ml, preparar una dilución apropiada de la suspensión de células en azul de tripano. Contar las células utilizando un hemocitómetro de acuerdo a protocolos previamente establecidos 74.
- En un tubo separado 50 ml, dividir la suspensión celularcon medio de diferenciación PC12 para obtener una adecuada suspensión celular diluida para la siembra de los pozos de una placa de 24 pocillos (30.000 ¢ / cm 2, 0,6 ml por pocillo de acuerdo con el protocolo del fabricante).
NOTA: La placa de 24 pocillos debe ser recubierto previamente con colágeno tal como se especifica por los protocolos previamente establecidos 75. - Distribuir 0,6 ml de la suspensión celular por pocillo usando una micropipeta.
- Cuando todos los pozos son cabeza de serie, el rock de la placa como en el paso 1.1.7).
- Para permitir la adecuada diferenciación de las células PC12, incubar las placas de 24 pocillos durante 7-9 días a 37 ° C en una atmósfera húmeda al 5% de CO 2 en la PC12 medio de diferenciación 15,16 antes de realizar experimentos de co-cultivo.
- Realizar cambios de medio cada dos días mediante la eliminación de la mitad del líquido y su sustitución por un volumen igual de medio de diferenciación PC12 fresco.
- Siembra microglia N9 en los insertos y el tratamiento con LPS
- Un día antes de realizar los experimentos de co-cultivo, pre-tratamiento de PTFE de 0,4 micras de poro insertos con medio de cultivo celular N9 rutina para optimizar la adherencia de las células, siguiendo los pasos 1.1.1) a través de 1.1.4)
- medio caliente rutina N9 cultivo celular y la tripsina-EDTA en un baño de agua a 37 ° C.
- Mientras tanto, un peso aproximado de 10 mg de LPS en un tubo de 1.5 ml para su uso posterior.
NOTA: Dado que la endotoxina LPS es un pro-inflamatoria potente y exigen especiales precauciones de seguridad, gafas, guantes y un respirador de partículas se recomienda encarecidamente. - Utilice células N9 a 80-90% de confluencia de un 75 cm 2 matraz.
- Siga los pasos 2.1.3) a 2.1.14). Siempre use medio de cultivo celular N9 rutina en lugar de medio de cultivo celular PC12 de rutina. También tenga en cuenta que la microglia N9 no se aglutinan tanto como lo hacen las células PC12, por lo menos la pipeta hacia arriba y hacia abajo pueden ser necesarios en el paso 2.1.13).
- En un tubo separado 50 ml, dividir la suspensión de células con medio de cultivo celular N9 a obtain una suspensión celular diluida adecuada para la siembra de insertos diseñados para sostener en placas de 24 pocillos (60.000 ¢ / cm 2, 0,05 ml por inserción de acuerdo con el protocolo del fabricante, para el área de superficie de la membrana ver información del fabricante).
NOTA: Estos insertos ya están recubiertas con colágeno por el fabricante y están optimizados para la adhesión celular. - Distribuir 0,05 ml de la suspensión celular por inserción utilizando una micropipeta.
- Cuando todas las inserciones son cabeza de serie, el rock de la placa como en el paso 1.1.7).
- Realizar diluciones en serie de LPS utilizando medio de tratamiento N9 para obtener 4 g / ml, 2 mg / ml y las soluciones de trabajo 1 g / ml.
- Pipetear 0,05 ml de la solución de 4 mg / ml de trabajo en un conjunto de insertos a fin de producir una dilución final de 2 mg / ml.
- Repita el paso 2.2.10) para las otras dos soluciones de trabajo en diferentes conjuntos de inserciones, produciendo una dilución final de 1 mg / ml y 0,5 mg / ml, respectivamente.
- EnCubate las placas que contienen los insertos de 24 horas a 37 ° C en una atmósfera húmeda de CO 2 al 5% para permitir la activación de microglia N9 con LPS antes de realizar los experimentos de co-cultivo.
