Introduction
Lo studio dei tessuti, organi o sistemi in vitro è un tentativo di semplificare le molto complesse relazioni esistenti fra i vari sottotipi cellulari che compongono organismi multicellulari. Infatti, gli studi in vitro permettono di acquisire una comprensione dettagliata delle popolazioni di cellule singole. Ci sono due principali vantaggi di condurre esperimenti in vitro: 1) riduzione interazioni cellulari, e 2) la capacità di manipolare facilmente l'ambiente cellulare. Scienziati Quindi, questi due vantaggi hanno consentito di prevedere il comportamento di specifici tipi cellulari in vivo, che porta alla capacità di regolare risultati delle influenze estrinseche in organismi interi. In questo senso, colture cellulari in vitro spesso funziona come un ponte che collega le scienze di base e applicate vita. Tuttavia, ci sono anche diversi svantaggi di lavorare in vitro, il più importante dei quali è che una certa riserva può dimorare nella fisiologicaAl rilevanza di fenotipi osservati. In effetti, quando un unico tipo di cellula è coltivato in un vaso, la cultura perde, a diversi livelli,, le sue connessioni cellula-cellula con altri tipi di cellule, il suo contributo per l'ambiente umorale dal tessuto e organismo di origine, e le ancore all'interno il tessuto che ha permesso di sostenere una particolare struttura tridimensionale volte cruciale per la funzione delle cellule.
La questione dei rapporti cellula-cellula è stato affrontato con lo sviluppo di tecniche di coltura mista. In questo metodo, due o più popolazioni di cellule sono coltivate insieme nello stesso recipiente di coltura. Tuttavia, queste culture miste sopportano disagi importanti. Da un lato, alcuni sottotipi di cellule non fisicamente interagiscono tra loro nei tessuti di origine e si basano esclusivamente sulle comunicazioni paracrini sostenute da fattori solubili secreti e recettori nelle vicinanze. Questo è il caso per diversi processi infiammatori che dipendono prossimale segnalazione di citochine. In misto cultures, interazioni fisiche sono inevitabili e rendono impossibile studiare le comunicazioni paracrini in assenza di contatti cellula-cellula che possono produrre risultati alterati. D'altra parte, ottenendo interpretazioni specifiche delle celle all'interno di una popolazione mista diventa irrealizzabile senza l'uso di tecniche di separazione dure che potrebbero influenzare significativamente i risultati.
Per risolvere questi problemi importanti, l'uso dei mezzi condizionati è stata sviluppata come una tecnica che consente culture compartimenti e lo studio di segnalazione paracrina. Questo metodo richiede il trasferimento del surnatante di un tipo di cellula, medio così chiamato condizionata, di pozzetti contenenti un'altra popolazione di cellule. Tuttavia, un importante inconveniente è che le molecole di breve durata non sopravvivono abbastanza a lungo nel mezzo condizionato da trasferire ai pozzetti della seconda popolazione di cellule. Anche le molecole lunghe durata sarà notevolmente diluiti nel tempo a causa di diffusione. Inoltre, sia cellulepopolazioni partecipano solo in comunicazione paracrina unidirezionale, piuttosto che nella comunicazione bidirezionale attiva. Questo porta alla mancanza di segnale di retroazione che è vitale per ricreare rapporti multicellulari accurate come esistono in vivo.
Di conseguenza e guidato dalla necessità di meglio simulare l'originale in condizioni in vivo l'ambiente cellulare in vitro, diverse progressi nelle tecniche di coltura cellulare sono stati ottenuti nel corso degli anni. Uno dei progressi più significativi è stato l'uso di supporti permeabili con membrane microporose di compartimentazione colture cellulari, utilizzate per la prima volta da Grobstein nel 1953 1. Tali supporti permeabili sono stati adattati negli anni per ospitare numerosi tipi di cellule e da utilizzare in diverse applicazioni. Oggi, questi supporti esistono inserti come cave che sono progettati per riposare in pozzetti di una piastra di coltura tissutale pozzetti o in circupiatti lar. In un sistema di co-coltura, l'inserto contiene un tipo di cellule che pozzo o piatto contiene l'altra popolazione cellulare, permettendo di studiare il contributo di due differenti popolazioni di cellule sul loro ambiente umorale (Figura 1). Come risultato, la polarità cellulare (basolaterale vs secrezione apicale o ricezione del segnale) è conservato, conferendo sistemi inserto co-coltura un importante vantaggio rispetto colture miste e tecniche mezzo condizionato. Diversi tipi di materiali membrana sono disponibili, i più comuni sono poliestere (PET), policarbonato (PC) o collagene rivestite con politetrafluoroetilene (PTFE), ed esistono in diverse dimensioni dei pori da 0,4 micron a 12,0 micron. Queste varietà di materiali e dimensioni dei pori offrono una gamma di inserti che esercitano funzioni di variabili rilevanti per le proprietà ottiche, spessore della membrana e l'adesione delle cellule che li rendono pratici a livelli diversi per i seguenti usi non limitato a:
-studiandola differenziazione delle cellule, lo sviluppo embrionale, metastasi tumorali e la riparazione delle ferite mediante saggi chemiotassica attraverso membrane permeabili;
-evaluating penetrazione farmaco, valutando il loro trasporto attraverso monostrati epiteliali o endoteliali in coltura su supporti permeabili, e;
-Esecuzione co-colture di cellule di analizzare modulazioni il comportamento delle cellule indotte da fattori solubili secreti in assenza di contatto cellula-cellula.
