Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Ontwikkeling van een Insert Co-cultuur systeem van twee mobiele soorten in de afwezigheid van cel-cel Contact

Published: July 17, 2016 doi: 10.3791/54356
Automatic Translation
1, 1
1Dept. of Medical Biology, University of Québec

Introduction

Het onderzoek van weefsels, organen of systemen in vitro is een poging om de complexe relaties die bestaan ​​tussen de verschillende cellulaire subtypen die meercellige organismen omvatten vereenvoudigen. Inderdaad, in vitro studies maken het mogelijk een gedetailleerd inzicht cel populaties te verkrijgen. Er zijn twee belangrijke voordelen van het uitvoeren van in vitro experimenten: 1) verminderde cellulaire interacties, en 2) het vermogen om eenvoudig te manipuleren cellulaire omgeving. Vandaar dat deze twee voordelen toegestaan ​​wetenschappers om het gedrag van specifieke celtypen in vivo te voorspellen, waardoor het vermogen om resultaten van extrinsieke invloeden gehele organismen te reguleren. In die zin, in vitro celkweek werkt vaak als een brug tussen fundamenteel en toegepast life sciences. Toch zijn er ook een aantal nadelen van het werken in vitro, het belangrijkste is dat een bepaalde reservering kan wonen in de fysiologischeal relevantie van de waargenomen fenotypes. Inderdaad, als een enkel type cel wordt gekweekt in een vat, de cultuur verliest, een verschillende mate, de cel-cel verbindingen met andere celtypen, zijn bijdrage aan de humorale milieu uit het weefsel en het organisme van herkomst, en de ankers binnen het weefsel dat het nodig om een ​​bepaalde driedimensionale structuur soms cruciaal voor celfunctie te handhaven.

De kwestie van cel-cel verhoudingen is aangepakt door de ontwikkeling van gemengde kweektechnieken. In deze werkwijze worden twee of meer celpopulaties vergroeid in dezelfde kweekvat. Echter, deze gemengde culturen dragen belangrijk ongemakken. Aan de ene kant, sommige cel subtypes niet fysiek met elkaar in het weefsel van herkomst en alleen vertrouwen op paracriene communicatie ondersteund door afgescheiden oplosbare factoren en de nabijgelegen receptoren. Dit geldt voor verschillende inflammatoire processen die afhankelijk proximale cytokine signaling. In gemengde cultures, fysische interacties onvermijdelijk en het onmogelijk maken om paracriene communicatie in de afwezigheid van cel-cel contacten die veranderde resultaten kan opleveren bestuderen. Anderzijds, bereiken celspecifieke interpretaties binnen een gemengde populatie wordt haalbaar zonder het gebruik van agressieve scheidingstechnieken die significante resultaten kunnen beïnvloeden.

Om deze belangrijke kwesties op te lossen is het gebruik van geconditioneerde media ontwikkeld als een techniek waardoor gecompartimenteerd culturen en de studie van paracrienen. Deze methode vereist de overdracht van het supernatant van een celtype, waardoor een genoemde geconditioneerd medium aan putjes met een celpopulatie. Nog een belangrijk nadeel is dat kortstondige moleculen niet lang genoeg overleven in het geconditioneerde medium worden overgebracht naar de putjes van de tweede populatie cellen. Zelfs langlevende moleculen zal sterk worden verdund na verloop van tijd als gevolg van diffusie. Voorts beide cellijnenpopulaties alleen deelnemen aan één richting paracriene communicatie in plaats van in actieve bi-directionele communicatie. Dit leidt tot het ontbreken van feedback signalering die essentieel herscheppen nauwkeurig meercellige verhoudingen zoals deze in vivo.

Bijgevolg en gedreven door de behoefte aan een betere simulatie van de oorspronkelijke in vivo omstandigheden in de in vitro cellulaire omgeving zijn verschillende ontwikkelingen in celkweek technieken resultaten van het jaar. Eén van de belangrijkste verbeteringen is het gebruik van doorlaatbare dragers met microporeuze membranen voor compartimentering celculturen voor het eerst Grobstein is in 1953 1. Dergelijke doorlaatbare dragers zijn afgestemd op de jaren vele celtypen te vangen en te gebruiken in verschillende toepassingen. Tegenwoordig zijn deze dragers bestaan ​​als holle inzetstukken die zijn ontworpen in putten uit te rusten van een multiwell weefselkweek plaat of in circuLAR gerechten. In een co-kweeksysteem, het inzetstuk bevat één celtype dat de put of schaal bevat andere celpopulatie, waardoor de bijdrage van twee verschillende populaties van cellen te bestuderen hun humorale milieu (figuur 1). Hierdoor wordt cellulaire polariteit (basolaterale vs apicale uitscheiding of signaalontvangst) bewaard, en daarmee in insert co-kweeksystemen een belangrijk voordeel ten opzichte van gemengde kweken en geconditioneerd medium technieken. Verschillende soorten membraanmaterialen zijn, de meest voorkomende zijn polyester (PET), polycarbonaat (PC) of met collageen beklede polytetrafluorethyleen (PTFE), en deze in verscheidene poriëngrootte variërend van 0,4 urn tot 12,0 urn. Deze soorten materialen en poriegroottes bieden een spectrum inzetstukken uitoefenen variabele kenmerken aan optische eigenschappen, membraandikte en celhechting die hen praktisch gedifferentieerd naar de volgende te vormen van gebruik niet beperkt tot:
-Studieceldifferentiatie, embryonale ontwikkeling, tumor metastase en wondheling door chemotaxische testen door middel doorlaatbare membranen;
-Evaluatie drug penetratie door de beoordeling van hun transport door epitheliale of endotheliale monolagen gekweekt op doorlatende steunen, en;
-performing cel co-culturen celgedrag modulaties geïnduceerd door oplosbare factoren uitgescheiden bij afwezigheid van cel-cel contact te analyseren.

Het doel van dit artikel is het algemene methodologische richtlijnen beschrijven de derde functie hierboven vermeld, dat wil cellulaire veranderingen gemedieerd door oplosbare factoren uitgescheiden bij afwezigheid van cel-cel contact met een insert co-kweeksysteem evalueren vervullen. Er zijn verschillende gebieden van het onderzoek gebruik maken van insert co-cultuur systemen om vragen aan het effect van de afgescheiden oplosbare factoren op populaties van cellen relevant te beantwoorden. Inderdaad, paracrienen die celgedrag moduleert op verschillende niveaus relevant is in alle weefselsen systemen, die insert co-cultuur systemen maakt onmisbaar voor de vooruitgang op deze gebieden te waarborgen. Omgekeerd, het gebruik van inzetstukken die signaaltransductie bevestigen is door direct contact cel-cel en niet van uitgescheiden factoren. Een van de belangrijkste toepassingen van inserts in ontsteking 2-14 studies waarbij het ​​effect van uitgescheiden cytokinen wordt geëvalueerd in verschillende cellulaire spelers van immuniteit. In het bijzonder is de studie van een ontsteking in het centrale zenuwstelsel (CNS) sterk profiteerde van insert co-cultuur studies, die hebben toegestaan ​​om beter te definiëren de verschillende paracriene rollen van neuronen en de microglia in het besturen neuroinflammatie 15-21. Deze systemen werden ontwikkeld om de anti-inflammatoire potentieel van moleculen die is gebaseerd op hun vermogen te verminderen of remmen de secretie van pro-inflammatoire factoren 22-26 bestuderen. Onderzoek met betrekking tot kanker 27-31, in het bijzonder de mechanismen die ten grondslag liggen aan angiogenese 32-34 en inflammatiop 35-42 in het ontstaan ​​van tumoren, profiteert ook van insert co-cultuur systemen. Bovendien zijn oplosbare factoren zijn van groot belang in de processen die rijden differentiatie en verschillende studies hebben inserts gebruikt om te vragen op dat gebied 43-50 te beantwoorden. In het CZS, aangezien neuraal weefsel heeft een zeer beperkte vernieuwend vermogen, de studie van neurotrophism en neuroprotectie is fundamenteel en is algemeen gewaarborgd door het gebruik van stamcellen in co-kweeksystemen 51-56. Daarnaast worden inserts ook gebruikt in diverse gebieden als nefrologie 57,58, endotheliale interacties en 59-62 angiogenese, apoptose signalering 63-65, ontsteking in obesitas en metabool syndroom 22,23,66-67, binnenoor beschermen haarcellen 68,69, en zelfs in schimmels virulentie 70,71 en parasitologie 72,73.

