Abstract
Yarrowia lipolytica er et non-patogene, dimorfe og strengt aerobe gærarter. På grund af dens særlige fysiologiske funktioner og metaboliske egenskaber, denne ukonventionelle gær er ikke kun en god model for studiet af den grundlæggende karakter af svampe differentiering, men er også en lovende mikrobiel platform for biokemisk produktion og forskellige bioteknologiske applikationer, som kræver omfattende genetiske manipulationer. Dog, genetiske manipulationer af Y. lipolytica har været begrænset på grund af manglen på en effektiv og stabil genetisk transformation system samt meget høje ikke-homolog rekombination, der kan primært henføres til Ku70 genet. Her rapporterer vi en nem og hurtig protokol til effektiv genetisk transformation og for gendeletion i Y. lipolytica Po1g. Først en protokol til effektiv omdannelse af exogent DNA i Y. lipolytica Po1g blev etableret. Second, for at opnå den forbedrede dobbelt-crossover homolog rekombination sats for yderligere deletion af målgener blev Ku70-genet deleteret ved at transformere en afbrydelse kassette transporterer 1 kb homologiarme. For det tredje, at demonstrere den forbedrede gendeletion effektivitet efter sletning af Ku70 genet, vi individuelt slettet 11 mål gener, der koder alkoholdehydrogenase og alkohol oxidase med de samme procedurer på Ku70 knockout platform stamme. Det blev observeret, at hastigheden af præcise homolog rekombination steg betydeligt fra mindre end 0,5% til sletning af Ku70 genet i Po1g til 33% -71% for enkelt gen sletning af de 11 målgener i Po1g Ku70 Δ. En replikative plasmid, der bærer hygromycin B-resistens markør og Cre / LoxP system blev konstrueret, og selektionsmarkørgen i gæren knockout-stammer blev til sidst fjernet ved ekspression af Cre-rekombinase at lette multiple runder af udsigt til rentenedsættelserted genetiske manipulationer. De resulterende single-gen-deletionsmutanter har potentielle anvendelser i biobrændsel og biokemisk produktion.
Introduction
I modsætning til Saccharomyces cerevisiae, Yarrowia lipolytica, en utraditionel gær, kan vokse i form af gær eller mycelium som følge af ændringer i miljøforhold 1,2. Dette kan således dimorfe gær anvendes som en god model for studiet af fungal differentiering, morphogenese og taksonomi 3,4,5. Det er generelt betragtes som en sikker (GRAS) gær arter, som er almindeligt anvendt til at producere en lang række tilsætningsstoffer såsom organiske syrer, polyalkoholer, aromastoffer, emulgatorer og overfladeaktive 6,7,8,9. Det er en obligat aerob og en velkendt olieagtig gær i stand til naturligt at akkumulere lipider ved høje mængder, dvs. op til 70% af celletørvægt 10. Det kan også anvende et bredt spektrum af carbonkilder til vækst, herunder forskellige former for rester i affaldsprodukter ressourcer som næringsstoffer 11,12,13. Alle disse unikke funktioner gør Y. lipolytica meget attraktivt forforskellige bioteknologiske applikationer.
Selvom hele genomet sekvens af Y. lipolytica er offentliggjort 14,15, genetisk manipulation af denne ukonventionelle gær er mere komplekse end andre gærarter. Første, transformation af denne gærart er langt mindre effektive på grund af fraværet af en stabil og effektiv genetisk transformationssystem 16,17. For det andet er besværlig genomisk integration af lineære ekspressionskassetter almindeligvis anvendes til ekspression af gener af interesse som ingen naturlig episomalt plasmid er blevet fundet i denne gær 18. For det tredje generation af genetiske knock-outs og knock-ins er begrænset, fordi det gen targeting effektivitet via nøjagtig homolog rekombination i denne gær er lav, og de fleste integration begivenheder ske gennem non-homolog ende sammenføjning (NHEJ) 19.
I denne undersøgelse rapporterer vi en optimeret transformation protokol for Y. lipolytica Ku70 genet, der koder for et nøgleenzym i NHEJ pathway. Ved at bruge den optimerede transformation protokol og transformation af en lineær knockout kassette indeholdende flankerende homologiregioner af 1 kb, den Ku70 genet fra Y. lipolytica Po1g blev slettet. Robustheden af denne gendeletion metode blev derefter påvist ved at målrette alkoholdehydrogenase og alkoholoxidase-gener i Po1g Ku70 Δ-stamme. Det blev observeret, at Ku70 deletion-stammen udviste en betydeligt højere virkningsgrad af homolog rekombination-medieret gen-targeting end vildtype-Po1g stamme. Desuden blev et replikativt Cre ekspressionsplasmid bærer hygromycin B-resistens markør fremstillet således, at markør redning. Markøren redning letter multiple runder af genmålretning i the opnåede gen-deletionsmutanter. Udover gendeletion, kan vores protokol for genetisk transformation og gendeletion beskrevet her anvendes til at indsætte gener til specifikke loci, og indføre stedsspecifikke mutationer i Y. lipolytica-genomet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Generering af Y. lipolytica Ku70 Sletning Strain
- Konstruktion af afbrydelsen kassette
Bemærk: Se tabel 1 for alle anvendte primere i polymerasekædereaktionen (PCR) amplifikationer.- Design primere 20 for PCR amplificere LEU2 ekspressionskassetten (se tabel 1) fra en Y. lipolytica ekspressionsvektor og introducere loxP-sites i 5'- og 3'-enderne af LEU2 kassette med en lang forward primer (# 1; tabel 1) og en lang reverse primer (# 2; tabel 1), henholdsvis. At indføre en yderligere restriktionssted til efterfølgende trin i kloningsprocessen, tilføje et BamHI-restriktionssted i primer # 1.