- Co-cultivo de células PC12 neuronales con microglia N9
- En 7-9 días de diferenciación de las células PC12, activar la microglia N9 después de 24 horas de incubación con LPS por medio de tratamiento caliente N9 y medio de tratamiento PC12 en un baño de agua a 37 ° C.
- Realizar un cambio de medio total de la microglia N9 como en el paso 1.3), la sustitución de todo el medio utilizado por 0,1 ml de medio de tratamiento N9. Haga esto para cada insert.This es necesario eliminar todos los rastros de LPS, dejando solamente la microglia N9 activados en los insertos.
- Realizar un cambio de medio total de células PC12 neuronales como en el paso 1.4). La transferencia de las inserciones en las placas de 24 pocillos como en el paso 1.5) .Incubate los N9-PC12 co-cultivos durante 24 horas o de 48 horas a 37 ° C en una atmósfera de CO2 al 5% húmedo.
- después de 24hr o 48 hr, recoger el sobrenadante y / o las células de la citotoxicidad, ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA), Western blot, u otros ensayos.
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Representative Results
El uso de sistemas de co-cultivo de inserción es particularmente pertinente en el estudio de los procesos neuroinflammatory que muestran las relaciones entre los diferentes actores paracrinos celulares del sistema nervioso central. Inmunidad en el SNC se logra principalmente por células residentes microgliales, que supervisan su entorno en su estado de reposo ramificada (Figura 2A) y son capaces de alteraciones de percepción que pudiera molestar al homeostasis muy valiosa necesaria para la función neuronal adecuada 76-78. La activación microglial, que se caracteriza por la adopción de una forma ameboide (Figura 2B) y la multiplicación de la población de células denomina microgliosis (Figura 3), seguido de la liberación de mediadores pro-inflamatorios, como las citocinas, constituye el aspecto principal de la neuroinflamación 79 . La liberación de citoquinas sirve el noble propósito de proteger a las neuronas contra los ataques dañinos y es closEly monitoreado. Sin embargo, cuando la neuroinflamación escapa este control estricto, adopta una naturaleza destructiva y puede lesionar seriamente la CNS. En la medida en tejidos neurales tienen un potencial de renovación muy limitado, el SNC es tanto más susceptibles a tales respuestas inflamatorias auto-destructiva. El estudio de la diafonía, que existe entre las neuronas y la microglia es imprescindible en la elucidación de los mecanismos subyacentes de la neuroinflamación. A diferencia de cultivos mixtos, sistemas de inserción de co-cultivo permiten al investigador a identificar qué población celular está generando los efectos tóxicos y cuál está siendo afectada.
A continuación, las células PC12 diferenciadas durante 7-9 días con factor de crecimiento nervioso fueron co-cultivadas con microglia N9 activados con LPS con el objetivo de quantifyingthe efectos nocivos de los factores solubles derivados de la inflamación en las neuronas. Para ello, las células neuronales PC12 se cultivaron en placas de 24 pocillos, mientras que la microglia N9 se sembraron en insertos. microgli N9un fueron tratados durante 24 horas con LPS, una endotoxina pro-inflamatorio muy potente comprendido en las membranas externas de bacterias gram-negativas. LPS es conocida por activar Toll-like receptor 4 provocando así una respuesta inflamatoria fuerte en una amplia variedad de células efectoras inmunes, incluyendo la línea celular murina inmortalizado N9 microglia 80,81. Los siguientes resultados representativos mostrar que microglia N9 activados con LPS tienen una tendencia a aumentar su población (Figura 3) y para secretar citoquinas pro-inflamatorias solubles, tales como interleucina-6 (IL-6), interferón gamma (IFN-γ) y factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α), que atraviesa fácilmente la membrana de los insertos de co-cultivo y causar daños citotóxicos para las células PC12 neuronales creciente en el compartimiento inferior.