Dit artikel biedt algemene methodologische richtlijnen met het oog op het opzetten van een experiment gezien evalueren cellulaire veranderingen gemedieerd door oplosbare factoren afgescheiden middels een insert co-kweeksysteem. In het bijzonder zullen we onze aandacht richten op zenuwcel co-culturen en hun toepassingen in het bestuderen van neuro-inflammatoire proces. Gezien de zeer grote spectrum van experimenten die inserts mogelijk maken om piloot, het is ondraaglijk om elk aspect van deze celkweek techniek te dekken. Als voorbeeld, een specifiek protocol voor het meten van de effecten van cytokinen uitgescheiden door lipopolysaccharide (LPS) N9 geactiveerde microglia op neuronale PC12 cellen worden gedetailleerd, met een concreet inzicht insert co-kweek methode.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

NB: Elk van de volgende stappen worden uitgevoerd onder steriele omstandigheden in een laminaire stroming kap zoals vereist voor zoogdierlijke celkweek. Daarnaast is de algemene richtlijnen voor een optimale steriele cel teelt toe te passen, bv., Weggooien tips elk moment dat ze kunnen leiden tot kruisbesmetting, het verminderen van de hoeveelheid tijd die cellen worden blootgesteld aan de lucht bij het ​​uitvoeren van complete media verandert, behoren maar voorzichtig al roerend celsuspensies om hun homogene pipetteren, etc. zorgen voor Bovendien, inserts zijn een soort plasticware die een speciale behandeling nodig hebben. Ten eerste, wanneer inserts worden gemanipuleerd, vermijd contact met de kwetsbare membraan, die gemakkelijk scheuren en kon daarom het experiment in gevaar brengen. Ook is het niet geschikt vacuümaspiratie van het celkweekmedium te voeren, aangezien het risico van het membraan perforeren of dissociëren hechtende cellen. Vervolgens inserts hangen los in de multiwell weefselkweekplaat en derhalve is voorzichtigheid geboden wanneer moVing de plasticware of wanneer pipetteren om te voorkomen dat dissociatie hechtende cellen. Bovendien, bij gebruik wisselplaten met grote poriën, is er een mogelijkheid dat het celkweekmedium sijpelt door het membraan en derhalve is het belangrijk om regelmatig te controleren het vloeistofniveau. Merk tenslotte op dat het volgende protocol is ontworpen voor hechtende cellen en vereist kleine wijzigingen om geschikt voor suspensie cellen.

1. Algemene richtlijnen voor het uitvoeren van insert co-cultuur experimenten

  1. Seeding celtype # 1 in inserts
    1. Haal de inzetstukken uit de verpakking.
    2. Plaats de inzetstukken in een lege multi- weefselkweek plaat van de juiste dimensie. Om dit te doen, greep de bovenste rand van het inzetstuk met een pincet.
    3. Om de hechting te verbeteren en verspreiden van hechtende cellen, de conditie van de inzetstukken met celkweekmedium voorafgaand aan het zaaien. Hiervoor bedekken het gehele oppervlak van het membraan met celkweek mediuben met behulp van een micropipet.
      LET OP: Doe dit voor zo veel inserts als nodig is.
    4. Plaats de deksel op de plaat en incubeer gedurende ten minste 1 uur of O / N onder dezelfde omstandigheden (gewoonlijk 37 ° C, 5-10% CO 2).
    5. Wanneer de inserts worden geconditioneerd, verwijder alle van de celkweek medium met behulp van een micropipet. Gooi het gebruikte medium.
    6. Zaad celtype # 1 in vers celcultuurmedium op dezelfde wijze als in een plaat met meerdere putjes. Om dit te doen, trek een geschikt volume van de celsuspensie met een micropipet en afzien van de vloeistof in de insert.
      OPMERKING: Bereid zoveel inserts als nodig is.
    7. Na zaaien alle inserts, schud de plaat naar links en rechts en heen en weer om de cellen gelijkmatig te verdelen. Vermijd cirkelvormige bewegingen, aangezien hierdoor de cellen te accumuleren in het midden van de inzetstukken.
    8. Plaats de deksel op de plaat en incubeer zoals door volgens cellulaire eisen (meestal 37 ° C, 5-10% CO
  2. Seeding celtype # 2 in meerdere putjes weefselkweekplaten
    1. Seed celtype # 2 in vers celcultuurmedium volgens punt 1.
    2. Bereid zoveel putten als nodig is voor het aantal inserties. Schommel de plaat als in stap 1.1.7), zodat de cellen gelijkmatig verdeeld in de putjes.
    3. Plaats de deksel op de plaat en incubeer onder dezelfde omstandigheden (gewoonlijk 37 ° C, 5-10% CO 2).
  3. Verfrissende medium in inserts
    1. Met behulp van een micropipet verwijderd geheel of gedeeltelijk het celkweekmedium in de inzetstukken met celtype # 1. Gooi het gebruikte medium.
    2. Teken een geschikt volume van verse celkweekmedium. Prettig zitten de punt op de binnenwand van het inzetstuk en langzaam bereid het celkweekmedium.
    3. Plaats de deksel op de plaat en incubeer volgens stap 1.1.4.
  4. Verfrissende medium in meerdere putjes weefselkweekplaten
    1. Met een micropiPette, verwijdert een deel of alles van het celkweekmedium in de putjes die celtype # 2. Gooi het gebruikte medium.
    2. Teken een geschikt volume van verse celkweekmedium. Rust de punt op de binnenwand van de put en langzaam bereid het celkweekmedium.
    3. Plaats de deksel op de plaat en incubeer volgens vooraf vastgestelde celkweek protocollen.
  5. Overbrengen inserts met celtype # 1 tot multiwell weefselkweek platen met celtype # 2.
    OPMERKING: Voer deze stap als beide celtypen de juiste groeifase hebben bereikt.
    1. Voorafgaand aan de overdracht van de inserts in putten, alle noodzakelijke mediumveranderingen, zoals eerder in stap 1,3) en 1,4 beschreven).
      OPMERKING: Op dit punt is het belangrijk om de juiste hoeveelheden media afgeven in beide compartimenten zoals vermeld in de instructies van de fabrikant invoegen.
    2. Met behulp van een pincet, pak de bovenste rand van een insert met mobiele tYpe # 1 en voorzichtig plaats deze in de juiste putje met celtype # 2.
    3. Na de overdracht van alle inserts, controleren op de aanwezigheid van luchtbellen onder het membraan van inserts.
      LET OP: Luchtbellen voorkomen elke uitwisseling over het membraan van het inzetstuk en kan het gehele experiment in gevaar brengen.
    4. Als er luchtbellen aanwezig zijn, heel voorzichtig til de insert uit de put met een pincet en duik terug in de cel kweekmedium. De bellen verdwijnen. Als ze zijn nog steeds aanwezig, probeer voorzichtig dompelen inserts terug in de cel kweekmedium in een hoek.
      LET OP: Wees niet kloppen of roer inserts om te voorkomen dat dissociatie hechtende cellen.
    5. Na het verwijderen van alle luchtbellen en controleren of de volumes van de media in beide compartimenten, leg het deksel op de plaat en incubeer.
  6. Verfrissende media in een co-kweeksysteem
    LET OP: Hoewel het membraan gemakkelijk maakt media uitwisselingen tussen insert en goed, het verversen van het medium is gedaan inbeide compartimenten sinds de tijd nodig om evenwicht in de bovenste en onderste compartimenten alleen bereikt door diffusie vrij lang.
    1. Verfrissende medium in inserts met celtype # 1 geschiedt op dezelfde wijze als in stap 1,3).
    2. Tot middelgroot putjes die celtype # 2 vernieuwen, schuif de insert naar de zijkant om een ​​ruimte breed genoeg om een ​​pipet tip tegemoet te creëren. Vernieuw de medium zoals in stap 1.4).
    3. Controleer op de aanwezigheid van luchtbellen en controleer de volumes als per stappen 1.5.3) tot en met 1.5.5).

2. Voorbeeld: het meten van de effecten van cytokinen uitgescheiden door LPS-geactiveerde microglia N9 op neuronale PC12 cellen

OPMERKING: De volgende stappen zijn bedoeld voor specifieke fles, goed en gerecht maten. Toch kan het protocol worden aangepast voor elke plasticware dimensies. Voor media en samenstelling zie Tabel Materials.