- Udfør PCR under anvendelse af en high-fidelity DNA polymerase som beskrevet i tabel 2.
- Oprense PCR-produktet LoxP-promotor-LEU2-terminator-LoxP kassette anvendelse af en PCR purification kit ifølge producentens instruktioner. Tilføj 3'-A udhæng til det oprensede PCR-produkt ifølge producentens anvisninger 21. Brug T4 DNA-ligase til at ligere A-tailed PCR-produkt ind i en TA kloningsvektor til opnåelse af plasmid T-LEU2 som pr tabel 3.
- PCR amplifikation af 1 kb 5 'opstrøms sekvens af Ku70 genet under anvendelse af primerne # 3 / # 4 fra Y. lipolytica Po1g genomisk DNA 22 som pr tabel 2. Oprens PCR-produkt under anvendelse af et PCR-oprensningskit ifølge producentens anvisninger.
- Dobbelt fordøjelse både det oprensede PCR-produkt og T-LEU2 plasmid med Sac II og Barn HI enzymer som pr tabel 4. Oprens fordøjelse ved anvendelse af en PCR-oprensningskit ifølge producentens instruktioner. Brug T4 DNA-ligase til at ligere det oprensede og spaltet PCR produkt til SacII / BamHI-stederne i T-LEU2 til opnåelse afplasmid T-LEU2-5E som pr tabel 3.
- PCR amplificere 1 kb 3 'nedstrøms sekvens af Ku70 genet under anvendelse af primere # 5 / # 6 fra Y. lipolytica Po1g genomisk DNA 22 som pr tabel 2. Oprens PCR-produkt under anvendelse af et PCR-oprensningskit ifølge producentens anvisninger. Dobbelt fordøjelse både det oprensede PCR-produkt og T-LEU2-5E plasmid med Not I og NdeI enzymer som pr tabel 4.
- Oprens fordøjelse ved anvendelse af en PCR-oprensningskit ifølge producentens instruktioner. Derefter ligere oprenset og spaltet PCR produkt til Not I / Nde I sites af T-LEU2-5E til opnåelse af plasmid T-KO anvendelse af T4 DNA ligase som pr tabel 3.
- Skær plasmidet T-KO med Sac II og Ndel enzymer som pr tabel 4 for at frembringe forstyrrelser kassetten (figur 1
- Kompetent forberedelse celle og transformation af Y. lipolytica Po1g stammen
- Kompetent forberedelse celle
- Inokulere en koloni af Y. lipolytica Po1g stamme fra en frisk gærekstrakt-pepton-dextrose (YPD) plade i 10 ml YPD-medium (1% gærekstrakt, 2% pepton, 2% dextrose og 50 mM citratpuffer pH 4,0) i en 100 ml kolbe. Inkuber i en 30 ° C rysteinkubator ved 225 rpm i 20 timer, indtil mætning (en OD600 på ca. 15, målt under anvendelse af et spektrofotometer).
- Pelletere cellerne ved centrifugering i 5 minutter ved 5000 xg ved stuetemperatur. Vask cellerne med 20 ml Tris-EDTA (TE) puffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7,5), og pelletere cellerne som beskrevet i trin 1.2.1.2. Resuspender cellerne i 1 ml 0,1 M lithiumacetat (pH 6,0, justeret med eddikesyre), og der inkuberes i 10 minutter ved stue temperatur.
- Alikvot de kompetente celler (100 pi) i sterile 1,5 ml rør. Fortsæt til transformationstrinene nedenfor øjeblikkeligt eller tilføje glycerol til en slutkoncentration på 25% (v / v) og opbevares ved -80 ° C til langsigtet opbevaring.
- Transformation
- Bland forsigtigt 10 pi denatureret laksesperma-DNA (10 mg / ml) og 1-5 ug af det oprensede forstyrrelse kassette sammen med 100 pi kompetente celler, og inkuberes ved 30 ° C i 15 min.
- Tilføj 700 pi 40% polyethylenglycol (PEG) -4000 (opløst i 0,1 M lithiumacetat, pH 6,0), bland godt og inkuber i et 30 ° C rysteinkubator ved 225 rpm i 60 min.
Bemærk: Det er vigtigt at bruge PEG med gennemsnitlig molekylvægt på 4000, i stedet for PEG-3350 (typisk anvendt i transformationen af konventionelle gær). - Varmechok transformationsblandingen ved at anbringe røret i et 39 ° C vandbad i 60 min.
- Tilsæt 1 ml YPD medium ogkomme sig i 2 timer ved 30 ° C og 225 rpm. Der centrifugeres ved 9.000 x g i 1 minut ved stuetemperatur, supernatanten fjernes, og pellet resuspenderes i 1 ml TE-buffer.
- Repellet cellerne ved centrifugering ved 9.000 x g i 1 min ved stuetemperatur, og kassér supernatanten. Pellet resuspenderes i 100 pi TE-buffer og plade på selektive plader (f.eks leucin-deficiente plader), og inkuberes ved 30 ° C i 2-3 dage.
- Pick 4 til 10 enkelt-kolonier og pode separat i 2 ml YPD medium. Inkuber natten over i en 30 ° C rysteinkubator ved 225 rpm. Identificere positive kolonier ved PCR-analyse af genomisk DNA fra transformanterne 22 som pr tabel 5 under anvendelse af to sæt primere # 55 / # 56 og # 56 / # 57, hhv.