La principal preocupación antes de transferir la microglia N9 LPS-activado a los pocillos que contienen las células PC12 neuronales consiste en confirmar that el PC12 se diferenció adecuadamente. Las células PC12 diferenciadas de siete días deben exhibir fenotipos neuronales obvios tales como un cuerpo celular más plana, que se proyecta varias veces neuritas largas mismos que muestran las varices (Figura 4). Una vez que se realiza este punto de control, inserciones microglia N9 que contienen medio fresco carente de LPS pueden ser transferidos a los pocillos que contienen PC12 diferenciadas. Después de un período de incubación de 24 hr o 48 h, el sobrenadante en el compartimiento inferior se cosecha y un ensayo de citotoxicidad, en base a la liberación de lactato deshidrogenasa 15,16, así como un ELISA 15, para medir las citocinas se realizan. Es importante para cosechar el sobrenadante en el compartimiento inferior con el fin de medir las citocinas que de hecho han cruzado la membrana permeable y que puede activar los receptores en la superficie de las células PC12. Los resultados demuestran que activadas con LPS microglia N9 desde el compartimiento superior generan una cyt la dosis y dependiente del tiempootoxic efecto sobre las células neuronales PC12 diferenciadas establecidas en el compartimiento inferior (Figura 5). La condición / ml LPS 0,5 mg sin embargo no es significativamente citotóxico a 24 hr o 48 h. Se encontraron niveles de citotoxicidad para llegar a casi el 100% en la condición hr 2 mg / ml de LPS 48. Además, los resultados muestran que la concentración de citocinas pro-inflamatorias IL-6, IFN-gamma y TNF-a en el sobrenadante aumenta simultáneamente con la citotoxicidad observada. Específicamente, IL-6 concentraciones aumentan significativamente después de 24 hr para la afección para 2 mg / ml, mientras que 1 g / ml de LPS también rendimientos aumentado de manera importante los niveles de la citoquina después de 48 hr (Figura 6). La microglía secretan IFN-γ que alcanza el compartimiento inferior de una manera significativamente mayor cuando son tratados con 1 mg / ml y 2 mg / ml, y se incuban con las células PC12 neuronales diferenciadas para cualquiera de 24 hr o 48 hr (Figura 7). El 0,5 mg / mlcondición LPS, una vez más no aumenta los niveles de IFN-gamma significativamente. Por último, las concentraciones de TNF-a en el compartimiento inferior se cuantificaron por ELISA y se han encontrado para ser el más aumentada por LPS activación de la microglia, llegando a niveles casi siete veces más importante que la condición de control (Figura 8). En particular, ambos períodos de 24 hr y 48 hr de incubación causaron aumentos importantes en los niveles de TNF-α en el sobrenadante. Sin embargo, la condición de LPS 1 mg / ml produjo un aumento significativo de los niveles de TNF-α sólo después de 48 h. En su conjunto, estos resultados muestran que las citoquinas pro-inflamatorias secretadas son al menos en parte responsable de los efectos citotóxicos observados en las células PC12 neuronales diferenciadas después de un período de incubación de 24 hr o 48 hr con microglia activadas por diferentes concentraciones de LPS.