  1. Zaaien en differentiërende PC12 cellen in multiputjes weefselkweekplaten
    1. Warm routine PC12 celkweekmedium, PC12 differentiatie medium en trypsine-EDTA in een 37 ° C waterbad.
    2. Gebruik PC12 cellen bij 60-80% confluentie van een 75 cm2 kolf.
    3. Met een 15 mm Pasteur pipet, voert vacuümaspiratie van de gehele cel kweekmedium in de kolf.
    4. Voorzichtig spoelen cel monolaag met 5 ml steriel fosfaatgebufferde zoutoplossing en verwijder de vloeistof met een Pasteur pipet. Zorg dat er geen cellen distantiëren bij deze stap.
    5. Bedek de cel monolaag met 3 ml trypsine-EDTA en incubeer gedurende 2-3 minuten bij 37 ° C.
    6. Zorg ervoor dat alle cellen worden losgemaakt onder een microscoop. Als zeer weinig cellen zweven, incubeer gedurende een langere periode van maximaal 5 minuten.
    7. Voeg 10 ml routine PC12 celkweekmedium om de trypsine-EDTA inactiveren.
    8. Met een 10 ml pipet voorzichtig vermaal terwijl ervoor te zorgen dat de meeste cellen worden losgemaakt van de bodem of de kolf. Voorkomen dat luchtbellen in de celsuspensie.
    9. Met dezelfde 10 ml pipet de celsuspensie in een 50 ml centrifugebuis.
    10. Centrifugeer 1 min bij 3200 xg
    11. Verwijder het supernatant met een pasteurpipet en dat daarbij de pellet te verstoren.
    12. Voeg 10 ml van routine PC12 celkweekmedium met een 10 ml pipet.
      LET OP: Dit volume kan worden aangepast als de pellet is ongewoon klein of groot.
    13. Vermaal met dezelfde 10 ml pipet om de pellet gehomogeniseerd. PC12 cellen vaak samenklonteren, zodat ten minste 20 pipetteren en noodzakelijk downare.
      LET OP: Terwijl krachtig vermalende nodig is, voorkomen dat luchtbellen in de celsuspensie.
    14. In een 1,5 ml tube, voor te bereiden een geschikte verdunning van de celsuspensie in trypan blauw. Tel de cellen met een hemocytometer volgens vooraf vastgestelde protocollen 74.
    15. In een afzonderlijke 50 ml buis, splitsing van de celsuspensiemet PC12 differentiatie medium om een verdunde celsuspensie geschikt te krijgen voor het zaaien van putten van een 24-well plaat (30.000 ¢ / cm 2, 0,6 ml per putje volgens het protocol van de fabrikant).
      OPMERKING: De 24-well plaat moet vooraf worden bekleed met collageen zoals door vooraf vastgestelde protocollen 75.
    16. Verdeel 0,6 ml van de celsuspensie per putje met behulp van een micropipet.
    17. Als alle putten worden uitgezet, rock de plaat als in stap 1.1.7).
    18. Om de juiste differentiatie van PC12 cellen, incubeer de 24-well platen gedurende 7-9 dagen bij 37 ° C in een 5% CO 2 vochtige atmosfeer in PC12 differentiatiemedium 15,16 voordat co-kweek-experimenten.
    19. Voeren veranderingen van medium elke andere dag door het verwijderen van de helft van de vloeistof en vervangen door een gelijk volume verse PC12-differentiatie medium.
  2. Zaaien N9 microglia in de inserts en behandelen met LPS
    1. Een dag voor het uitvoeren van de co-cultuur experimenten, pre-behandeling PTFE 0,4 urn poriën inzetstukken met routine N9 celkweekmedium om celhechting te optimaliseren volgende stappen 1.1.1) tot 1.1.4)
    2. Warm routine N9 celcultuurmedium en trypsine-EDTA in een 37 ° C waterbad.
    3. Ondertussen, weegt ongeveer 10 mg LPS in een 1,5 ml buis voor later gebruik.
      LET OP: Aangezien LPS is een krachtige pro-inflammatoire endotoxine en vereist bijzondere veiligheidsmaatregelen, bril, handschoenen en een stofmasker wordt sterk aanbevolen.
    4. Gebruik N9 cellen bij 80-90% confluentie van een 75 cm2 kolf.
    5. Volg de stappen 2.1.3) tot 2.1.14). Gebruik altijd routine N9 celkweekmedium in plaats van routine PC12 celkweekmedium. Merk ook op dat N9 microglia niet bij elkaar zo veel als PC12-cellen op te knappen klonteren, waardoor minder pipetteren en neer kan nodig bij stap 2.1.13 zijn).
    6. In een afzonderlijke 50 ml tube, splitsing van de celsuspensie met N9 celkweekmedium te obtain een verdunde celsuspensie geschikt zaaien inserts ontworpen te houden in 24-well platen (60.000 ¢ / cm 2, 0,05 ml per inzetstuk volgens het protocol van de fabrikant, voor membraanoppervlak zie informatie van de producent).
      Opmerking: Deze inserts worden reeds bekleed met collageen door de fabrikant en zijn geoptimaliseerd voor celadhesie.
    7. Verdeel 0,05 ml van de celsuspensie per insert met een micropipet.
    8. Als alle inserts worden uitgezet, rock de plaat als in stap 1.1.7).
    9. Voer seriële verdunningen van LPS via N9 behandelingsmedium tot 4 ug / ml, 2 ug / ml en 1 ug / ml werkoplossingen verkrijgen.
    10. Pipetteer 0,05 ml 4 ug / ml werkoplossing in een de set inzetstukken om een ​​eindverdunning van 2 ug / ml werd verkregen.
    11. Herhaal stap 2.2.10) voor de andere twee werkoplossingen in verschillende sets inserts, waardoor uiteindelijke verdunningen van 1 ug / ml respectievelijk 0,5 ug / ml.
    12. Incubate de platen die de inzetstukken voor 24 uur bij 37 ° C in een 5% CO 2 vochtige atmosfeer N9 microglia activering met LPS mogelijk voordat de co-kweek-experimenten.
  3. Co-kweken van neuronale PC12 cellen met N9 microglia
    1. Bij 7-9 dagen differentiëren PC12 cellen, activeert de N9 microglia na 24 uur van incubatie met LPS door warme N9 behandeling medium en PC12 behandeling medium in een 37 ° C waterbad.
    2. Voer een totale verandering medium voor N9 microglia zoals in stap 1.3), ter vervanging van het gehele gebruikte medium met 0,1 ml van de N9 behandeling medium. Doe dit voor elke insert.This is noodzakelijk om alle sporen van LPS te verwijderen, waardoor alleen geactiveerd N9 microglia in de inzetstukken.
    3. Voer een totaal mediumverversing voor neuronale PC12 cellen als in stap 1,4). Breng de inserts in de 24-well platen als in stap 1,5) .Incubate de N9-PC12 co-kweken gedurende 24 uur of 48 uur bij 37 ° C in een 5% CO 2 vochtige atmosfeer.
    4. na 24uur of 48 uur, verzamel de supernatant en / of cellen voor cytotoxiciteit, enzymgekoppelde immunosorbent assay (ELISA), Western blot of andere assays.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Het gebruik van co-insert kweeksystemen een bijzonder belang in de studie van neuro-inflammatoire processen die paracriene relatie tussen verschillende cellulaire spelers van het CZS demonstreren. Immuniteit in het CZS wordt voornamelijk bereikt door resident microglia cellen genaamd hun omgeving in hun vertakte rustende toestand (figuur 2A) volgen en kunnen sensing verstoringen die kunnen problemen de kostbare homeostase vlot te neuronale functie 76-78. Microgliale activering, gekenmerkt door de toepassing van een amoeboid vorm (figuur 2B) en de vermenigvuldiging van de celpopulatie genoemd microgliosis (figuur 3), gevolgd door het vrijkomen van pro-inflammatoire mediatoren, zoals cytokinen, vormt het belangrijkste aspect van neuroinflammatie 79 . Cytokine release dient de nobele doel van het beschermen van neuronen tegen schadelijke aanvallen en is closely gecontroleerd. Echter, wanneer neuroinflammatie ontsnapt aan dit strakke controle, hij neemt een destructieve aard en kunnen ernstig verwonden het CNS. Aangezien neurale weefsels een zeer beperkte vernieuwend vermogen, het CZS alle gevoeliger voor dergelijke auto-destructieve ontstekingsreacties. Het bestuderen van de overspraak, die bestaat tussen neuronen en de microglia is absoluut noodzakelijk in het ophelderen van de onderliggende mechanismen van neuroinflammatie. In tegenstelling tot gemengde kweken, insert co-kweeksystemen kan de onderzoeker bepalen welke celpopulatie opwekt toxische effecten en welke wordt beïnvloed.