Lo scopo di questo articolo è descrivere orientamenti metodologici generali per compiere la terza funzione sopra indicato, che è di valutare cambiamenti cellulari mediati da fattori solubili secrete in assenza di contatto cellula-cellula con un sistema di inserimento co-coltura. Diversi campi di ricerca fanno uso di sistemi inserto co-coltura per rispondere a domande relative all'effetto di fattori solubili secreti su popolazioni di cellule. Infatti, segnalazione paracrina che modula comportamento cellulare a vari livelli è pertinente in tutti i tessutie sistemi, il che rende i sistemi di co-coltura inserto indispensabile per assicurare progressi in questi campi. Al contrario, l'utilizzo di inserti può confermare che il segnale di trasduzione è attraverso il contatto diretto cellula-cellula e non da fattori secreti. Uno degli usi più importanti di inserti è in studi infiammazione 2-14 in cui l'effetto di citochine secrete viene valutato in vari giocatori cellulari di immunità. In particolare, lo studio di infiammazione nel sistema nervoso centrale (SNC) ha notevolmente beneficiato da studi inserto co-coltura, che hanno permesso di definire meglio i ruoli paracrini distinti di neuroni e microglia nel guidare neuroinfiammazione 15-21. Questi sistemi sono stati concepiti per studiare il potenziale anti-infiammatorio di molecole che si basa sulla loro capacità di ridurre o inibire la secrezione di fattori pro-infiammatori 22-26. La ricerca di pertinenza di cancro 27-31, in particolare i meccanismi alla base dell'angiogenesi 32-34 e inflammatisul 35-42 nella tumorigenesi, beneficia anche di sistemi di inserti co-coltura. Inoltre, fattori solubili sono di primaria importanza nei processi che guidano la differenziazione e diversi studi hanno usato gli inserti di rispondere alle domande in quel particolare settore 43-50. Nel SNC, visto che tessuto neurale ha un potenziale rinnovamento molto limitato, lo studio di neurotrophism e neuroprotezione è fondamentale ed è stato ampiamente garantita dall'uso di cellule staminali in sistemi di co-coltura 51-56. Inoltre, gli inserti sono utilizzati anche in settori diversi come nefrologia 57,58, interazioni endoteliali e l'angiogenesi 59-62, apoptosi segnalazione 63-65, infiammazione di obesità e sindrome metabolica 22,23,66-67, orecchio interno di protezione delle cellule dei capelli 68,69, e anche in funghi virulenza 70,71 e parassitologia 72,73.
Questo articolo offre indicazioni metodologiche generali al fine di istituire un sperimento in vista di valutare cambiamenti cellulari mediati da fattori solubili secreti che utilizzano un sistema di inserimento co-coltura. In particolare, ci concentreremo la nostra attenzione su co-colture di cellule nervose e il loro uso nello studio processo neuroinfiammatorio. Data la vasta gamma di esperimenti che inserisce rendere possibile pilota, è insopportabile per coprire ogni aspetto di questa tecnica di coltura cellulare. Come esempio, un protocollo specifico per misurare gli effetti di citochine secrete da lipopolisaccaride (LPS) -activated microglia N9 su cellule PC12 neuronali sarà dettagliato, offrendo una comprensione concreta della metodologia inserto co-coltura.
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Protocol
NB: Ciascuna delle seguenti operazioni deve essere eseguita in condizioni sterili in una cappa a flusso laminare come richiesto per colture cellulari di mammifero. Inoltre, le linee guida generali per la coltivazione ottimale delle cellule sterili si applicano, ad esempio., Scartando consigli ogni volta che possono portare a contaminazione incrociata, riducendo la quantità di cellule di tempo sono esposti all'aria durante l'esecuzione di interi cambiamenti dei media, correttamente, ma con delicatezza mescolando sospensioni cellulari per garantire la loro dispensazione omogeneo, ecc Inoltre, gli inserti sono una sorta di plasticware che richiedono un trattamento speciale. In primo luogo, ogni volta che gli inserti sono manipolati, evitare di toccare la membrana fragile, che strappa facilmente e potrebbe quindi compromettere l'esperimento. Inoltre, non è adatto per eseguire l'aspirazione sotto vuoto del mezzo di coltura cellulare, in quanto vi è il rischio di perforazione della membrana o dissociare cellule aderenti. Successivamente, inserti pendere nella piastra di coltura tissutale pozzetti e, pertanto, deve essere posta attenzione quando moVing il Plasticware o durante la dispensazione per evitare di dissociare cellule aderenti. Inoltre, quando si usano inserti di grandi dimensioni dei pori, c'è una possibilità che il mezzo di coltura cellulare filtra attraverso la membrana e, quindi, è importante monitorare frequentemente il livello del liquido. Infine, si noti che il seguente protocollo è progettato per cellule aderenti e richiede piccole modifiche per essere adatto per cellule in sospensione.
1. Linee guida generali per lo svolgimento di esperimenti di co-coltura di inserimento
- Semina tipo di cellula # 1 a inserti
- Scartare gli inserti dalla confezione.
- Posizionare gli inserti in una piastra di coltura tissutale pozzetti vuota della dimensione corretta. Per fare ciò, afferrare il bordo superiore dell'inserto usando pinzette.
- Per migliorare l'attaccamento e la diffusione di cellule aderenti, condizionare gli inserti con terreno di coltura cellulare prima della semina. Per fare ciò, coprire l'intera superficie della membrana con coltura cellulare medium con una micropipetta.
NOTA: Fate questo per il maggior numero di inserti, come richiesto. - Riposizionare il coperchio sulla piastra e incubare per almeno 1 ora o O / N alle stesse condizioni (normalmente 37 ° C, 5-10% CO 2).
- Quando gli inserti sono condizionati, rimuovere tutto il terreno di coltura cellulare utilizzando una micropipetta. Eliminare il mezzo utilizzato.
- tipo di cellula Seed # 1 nel terreno di coltura fresco nello stesso modo come in una piastra multipozzetto. Per fare ciò, disegnare un appropriato volume di sospensione cellulare con una micropipetta e dispensare il liquido nell'inserto.