Bemærk: Ikke jeg lineariseret pYLEX1 vektor transformeret til Y. lipolytica Po1g kompetente celler for at bestemme transformationseffektiviteten ved at tælle antalletaf kolonidannende enheder (cfu) pr ug plasmid-DNA anvendes 23.
- Kompetent forberedelse celle
2. Marker Rescue
- Konstruktion af Cre-ekspressionsplasmidet
- Konstruktion af pYLEX1-CRE og pYLEX1-HPH
- Design primere 20 for PCR amplificere de åbne læserammer af CRE og hph. Tilføje en ekstra adeninnukleotid opstrøms for startkodoner i de fremadrettede primere # 82 og # 84, og indsætte Kpnl restriktionssites nedstrøms for stopkodoner i de reverse primere # 83 og # 85. PCR amplificere de åbne læserammer af cre og HPH fra pSH69 (tiltrædelse nummer HQ412578) 24 som pr tabel 2.
- Oprense både cre og HPH fragmenter ved anvendelse af et PCR-oprensningskit ifølge producentens anvisninger. Digest både de oprensede CRE og HPH fragmenter med Kpnl enzym som pr TablE 4. dobbelt fordøjelse af pYLEX1 plasmidet med Pml og Kpnl enzymer som pr tabel 4. Oprens fordøjelse ved anvendelse af en PCR-oprensningskit ifølge producentens instruktioner.
- Brug T4 DNA ligase som pr tabel 3 at ligere de oprensede og spaltet CRE og HPH fragmenter til Pml I / Kpn I-stederne i Y. lipolytica ekspressionsvektor, hvilket gav pYLEX1-CRE og pYLEX1-HPH hhv.
- Konstruktion af pSL16-CRE-HPH
- PCR amplifikation promotor-gen-terminator-kassetten af cre fra pYLEX1-CRE anvendelse af primere # 86 / # 87 flankerende Sall / Pst I-restriktionssteder som pr tabel 2. Oprens PCR-produkt under anvendelse af et PCR-oprensningskit ifølge producentens instruktioner .
- Dobbelt fordøjelse både det oprensede PCR-produkt og pSL16-CEN1-1 (227) plasmid 25 med Sall ogPstI enzymer som pr tabel 4. Oprens fordøjelse ved anvendelse af en PCR-oprensningskit ifølge producentens instruktioner. Derefter ligere oprenset og spaltet PCR produkt ind pSL16-CEN1-1 (227) ved de tilsvarende sider for at skabe pSL16-CRE anvendelse af T4 DNA ligase som pr tabel 3.
- PCR amplifikation promotor-gen-terminator-kassetten af hph fra pYLEX1-HPH anvendelse af primere # 88 / # 89 flankerende Xhol / Bglll restriktionssites som pr tabel 2. Oprens PCR-produkt under anvendelse af et PCR-oprensningskit ifølge producentens instruktioner .
- Dobbelt fordøjelse både det oprensede PCR-produkt og pSL16-CRE plasmidet med XhoI og BglII enzymer som pr tabel 4. Oprens fordøjelse ved anvendelse af en PCR-oprensningskit ifølge producentens instruktioner. Derefter ligere oprenset og spaltet PCR produkt ind pSL16-CRE ved den tilsvarendesider for at generere pSL16-CRE-HPH anvendelse af T4 DNA ligase som pr tabel 3.
Bemærk: Det resulterende Cre ekspressionsplasmid, pSL16-CRE-HPH, huser en selekterbar hygromycin B-markør og er et centromerisk og episomalt replikerende vektor (figur 2).
- Dobbelt fordøjelse både det oprensede PCR-produkt og pSL16-CRE plasmidet med XhoI og BglII enzymer som pr tabel 4. Oprens fordøjelse ved anvendelse af en PCR-oprensningskit ifølge producentens instruktioner. Derefter ligere oprenset og spaltet PCR produkt ind pSL16-CRE ved den tilsvarendesider for at generere pSL16-CRE-HPH anvendelse af T4 DNA ligase som pr tabel 3.
- Kontrollere alle konstruktionerne ved spaltning med passende restriktionsenzymer (f.eks Sall / Pstl, for at udskære insertet fra vektoren), som pr tabel 4.
- PCR amplifikation promotor-gen-terminator-kassetten af cre fra pYLEX1-CRE anvendelse af primere # 86 / # 87 flankerende Sall / Pst I-restriktionssteder som pr tabel 2. Oprens PCR-produkt under anvendelse af et PCR-oprensningskit ifølge producentens instruktioner .
- Konstruktion af pYLEX1-CRE og pYLEX1-HPH
- Cre-rekombinase-medieret markør rednings
- Transform pSL16-CRE-HPH i kompetente celler af Ku70 knockout stammen følge fremgangsmåden beskrevet i afsnit 1.2 ovenfor, transformation protokol. Plate transformerede celler på YPD plus hygromycin B (YPDH) plader (indeholdende 400 ug / ml hygromycin B) og inkuber ved 30 ° C i 2-3 dage.
- Udfør koloni PCR som pr tabel 5 under anvendelse af primere # 84 / # 85 for at identificere positivekolonier indeholdende pSL16-CRE-HPH plasmidet efter transformation.
Bemærk: Den fremadrettede primer # 84 og den reverse primer # 85 er placeret inde den kodende region af hph-genet (tabel 1). Kun positive kloner generere et specifikt PCR-produkt i PCR-reaktionen. - Vælg en positiv klon og pode i 2 ml YPDH medium og inkuberes i en 30 ° C rysteinkubator ved 225 rpm natten over til mætning. Mål celle OD 600 med et spektrofotometer. Cellerne høstes ved en OD600 på ~ 15. Centrifuger ved 5000 xg i 5 min ved stuetemperatur, og vask en gang med 2 ml sterilt vand.