Hier, PC12 cellen gedifferentieerd gedurende 7-9 dagen met zenuwgroeifactor werden samen gekweekt met LPS geactiveerde microglia N9 met als doel quantifyingthe schadelijke effecten van inflammatie afgeleide oplosbare factoren neuronen. Hiertoe werden neuronale PC12-cellen gekweekt in 24-wells platen terwijl N9 microglia in inserties werden gezaaid. N9 microglieen behandeld werden gedurende 24 uur met LPS, een zeer krachtige pro-inflammatoire endotoxine omvat in de buitenmembraan van Gram-negatieve bacteriën. LPS is bekend toll-like receptor 4 dus een robuust ontstekingsreactie in diverse immune effectorcellen, waaronder de geïmmortaliseerde cellijn van muis N9 microglia 80,81 opwekken activeren. De volgende representatieve resultaten tonen dat N9 microglia geactiveerd met LPS hebben de neiging om hun populatie (Figuur 3) te verhogen en oplosbare pro-inflammatoire cytokines, zoals interleukine-6 ​​(IL-6), interferon gamma (IFN-γ) en scheiden tumornecrosefactor-alfa (TNF-α), die gemakkelijk het membraan van de co-cultuur inserts overschrijden en veroorzaken cytotoxische schade aan neuronale PC12-cellen groeien in het onderste compartiment.

De belangrijkste zorg Alvorens de LPS-geactiveerde microglia N9 aan de putjes die neuronale PC12-cellen bestaat uit het bevestigen that de PC12 goed gedifferentieerd. Zevendaagse gedifferentieerde PC12 cellen zou duidelijk neuronale fenotypen vertonen zoals een vlakkere cellichaam, waar een aantal lange neurieten soms zelf tonen varicosities (figuur 4) uitsteekt. Zodra dit ijkpunt wordt uitgevoerd, kan N9 microglia inserts met vers medium zonder LPS worden overgebracht naar de putjes die gedifferentieerde PC12. Na een incubatieperiode van 24 uur of 48 uur, de bovenstaande vloeistof in het onderste compartiment wordt geoogst en cytotoxiciteit assay op basis van lactaat dehydrogenase 15,16 afgifte, alsook een ELISA 15 om cytokines te meten worden uitgevoerd. Het is belangrijk om de bovenstaande vloeistof in het onderste compartiment oogsten om de cytokinen die inderdaad de permeabele membraan hebben overschreden en dat kan activeren receptoren op het oppervlak van PC12-cellen te meten. Resultaten tonen dat LPS-geactiveerde microglia N9 uit het bovenste compartiment genereren dosis- en tijdsafhankelijke cytotoxic effect op neuronale gedifferentieerde PC12-cellen in het onderste compartiment (Figuur 5). De 0,5 ug / ml LPS voorwaarde is echter niet significant cytotoxisch bij 24 h of 48 h. Cytotoxiciteit bleken bijna 100% in de 2 ug / ml LPS 48 uur staat. Bovendien, laten zien dat de concentratie van pro-inflammatoire cytokines IL-6, IFN-γ en TNF-α in het supernatant stijgt gelijktijdig met waargenomen cytotoxiciteit. Specifiek worden IL-6 concentraties significant verhoogd na 24 uur alleen voor de 2 ug / ml conditie, terwijl 1 ug / ml LPS levert ook significant verhoogde niveaus van het cytokine na 48 uur (Figuur 6). Microglia scheiden IFN-γ dat het onderste compartiment een significant verhoogd wijze bereikt wanneer zij worden behandeld met 1 ug / ml en 2 ug / ml en geïncubeerd met gedifferentieerde neuronale PC12 cellen ofwel 24 uur of 48 uur (Figuur 7). De 0,5 ug / mlLPS staat wederom niet significant toeneemt IFN-γ levels. Tenslotte TNF-α concentraties in het onderste compartiment werden gekwantificeerd door ELISA en bleken te zijn de meest uitgebreid met LPS activering van microglia bereikte niveaus bijna zeven maal belangrijker dan de controlegroep (figuur 8). Met name zowel 24 uur en 48 uur incubatie perioden veroorzaakt belangrijke toename in TNF-α niveaus in het supernatant. De 1 ug / ml LPS staat leverde een significante toename van TNF-α niveaus na 48 uur. Als geheel, deze resultaten dat uitgescheiden cytokines ten minste gedeeltelijk verantwoordelijk voor de cytotoxische effecten waargenomen in neuronale gedifferentieerde PC12-cellen na een 24 uur of 48 uur incubatieperiode met microglia geactiveerd door verschillende concentraties LPS.

Plaats co-kweeksystemen LPS-geactiveerde microglia N9 en PC12 cellen is aangetoondzijn bijzonder nuttig in de studie van neuroinflammation en bij de uitwerking van strategieën om het tegen te gaan. Onze fractie onlangs aangetoond dat LPS-geactiveerde microglia N9 gekweekt in celkweek inserts vertonen verhoogde transcriptie van cytokines, waardoor apoptose van zenuwgroei-factor gedifferentieerde PC12-cellen induceren door het kruisen van de microporiën van het inzetstuk 15, 16. In dezelfde paradigma voorbehandeling van de microgliale bevolking met het polyfenol resveratrol (0,1 uM, 3 uur) verhinderde de transcriptie van cytokines en daardoor belemmerd apoptose van gedifferentieerde neuronale PC12 cellen door het blokkeren van caspase-3 activatie en daarna , DNA-splitsing. Een andere groep heeft ook aangetoond dat de neuroprotectieve effecten van vitamine E in een N9-PC12 co-cultuur 26. Naast N9-PC12 co-culturen zijn verschillende geïmmortaliseerde cellijnen of primaire culturen ook gebruikt in een context van inflammatoire processen. Bijvoorbeeld, demuizen microglia BV2 cellijn samen gekweekt met humaan neuroblastoma SH-SY5Y cellen aan het anti-apoptotische effect van de polyfenolische luteoline blijkbaar gemedieerd door zijn anti-inflammatoire potentieel 17 tonen. Als goed, BV2 microglia geactiveerd door gewonde PC12-cellen werd aangetoond dat anti-apoptotische effecten in mesenchymale stamcellen 18 uit te oefenen. Wederzijdse signalering aangetoond belangrijk in de anti-apoptotische mechanismen onderliggende primaire microglia neuroprotectie bij primaire cerebellaire granule neuronen 19 toegekend worden. Bovendien primaire hippocampale neuronen werden samen gekweekt met primaire microglia geactiveerd uitgescheiden amyloïd precursor eiwit om de afgifte van glutamaat evalueren cysteïne uitwisseling en de daaropvolgende verzwakking van synaptische functie 20. Tot slot, de ene groep bleek ook dat de overspraak die bestaat tussen de primaire hippocampus neuronen en primaire microglia met betrekking tot fractalkine signalering, een chemokine constitutief expressed van neuronen in het CNS waarvan receptor wordt gevonden op het oppervlak van microglia 21.

Figuur 1
Figuur 1. Schematische weergave van een inzetstuk co-kweeksysteem. Het bovenste compartiment bestaat uit de insertie die men celtype en de apicale humorale omgeving houdt. Het onderste compartiment bestaat uit een goed of een schotel met het tweede type cel. Het inzetstuk steunt op de randen van de multi- weefselkweekplaat of schaal. Het inzetstuk is bedoeld om te liggen boven de bodem van de put zodat niet op de populatie van cellen onder groeien raken. Het medium in het onderste compartiment in contact met zowel het basale oppervlak van het eerste celtype en het apicale oppervlak van het tweede celtype. Klik hier om een grotere vers bekijkenion van dit cijfer.

Figuur 2
Figuur 2. microfoto van N9 microglia. (A) Onbehandelde rust N9 microglia in inserts vertonen een wijdvertakt cellulaire morfologie zodat ze actief te monitoren hun omgeving. (B) N9 microglia inzetstukken behandeld met lipopolysaccharide (LPS) voor 24 uur weergave een amoeboid vorm kenmerkend de geactiveerde fenotype. Deze microfoto werd genomen vlak vóór de overbrenging van de insert die deze geactiveerd N9 microglia aan de putjes die gedifferentieerde PC12-cellen, zoals weergegeven in figuur 4. Schaal bar = 25 pm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3. N9 microglia celdichtheid na behandeling met lipopolysaccharide (LPS). Behandelt N9 microglia met verschillende concentraties LPS gedurende verschillende tijdspannen werd bepaald door schatting van het aantal cellen met een hemocytometer 69. Significante verschillen tussen groepen werden vastgesteld door one-way analyse van variantie gevolgd door Tukey's post-hoc analyse met GraphPad Instat programma, versie 3.06 voor Windows (San Diego, CA; www.graphpad.com). Alle gegevens geanalyseerd op het 95% betrouwbaarheidsinterval worden uitgedrukt als gemiddelden ± standaardfout van het gemiddelde van 3 onafhankelijke experimenten waarbij 10 putjes werden beschouwd. Sterretjes geven statistische verschillen tussen de behandeling en controle conditie (** p <0,01). Klik hier om een larg bekijkenER versie van deze figuur.