NOTA: Preparare come molti inserti come richiesto. - Dopo la semina tutti gli inserti, oscillare delicatamente la piastra destra e sinistra, poi avanti e indietro in modo da distribuire le cellule in modo uniforme. Evitare di fare movimenti circolari, ciò causerebbe le cellule a accumulano nel centro degli inserti.
- Posizionare il coperchio sulla piastra e incubare come specificato per i requisiti cellulari (normalmente 37 ° C, 5-10% CO
- Semina tipo di cellula # 2 in piastre di coltura di tessuti pozzetti
- tipo di cellula Seed # 2 nel terreno di coltura fresco secondo il punto 1.
- Preparare come molti pozzi come richiesto per il numero di inserti. Oscillare la piastra come al punto 1.1.7), al fine di garantire che le cellule sono equamente distribuiti nei pozzetti.
- Mettere il coperchio sulla piastra e incubare alle stesse condizioni (normalmente 37 ° C, 5-10% CO 2).
- media rinfrescante in inserti
- Usando una micropipetta, rimuovere parte o tutto il mezzo di coltura cellulare, negli inserti contenenti tipo cellulare # 1. Eliminare il mezzo utilizzato.
- Disegnare un volume adeguato di terreno di coltura cellulare fresca. riposare delicatamente la punta sulla parete interna dell'inserto e dispensare lentamente il mezzo di coltura cellulare.
- Posizionare il coperchio sulla piastra e incubare secondo passo 1.1.4.
- media rinfrescante in piastre di coltura di tessuti pozzetti
- Utilizzando un MICROPIpipetta, rimuovere parte o tutto il mezzo di coltura cellulare nei pozzetti contenenti tipo cellulare # 2. Eliminare il mezzo utilizzato.
- Disegnare un volume adeguato di terreno di coltura cellulare fresca. Posizionare la punta sulla parete interna del canale e dispensare lentamente il mezzo di coltura cellulare.
- Mettere il coperchio sulla piastra e incubare secondo protocolli di coltura cellulare precedentemente stabiliti.
- Trasferimento di inserti contenenti tipo di cellula # 1 a piastre di coltura tissutale pozzetti contenenti tipo di cellula # 2.
NOTA: Eseguire questo passaggio quando entrambi i tipi di cellule hanno raggiunto la fase di crescita adeguato.- Prima di trasferire gli inserti nei pozzetti, apportare le necessarie modifiche medie, come precedentemente descritto ai punti 1.3) e 1.4).
NOTA: A questo punto, è importante dispensare i volumi appropriati di supporto in entrambi i compartimenti, come specificato da istruzioni del produttore dell'inserto. - Con una pinzetta, afferrare il bordo superiore di un inserto contenente cellule Tipo 1 # e delicatamente posizionarlo nella appropriata pozzetto contenente tipo di cellula # 2.
- Dopo aver trasferito tutti gli inserti, verificare la presenza di bolle d'aria sotto la membrana di inserti.
NOTA: Le bolle d'aria impediscono qualsiasi scambio attraverso la membrana dell'inserto e possono compromettere l'intero esperimento. - Se le bolle d'aria sono presenti, sollevare molto delicatamente l'inserto dal bene con una pinzetta e immergersi di nuovo nel mezzo di coltura cellulare. Le bolle spariranno. Se sono ancora presenti, provare delicatamente immergendo inserti di nuovo nel mezzo di coltura cellulare in un angolo.
NOTA: Non battere o mescolare gli inserti per evitare di dissociare cellule aderenti. - Dopo aver rimosso tutte le bolle d'aria e controllare che i volumi di media in entrambi i comparti, posizionare il coperchio sulla piastra e incubare.
- Prima di trasferire gli inserti nei pozzetti, apportare le necessarie modifiche medie, come precedentemente descritto ai punti 1.3) e 1.4).
- mezzi rinfrescanti in un sistema di co-coltura
NOTA: Anche se la membrana consente facilmente gli scambi multimediali tra inserto e ben, rinfrescante il medium è fatto inentrambi i comparti Poiché il tempo necessario per raggiungere l'equilibrio nei vani superiori e inferiori da sola diffusione possono essere piuttosto lungo.- media rinfrescante in inserti contenenti tipo cellulare # 1 viene effettuata nello stesso modo come nel punto 1.3).
- Per aggiornare medie pozzetti contenenti tipo di cellula # 2, far scorrere delicatamente l'inserto di lato per creare uno spazio abbastanza ampio per ospitare una punta della pipetta. Aggiornare il medium come al punto 1.4).
- Controllare la presenza di bolle d'aria e verificare i volumi come per gradini 1.5.3) attraverso 1.5.5).
2. Esempio: misurare gli effetti delle citochine secrete da microglia N9 LPS-attivati sulle cellule neuronali PC12
NOTA: Le seguenti operazioni sono progettati per specifiche pallone, bene e dimensioni del piatto. Tuttavia, il protocollo può essere personalizzato per qualsiasi dimensione plasticware. Per i media e la composizione vedi Materiali Tavolo.
- Semina e differenziazione delle cellule PC12 in multie piastre di coltura tissutale
- mezzo di coltura cellulare PC12 routine di riscaldamento, PC12 terreno di differenziamento e tripsina-EDTA in un bagno d'acqua a 37 ° C.
- Utilizzare cellule PC12 al 60-80% di confluenza da un 2 pallone 75 cm.
- Con di 15 mm pipetta Pasteur, effettuare l'aspirazione a vuoto dell'intero mezzo di coltura cellulare nel pallone.
- Lavare delicatamente il monostrato cellulare con 5 ml di sterile tampone fosfato e rimuovere il liquido con una pipetta Pasteur. Fare attenzione a non dissociare le cellule in questa fase.
- Coprire il monostrato cellulare con 3 ml di tripsina-EDTA e incubare per 2-3 minuti a 37 ° C.
- Assicurarsi che tutte le cellule sono staccati al microscopio. Se pochissime cellule sono flottanti, incubare per un periodo più lungo per un massimo di 5 min.
- Aggiungere 10 ml di mezzo di coltura cellulare PC12 di routine al fine di inattivare la tripsina-EDTA.
- Con una pipetta 10 ml, triturare delicatamente facendo in modo che la maggior parte delle cellule sono dissociate dal basso of matraccio. Evitare la formazione di bolle d'aria nella sospensione cellulare.
- Con la stessa pipetta 10 ml, trasferire la sospensione cellulare in un tubo di centrifugazione 50 ml.
- Centrifugare per 1 min a 3.200 xg
- Eliminare il surnatante con una pipetta Pasteur facendo attenzione a non disturbare il pellet.
- Aggiungere 10 ml di terreno di coltura cellulare PC12 routine con una pipetta 10 ml.
NOTA: Questo volume può essere regolato se il pellet è insolitamente piccolo o grande. - Triturare con la stessa pipetta 10 ml per omogeneizzare il pellet. cellule PC12 spesso si raggruppano in modo almeno il 20 pipettando su e downare necessario.
NOTA: Durante la triturazione vigorosa è necessario, evitare di creare bolle d'aria nella sospensione cellulare. - In una provetta da 1,5 ml, preparare una diluizione appropriata di sospensione cellulare in blu trypan. Contare le cellule utilizzando un emocitometro secondo protocolli stabiliti in precedenza 74.
- In un tubo separato 50 ml, dividere la sospensione cellularecon terreno di differenziamento PC12 per ottenere una sospensione appropriata diluite per semina pozzetti di una piastra da 24 pozzetti (30.000 ¢ / cm 2, 0,6 ml per pozzetto secondo il protocollo del produttore).
NOTA: Il 24-pozzetti deve essere preventivamente rivestito con collagene, come specificato dai protocolli stabiliti in precedenza 75. - Distribuire 0,6 ml della sospensione di cellule per pozzetto con una micropipetta.
- Quando tutti i pozzi sono testa di serie, il rock la piastra come al punto 1.1.7).
- Per consentire il corretto differenziamento delle cellule PC12, incubare le piastre a 24 pozzetti per 7-9 giorni a 37 ° C in atmosfera umida 5% CO 2 in PC12 differenziazione medio 15,16 prima di eseguire esperimenti di co-coltura.
- Eseguire modifiche medie a giorni rimuovendo la metà del liquido e la sua sostituzione con un uguale volume di terreno di differenziamento PC12 fresco.
- Semina microglia N9 negli inserti e trattare con LPS
- Un giorno prima di effettuare degli esperimenti di co-coltura, pre-trattamento di PTFE 0,4 inserti micron-pori con routine di terreno di coltura cellulare N9 per ottimizzare l'aderenza delle cellule, seguendo i punti 1.1.1) attraverso 1.1.4)
- Warm medio di routine N9 coltura cellulare e tripsina-EDTA in un bagno d'acqua a 37 ° C.
- Nel frattempo, pesano circa 10 mg di LPS in una provetta da 1,5 ml per un uso successivo.
NOTA: Dal momento che LPS è un potente endotossine pro-infiammatorio e richiede particolari precauzioni di sicurezza, occhiali, guanti, e un respiratore per particolati sono fortemente raccomandato. - Utilizzare le cellule N9 a 80-90% di confluenza da un 2 pallone 75 cm.
- Seguire i passaggi 2.1.3) a 2.1.14). Usare sempre terreno di coltura cellulare N9 di routine, invece di mezzo di coltura cellulare PC12 di routine. Si noti inoltre che la microglia N9 non si aggregano insieme tanto quanto le cellule PC12 fanno, in modo meno pipettando su e giù possono essere necessarie al punto 2.1.13).
- In un tubo separato 50 ml, dividere la sospensione cellulare con terreno di coltura cellulare N9 per obtain una sospensione cellulare diluita appropriato per la semina inserti progettati per tenere in piastre da 24 pozzetti (60.000 ¢ / cm 2, 0,05 ml per inserto secondo il protocollo del produttore, per superficie della membrana vedere le informazioni del produttore).
NOTA: Questi inserti sono già rivestiti con collagene dal produttore e sono ottimizzati per l'adesione cellulare. - Distribuire 0,05 ml della sospensione cellulare per inserto utilizzando una micropipetta.
- Quando tutti gli inserti sono teste di serie, il rock la piastra come al punto 1.1.7).
- Eseguire diluizioni seriali di LPS utilizzando terreno di trattamento N9 per ottenere 4 mg / ml, 2 mg / ml e / ml soluzione di lavoro 1 mg.
- Pipettare 0,05 ml di 4 mg / ml soluzione di lavoro in un set di inserti per produrre una diluizione finale di 2 mg / ml.
- Ripetere il passaggio 2.2.10) per le altre due soluzioni di lavoro in diversi inserti set, ottenendo diluizioni finali di 1 mg / ml e 0,5 mg / ml, rispettivamente.
- Incubate le piastre contenenti gli inserti per 24 ore a 37 ° C in CO 2 ambiente umido 5% per consentire N9 microglia attivazione con LPS prima di eseguire degli esperimenti di co-coltura.
- Co-coltivando cellule PC12 neuronali con microglia N9
- A 7-9 giorni di differenziazione delle cellule PC12, attivare le microglia N9 dopo 24 ore di incubazione con LPS di terreno di trattamento N9 calda e terreno di trattamento PC12 in un bagno d'acqua a 37 ° C.
- Eseguire un cambio medio totale per microglia N9 come al punto 1.3), sostituendo l'intero mezzo utilizzato da 0,1 ml di terreno di trattamento N9. Fate questo per ogni insert.This è necessario rimuovere tutte le tracce di LPS, lasciando microglia N9 solo attivati negli inserti.
- Eseguire un cambio medio totale per le cellule neuronali PC12 come al punto 1.4). Trasferire gli inserti nelle piastre da 24 pozzetti come al punto 1.5) .Incubate co-colture N9-PC12 per 24 ore o 48 ore a 37 ° C in CO 2 ambiente umido 5%.
- dopo 24hr o 48 hr, raccogliere il surnatante e / o le cellule per la citotossicità, saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA), Western Blot, o di altri test.
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Representative Results
L'utilizzo di sistemi di inserti co-coltura è particolarmente pertinente nello studio dei processi neuroinfiammatori che mettono in risalto le relazioni tra i diversi attori paracrini cellulari del sistema nervoso centrale. Immunità nel sistema nervoso centrale avviene principalmente dalle cellule residenti chiamate microglia che monitorano l'ambiente nel loro riposo stato ramificata (Figura 2A) e sono in grado di disturbi di rilevamento che potrebbero turbare la preziosissima omeostasi necessarie per il corretto funzionamento neuronale 76-78. Attivazione della microglia, caratterizzato dall'adozione di una forma ameboide (Figura 2B) e la moltiplicazione della popolazione cellulare definito microgliosis (figura 3), seguita dal rilascio di mediatori pro-infiammatori, come le citochine, costituisce l'aspetto principale della neuroinflammation 79 . rilascio di citochine serve il nobile scopo di proteggere i neuroni contro gli attacchi nocivi ed è closely monitorato. Tuttavia, quando neuroinflammation sfugge questo controllo stretto, adotta una natura distruttiva e può ferire gravemente il sistema nervoso centrale. Poiché tessuti neurali hanno un potenziale rinnovamento molto limitata, il CNS è tanto più suscettibili a tali risposte infiammatorie auto-distruttiva. Lo studio della diafonia, che esiste tra i neuroni e microglia è indispensabile nel chiarire i meccanismi alla base della neuroinfiammazione. A differenza di culture miste, sistemi inserto co-coltura consentono al ricercatore di identificare quale popolazione cellulare sta generando gli effetti tossici e che uno è influenzato.
Qui, le cellule PC12 differenziate per 7-9 giorni con il fattore di crescita dei nervi sono stati co-coltura con cellule microgliali N9 LPS-attivati con l'obiettivo di quantifyingthe effetti nocivi di fattori solubili infiammazione-derivati sui neuroni. Per fare ciò, le cellule neuronali PC12 sono state coltivate in piastre da 24 pozzetti mentre microglia N9 sono state seminate in inserti. N9 microgliun sono stati trattati per 24 ore con LPS, molto potente endotossina pro-infiammatorie comprese nelle membrane esterne di batteri gram-negativi. LPS è noto per attivare toll-like receptor 4 suscitando così una robusta risposta infiammatoria in un'ampia varietà di cellule effettrici del sistema immunitario, compresa la immortalate murino linea cellulare N9 microglia 80,81. I seguenti risultati rappresentativi mostrano che microglia N9 attivati con LPS hanno la tendenza ad aumentare la loro popolazione (Figura 3) ed a secernere citochine pro-infiammatorie solubili, come l'interleuchina-6 (IL-6), interferone gamma (IFN-γ) e fattore di necrosi tumorale alfa (TNF-α), che attraversano facilmente la membrana degli inserti co-coltura e causare danni citotossici per le cellule PC12 neuronali crescente nel vano inferiore.
La preoccupazione principale prima di trasferire le microglia N9 LPS-activated ai pozzetti contenenti cellule neuronali PC12 consiste nel confermare that il PC12 siano correttamente differenziati. Cellule PC12 differenziate di sette giorni devono mostrare evidenti fenotipi neuronali, come un corpo cellulare piatta, che proietta diversi neuriti lunghi a volte si visualizzano varicosità (Figura 4). Una volta che questo punto di controllo viene eseguito, inserti microgliali N9 contenenti mezzo fresco privo di LPS possono essere trasferiti nei pozzetti contenenti PC12 differenziata. Dopo un periodo di incubazione di 24 ore o 48 ore, il surnatante nel vano inferiore viene raccolto e un saggio di citotossicità, sulla base del rilascio di lattato deidrogenasi 15,16, così come un ELISA 15, per misurare citochine vengono eseguite. È importante raccogliere il surnatante nel vano inferiore per misurare le citochine che hanno effettivamente attraversato la membrana permeabile e che possono attivare recettori presenti sulla superficie delle cellule PC12. I risultati dimostrano che LPS-activated microglia N9 dal vano superiore generano un citocromo dose e tempo dipendenteeffetto otoxic su cellule PC12 neuronali differenziate impostati nel compartimento inferiore (Figura 5). La condizione / ml LPS 0,5 mg non è però significativamente citotossica a 24 ore o 48 ore. I livelli di citotossicità sono state trovate per raggiungere quasi il 100% in 2 ug / ml LPS 48 condizione hr. Inoltre, i risultati mostrano che la concentrazione di citochine pro-infiammatorie IL-6, IFN-y e TNF-alfa nel surnatante aumenta simultaneamente con citotossicità osservata. In particolare, IL-6 concentrazioni sono significativamente aumentati dopo 24 ore solo per la condizione 2 ug / ml, mentre 1 ug / ml di LPS anche rendimenti livelli della citochina sollevate significativamente dopo 48 ore (Figura 6). Microglia secernono IFN-γ che raggiunge il vano inferiore in un aumento significativo del modo quando sono trattati con 1 mg / ml e 2 ug / ml, e sono incubati con cellule PC12 neuronali differenziate sia per 24 ore o 48 ore (Figura 7). Il 0,5 mg / mlcondizione di LPS, ancora una volta non aumenta i livelli di IFN-g in modo significativo. Infine, le concentrazioni di TNF-alfa nel vano inferiore sono stati quantificati da ELISA e sono stati trovati ad essere il più potenziata da LPS attivazione della microglia, raggiungendo livelli quasi sette volte più importante della condizione di controllo (Figura 8). In particolare, entrambi i periodi 24 hr e 48 ore di incubazione provocato importanti incrementi nei livelli di TNF-α nel surnatante. Tuttavia, il / ml LPS condizione 1 mg ha prodotto un significativo aumento dei livelli di TNF-α solo dopo 48 h. Nel complesso, questi risultati mostrano che le citochine pro-infiammatorie secrete sono almeno in parte responsabile degli effetti citotossici osservati in cellule PC12 neuronali differenziate dopo un periodo di incubazione 24 ore o 48 ore con microglia attivate da diverse concentrazioni di LPS.
Inserire sistemi di co-coltura di cellule microgliali e PC12 N9 LPS-attivati hanno dimostrato diparticolarmente utile nello studio della neuroinflammation e nell'elaborazione di strategie per contrastare esso. Il nostro gruppo ha recentemente dimostrato che LPS-activated microglia N9 cresciuti in coltura cellulare inserisce mostra un aumento della trascrizione di citochine pro-infiammatorie, che a loro volta inducono l'apoptosi delle cellule PC12 fattore di crescita nervosa differenziate attraversando i micropori dell'inserto 15, 16. Nello stesso paradigma, pre-trattamento della popolazione microglia con il resveratrolo composto polifenolico (0,1 pM, 3 hr) impedito la trascrizione di citochine pro-infiammatorie e apoptosi pertanto impedito di cellule PC12 neuronali differenziate bloccando caspasi-3 attivazione e, successivamente, , DNA scissione. Un altro gruppo ha anche dimostrato gli effetti neuroprotettivi della vitamina E in un N9-PC12 co-coltura 26. Oltre alla co-culture N9-PC12, diverse linee cellulari immortalizzate o colture primarie sono anche stati impiegati in un contesto di neuroinfiammazione. Ad esempio, lalinea di cellule microgliali BV2 murino è stato co-coltura con cellule SH-SY5Y neuroblastoma umano per mostrare l'effetto anti-apoptotico della luteolina polifenolico apparentemente mediata dal suo anti-infiammatorio potenziale 17. Come pure, microglia BV2 attivati dalle cellule PC12 feriti sono stati dimostrato di esercitare effetti anti-apoptotici in cellule staminali mesenchimali 18. Segnalazione reciproco è stato dimostrato di essere importante nei meccanismi anti-apoptotici sottostante microglia primaria neuroprotezione conferitegli primari neuroni granuli cerebellari 19. Inoltre, neuroni ippocampali primari sono stati co-coltivati con microglia primaria attivato da proteina precursore amiloide secreta per valutare il rilascio di glutammato per scambio cisteina e la conseguente indebolimento della funzione sinaptica 20. Infine, un gruppo ha anche mostrato il crosstalk che esiste tra i neuroni dell'ippocampo primari e microglia primaria di competenza fractalkine segnalazione, a chemochine Expres costitutivamentesed dai neuroni nel sistema nervoso centrale il cui recettore si trova sulla superficie della microglia 21.
Figura 1. Rappresentazione schematica di un sistema di inserimento di co-coltura. Il vano superiore è composto dell'inserto che contiene un tipo di cellula e il suo ambiente umorale apicale. Il vano inferiore è costituita da un pozzo o piatto contenente il secondo tipo di cella. L'inserto poggia sui bordi della piastra di coltura tissutale pozzetti o piatto. L'inserto è progettato per giacere appena sopra il fondo del pozzo in modo da non toccare la popolazione di cellule in crescita sotto. Il mezzo nel vano inferiore è in contatto sia con la superficie basale del primo tipo di cellula e la superficie apicale del secondo tipo di cellula. Clicca qui per visualizzare un vers più grandiione di questa figura.
Figura 2. microfotografie della microglia N9. (A) non trattati di riposo microglia N9 in inserti presentano una morfologia cellulare ramificata che consente loro di monitorare attivamente il loro ambiente. (B) microglia N9 in inserti trattati con lipopolisaccaride (LPS) per 24 hr visualizzazione una forma ameboide tipica del fenotipo attivato. Questa microfotografia è stata presa poco prima di trasferire l'inserto contenente questi microglia N9 attivato per i pozzetti contenenti cellule PC12 differenziate come illustrato in figura 4. Barra di scala = 25 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. microfotografie di cellule neuronali PC12 differenziate. Sette giorni di crescita nervoso fattore differenziato cellule neuronali PC12 mostrano evidenti fenotipi neuronali quali lunghe neuriti e varicosità. Questa microfotografia è stata presa poco prima di trasferire gli inserti contenenti microglia N9 attivati come illustrato nella figura 2. Barra di scala = 25 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5. effetto citotossico di lipopolisaccaride (LPS) -activated microglia sulle cellule neuronali PC12 differenziate.microglia N9 state attivate con differenti concentrazioni di LPS per 24 h, quindi trasferiti in pozzetti contenenti cellule PC12 neuronali differenziate per 24 ore o 48 ore. La citotossicità è stata valutata usando un saggio di rilascio di lattato deidrogenasi eseguita sul supernatante del vano inferiore. Differenze significative tra i gruppi sono state accertate da una analisi della varianza, seguita da analisi di Tukey post-hoc con il programma GraphPad Instat, versione 3.06 per Windows (San Diego, CA; www.graphpad.com). Tutti i dati, analizzati con l'intervallo di confidenza del 95%, sono espressi come media ± errore standard della media da 3 esperimenti indipendenti in cui sono stati considerati 6 pozzi. Gli asterischi indicano differenze statistiche tra la condizione di trattamento e di controllo (*** p <0.001). Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 6. Concentrazione di i nterleukin-6 (IL-6) nel supernatante dopo l'attivazione N9 da lipopolisaccaride (LPS). Microglia N9 stati attivati con diverse concentrazioni di LPS per 24 ore, e poi trasferito in pozzetti contenenti cellule PC12 neuronali differenziate per 24 ore o 48 ore. IL-6 concentrazioni nel supernatante del vano inferiore sono stati valutati utilizzando un test ELISA. Differenze significative tra i gruppi sono state accertate da una analisi della varianza, seguita da analisi di Tukey post-hoc con il programma GraphPad Instat, versione 3.06 per Windows (San Diego, CA; www.graphpad.com). Tutti i dati, analizzati con l'intervallo di confidenza del 95%, sono espressi come media ± errore standard della media da 3 esperimenti indipendenti in cui sono stati considerati 6 pozzi. Gli asterischi indicano differenze statistiche tra il trattamento e concondizione di controllo (*** p <0.001, ** p <0.01 e * p <0,05). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 7. Concentrazione di interferone gamma (IFN-γ) nel supernatante dopo l'attivazione N9 da lipopolisaccaride (LPS). Microglia N9 stati attivati con diverse concentrazioni di LPS per 24 ore, e poi trasferito in pozzetti contenenti cellule PC12 neuronali differenziate per 24 ore o 48 ore. Le concentrazioni di IFN-gamma nel surnatante del vano inferiore sono stati valutati utilizzando un test ELISA. Differenze significative tra i gruppi sono state accertate da una analisi della varianza, seguita da analisi post-hoc di Tukey con il programma GraphPad Instat, versione 3.06per Windows (San Diego, CA; www.graphpad.com). Tutti i dati, analizzati con l'intervallo di confidenza del 95%, sono espressi come media ± errore standard della media da 3 esperimenti indipendenti in cui sono stati considerati 6 pozzi. Gli asterischi indicano differenze statistiche tra la condizione di trattamento e di controllo (** p <0.01 e * p <0,05). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 8. Concentrazione del fattore di necrosi tumorale alfa (TNF-α) nel supernatante dopo l'attivazione N9 da lipopolisaccaride (LPS). Microglia N9 stati attivati con diverse concentrazioni di LPS per 24 ore, e poi trasferito in pozzetti contenenti cellule PC12 neuronali differenziate per 24 ore o 48 ore. TNF-αconcentrazioni nel supernatante del vano inferiore sono stati valutati utilizzando un test ELISA. Differenze significative tra i gruppi sono state accertate da una analisi della varianza, seguita da analisi di Tukey post-hoc con il programma GraphPad Instat, versione 3.06 per Windows (San Diego, CA; www.graphpad.com). Tutti i dati, analizzati con l'intervallo di confidenza del 95%, sono espressi come media ± errore standard della media da 3 esperimenti indipendenti in cui sono stati considerati 6 pozzi. Gli asterischi indicano differenze statistiche tra la condizione di trattamento e di controllo (*** p <0.001). Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
La fase più critica di esperimenti sistema inserto co-coltura effettivamente abita nello scegliere l'inserto corretto di utilizzare. Dimensione dei pori e materiale della membrana devono essere presi in considerazione approfondita, senza dimenticare di considerare il tipo di cellule che saranno seminate e lo scopo dell'esperimento. Per esempio, saggi chemiotassica possono utilizzare lo stesso tipo di membrana di co-colture cellulari per analizzare modulazioni comportamento cellulare indotta da fattori solubili secrete in assenza di contatto cellula-cellula. Tuttavia, entrambi i tipi di esperimenti richiedono diverse dimensioni dei pori: quelli più grandi per il primo, per consentire la migrazione cellulare, e quelli più piccoli per quest'ultimo, per impedire la migrazione cellulare e il contatto cellula-cellula. Per la valutazione di cambiamenti cellulari mediati da fattori solubili secreti in assenza di contatto cellula-cellula, poro dimensioni di 0,4 micron o 3 micron sono solitamente appropriate in quanto consentono di grandi molecole, quali proteine, attraversare ma prevenire la maggior parte delle cellule da fare così. Membranamateriale dipende in larga misura dal tipo di cellula e le tecniche da utilizzare al fine del protocollo coltura cellulare. Brevemente, membrane PET offrono una buona visibilità cella come sono chiari ma non sono rivestite collagene, che può essere un problema per cellule aderenti quello richiesto per il supporto da trattare. Essi hanno anche la migliore resistenza chimica a fissativi che, accanto alle loro buone proprietà ottiche, li rende ideali per gli studi istologici. D'altra parte, membrane PC offrono scarsa visibilità cella come sono traslucide e non sono collagene rivestite. Tuttavia, essi possiedono la più alta densità di pori e la disponibilità più diversificata di dimensioni dei pori. Infine, le membrane in PTFE sono chiare quando bagnato ma consentono solo la visualizzazione di cellule delinea nel microscopio. Come un vantaggio importante, essi sono collagene rivestite, che li rende anche un po 'più spessa. È importante notare che il rivestimento inserti PET o membrana PC con collagene può ostruire i pori e impedire il passaggio di solubile factoRS. In ogni caso, la maggior parte dei produttori inserto offrono guide complete per assistere ricercatori nel selezionare l'inserto corretto. Nel nostro paradigma specifico, le scelte di densità di placcatura, i media, la concentrazione sierica, giorni di differenziazione, giorni di attivazione LPS, le concentrazioni di LPS, e rivestimento dei flaconi per cellule PC12 sono stati ottimizzati in anni di lavoro con questi sistemi co-coltura 15 , 16. Degno di nota, la densità di placcatura della microglia N9 negli inserti stato scelto a 60.000 ¢ / cm 2 al fine di ottenere il 40-50% di confluenza al momento di iniziare la co-coltura e, quindi, per dare loro spazio di moltiplicare sulla loro attivazione da LPS. Altre condizioni ottimali quando può anche portare a risultati soddisfacenti, come ad esempio la sostituzione di collagene da L-lisina nei palloni destinati per la manutenzione PC12 nativo.
Per aumentare la sostenibilità dei risultati, diversi controlli diversi possono essere eseguite. Quando si cerca di dimostrare che i fattori solubilisono responsabili degli effetti osservati, colture miste manifestano contatto diretto cellula-cellula e gli esperimenti mezzo condizionato dovrebbero essere condotti in parallelo. Inoltre, facendo uso di anticorpi per neutralizzare un fattore secreto specifico aiutare a identificare la molecola responsabile dell'effetto paracrino che è percepito. Quando possibile, bloccare un recettore o di una parte del suo percorso di segnalazione per individuare l'esatta identità del recettore in fase di attivazione. Se una molecola viene utilizzato per attivare una popolazione cellulare prima dell'esperimento co-coltura con un secondo tipo di cellule, come nell'esempio descritto in precedenza, è importante prendere in considerazione la presenza della molecola nel sistema. Come prima opzione, il terreno deve essere completamente modificato prima dell'esperimento co-coltura per assicurare che la molecola è assente dal sistema del tutto. Come seconda opzione, una condizione deve essere aggiunto in cui la molecola sola viene incubato con il secondo tipo di cella pervalutarne l'effetto in assenza del primo tipo di cellula. Se non vi è alcun effetto della molecola sul secondo tipo di cellule, non vi sarà alcuna necessità di cambiare il mezzo prima dell'esperimento co-coltura. Allo stesso modo, se entrambi i tipi cellulari non sono coltivate nello stesso mezzo di coltura cellulare, devono essere prese precauzioni simili per assicurarsi che le differenze di composizione media non influiscono una o l'altra popolazione cellulare. Sebbene entrambi i supporti saranno separati dalla membrana inserto in un primo momento, la diffusione è destinata a garantire che essi si mescoleranno per periodi di incubazione più lunghi. Inoltre, diversi problemi possono derivare da interruzioni aberrante di solubili rapporti fattore-recettore. Tra diverse cause di errore, l'uso eccessivo di dissociazione enzimatica e la presenza di importanti concentrazioni di siero possono interferire con i recettori della superficie cellulare. Altre cause di errore nei sistemi inserto co-coltura includono, ma non sono limitati a 1) improprie tecniche di coltura cellulare, come ad esempio la rimozione della totalità della cellamezzo di coltura in troppi pozzetti contemporaneamente causando cellule per asciugare, 2) un monostrato che è troppo confluenti nell'inserto, responsabile per sigillare la membrana inserto e prevenire molecole apicalmente-secrete per raggiungere il vano inferiore, e 3) mal regolato confluenza delle cellule, che causa un espressione sotto-sovra o di fattori solubili che portano a risultati fisiologicamente irrilevanti o assenza di qualsiasi effetto.
Mentre solo uno scenario inserto co-coltura è stata presentata qui, ci sono numerosi modi per fare uso di questa tecnica molto versatile. Qui, un tipo di cellule sono state pretrattate con una molecola responsabile per indurre la secrezione di un fattore solubile che, in caso di trasferimento l'inserto al pozzo, influisce sul comportamento del secondo tipo di cellula. È anche possibile incubare entrambi i tipi cellulari insieme in un sistema di co-coltura prima di separare loro di rilevare la maggiore vulnerabilità o la resistenza di popolazioni una o entrambe le cellule ad un trattamento ulteriore. HoWever, se si considera la sua forma più rudimentale, questa tecnica può fare uso di due popolazioni di cellule incubate insieme senza alcun trattamento, con l'obiettivo di valutare basale segnalazione reciproca paracrina.
Il limite più importante di questa tecnica è che entità molecolari molto breve durata come le specie reattive dell'ossigeno non sopravvivono la distanza che separa la popolazione di cellule in crescita nel vano superiore e quella nel vano inferiore 82. L'ultimo sviluppo nelle tecniche di co-coltura ha cercato di rispondere a questo problema utilizzando un substrato di cultura microfabbricazione in grado di mantenere due popolazioni cellulari in prossimità microscala 83. Oltre a portare tutti i vantaggi dei sistemi inserto co-coltura, come il rilevamento specifico frazione di cambiamenti e segnalamento bidirezionale, è stato anche dimostrato questa schermata microfabbricazione per rendere possibile il rilevamento di interazioni a corto raggio che non erano prima detectable a causa del decadimento di fattori solubili su distanze. Questa piattaforma coltura cellulare è l'ultima innovazione in co-coltura cellulare e promette di aiutare a svelare i meccanismi tra le cellule che sono stati trascurati prima segnalazione.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI-1640 medium | Sigma | R8755 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham | Sigma | D6421 | Warm in 37 °C water bath before use, must be supplemented with 0.365 gm/L L-glutamine |
| Horse serum | ATCC | 30-2040 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Fetal bovine serum | MultiCell | 80350 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Nerve Growth Factor-7S from murine submaxillary gland | Sigma | N0513 | Reconstitute the lyophilized powder in a solution of buffered saline or tissue culture medium containing 0.1–1.0% bovine serum albumin or 1-10% serum |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma | T3924 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli 055:B5 | Sigma | L2880 | Toxic |
| Cell culture inserts for use with 24-well plates | BD Falcon | 353095 | 0.4 μm pores |
| 24-well plates | TrueLine | TR5002 | Coat with collagen before use |
| Routine PC12 cell culture medium | Routine N9 cell culture medium | ||
| - 85% RPMI medium | - 90% DMEM-F12 medium | ||
| - 10% heat-inactivated horse serum | - 10% heat-inactivated horse serum | ||
| - 5% heat-inactivated fetal bovine serum | |||
| PC12 differentiation medium | N9 treatment medium | ||
| - 99% RPMI medium | - 99% DMEM-F12 medium | ||
| - 1% heat-inactivated fetal bovine serum | - 1% heat-inactivated fetal bovine serum | ||
| - 50 ng/mL nerve growth factor | |||
| PC12 treatment medium | |||
| - 99% RPMI medium | |||
| - 1% heat-inactivated fetal bovine serum |
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