- Re-pode celler i 2 ml YPD-medium med en indledende OD600 på 0,1 og lade cellerne vokse i en 30 ° C rysteinkubator ved 225 rpm natten over. Streak overnight cellekultur på YPD-plader til isolering af enkeltkolonier 23. Replika plade kolonier onto YPD, YPDH, og leucin-deficiente plader 23 Bemærk: Kolonier, der har mistet både LEU2 markør og pSL16-CRE-HPH plasmid kan kun vokse på YPD-plader (figur 3).
3. Sletning af alkoholdehydrogenase og alkohol oxidasegener
- Foretag en søgning på Y. lipolytica genom database ved hjælp af Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) at identificere de gen-kandidater til sletning 26. Input proteinsekvensen af S. cerevisiae alkohol dehydrogenase jeg i BLAST søgeværktøj (http://www.genome.jp/tools-bin/search_sequence?prog=blast&db=yli&seqid=aa).
Bemærk: BLAST søgeværktøj returnerer de tilsvarende proteinsekvenser i Y. lipolytica-genomet database. - Konstruere sletning kassetter ved PCR med primere # 7 til # 56 (tabel 1), og udfører restriktionsenzym fordøjelse og ligeringsreaktioner med de samme metoder som beskrevet i afsnit 1.1 ovenfor.
- Forbereder kompetente celler af Ku70 knockout-stammen, udføre transformationer og udføre PCR til at identificere positive kolonier med primere # 55, # 58 til # 81 (tabel 1) ved at følge protokollen beskrevet i afsnit 1.2 ovenfor.
Bemærk: Som et eksempel er fremgangsmåden for YALI0E17787g gendeletion beskrevet i figur 4 og 5. Virkningerne af 1 kb og 2 kb lange homologe region på homolog rekombination sats er rapporteret.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det lineariserede Y. lipolytica ekspressionsvektor blev indsat i pBR docking platform i genomet af Y. lipolytica Po1g stammen ved at udføre en enkelt overkrydsningsrekombination 27. Ved at bruge den hurtige kemisk omdannelse proceduren i denne undersøgelse, det lineariserede Y. lipolytica ekspressionsvektor blev succesfuldt transformeret til vildtype Po1g tøjningen ved en transformationseffektivitet på> 100 cfu / ug DNA. En knockout-kassette flankeret af 1 kb homologe sekvenser blev omdannet til Po1g stammen og Ku70-genet blev slettet (figur 1). Her, den fremadrettede primer # 56 annealer til sekvensen placeret i 5'homologiarm af Ku70 genet. Den reverse primer # 55 er placeret inde i kodende region af LEU2 markør. Den reverse primer # 57 er placeret inde i kodende region af Ku70 genet. Hvordannogensinde, ud af over 200 kolonier, blev kun en positiv koloni med det deleterede Ku70 genet observeret, hvilket tyder på en meget lav gendeletion sats (<0,5%). Efterfølgende blev en replikative plasmid, der bærer hygromycin B-resistens markør og Cre / LoxP opbygget (figur 2), og selektionsmarkørgen i Ku70 knockout-stammen blev til sidst fjernet ved ekspression af Cre-rekombinase (figur 3). Anvendelse af BLAST søgeværktøj blev elleve putative alkohol dehydrogenase gener og en alkohol oxidase genet identificeret i Y. lipolytica-genomet. De formodede alkohol dehydrogenase gener er YALI0E17787g, YALI0D25630g, YALI0A16379g, YALI0E15818g, YALI0D02167g, YALI0A15147g, YALI0E07766g, YALI0F09603g, YALI0B10175g, YALI0F08129g, YALI0E07810g. Det formodede alkohol oxidase genet er YALI0B14014g. For at verificere stigningen i gendeletion sats efter sletning af Ku70 genet, vi individuelt slettet 11 gener i parallel (undtagenfor YALI0A16379g) ved hjælp af forstyrrelser kassetter med lange homologe sekvenser i Y. lipolytica Ku70 knockout-stammen (figurerne 4 og 5). Her er de fremadrettede primere (P1-F og P2-F) annealer til sekvensen placeret i 5'homologiarm af målgener. De reverse primere (P1-R) er placeret inde den kodende region af LEU2 markør. De reverse primere (P2-R) er placeret inde den kodende region af målgener (figur 4). De knock-out kassetter afviger kun lidt i længderne af de homologe sekvenser og restriktionssteder (tabel 1). Gendeletion satser [homolog rekombination / (homolog rekombination + non-homolog rekombination)] på 33% -71% blev opnået, hvilket tyder på en dramatisk stigning i den målrettede homolog rekombination frekvens over Ku70 gendeletionen. For eksempel deletionen på YALI0E17787g var 40% (~ 100 cfu / ug DNA). EndvidereMuligheden for yderligere stigning i gendeletion rate blev undersøgt ved længere homologe sekvenser blev anvendt. Det viste, at YALI0E17787g genet forstyrrelser kassette med 2 kb homologe sekvenser gav en sletning på 87,5% (~ 400 cfu / ug DNA). Desuden blev der indført selektionsmarkørgen LEU2 i de opnåede deletionsmutanter fjernes ved at transformere vektoren pSL16-CRE-HPH (hp4d- cre, HPH), således at flere runder af målgenet manipulationer.