figuur 4
Figuur 4. microfoto van gedifferentieerde neuronale PC12 cellen. Zeven dagen zenuwgroeifactor-gedifferentieerde neuronale PC12 cellen vertonen duidelijke neurale fenotypes zoals lange neurieten en varicosities. Deze microfoto werd genomen vlak vóór de overdracht van de inserts met geactiveerde N9 microglia zoals afgebeeld in figuur 2. Schaal bar = 25 pm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 5
Figuur 5. Cytotoxische werking van lipopolysaccharide (LPS) geactiveerde microglia op neuronale gedifferentieerde PC12-cellen.N9 microglia werden geactiveerd met verschillende concentraties LPS gedurende 24 uur, vervolgens overgebracht naar putjes met neuronale gedifferentieerde PC12 cellen gedurende 24 uur of 48 uur. Cytotoxiciteit werd geëvalueerd onder toepassing van een lactaatdehydrogenase afgifte assay uitgevoerd op het supernatant van het onderste compartiment. Significante verschillen tussen groepen werden vastgesteld door one-way analyse van variantie gevolgd door Tukey's post-hoc analyse met GraphPad Instat programma, versie 3.06 voor Windows (San Diego, CA; www.graphpad.com). Alle gegevens geanalyseerd op het 95% betrouwbaarheidsinterval worden uitgedrukt als gemiddelden ± standaardfout van het gemiddelde van 3 onafhankelijke experimenten waarbij 6 putjes werden beschouwd. Sterretjes geven statistische verschillen tussen de behandeling en controle conditie (*** p <0,001). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.


Figuur 6. Concentratie van i nterleukin-6 (IL-6) in de supernatant na N9 activering door lipopolysaccharide (LPS). N9 microglia werden geactiveerd met verschillende concentraties LPS gedurende 24 uur en vervolgens overgebracht naar putjes met neuronale gedifferentieerde PC12 cellen 24 uur of 48 uur. IL-6 concentraties in de bovenstaande vloeistof van het onderste compartiment werden bepaald met een ELISA. Significante verschillen tussen groepen werden vastgesteld door one-way analyse van variantie gevolgd door Tukey's post-hoc analyse met GraphPad Instat programma, versie 3.06 voor Windows (San Diego, CA; www.graphpad.com). Alle gegevens geanalyseerd op het 95% betrouwbaarheidsinterval worden uitgedrukt als gemiddelden ± standaardfout van het gemiddelde van 3 onafhankelijke experimenten waarbij 6 putjes werden beschouwd. Sterretjes geven statistische verschillen tussen de behandeling en control voorwaarde (*** p <0,001, ** p <0,01 en * p <0,05). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 7
Figuur 7. Concentratie van interferon gamma (IFN-γ) in de supernatant na N9 activering door lipopolysaccharide (LPS). N9 microglia werden geactiveerd met verschillende concentraties LPS gedurende 24 uur en vervolgens overgebracht naar putjes met neuronale gedifferentieerde PC12 cellen gedurende 24 uur of 48 uur. IFN-γ-concentraties in de bovenstaande vloeistof van het onderste compartiment werden bepaald met een ELISA. Significante verschillen tussen groepen werden vastgesteld door one-way analyse van variantie gevolgd door Tukey's post-hoc analyse met GraphPad Instat programma, versie 3.06voor Windows (San Diego, CA; www.graphpad.com). Alle gegevens geanalyseerd op het 95% betrouwbaarheidsinterval worden uitgedrukt als gemiddelden ± standaardfout van het gemiddelde van 3 onafhankelijke experimenten waarbij 6 putjes werden beschouwd. Sterretjes geven statistische verschillen tussen de behandeling en controle conditie (** p <0,01 en * p <0,05). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 8
Figuur 8. Concentratie van tumornecrosefactor alfa (TNF-α) in de supernatant na N9 activering door lipopolysaccharide (LPS). N9 microglia werden geactiveerd met verschillende concentraties LPS gedurende 24 uur en vervolgens overgebracht naar putjes met neuronale gedifferentieerde PC12 cellen 24 h of 48 h. TNF-αconcentratie in het supernatant van het onderste compartiment werden bepaald met een ELISA. Significante verschillen tussen groepen werden vastgesteld door one-way analyse van variantie gevolgd door Tukey's post-hoc analyse met GraphPad Instat programma, versie 3.06 voor Windows (San Diego, CA; www.graphpad.com). Alle gegevens geanalyseerd op het 95% betrouwbaarheidsinterval worden uitgedrukt als gemiddelden ± standaardfout van het gemiddelde van 3 onafhankelijke experimenten waarbij 6 putjes werden beschouwd. Sterretjes geven statistische verschillen tussen de behandeling en controle conditie (*** p <0,001). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De meest kritische stap van een insert co-kweeksysteem experiment eigenlijk woont in het kiezen van de juiste insert te gebruiken. Poriegrootte en membraanmateriaal moet rekening gehouden worden grondig, zonder te vergeten het type cellen die worden gezaaid en het doel van het experiment onderzocht. Bijvoorbeeld kan chemotaxische assays hetzelfde type membraan gebruikt dan cel co-culturen celgedrag modulaties geïnduceerd door oplosbare factoren uitgescheiden bij afwezigheid van cel-cel contact te analyseren. Echter, beide soorten experimenten vereisen verschillende poriegroottes: grotere voor de voormalige, naar cel migratie mogelijk te maken, en de kleinere voor het laatste, naar cel migratie en cel-cel-contact in de weg. Voor de evaluatie van cellulaire veranderingen gemedieerd door uitgescheiden oplosbare factoren bij afwezigheid van cel-cel contact, poriegrootten van 0,4 urn tot 3 urn zijn gewoonlijk geschikt zijn als ze zorgen voor grote moleculen, zoals eiwitten, oversteken maar voorkomen dat de meeste cellen van het doen zo. Membraanmaterialen grotendeels afhankelijk van het celtype en de technieken worden gebruikt aan het einde van de celkweek protocol. Kort samengevat, PET membranen bieden goede mobiele zichtbaarheid zij duidelijk maar niet collageen bekleed, die een probleem voor hechtende cellen die nodig zijn voor de drager te behandelen kunnen zijn. Ze hebben ook de beste chemische bestendigheid tegen fixatieven die, naast hun goede optische eigenschappen, maakt ze ideaal voor histologisch onderzoek. Anderzijds, PC membranen bieden slechte mobiele zichtbaarheid ze doorschijnend zijn en niet collageen bekleed. Echter, ze hebben de hoogste dichtheid van de poriën en de meest gevarieerde beschikbaarheid van poriegroottes. Tot slot, PTFE membranen zijn duidelijk als het nat is, maar staan ​​alleen visualisatie van de cel schetst in de microscoop. Als groot voordeel, ze collageen beklede, waardoor zij ook een beetje dikker. Het is belangrijk op te merken dat het bekleden PET- of PC membraan inzetstukken met collageen de poriën blokkeren en belemmeren de doorgang van oplosbare factors. In elk geval meeste insert fabrikanten bieden uitgebreide handleidingen onderzoekers helpen bij het selecteren van de juiste insert. In onze specifieke paradigma, hebben de keuzes van plating dichtheid, media, serum concentratie, dagen van differentiatie, dagen van LPS activering, concentraties van LPS, en coating van de kolven voor de PC12 cellen geoptimaliseerd over jaren van het werken met deze co-cultuur systemen 15 , 16. Opmerkelijk, de plaatdichtheid van N9 microglia in de inserties werd gekozen 60.000 ¢ / cm 2 om 40-50% confluentie te verkrijgen op het moment van aanvang van de co-cultuur, dus ze speelt vermenigvuldigen op hun activering te door LPS. Andere voorwaarden wanneer geoptimaliseerd kan ook bevredigende resultaten, zoals het vervangen van collageen door L-lysine in de kolven die bestemd zijn voor inheemse PC12 onderhoud opleveren.