Inserte los sistemas de co-cultivo de células de microglia y PC12 N9 activados con LPS se ha demostrado,ser particularmente útil en el estudio de la neuroinflamación y en la elaboración de estrategias para contrarrestarla. Nuestro grupo demostró recientemente que activada con LPS microglia N9 crecido en cultivo celular inserta exhiben aumento de la transcripción de citocinas pro-inflamatorias, que a su vez inducen la apoptosis de las células PC12 diferenciadas factor de crecimiento nervioso mediante el cruce de los microporos de la pieza de inserción 15, 16. En el mismo paradigma, el tratamiento previo de la población microglial con el resveratrol compuesto polifenólico (0,1 M, 3 hr) impidió la transcripción de citoquinas pro-inflamatorias y apoptosis por lo tanto impedido de células PC12 neuronales diferenciadas mediante el bloqueo de la caspasa-3 de activación y, a partir de entonces , la división del ADN. Otro grupo también ha demostrado los efectos neuroprotectores de la vitamina E en una N9-PC12 co-cultivo 26. Además de N9-PC12 co-cultivos, diferentes líneas de células inmortalizadas o cultivos primarios también se han empleado en un contexto de la neuroinflamación. Por ejemplo, ellínea celular BV2 microglía murina fue co-cultivadas con células SH-SY5Y de neuroblastoma humano para mostrar el efecto anti-apoptótica de la luteolina polifenólico aparentemente mediado por su potencial antiinflamatorio 17. Además, se mostró que la microglía BV2 activadas por las células PC12 lesionados para ejercer efectos anti-apoptóticos en células madre mesenquimales 18. La señalización recíproca ha demostrado ser importante en los mecanismos anti-apoptóticos subyacente neuroprotección primaria microglia conferidas a las neuronas granulares de cerebelo primarias 19. Además, las neuronas del hipocampo primarias fueron co-cultivadas con microglia primaria activada por la proteína precursora de amiloide secretada con el fin de evaluar la liberación de glutamato por intercambio de cisteína y la posterior debilitamiento de la función sináptica 20. Por último, un grupo también mostró la diafonía que existe entre las neuronas del hipocampo primaria y microglia primaria pertenecientes a fractalquina señalización, una quimiocina expres constitutivamentesed por las neuronas en el SNC cuyo receptor se encuentra en la superficie de la microglía 21.
Figura 1. Representación esquemática de un sistema de inserción de co-cultivo. El compartimento superior se compone de la pieza de inserción que tiene un tipo de célula y de su entorno humoral apical. El compartimiento inferior consta de un pozo o un plato que contiene el segundo tipo de célula. El inserto se apoya sobre los bordes de la placa de cultivo de tejidos de múltiples pocillos o plato. El inserto está diseñado para estar justo encima de la parte inferior del pozo a fin de no tocar la población de células que crecen por debajo. El medio en el compartimiento inferior está en contacto tanto con la superficie basal del primer tipo de célula y la superficie apical del segundo tipo celular. Por favor, haga clic aquí para conocer el vers más grandesión de esta figura.
Figura 2. Las microfotografías de microglia N9. (A) no tratadas en reposo microglia N9 en inserciones presentan una morfología celular ramificada que les permite controlar de forma activa su entorno. (B) microglia N9 en insertos tratados con lipopolisacárido (LPS) durante 24 hr pantalla una forma ameboide típico del fenotipo activado. Esta microfotografía fue tomada justo antes de transferir el inserto que contiene estas microglia N9 activados a los pocillos que contienen las células PC12 diferenciadas como se ilustra en la Figura 4. La barra de escala = 25 micras. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Las microfotografías de células neuronales PC12 diferenciadas. Diferenciado factor de siete días de crecimiento nervioso células PC12 neuronales muestran fenotipos neuronales obvios como neuritas largas y varices. Esta microfotografía fue tomada justo antes de transferir los insertos que contienen microglia N9 activados como se muestra en la Figura 2. La barra de escala = 25 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5. Efecto citotóxico de lipopolisacárido (LPS), activado microglia en las células PC12 neuronales diferenciadas.microglia N9 se activaron con diferentes concentraciones de LPS durante 24 h, después se transfirieron a pocillos que contienen células PC12 neuronales diferenciadas para 24 hr o 48 hr. La citotoxicidad se evaluó utilizando un ensayo de liberación de lactato deshidrogenasa realizado en el sobrenadante del compartimiento inferior. Las diferencias significativas entre los grupos se determinó por análisis de una vía de la varianza, seguido por el análisis de Tukey post-hoc con el programa GraphPad INSTAT, versión 3.06 para Windows (San Diego, CA; www.graphpad.com). Todos los datos, analizados en el intervalo de confianza del 95%, se expresan como media ± error estándar de la media de 3 experimentos independientes en los que se consideraron 6 pozos. Los asteriscos indican diferencias estadísticas entre la condición de tratamiento y control (*** p <0,001). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6. La concentración de i nterleukin-6 (IL-6) en el sobrenadante después de la activación N9 por lipopolisacárido (LPS). Microglia N9 se activaron con diferentes concentraciones de LPS durante 24 h, y luego se transfiere a los pocillos que contienen las células PC12 neuronales diferenciadas para 24 horas o 48 horas. IL-6 concentraciones en el sobrenadante del compartimiento inferior se evaluaron utilizando un ELISA. Las diferencias significativas entre los grupos se determinó por análisis de una vía de la varianza, seguido por el análisis de Tukey post-hoc con el programa GraphPad INSTAT, versión 3.06 para Windows (San Diego, CA; www.graphpad.com). Todos los datos, analizados en el intervalo de confianza del 95%, se expresan como media ± error estándar de la media de 3 experimentos independientes en los que se consideraron 6 pozos. Los asteriscos indican diferencias estadísticamente significativas entre el tratamiento y en contracondición de control (*** p <0,001, ** p <0,01 y * p <0,05). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7. La concentración de interferón gamma (IFN-γ) en el sobrenadante después de la activación N9 por lipopolisacárido (LPS). Microglia N9 se activaron con diferentes concentraciones de LPS durante 24 h, y luego se transfiere a los pocillos que contienen las células PC12 neuronales diferenciadas por 24 hr o 48 hr. las concentraciones de IFN-gamma en el sobrenadante del compartimiento inferior se evaluaron utilizando un ELISA. diferencias significativas entre los grupos se determinaron mediante análisis unidireccional de la varianza, seguido de análisis post-hoc de Tukey con el programa GraphPad INSTAT, versión 3.06para Windows (San Diego, CA; www.graphpad.com). Todos los datos, analizados en el intervalo de confianza del 95%, se expresan como media ± error estándar de la media de 3 experimentos independientes en los que se consideraron 6 pozos. Los asteriscos indican diferencias estadísticas entre la condición de tratamiento y control (** p <0,01 y * p <0,05). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 8. La concentración de factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) en el sobrenadante después de la activación N9 por lipopolisacárido (LPS). Microglia N9 se activaron con diferentes concentraciones de LPS durante 24 h, y luego se transfiere a los pocillos que contienen las células PC12 neuronales diferenciadas para 24 horas o 48 horas. TNF-αconcentraciones en el sobrenadante del compartimiento inferior se evaluaron utilizando un ELISA. Las diferencias significativas entre los grupos se determinó por análisis de una vía de la varianza, seguido por el análisis de Tukey post-hoc con el programa GraphPad INSTAT, versión 3.06 para Windows (San Diego, CA; www.graphpad.com). Todos los datos, analizados en el intervalo de confianza del 95%, se expresan como media ± error estándar de la media de 3 experimentos independientes en los que se consideraron 6 pozos. Los asteriscos indican diferencias estadísticas entre la condición de tratamiento y control (*** p <0,001). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El paso más crítico de cualquier sistema de inserción experimento de co-cultivo realidad habita en la elección de la inserción correcta de usar. El tamaño de poro y material de la membrana se deben tener en cuenta a fondo, sin olvidar a considerar el tipo de células que se sembraron y el propósito del experimento. Por ejemplo, los ensayos de quimiotácticas pueden utilizar el mismo tipo de membrana de células que co-cultivos para analizar las modulaciones de comportamiento de las células inducidas por factores solubles secretadas en ausencia de contacto célula-célula. Sin embargo, ambos tipos de experimentos requieren diferentes tamaños de poro: los más grandes para el primero, para permitir la migración celular, y las más pequeñas de estos últimos, para impedir la migración celular y el contacto célula-célula. Para la evaluación de los cambios celulares mediadas por factores solubles secretadas en ausencia de contacto célula-célula, tamaños de poro de 0,4 micras o 3 micras son generalmente apropiado, ya que permiten para las moléculas grandes, como las proteínas, para cruzar pero prevenir la mayoría de las células de hacer asi que. Membranamaterial depende en gran medida del tipo de células y las técnicas para ser utilizado al final del protocolo de cultivo de