Figur 1. Konstruktion af Ku70 knockout kassetten og Ku70 mutant. A. Den Ku70 knockout plasmid T-KO. B. Det skematiske diagram af Ku70 knockout kassetten. Opstrøms og nedstrøms reregioner (1 kb) af Ku70 genet blev klonet til 5'- og 3'-enden af forstyrrelser kassette til homolog rekombination. LEU2 ekspressionskassetten blev indsat mellem to homologe flankerende sekvenser. C. Gelelektroforese af Ku70 deletionskassetten efter Sac II og NdeI-fordøjelse fra T-KO. L: 1 kb DNA-stige; 1: Ku70 sletning kassette (den forventede band størrelse er 4,3 kb) D.. PCR bekræftelse af Ku70 gendeletion i Y. lipolytica Po1g. PCR-produkter blev amplificeret fra genomisk DNA af transformanter (bane 1-10) og vildtypestamme (bane 11). Bane 7 illustrerer en positiv knockout, mens bane 1 viser en falsk positiv. I den øverste gel, er et fragment på 500 bp opnået med primersæt # 56 / # 57 og er kun fraværende i bane 1 og 7. I den nederste gel, de vellykkede knockouts generere et fragment på 750 bp, som er opnået med primersættet # 55 / # 56. Than 750 bp-båndet er kun set i bane 7. L:. 1 kb DNA Ladder Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Skematisk diagram af Cre-rekombinase ekspressionsplasmid for markering redning. Den episomalt replikerende plasmid pSL16-CRE-HPH bærer et Cre-rekombinase (CRE), en hygromycin B-resistens markør (HPH), et ampicillinresistensgen (amp), en replikationsinitieringssted af Escherichia coli (pMB1), et replikationsstartsted af Y. lipolytica (ORI1001), en centromer DNA sekvens af Y. lipolytica (CEN1-1) og et lacZ gen, der koder for enzymet β-galactosidase. Klik her for at se et større version af dette tal.
Figur 3. Vækst screening af positive markør-mindre Y. lipolytica stammer efter markør redning. Transformanter (1-4) blev fortyndet og spottet på YPD plader, YPDH plader og leucin-mangelfuld plader hhv. Efter 3 dages vækst ved 30 ° C, positive markør-fri transformanter (1, 3, 4) kan kun vokse på YPD plade, hvilket indikerer udskæringen af LEU2 markør-gen efter ekspression af Cre-rekombinase og tabet af plasmid pSL16- CRE-HPH a:. YPD plade, B: YPDH plade, C:. leucin-mangelfuld plade klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Skematisk diagram af målrettet gendeletion og markør redning procedure. Genet afbrydelse kassette består af et udvalg markør gen (LEU2) flankeret af to LoxP anerkendelse sites og to målretning arme (opstrøms og nedstrøms flankerende sekvenser). Efter transformation af afbrydelsen kassetten i Y. lipolytica-celler, forekommer en genudskiftning begivenhed via dobbelt-crossover homolog rekombination inden for de to flankerende homologiarme på locus-målet. To sæt PCR-primere blev anvendt til at verificere integrationen af afbrydelsen kassette (P1-F og P1-R) og samtidig deletion af de målrettede genomiske regioner (P2-F og P2-R). Endelig er LEU2 markør fjernet ved ekspression af Cre-rekombinase, efterlod en enkelt LoxP site ved det kromosomale locus. Målrettet gendeletion og udskiftning af YALI0E17787 gene blev vist her som et eksempel. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. PCR bekræftelse af YALI0E17787 gen afbrydelse i Y. lipolytica Po1g. PCR-produkter var amplificeret fra genomisk DNA af transformanter (bane 1-4) og vildtypestamme (bane 5). Bane 1, 2 og 4 illustrerer positive knockouts, mens bane 3 viser en falsk positiv. I øverste gel, de vellykkede knockouts generere et fragment på 750 bp, som opnås med primersæt P1-F og P1-R. Den 750 bp bånd ses i banerne 1, 2, og 4, men ikke i bane 3 og 5. I den nederste gel, er et fragment på 500 bp opnået med primersæt P2-F og P2-R og er kun til stede i bane 3 and 5. L:. 1 kb DNA Ladder Klik her for at se en større version af dette tal.
Tabel 1. Primere anvendt i denne undersøgelse. Klik her for at downloade denne tabel.
| PCR-komponent | ||
| PCR materialer | Mængder | Endelig koncentration |
| PCR-buffer | 10 pi | 1x |
| dNTP-blanding | 1 pi | 200 uM |
| fremadrettet primer | 2,5 pi | 500 nM </ Td> |
| reverse primer | 2,5 pi | 500 nM |
| DNA-polymerase | 0,5 pi | 1 U |
| DNA-template (fortyndet genomisk eller plasmid DNA) | 0,5-2 ul | 50 ng |
| sterilt vand | op til 50 pi | |
| PCR-betingelser | ||
| Temperatur | Tid | Antal cykler |
| 98 ° C | 30 sek | 1 |
| 98 ° C | 10 sek | 30 |
| 55 ° C | 30 sek | |
| 72 ° C | 30 sek | |
| 72 ° C | 10 min | 1 |
| Udfør PCR-amplifikation under anvendelse af en thermal cycler | ||
Tabel 2. PCR opsætning og betingelser for high-fidelity DNA-polymerase.
| Komponent | |||
| Materialer | Endelig koncentration | ||
| T4 DNA-ligasepuffer | 1x | ||
| vektor-DNA | 0,03 pmol | ||
| indsættelses-DNA | 0,15 pmol | ||
| T4 DNA-ligase | 400 U | ||
| sterilt vand | op til 20 pi | ||
| Betingelser | |||
| Temperatur | Tid | ||
| 16 ° C | 16 timer | ||
| Komponent | |
| Materialer | Endelig koncentration |
| Restriktionsfordøjelse puffer | 1x |
| DNA (plasmid eller PCR-produkt) | 1 ug |
| 1. restriktionsenzym | 5 U |
| 2. restriktionsenzym (valgfrit) | 5 U |
| sterilt vand | op til 50 pi |
| Betingelser | |
| Temperatur | Tid |
| 37 ° C | <td> 6 timer|
| Udfør enkelt fordøjelse med et enkelt restriktionsenzym | |
| Udfør dobbelt fordøjelse med et par restriktionsenzymer | |
Tabel 4. Betingelser for restriktionsenzymfordøjelse af DNA.