Om de duurzaamheid van de resultaten te verhogen, kan verschillende controles worden uitgevoerd. Wanneer het proberen te bewijzen dat oplosbare factorenverantwoordelijk zijn voor de waargenomen effecten, gemengde culturen manifesteert direct contact cel-cel geconditioneerd medium experimenten worden uitgevoerd in parallel. Bovendien, gebruikmakend van antilichamen te neutraliseren een specifieke afgegeven factor helpt bij het identificeren van het molecuul verantwoordelijk is voor het paracriene effect dat wordt waargenomen. Indien mogelijk, blokkeert een receptor of een gedeelte van de signaalroute te lokaliseren de juiste identiteit van de receptor wordt geactiveerd. Indien een molecule wordt gebruikt om één celpopulatie voorafgaand aan de co-kweek experiment met een tweede celtype, zoals in het hiervoor beschreven voorbeeld activeren, is het belangrijk om rekening te houden met de aanwezigheid van het molecuul in het systeem. Als eerste optie moet het medium volledig gewijzigd voordat de co-kweek experiment om te verzekeren dat het molecuul niet aanwezig is in het systeem geheel. Als tweede mogelijkheid, moet een voorwaarde worden toegevoegd wanneer de molecule alleen wordt geïncubeerd met het tweede celtype teneindebeoordeelt het effect bij afwezigheid van het eerste celtype. Indien er geen effect van het molecuul op de tweede celtype, zal er geen noodzaak om het medium te wijzigen voordat de co-kweek experiment. Evenzo, als beide celtypen niet worden geteeld in dezelfde cel kweekmedium soortgelijke voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen om ervoor te zorgen dat de verschillen in samenstelling van het medium hebben geen invloed op een of andere celpopulatie. Hoewel beide media eerst worden gescheiden door het inzetstuk membraan diffusie gebonden zodat ze zullen mengen langere incubatieperioden. Bovendien kunnen verschillende problemen ontstaan ​​door abnormale onderbreking van de oplosbare factor-receptor relaties. Onder de verschillende oorzaken van fouten, kan het overmatig gebruik van enzymatische dissociatie en de aanwezigheid van belangrijke concentraties van serum interfereren met celoppervlak receptoren. Andere fouten van de insert co-kweek omvatten, maar zijn niet beperkt tot 1) onjuiste celkweek technieken, zoals het verwijderen van het geheel van de celkweekmedium teveel putjes tegelijk waardoor cellen te drogen, 2) een monolaag die ook wordt confluent in het inzetstuk, die de sluiting van de insert membraan en voorkomen apicaal-uitgescheiden moleculen aan het onderste compartiment te bereiken, en 3) niet goed afgesteld celconfluentie, die een over- of onder-expressie van oplosbare factoren die fysiologisch irrelevante resultaten of afwezigheid van enig effect veroorzaakt.

Terwijl slechts één scenario insert co-kweek hier gepresenteerd, er talloze manieren om van deze zeer veelzijdige techniek maken. Hier één celtype werd voorbehandeld met een molecule verantwoordelijk voor het induceren van de uitscheiding van een oplosbare factor die, na overdracht van het inzetstuk naar de bron, verandert het gedrag van de tweede celtype. Het is ook mogelijk beide celtypen samen incuberen in een co-kweeksysteem voor hen scheidt de verhoogde kwetsbaarheid of weerstand van één of beide celpopulaties detecteren een latere behandeling. However bij het onderzoek zijn meest rudimentaire vorm, kan deze techniek gebruik van twee populaties cellen samen geïncubeerd zonder enige behandeling te maken, met als doel basale paracriene wederzijdse signalering beoordelen.

De belangrijkste beperking van deze techniek is dat een zeer korte levensduur moleculaire entiteiten, zoals reactieve zuurstofsoorten niet de afstand die de celpopulatie groeien in het bovenste compartiment en die in het onderste compartiment 82 scheidt overleven. De laatste ontwikkeling in co-kweek technieken heeft getracht dit probleem beantwoordt via een microfabricated kweeksubstraat kunnen twee celpopulaties in microschaal omgeving 83 houden. Zal behalve alle voordelen van insertie co-kweeksystemen, zoals populatie-specifieke detectie van veranderingen en bidirectionele signalering, was dit microfabricated scherm ook aangetoond dat de detectie van korte-afstand interacties die voorheen niet mogelijk waren detectable gevolg van het verval van oplosbare factoren over afstanden. Deze celcultuur platform is de nieuwste innovatie in cel co-cultuur en belooft te helpen ontrafelen signalering mechanismen tussen cellen die voor het hoofd werden gezien.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI-1640 medium Sigma R8755 Warm in 37 °C water bath before use
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham Sigma D6421 Warm in 37 °C water bath before use, must be supplemented with 0.365 gm/L L-glutamine
Horse serum ATCC 30-2040 Warm in 37 °C water bath before use
Fetal bovine serum MultiCell 80350 Warm in 37 °C water bath before use
Nerve Growth Factor-7S from murine submaxillary gland Sigma N0513 Reconstitute the lyophilized powder in a solution of buffered saline or tissue culture medium containing 0.1–1.0% bovine serum albumin or 1-10% serum
Trypsin-EDTA solution Sigma T3924 Warm in 37 °C water bath before use
Lipopolysaccharides from Escherichia coli 055:B5 Sigma L2880 Toxic
Cell culture inserts for use with 24-well plates BD Falcon 353095 0.4 μm pores
24-well plates TrueLine TR5002 Coat with collagen before use
Routine PC12 cell culture medium Routine N9 cell culture medium
-       85% RPMI medium -       90% DMEM-F12 medium
-       10% heat-inactivated horse serum -       10% heat-inactivated horse serum
-       5% heat-inactivated fetal bovine serum
PC12 differentiation medium N9 treatment medium
-        99% RPMI medium -       99% DMEM-F12 medium
-        1% heat-inactivated fetal bovine serum -       1% heat-inactivated fetal bovine serum
-        50 ng/mL nerve growth factor
PC12 treatment medium
-        99% RPMI medium
-        1% heat-inactivated fetal bovine serum