células. Brevemente, las membranas de PET ofrecen una buena visibilidad de células, ya que son claras, pero no están recubiertos de colágeno, que puede ser un problema para las células adherentes que necesita el soporte a tratar. También tienen la mejor resistencia química a los fijadores que, junto a sus buenas propiedades ópticas, los hace ideales para estudios histológicos. Por otra parte, las membranas PC ofrecen visibilidad celular pobre, ya que son translúcidos y no están recubiertas de colágeno. Sin embargo, poseen la mayor densidad de poros y la disponibilidad más diversificada de tamaños de poro. Por último, las membranas de PTFE son claras cuando está mojado, pero sólo permite la visualización de las células se describen en el microscopio. Como una gran ventaja, que están recubiertos de colágeno, que también hace un poco más gruesa. Es importante señalar que el revestimiento de PET o de membrana PC insertos con el colágeno puede obstruir los poros e impedir el paso de facto solublers. En cualquier caso, la mayoría de los fabricantes de inserción ofrecen guías completas para ayudar a los investigadores en la selección de la inserción correcta. En nuestro paradigma específico, las opciones de densidad de placas, medios de comunicación, la concentración sérica, días de diferenciación, días de la activación por LPS, las concentraciones de LPS, y revestimiento de frascos de células PC12 se han optimizado durante años de trabajo con estos sistemas de co-cultivo 15 , 16. Digno de mención, la densidad de placas de microglia N9 en los insertos se eligió a 60.000 ¢ / cm 2 con el fin de obtener 40 a 50% de confluencia en el momento de comenzar el co-cultivo y, por lo tanto, para darles el espacio para multiplicar a su activación por LPS. Otras condiciones optimizadas cuando también pueden dar resultados satisfactorios, tales como la sustitución de colágeno por L-lisina en los frascos destinados al mantenimiento PC12 nativo.
Con el fin de aumentar la sostenibilidad de los resultados, varios controles diferentes pueden llevar a cabo. Al tratar de demostrar que los factores solublesson responsables de los efectos observados, cultivos mixtos que manifiestan el contacto directo célula-célula y el medio condicionado experimentos deben llevarse a cabo en paralelo. Además, haciendo uso de los anticuerpos para neutralizar un factor secretado específica ayudará en la identificación de la molécula responsable del efecto paracrino que se percibe. Cuando sea posible, bloquear un receptor o una parte de su vía de señalización para identificar la identidad exacta del receptor se activa. Si se utiliza una molécula para activar una población de células antes del experimento de co-cultivo con un segundo tipo de célula, tal como en el ejemplo descrito anteriormente, es importante tomar en consideración la presencia de la molécula en el sistema. Como primera opción, el medio debe ser cambiado por completo antes del experimento de co-cultivo con el fin de garantizar que la molécula está ausente del sistema completo. Como segunda opción, una condición se debe añadir en el que se incuba la molécula solo con el segundo tipo de célula con el fin deevaluar su efecto en la ausencia de la primera tipo de célula. Si no hay ningún efecto de la molécula en el segundo tipo de célula, no habrá necesidad de cambiar el medio antes del experimento de co-cultivo. Del mismo modo, si ambos tipos de células no se cultivan en el mismo medio de cultivo celular, precauciones similares deben tomar medidas para asegurarse de que las diferencias en la composición del medio no afectan a una o la otra población de células. Aunque ambos medios serán separados por la membrana de inserción en primera, la difusión está obligado a garantizar que van a mezclar durante periodos de incubación más largos. Por otra parte, varios problemas pueden surgir de interrupción aberrante de relaciones factor de receptor soluble. Entre varias causas de error, el uso excesivo de la disociación enzimática y la presencia de importantes concentraciones de suero pueden interferir con los receptores de la superficie celular. Otras causas de error en los sistemas de inserción de co-cultivo incluyen, pero no se limitan a 1) las técnicas de cultivo de células inadecuadas, tales como la eliminación de la totalidad de la célulamedio de cultivo en muchos pozos, al mismo tiempo que las células que se seque, 2) una monocapa que está demasiado confluente en el inserto, responsable de sellado de la membrana de inserción y la prevención de moléculas secretadas apicalmente-para alcanzar el compartimento inferior, y 3) desajustado la confluencia celular, lo que provoca una expresión excesiva o insuficiente de factores solubles que conducen a resultados fisiológicamente irrelevantes o ausencia de cualquier efecto.
Mientras que sólo uno de los escenarios de inserción de co-cultivo se presenta aquí, hay muchas maneras de hacer uso de esta técnica muy versátil. Aquí, un tipo de células se pre-trata con una molécula responsable de la inducción de la secreción de un factor soluble que, tras la transferencia de la pieza de inserción a la fuente, afecta el comportamiento de la segunda tipo de célula. También es posible incubar ambos tipos de células juntos en un sistema de co-cultivo antes de la separación de ellos para detectar la mayor vulnerabilidad o resistencia de las poblaciones de una o ambas de células a un tratamiento ulterior. HoWever, al considerar su forma más rudimentaria, esta técnica puede hacer uso de dos poblaciones de células incubadas juntos sin ningún tipo de tratamiento, con el objetivo de evaluar la señalización paracrina recíproco basal.
La limitación más importante de esta técnica es que las entidades moleculares de muy corta vida, tales como especies reactivas de oxígeno no sobreviven la distancia que separa la población de células en crecimiento en el compartimiento superior y el que en el compartimiento inferior 82. El último avance en las técnicas de co-cultivo ha intentado dar respuesta a este problema mediante el uso de un sustrato de cultivo microfabricado capaz de mantener dos poblaciones de células en las proximidades microescala 83. Además de con todas las ventajas de los sistemas de inserción de co-cultivo, tales como la detección de la población específica de cambios y de señalización bidireccional, esta pantalla microfabricado se demostró también para hacer posible la detección de interacciones de corto alcance que no han sido antes detectable debido a la descomposición de factores solubles en distancias. Esta plataforma cultivo celular es la última innovación en la celda de co-cultivo y se compromete a ayudar a desentrañar los mecanismos entre las células que fueron pasados por alto antes de señalizar.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI-1640 medium | Sigma | R8755 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham | Sigma | D6421 | Warm in 37 °C water bath before use, must be supplemented with 0.365 gm/L L-glutamine |
| Horse serum | ATCC | 30-2040 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Fetal bovine serum | MultiCell | 80350 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Nerve Growth Factor-7S from murine submaxillary gland | Sigma | N0513 | Reconstitute the lyophilized powder in a solution of buffered saline or tissue culture medium containing 0.1–1.0% bovine serum albumin or 1-10% serum |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma | T3924 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli 055:B5 | Sigma | L2880 | Toxic |
| Cell culture inserts for use with 24-well plates | BD Falcon | 353095 | 0.4 μm pores |
| 24-well plates | TrueLine | TR5002 | Coat with collagen before use |
| Routine PC12 cell culture medium | Routine N9 cell culture medium | ||
| - 85% RPMI medium | - 90% DMEM-F12 medium | ||
| - 10% heat-inactivated horse serum | - 10% heat-inactivated horse serum | ||
| - 5% heat-inactivated fetal bovine serum | |||
| PC12 differentiation medium | N9 treatment medium | ||
| - 99% RPMI medium | - 99% DMEM-F12 medium | ||
| - 1% heat-inactivated fetal bovine serum | - 1% heat-inactivated fetal bovine serum | ||
| - 50 ng/mL nerve growth factor | |||
| PC12 treatment medium | |||
| - 99% RPMI medium | |||
| - 1% heat-inactivated fetal bovine serum |
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