| PCR-komponent | ||
| PCR materialer | Mængder | Endelig koncentration |
| PCR-buffer | 2,5 pi | 1x |
| dNTP-blanding | 0,5 pi | 200 uM |
| fremadrettet primer | 0,5 pi | 200 nM |
| ReveRSE primer | 0,5 pi | 200 nM |
| DNA-polymerase | 0,2 pi | 1 U |
| DNA-template (fortyndet genomisk eller plasmid DNA) | 0,5-2 ul | 50 ng |
| sterilt vand | op til 25 pi | |
| PCR-betingelser | ||
| Temperatur | Tid | Antal cykler |
| 95 ° C | 5 min | 1 |
| 95 ° C | 30 sek | 30 |
| 50 ° C | 30 sek | |
| 72 ° C | 30 sek | |
| 72 ° C | 10 min | 1 |
| Udfør PCR-amplifikation under anvendelse af et termisk cykliseringsapparat | ||
| Udfør koloni-PCR direkte anvendelse af en koloni som template, snarere end en DNA-prøve | ||
Tabel 5. PCR / Colony PCR opsætning og betingelser for Taq DNA-polymerase.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vores mål for denne undersøgelse er at give hurtig og effektiv generation af målrettede gen knockouts i Y. lipolytica Po1g stamme. Flere overvejelser skal løses for at opnå dette. Først en høj transformationseffektivitet påkrævet. Således en effektiv og bekvem kemisk omdannelse protokol for Y. lipolytica Po1g stamme blev beskrevet i denne undersøgelse. Anvendelsen af PEG-4000 er en kritisk faktor for vellykket transformation af denne stamme. Ingen transformanter blev opnået for plasmid transformation ved brug PEG-3350 (til transformation af S. cerevisiae) i stedet for PEG-4000. Desuden er fremstillingen af kompetente celler anvendes frisklavet celler kræves for at opnå en høj transformationseffektivitet i denne stamme. For det andet, for at reducere ikke-homolog rekombination og tilfældig integration begivenheder via dominerende NHEJ i denne stamme, blev en effektiv transformationsmetode derefter anvendes til at konstruere KU70 knockout-mutant. For det tredje, for at forbedre effektiviteten af genudskiftning ved homolog rekombination, lange flankerende arme (1 kb) opstrøms og nedstrøms for mål-gener blev anvendt i gendeletion kassetter. De lange flankerende homologe områder i disruption kassetter er afgørende for effektiv homolog rekombination i denne stamme. Ingen positive kolonier blev opnået ved brug af forstyrrelser kassetter med 50 bp homologe regioner (tilstrækkelige til effektiv homolog rekombination i S. cerevisiae). Ved hjælp af alle disse strategier, den Ku70 genet fra Y. lipolytica Po1g stamme blev slettet. Ikke desto mindre er det yderst vanskeligt at opnå den Ku70 knockout-stammen på grund af meget høje ikke-homolog rekombination i Y. lipolytica Po1g stamme. Der skal udvises forsigtighed ved håndtering af antibiotika hygromycin B holdige medier som hygromycin B er lysfølsomt. Brug af medier med forringet hygromycin B vil resultere i falsk positives i trin 2.2.1 og 2.2.2 og falske negativer i trin 2.2.7.
Når Ku70 deletion-stamme blev anvendt til at generere målrettet deletion af enkelte gener, der koder alkoholdehydrogenaser og alkoholoxidase blev en meget højere deletion, der opnås i forhold til deletion af Ku70 genet. Den viser, at anvendelsen af Ku70 deletion platform stamme resulterede i en dramatisk stigning i homolog rekombination frekvens. Efter udstedelse af meget lav homolog rekombination sats var rettet til, screening af Y. lipolytica single-gen knockout mutanter var stærkt drønede op. Vi bemærkede også, at 1 kb længde homologe region var effektiv nok til målrettet gendeletion. En stigning i homolog rekombination frekvens kunne opnås, når der anvendes længere homologe sekvenser (2 kb). Især disse gener koder alkoholdehydrogenaser og alkoholoxidase, som katalyserer den reversible omdannelse mellem alkoholer og ALDehydes. Udeladelsen af disse gener kan føre til øget akkumulering af biobrændstoffer og biokemiske forbindelser, herunder kortkædede fedtsyrer, mellemlange kæder fedtsyrer, langkædede fedtsyrer, hydroxy fedtsyrer, alkoholer, aldehyder og lipider. Yderligere undersøgelser vil blive udført for at verificere denne mulighed.
Et PCR-medieret genafbrydelse metode er blevet rapporteret i Y. lipolytica Po1d stammen 28. Men denne metode er besværlig og tidskrævende. En væsentlig begrænsning ved denne metode er vanskeligheden ved at opnå tilstrækkelige mængder af de gendeletion kassetter for én transformationsforsøg. En anden begrænsning er, at denne metode er begrænset til URA3 markør. Beskrevet i denne undersøgelse metode specifikt disse spørgsmål i PCR-baseret teknik ved at kombinere fordøjelsen-ligation tilgang og Cre / LoxP system. Denne fremgangsmåde tillader brugen af forskellige antibiotiske og auxotrofe markører og er således mere versaflise. Det kan lette hurtig gendeletion i Y. lipolytica Po1g stamme. Vi heri præsenterer en detaljeret beskrivelse af det målrettede single-gendeletion strategi gennem homolog rekombination i Y. lipolytica Po1g celler. Men en loxP-sted forbliver som et ar i genomet efter den vellykkede markørredning (figur 4). I multiple-gendeletion, multiple LoxP ar indføres i genomet, og dette kan resultere i genomisk ustabilitet på grund af potentielle rekombinationsbegivenheder, der kan opstå mellem loxP-steder. Alligevel knockout-stammer konstrueret på denne undersøgelse viste meget god genetisk stabilitet, hvilket indikerer, at utilsigtede rekombinationsbegivenheder ikke skete mellem loxP-steder.
Sammenfattende er der etableret en effektiv genetisk transformation protokol for Y. lipolytica Po1g stamme. Den målrettede sletning af enkelte gener i denne stamme blev demonstreret som et proof of concept. Y. lipolytica Po1g Ku70 deletion platform stamme konstrueret på denne undersøgelse viste meget effektiv homolog rekombination frekvens, som muliggør en lettere og hurtigere screening af de målrettede gendeletioner. Således er denne platform stammen giver et mere effektivt system og et bedre valg til applikationer i pathway engineering og stamme optimering ved konstruktion andre kromosomal deletionsmutanter. Den beskrevne metode og den beregnede Ku70 sletning stammen kunne også anvendes til indsættelse af target gener i specifikke loci og oprettelse af stedsspecifikke mutationer i genomet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi takker finansieringen støtte fra National Environment Agency of Singapore (ETRP 1.201.102), den konkurrencedygtig forskning Program for National Research Foundation of Singapore (NRF-CRP5-2009-03), agenturet for Videnskab, Teknologi og forskning Singapore ( 1324004108), Global R & D-projekt Program, Ministeriet for videnøkonomien, Republikken Korea (N0000677), Defense Threat Reduction Agency (DTRA, HDTRA1-13-1-0037) og syntetisk biologi initiativ fra National University of Singapore ( DPRT / 943/09/14).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| Oligonucleotide primers | Integrated DNA Technologies | 25 nmole DNA oligos | |
| Y. lipolytica strain Po1g | Yeastern Biotech | leucine auxotrophic derivative of the wild-type strain W29 (ATCC 20460) | |
| Vector pYLEX1 | Yeastern Biotech | FYY203-5MG | Y. lipolytica expression vector |
| E. coli TOP10 | Invitrogen | For cloning and propagation of plasmids | |
| pGEM-T vector | Promega | A3600 | TA cloning vector |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | For plasmid isolation |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System |
Promega | A9282 | Extract DNA fragments from agarose gels and purify PCR products from an amplification reaction |
| The iProof high-fidelity DNA polymerase |
Bio-Rad | 172-5302 | High-fidelity DNA polymerase |
| BamHI | New England Biolabs | R0136S | Restriction enzyme |
| BglII | New England Biolabs | R0144L | Restriction enzyme |
| KpnI | New England Biolabs | R0142S | Restriction enzyme |
| NdeI | New England Biolabs | R0111S | Restriction enzyme |
| NotI | New England Biolabs | R0189L | Restriction enzyme |
| PmlI | New England Biolabs | R0532S | Restriction enzyme |
| PstI | New England Biolabs | R0140S | Restriction enzyme |
| SacII | New England Biolabs | R0157S | Restriction enzyme |
| SalI | New England Biolabs | R0138S | Restriction enzyme |
| XhoI | New England Biolabs | R0146L | Restriction enzyme |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202L | |
| Taq DNA polymerase | Bio-Rad | M0267L | |
| Ampicillin | Gibco-Life Technologies | 11593-027 | Antibiotics |
| Hygromycin B | PAA | P21-014 | Antibiotics |
| GeneRuler 1 kb DNA ladder | Thermo Scientific | SM0312 | 1 kb DNA ladder |
| PEG4000 | Sigma | 95904-F | |
| Tris | Promega | H5135 | |
| EDTA | Bio-Rad | 161-0729 | |
| Salmon Sperm DNA | Invitrogen | 15-632-011 | |
| Lithium Acetate | Sigma | ||
| Acetic acid | Sigma | ||
| Glass beads (425-600 µm) | Sigma | G8772 | |
| RNAse A | Thermo Scientific | EN0531 | |
| DNA Loading Dye | Thermo Scientific | R0611 | |
| Bacto Yeast Extract | BD | 212750 | |
| Bacto Peptone | BD | 211677 | |
| D-Glucose | 1st Base | BIO-1101 | |
| YNB without amino acids | Sigma | Y0626 | |
| DO Supplement-Leu | Clontech | 630414 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| Difco LB Broth | BD | 244620 | |
| Difco LB Agar | BD | 244520 | |
| Bacto Agar | BD | 214010 | |
| Equipment | |||
| PCR machine | Biorad | T100 Thermal Cycler | |
| Water bath | Memmert | WNB 14 | |
| Stationary/Shaking Incubator | Yihder | LM-570RD | |
| Thermo-shaker | Allsheng | MS-100 | |
| Micro centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Spectrophotometer | Eppendorf | BioPhotometer plus | |
| Gel imager | GE | Amersham Imager 600 |
References
- Jiménez-Bremont, J. F., Rodrìguez-Hernández, A. A., Rodrìguez-Kessler, M. Development and dimorphism of the yeast Yarrowia lipolytica. Dimorphic fungi: Their importance as models for differentiation and fungal pathogenesis. J, R. uiz-H. errera , 58-66 (2012).
- Coelho, M., Amaral, P., Belo, I. Yarrowia lipolytica: an industrial workhorse. Current research, technology and education topics in applied microbiology and microbial biotechnology. Méndez-Vilas, A. , 930-940 (2010).
- Martinez-Vazquez, A., et al. Identification of the transcription factor Znc1p, which regulates the yeast-to-hypha transition in the dimorphic yeast Yarrowia lipolytica. Plos One. 8 (6), e66790 (2013).
- Richard, M., Quijano, R. R., Bezzate, S., Bordon-Pallier, F., Gaillardin, C. Tagging morphogenetic genes by insertional mutagenesis in the yeast Yarrowia lipolytica. J. Bacteriol. 183 (10), 3098-3107 (2001).
- Flores, C. L., Martìnez-Costa, O. H., Sánchez, V., Gancedo, C., Aragòn, J. J. The dimorphic yeast Yarrowia lipolytica possesses an atypical phosphofructokinase: characterization of the enzyme and its encoding gene. Microbiology. 151 (5), 1465-1474 (2005).
- Domìnguez, Á, et al. Non-conventional yeasts as hosts for heterologous protein production. Int. Microbiol. 1 (2), 131-142 (1998).
- Zinjarde, S. S. Food-related applications of Yarrowia lipolytica. Food Chem. 152, 1-10 (2014).
- Finogenova, T., Morgunov, I., Kamzolova, S., Chernyavskaya, O. Organic acid production by the yeast Yarrowia lipolytica: a review of prospects. Appl. Biochem. Micro+. 41 (5), 418-425 (2005).
- Groguenin, A., et al. Genetic engineering of the β-oxidation pathway in the yeast Yarrowia lipolytica to increase the production of aroma compounds. J. Mol. Catal. B-Enzym. 28 (2), 75-79 (2004).
- Meng, X., et al. Biodiesel production from oleaginous microorganisms. Renew. Energ. 34 (1), 1-5 (2009).
- Papanikolaou, S., Aggelis, G. Lipid production by Yarrowia lipolytica growing on industrial glycerol in a single-stage continuous culture. Bioresource Technol. 82 (1), 43-49 (2002).
- Tai, M., Stephanopoulos, G. Engineering the push and pull of lipid biosynthesis in oleaginous yeast Yarrowia lipolytica for biofuel production. Metab. Eng. 15, 1-9 (2013).
- Liu, H. H., Ji, X. J., Huang, H. Biotechnological applications of Yarrowia lipolytica: Past, present and future. Biotechnol. Adv. 33 (8), 1522-1546 (2015).
- Liu, L., Alper, H. S. Draft genome sequence of the oleaginous yeast Yarrowia lipolytica PO1f, a commonly used metabolic engineering host. Genome Announc. 2 (4), e00652-e00614 (2014).
- Dujon, B., et al. Genome evolution in yeasts. Nature. 430 (6995), 35-44 (2004).
- Chen, D. C., Beckerich, J. M., Gaillardin, C. One-step transformation of the dimorphic yeast Yarrowia lipolytica. Appl. Microbial. Biotechnol. 48 (2), 232-235 (1997).
- Wang, J. H., Hung, W., Tsai, S. H. High efficiency transformation by electroporation of Yarrowia lipolytica. J. Microbiol. 49 (3), 469-472 (2011).
- Matsuoka, M., et al. Analysis of regions essential for the function of chromosomal replicator sequences from Yarrowia lipolytica. Mol. Gen. Genet. 237 (3), 327-333 (1993).
- Kretzschmar, A., et al. Increased homologous integration frequency in Yarrowia lipolytica strains defective in non-homologous end-joining. Curr. Genet. 59 (1-2), 63-72 (2013).
- Lorenz, T. C. Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies. J. Vis. Exp. (63), e3998 (2012).
- Kobs, G. Cloning blunt-end DNA fragments into the pGEM-T Vector Systems. Promega Notes. 62, 15-18 (1997).
- JoVE Science Education Database. Isolating Nucleic Acids from Yeast. Essentials of Biology 1: yeast, Drosophila and C. elegans. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: http://www.jove.com/science-education/5096/isolating-nucleic-acids-from-yeast (2016).
- Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques: plating methods. J. Vis. Exp. (63), e3064 (2012).
- Hegemann, J. H., Heick, S. B. Delete and repeat: a comprehensive toolkit for sequential gene knockout in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Methods Mol. Biol. 765, 189-206 (2011).
- Yamane, T., Sakai, H., Nagahama, K., Ogawa, T., Matsuoka, M. Dissection of centromeric DNA from yeast Yarrowia lipolytica and identification of protein-binding site required for plasmid transmission. J. Biosci. Bioeng. 105 (6), 571-578 (2008).
- McGinnis, S., Madden, T. L. BLAST: at the core of a powerful and diverse set of sequence analysis tools. Nucleic Acids Res. 32 ((Web Server issue)), W20-W25 (2004).
- Madzak, C., Tréton, B., Blanchin-Roland, S. Strong hybrid promoters and integrative expression/secretion vectors for quasi-constitutive expression of heterologous proteins in the yeast Yarrowia lipolytica. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 2 (2), 207-216 (2000).
- Nicaud, J. M., Le Clainche, A., Le Dall, M. T., Wang, H., Gaillardin, C. Yarrowia lipolytica, a yeast model for the genetic studies of hydroxy fatty acids biotransformation into lactones. J. Mol. Catal. B-Enzym. 5 (1), 175-181 (1998).
Tags
Genetik Bioengineering Ukonventionel gær,
Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.