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Grobstein, C. Morphogenetic interaction between embryonic mouse tissues separated by a membrane filter. Nature. 172 (4384), 869-870 (1953).
  2. Hoffman, R. A. Intraepithelial lymphocytes coinduce nitric oxide synthase in intestinalepithelial cells. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 278 (6), G886-G894 (2000).
  3. Zhang, W. C., et al. Regulatory T cells protect fine particulate matter-induced inflammatory responses in human umbilical vein endothelial cells. Mediators Inflamm. 2014, 869148 (2014).
  4. Vasileiadou, K., et al. alpha1-Acid glycoprotein production in rat dorsal air pouch in response to inflammatory stimuli, dexamethasone and honey bee venom. Exp. Mol. Pathol. 89 (1), 63-71 (2010).
  5. Talayev, V. Y., et al. The effect of human placenta cytotrophoblast cells on the maturation and T cell stimulating ability of dendritics cells in vitro. Clin. Exp. Immunol. 162 (1), 91-99 (2010).
  6. Elishmereni, M., et al. Physical interactions between mast cells and eosinophils: a novel mechanism enhancing eosinophil survival in vitro. Allergy. 66 (3), 376-385 (2011).
  7. Ishihara, Y., et al. Regulation of immunoglobulin G2 production by prostaglandin E(2) and platelet-activating factor. Infect. Immun. 68 (3), 1563-1568 (2000).
  8. Kranzer, K., Bauer, M., Lipford, G. B., Heeg, K., Wagner, H., Lang, R. CpG-oligodeoxynucleotides enhance T-cell receptor-triggered interferon- gamma production and up-regulation of CD69 via induction of antigen- presenting cell-derived interferon type I and interleukin-12. Immunology. 99 (2), 170-178 (2000).
  9. Vendetti, S., Chai, J. G., Dyson, J., Simpson, E., Lombardi, G., Lechler, R. Anergic T cells inhibit the antigen-presenting function of dendritic cells. J. Immunol. 165 (3), 1175-1181 (2000).
  10. Haller, D., Bode, C., Hammes, W. P., Pfeifer, A. M., Schiffrin, E. J., Blum, S. Non-pathogenic bacteria elicit a differential cytokine response by intestinal epithelial cell/leucocyte co-cultures. Gut. 47 (1), 79-87 (2000).
  11. Dono, M., et al. In vitro stimulation of human tonsillar subepithelial B cells: requirement for interaction with activated T cells. Eur. J. Immunol. 31 (3), 752-756 (2001).
  12. Yu, Y., et al. Enhancement of human cord blood CD34+ cell-derived NK cell cytotoxicity by dendritic cells. J. Immunol. 166 (3), 1590-1600 (2001).
  13. Watanabe, T., Tokuyama, S., Yasuda, M., Sasaki, T., Yamamoto, T. Changes of tissue factor-dependent coagulant activity mediated by adhesion between polymorphonuclear leukocytes and endothelial cells. Jpn J. Pharmacol. 86 (4), 399-404 (2001).
  14. Krampera, M., et al. Bone marrow mesenchymal stem cells inhibit the response of naive and memory antigen-specific T cells to their cognate peptide. Blood. 101 (9), 3722-3729 (2003).
  15. Bournival, J., Plouffe, M., Renaud, J., Provencher, C., Martinoli, M. G. Quercetin and sesamin protect dopaminergic cells from MPP+-induced neuroinflammation in a microglial (N9)-neuronal (PC12) coculture system. Oxid. Med. Cell. Longev. 2012, 921941 (2012).
  16. Bureau, G., Longpré, F., Martinoli, M. G. Resveratrol and quercetin, two natural polyphenols, reduce apoptotic neuronal cell death induced by neuroinflammation. J. Neurosci. Res. 86 (2), 403-410 (2008).
  17. Zhu, L., Bi, W., Lu, D., Zhang, C., Shu, X., Lu, D. Luteolin inhibits SH-SY5Y cell apoptosis through suppression of the nuclear transcription factor-κB, mitogen-activated protein kinase and protein kinase B pathways in lipopolysaccharide-stimulated cocultured BV2 cells. Exp. Ther. Med. 7 (5), 1065-1070 (2014).
  18. Luo, X., et al. BV2 enhanced the neurotrophic functions of mesenchymal stem cells after being stimulated with injured PC12. Neuroimmunomodulation. 16 (1), 28-34 (2009).
  19. Polazzi, E., Gianni, T., Contestabile, A. Microglial cells protect cerebellar granule neurons from apoptosis: evidence for reciprocal signaling. Glia. 36 (3), 271-280 (2001).
  20. Barger, S. W., Basile, A. S. Activation of microglia by secreted amyloid precursor protein evokes release of glutamate by cystine exchange and attenuates synaptic function. J. Neurochem. 76 (3), 846-854 (2001).
  21. Zujovic, V., Taupin, V. Use of cocultured cell systems to elucidate chemokine-dependent neuronal/microglial interactions: control of microglial activation. Methods. 29 (4), 345-350 (2003).
  22. Iwashita, M., et al. Valsartan, independently of AT1 receptor or PPARγ, suppresses LPS-induced macrophage activation and improves insulin resistance in cocultured adipocytes. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 302 (3), E286-E296 (2012).
  23. Oliver, E., et al. Docosahexaenoic acid attenuates macrophage-induced inflammation and improves insulin sensitivity in adipocytes-specific differential effects between LC n-3 PUFA. J. Nutr. Biochem. 23 (9), 1192-1200 (2012).
  24. Tang, S. Y., Cheah, I. K., Wang, H., Halliwell, B. Notopterygium forbesii Boiss extract and its active constituent phenethyl ferulate attenuate pro-inflammatory responses to lipopolysaccharide in RAW 264.7 macrophages. A "protective" role for oxidative stress. Chem. Res. Toxicol. 22 (8), 1473-1482 (2009).
  25. De Boer, A. A., Monk, J. M., Robinson, L. E. Docosahexaenoic acid decreases pro-inflammatory mediators in an in vitro murine adipocyte macrophage co-culture model. PLoS One. 9 (1), e85037 (2014).
  26. Li, Y., Liu, L., Barger, S. W., Mrak, R. E., Griffin, W. S. Vitamin E suppression of microglial activation is neuroprotective. J. Neurosci. Res. 66 (2), 163-170 (2001).
  27. Brizuela, L., et al. Osteoblast-derived sphingosine 1-phosphate to induce proliferation and confer resistance to therapeutics to bone metastasis-derived prostate cancer cells. Mol. Oncol. 8 (7), 1181-1195 (2014).
  28. Yuan, L., Chan, G. C., Fung, K. L., Chim, C. S. RANKL expression in myeloma cells is regulated by a network involving RANKL promoter methylation, DNMT1, microRNA and TNFα in the microenvironment. Biochim. Biophys. Acta. 1843, 1834-1838 (2014).
  29. Krtolica, A., Parrinello, S., Lockett, S., Desprez, P. Y., Campisi, J. Senescent fibroblasts promote epithelial cell growth and tumorigenesis: a link between cancer and aging. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 98 (21), 12072-12077 (2001).
  30. Lawrenson, K., Grun, B., Benjamin, E., Jacobs, I. J., Dafou, D., Gayther, S. A. Senescent fibroblasts promote neoplastic transformation of partially transformed ovarian epithelial cells in a three-dimensional model of early stage ovarian cancer. Neoplasia. 12 (4), 317-325 (2010).
  31. Liu, J., et al. BCR-ABL mutants spread resistance to non-mutated cells through a paracrine mechanism. Leukemia. 22 (4), 791-799 (2008).
  32. Giuliani, N., et al. Proangiogenic properties of human myeloma cells: production of angiopoietin-1 and its potential relationship to myeloma-induced angiogenesis. Blood. 102 (2), 638-645 (2003).
  33. Gupta, D., et al. Adherence of multiple myeloma cells to bone marrow stromal cells upregulates vascular endothelial growth factor secretion: therapeutic applications. Leukemia. 15 (12), 1950-1961 (2001).
  34. Anderson, I. C., Mari, S. E., Broderick, R. J., Mari, B. P., Shipp, M. A. The angiogenic factor interleukin 8 is induced in non-small cell lung cancer/pulmonary fibroblast cocultures. Cancer Res. 60 (2), 269-272 (2000).
  35. Hoechst, B., et al. A new population of myeloid-derived suppressor cells in hepatocellular carcinoma patients induces C4(+)CD25(+)Foxp3(+) T cells. Gastroenterology. 135 (1), 234-243 (2008).
  36. Karadag, A., Oyajobi, B. O., Apperley, J. F., Russell, R. G., Croucher, P. I. Human myeloma cells promote the production of interleukin 6 by primary human osteoblasts. Br. J. Haematol. 108 (2), 383-390 (2000).
  37. Garrido, S. M., Appelbaum, F. R., Willman, C. L., Banker, D. E. Acute myeloid leukemia cells are protected from spontaneous and drug- induced apoptosis by direct contact with a human bone marrow stromal cell line (HS-5). Exp. Hematol. 29 (4), 448-457 (2001).
  38. Heissig, B., Pasternak, G., Horner, S., Schwerdtfeger, R., Rossol, S., Hehlmann, R. CD14+ peripheral blood mononuclear cells from chronic myeloid leukemia and normal donors are inhibitory to short- and long-term cultured colony-forming cells. Leuk. Res. 24 (3), 217-231 (2000).
  39. Moore, M. B., Kurago, Z. B., Fullenkamp, C. A., Lutz, C. T. Squamous cell carcinoma cells differentially stimulate NK cell effector functions: the role of IL-18. Cancer Immunol Immunother. 52 (2), 107-115 (2003).
  40. Giuliana, N., et al. Human myeloma cells stimulate the receptor activator of nuclear factor- kappa B ligand (RANKL) in T lymphocytes: a potential role in multiple myeloma bone disease. Blood. 100 (13), 4615-4621 (2002).
  41. Ye, Z., Haley, S., Gee, A. P., Henslee-Downey, P. J., Lamb, L. S. Jr In vitro interactions between gamma deltaT cells, DC, and CD4+ T cells; implications for the immunotherapy of leukemia. Cytotherapy. 4 (3), 293-304 (2002).
  42. Zhang, X. M., Xu, Q. Metastatic melanoma cells escape from immunosurveillance through the novel mechanism of releasing nitric oxide to induce dysfunction of immunocytes. Melanoma Res. 11 (6), 559-567 (2001).
  43. Zhang, M., et al. The differentiation of human adipose-derived stem cells towards a urothelium-like phenotype in vitro and the dynamic temporal changes of related cytokines by both paracrine and autocrine signal regulation. PLoS One. 9 (4), e95583 (2014).
  44. Qu, C., et al. Chondrogenic differentiation of human pluripotent stem cells in chondrocyte co-culture. Int. J. Biochem. Cell. Biol. 45 (8), 1802-1812 (2013).
  45. Krassowska, A., et al. Promotion of haematopoietic activity in embryonic stem cells by the aorta-gonad-mesonephros microenvironment. Exp. Cell. Res. 312 (18), 3595-3603 (2006).
  46. Darcy, K. M., et al. Mammary fibroblasts stimulate growth, alveolar morphogenesis, and functional differentiation of normal rat mammary epithelial cells. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 36 (9), 578-592 (2000).
  47. Spector, J. A. Co-culture of osteoblasts with immature dural cells causes an increased rate and degree of osteoblast differentiation. Plast. Reconstr. Surg. 109 (2), 631-642 (2002).
  48. Khanolkar, A., Fu, Z., Underwood, L. J., Bondurant, K. L., Rochford, R., Cannon, M. J. CD4+ T cell-induced differentiation of EBV-transformed lymphoblastoid cells is associated with diminished recognition by EBV-specific CD8+ cytotoxic T cells. J. Immunol. 170 (6), 3187-3194 (2003).
  49. Fritsch, C. Epimorphin expression in intestinal myofibroblasts induces epithelial morphogenesis. J. Clin. Invest. 110 (11), 1629-1641 (2002).
  50. Abouelfetouh, A., Kondoh, T., Ehara, K., Kohumra, E. Morphological differentiation of bone marrow stromal cells into neuron-like cells after co-culture with hippocampal slice. Brain Res. 1029 (1), 114-119 (2004).
  51. Llado, J., Haenggeli, C., Maragakis, N., Snyder, E., Rothstein, J. Neural stem cells protect against glutamate-induced excitotoxicitiy and promote survival of injured motor neurons through the secretion of neurotrophic factors. Mol. Cell. Neurosci. 27 (3), 322-331 (2004).
  52. Fong, S. P., et al. Trophism of neural progenitor cells to embryonic stem cells: Neural induction and transplantation in a mouse ischemic stroke model. J. Neurosci. Res. 85 (9), 1851-1862 (2007).
  53. Gordon-Keylock, S. A., et al. Induction of hematopoietic differentiation of mouse embryonic stem cells by an AGM-derived stromal cell line is not further enhanced by overexpression of HOXB4. Stem Cells. 19 (11), 1687-1698 (2010).
  54. Yang, T., Tsang, K. S., Poon, W. S., Ng, H. K. Neurotrophism of bone marrow stromal cells to embryonic stem cells: noncontact induction and transplantation to a mouse ischemic stroke model. Cell transplant. 18 (4), 391-404 (2009).
  55. Kim, J. Y., et al. Umbilical cord blood mesenchymal stem cells protect amyloid-β42 neurotoxicity via paracrine. World J. Stem Cells. 4 (11), 110-116 (2012).
  56. Mauri, M., et al. Mesenchymal stem cells enhance GABAergic transmission in co-cultured hippocampal neurons. Mol. Cell Neurosci. 49 (4), 395-405 (2012).
  57. Ichikawa, J., et al. Increased crystal-cell interaction in vitro under co-culture of renal tubular cells and adipocytes by in vitro co-culture paracrine systems simulating metabolic syndrome. Urolithiasis. 42 (1), 17-28 (2014).
  58. Zuo, L., et al. A Paracrine mechanism involving renal tubular cells, adipocytes and macrophages promotes kidney stone formation in a simulated metabolic syndrome environment. J. Urol. 191 (6), 1906-1912 (2014).
  59. Fan, W., Zheng, J. J., McLaughlin, B. J. An in vitro model of the back of the eye for studying retinal pigment epithelial-choroidal endothelial interactions. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 38 (4), 228-234 (2002).
  60. Mierke, C. T., Ballmaier, M., Werner, U., Manns, M. P., Welte, K., Bischoff, S. C. Human endothelial cells regulate survival and proliferation of human mast cells. J. Exp. Med. 192 (6), 801-811 (2000).
  61. Beckner, M. E., Jagannathan, S., Peterson, V. A. Extracellular angio-associated migratory cell protein plays a positive role in angiogenesis and is regulated by astrocytes in coculture. Microvasc. Res. 63 (3), 259-269 (2002).
  62. Damon, D. H. VSM growth is stimulated in sympathetic neuron/VSM cocultures: role of TGF-beta2 and endothelin. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 278 (2), H404-H411 (2000).
  63. Anna De Berardinis, M., Ciotti, M. T., Amadoro, G., Galli, C., Calissano, P. Transfer of the apoptotic message in sister cultures of cerebellar neurons. Neuroreport. 12 (10), 2137-2140 (2001).
  64. Lange-Sperandio, B., Fulda, S., Vandewalle, A., Chevalier, R. L. Macrophages induce apoptosis in proximal tubule cells. Pediatr. Nephrol. 18 (4), 335-341 (2003).
  65. Vjetrovic, J., Shankaranarayanan, P., Mendoza-Parra, M. A., Gronemeyer, H. Senescence-secreted factors activate Myc and sensitize pretransformed cells to TRAIL-induced apoptosis. Aging Cell. 13 (3), 487-496 (2014).
  66. Fujiya, A., et al. The role of S100B in the interaction between adipocytes and macrophages. Obesity (Silver Spring). 22 (2), 371-379 (2014).
  67. Suganami, T., Nishida, J., Ogawa, Y. A paracrine loop between adipocytes and macrophages aggravates inflammatory changes: role of free fatty acids and tumor necrosis factor alpha. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 25 (10), 2062-2068 (2005).
  68. Yoshida, A., Kitajiri, S., Nakagawa, T., Hashido, K., Inaoka, T., Ito, J. Adipose tissue-derived stromal cells protect hair cells from aminoglycoside. Laryngoscope. 121 (6), 1281-1286 (2011).
  69. May, L. A., et al. Inner ear supporting cells protect hair cells by secreting HSP70. J. Clin. Invest. 123 (8), 3577-3587 (2013).
  70. Jarosz, L. M., Deng, D. M., vander Mei, H. C., Crielaard, W., Krom, B. P. Streptococcus mutans competence-stimulating peptide inhibits Candida albicans hypha formation. Eukaryot Cell. 8 (11), 1658-1664 (2009).
  71. Dagenais, T. R., Giles, S. S., Aimanianda, V., Latgé, J. P., Hull, C. M., Keller, N. P. Aspergillus fumigatus LaeA-mediated phagocytosis is associated with a decreased hydrophobin layer. Infect. Immun. 78 (2), 823-829 (2010).
  72. Spiliotis, M., Lechner, S., Tappe, D., Scheller, C., Krohne, G., Brehm, K. Transient transfection of Echinococcus multilocularis primary cells and complete in vitro regeneration of metacestode vesicles. Int. J. Parasitol. 38 (8-9), 1025-1039 (2008).
  73. Scholzen, A., Mittag, D., Rogerson, S. J., Cooke, B. M., Plebanski, M. Plasmodium falciparum-mediated induction of human CD25Foxp3 CD4 T cells is independent of direct TCR stimulation and requires IL-2, IL-10 and TGFbeta. PLoS Pathog. 5 (8), e1000543 (2009).
  74. Fedoroff, S., Richardson, A. Quantification of Cells in Culture. Protocols for Neural Cell Culture. , 4th ed, Humana. Totowa, NJ. 333-335 (2001).
  75. Fedoroff, S., Richardson, A. Primary Cultures of Sympathetic Ganglia. Protocols for Neural Cell Culture. , 4th ed, Humana. Totowa, NJ. 88-89 (2001).
  76. Kreutzberg, G. W. Microglia: a sensor for pathological events in the CNS. Trends Neurosci. 19 (8), 312-318 (1996).
  77. Hanisch, U. K., Kettenmann, H. Microglia: active sensor and versatile effector cells in the normal and pathologic brain. Nat. Neurosci. 10 (11), 1387-1394 (2007).
  78. Davalos, D., et al. ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nat. Neurosci. 8 (6), 752-758 (2005).
  79. Block, M. L., Zecca, L., Hong, J. S. Microglia-mediated neurotoxicity: uncovering the molecular mechanisms. Nat. Rev. Neurosci. 8 (1), 57-69 (2007).
  80. Qureshi, S. T., Larivière, L., Leveque, G., Clermont, S., Moore, K. J., Gros, P., Malo, D. Endotoxin-tolerant mice have mutations in Toll-like receptor 4 (Tlr4). J. Exp. Med. 189, 615-625 (1999).
  81. Sabroe, I., Jones, E. C., Usher, L. R., Whyte, M. K., Dower, S. K. Toll-like receptor (TLR)2 and TLR4 in human peripheral blood granulocytes: a critical role for monocytes in leukocyte lipopolysaccharide responses. J. Immunol. 168, 4701-4710 (2002).
  82. Winterbourn, C. C. Reconciling the chemistry and biology of reactive oxygen species. Nat. Chem. Bio. 4 (5), 278-286 (2008).
  83. Spencer, K. H., Kim, M. Y., Hughes, C. C., Hui, E. E. A screen for short-range paracrine interactions. Integr. Biol. (Camb). 6 (4), 382-387 (2014).

Tags

Cellular Biology Co-cultuur insert Transwell celkweek afgescheiden oplosbare factoren PC12 N9 lipopolysaccharide cytokines microglia neuronen neuroinflammatie
Ontwikkeling van een Insert Co-cultuur systeem van twee mobiele soorten in de afwezigheid van cel-cel Contact
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Renaud, J., Martinoli, M. G.… More

Renaud, J., Martinoli, M. G. Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact. J. Vis. Exp. (113), e54356, doi:10.3791/54356 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter