Abstract
Yarrowia lipolytica ist ein nicht-pathogen, dimorphic und streng aeroben Hefe - Arten. Aufgrund seiner besonderen physiologischen Eigenschaften und metabolischen Eigenschaften, diese unkonventionelle Hefe ist nicht nur ein gutes Modell für die Untersuchung der grundlegenden Natur der Pilz-Differenzierung, sondern auch eine vielversprechende mikrobielle Plattform für biochemische Produktion und verschiedene biotechnologische Anwendungen, die umfangreiche genetische Manipulationen erfordern. Allerdings genetische Manipulationen von Y. lipolytica sind begrenzt aufgrund des Fehlens einer effizienten und stabilen genetischen Transformationssystems sowie sehr hohe Raten von nicht-homologe Rekombination , die vor allem auf die KU70 - Gen zugeschrieben werden. Hier berichten wir über ein einfaches und schnelles Protokoll für die effiziente genetische Transformation und für die Gen - Deletion in Y. lipolytica Po1g. Zuerst wird ein Protokoll für die effiziente Transformation von exogener DNA in Y. lipolytica Po1g gegründet wurde. Second, die verbesserte Doppel-crossover homologe Rekombinationsrate für weitere Deletion von Zielgenen zu erreichen, wurde das KU70 - Gens durch Transformieren einer Unterbrechungskassette tragenden 1 kb Homologiearme gelöscht. Drittens die verstärkte Gen - Deletion Effizienz nach dem Löschen des KU70 - Gens zu zeigen, löschten wir einzeln 11 Zielgene kodieren , Alkoholdehydrogenase und Alkohol - Oxidase die gleichen Verfahren auf der KU70 - Knockout - Plattform Stamm verwenden. Es wurde beobachtet, dass die Rate der präzisen homologe Rekombination im wesentlichen von weniger als 0,5% für die Löschung erhöht des KU70 - Gens in Po1g auf 33% -71% für das einzelne Gen - Deletion der 11 Zielgene in Po1g KU70 Δ. Eine replikative Plasmid, das das Hygromycin B-Resistenzmarker und das Cre / loxP-Systems trug konstruiert, und das Selektionsmarker-Gen in der Hefe knockout Stämme wurde schließlich durch die Expression von Cre-Rekombinase entfernt, um mehrere Runden targe erleichternted genetische Manipulationen. Die sich daraus ergebenden Einzel Gen-Deletionsmutanten haben potentielle Anwendungen in der Biokraftstoff- und Biochemie Produktion.
Introduction
Im Gegensatz zu Saccharomyces cerevisiae, Yarrowia lipolytica, eine unkonventionelle Hefe kann in Form von Hefe oder Mycel in Reaktion auf Änderungen der Umgebungsbedingungen 1,2 wachsen. Somit ist diese dimorphic Hefe kann für die Untersuchung der Pilzdifferenzierung, Morphogenese und Taxonomie 3,4,5 als gutes Modell verwendet werden. Es wird allgemein als sicher (GRAS) Hefearten angesehen, die allgemein verwendet wird , eine Vielzahl von Lebensmittelzusatzstoffen, wie organische Säuren zu produzieren, Polyalkoholen, Aromastoffen, Emulgatoren und oberflächenaktive Mittel 6,7,8,9. Es ist ein obligat aerob und eine bekannte ölige Hefe fähig ist natürlich Lipide bei hohen Mengen, dh bis zu 70% des Zelltrockengewicht 10 ansammeln. Es kann auch ein breites Spektrum von Kohlenstoffquellen für das Wachstum, einschließlich verschiedener Arten von Rückständen in Abfallressourcen als Nährstoffe 11,12,13 nutzen. All diese einzigartigen Eigenschaften machen Y. lipolytica sehr attraktiv fürverschiedene biotechnologische Anwendungen.
Obwohl die gesamte Genomsequenz des Y. lipolytica hat 14,15, genetische Manipulation dieser unkonventionellen Hefe veröffentlicht worden ist komplexer als andere Hefearten. Erstens Transformation dieser Hefearten ist viel weniger effizient aufgrund des Fehlens eines stabilen und effizienten genetischen Transformationssystem 16,17. Zweitens mühselige genomische Integration von linearen Expressionskassetten für die Expression von Genen von Interesse allgemein verwendet , da kein natürlicher episomal Plasmid System in dieser Hefe 18 gefunden. Drittens Generation von genetischen Knock-Outs und Knock-Ins begrenzt, da das Gen Effizienz durch genaue homologe Rekombination in dieser Hefe - Targeting ist gering , und die meisten Integrationsereignisse auftreten , durch nicht-homologe Endverbindung (NHEJ) 19.
In dieser Studie berichten wir einen optimierten Transformationsprotokoll für die Y. lipolytica KU70 - Gen, das ein Schlüsselenzym in dem NHEJ Stoffwechselweg kodiert. Durch die optimierte Transformationsprotokoll verwendet und eine lineare Knockout - Kassette transformiert enthält flankierenden Homologiebereiche von 1 kb, das KU70 Gen des Y. lipolytica Po1g wurde erfolgreich gelöscht. Die Robustheit dieser Gen - Deletion Methodik wurde dann durch gezielte Alkoholdehydrogenase und Alkohol - Oxidase - Gene in der Po1g KU70 Δ Stamm demonstriert. Es wurde beobachtet , dass die KU70 Deletionsstamms eine wesentlich höhere Effizienz der homologen Rekombination vermittelten Gen zeigten Targeting als die des Wildtyp - Po1g Stamm. Zusätzlich wurde eine replikative Cre Expressionsplasmid den Hygromycin B-Resistenzmarker trägt, konstruiert marker rescue auszuführen. Die Markerrettung erleichtert mehrere Runden von Gen in th Targetinge Gen-Deletionsmutanten erhalten. Neben Gen - Deletion, unser Protokoll für die genetische Transformation und Gen - Deletion hier beschrieben sind, können auf Gene auf bestimmte Loci einfügen angewendet werden, und die ortsspezifische Mutationen in den Y. einführen lipolytica - Genoms.
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Protocol
1. Erzeugung des Y. lipolytica KU70 Deletionsstamms
- Der Bau der Disruptionskassette
Anmerkung: Siehe Tabelle 1 für alle Primer in der Polymerasekettenreaktion (PCR) Amplifikationen verwendet.- Design Primer 20 der PCR die LEU2 Expressionskassette amplifizieren (siehe Tabelle 1) von einer Y. lipolytica Expressionsvektor und LoxP - Stellen in den 5'- und 3' - Enden der LEU2 Kassette mit einem langen Vorwärtsprimer (# 1; Tabelle 1) einzuführen , und einem langen Rückwärtsprimer (# 2; Tabelle 1), respectively. Um eine zusätzliche Restriktionsstelle für nachfolgende Schritte des Klonprozess einzuführen, fügen Sie eine Einschränkung Bam HALLO Website in Primer # 1.
- Führen PCR unter Verwendung eines High-fidelity DNA - Polymerase , wie in Tabelle 2 aufgeführt.
- Reinige das PCR-Produkt LoxP--Promotor-LEU2-Terminator-loxP Kassette ein PCR-purificatio mitn-Kit nach den Anweisungen des Herstellers. Hinzufügen , 3'-A - Überhänge an den gereinigten PCR - Produkt gemäß den Anweisungen des Herstellers 21. Verwendung von T4 - DNA - Ligase die A-tailed PCR - Produkt in einen TA - Klonierungsvektor abzubinden das Plasmid T-LEU2 gemäß Tabelle 3 zu ergeben.
- PCR das 1 kb 5' - stromaufwärts - Sequenz der Primer # 3 / # 4 von der Y. Verwendung KU70 Gen amplifizieren lipolytica Po1g genomische DNA 22 gemäß Tabelle 2. Man reinige das PCR - Produkt einer PCR Purification Kit nach den Anweisungen des Herstellers.
- Doppel verdauen sowohl das gereinigte PCR - Produkt und T-LEU2 - Plasmid mit Sac II und Bam HALLO Enzyme gemäß Tabelle 4. Reinige den Verdauungsgemisch ein PCR Purification Kit nach den Anweisungen des Herstellers verwendet wird . Verwenden Sie T4 - DNA - Ligase das gereinigte und verdaute PCR - Produkt der Sac II / Bam HALLO - Stellen von T-LEU2 abzubinden die zu ergebenPlasmid T-LEU2-5E gemäß Tabelle 3.
- PCR das 1 kb 3 'Downstream - Sequenz der Primer # 5 / # 6 von der Y. Verwendung KU70 Gen amplifizieren lipolytica Po1g genomische DNA 22 gemäß Tabelle 2. Man reinige das PCR - Produkt einer PCR Purification Kit nach den Anweisungen des Herstellers. Doppel verdauen sowohl das gereinigte PCR - Produkt und T-LEU2-5E Plasmid mit Not I und Nde I - Enzyme gemäß Tabelle 4.
- Man reinigt den Verdauungsmischung ein PCR-Reinigungs-Kits gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet wird. Dann abzubinden das gereinigte und verdaute PCR - Produkt der Not I / Nde I - Stellen von T-LEU2-5E 3 das Plasmid T-KO unter Verwendung von T4 - DNA - Ligase gemäß Tabelle zu erhalten.
- Digest das Plasmid T-KO mit Sac II und Nde I - Enzyme gemäß Tabelle 4 die Disruptionskassette zu erzeugen (Abbildung 1
- Kompetente Zellpräparation und Transformation von Y. lipolytica Po1g Stamm
- Kompetente Zellpräparation
- Impfen eine Kolonie von Y. lipolytica Po1g Stamm aus einem frischen Hefeextrakt-Pepton-Dextrose (YPD) Platte in 10 ml YPD - Medium (1% Hefeextrakt, 2% Pepton, 2% Dextrose und 50 mM Citrat - Puffer pH 4,0) in einem 100 ml Kolben. Inkubieren in einem 30 ° C Schüttelinkubator bei 225 UpM für 20 Stunden bis zur Sättigung (eine OD 600 von etwa 15, unter Verwendung eines Spektrophotometers gemessen).
- Pelletieren Sie die Zellen durch 5 min bei 5000 xg bei Raumtemperatur zentrifugiert. Waschen der Zellen mit 20 ml Tris-EDTA (TE) -Puffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7,5) und pelletieren Sie die Zellen wie in Schritt 1.2.1.2 beschrieben. Resuspendieren der Zellen in 1 ml 0,1 M Lithiumacetat (pH 6,0, eingestellt mit Essigsäure) und Inkubation bei Raum tempe für 10 minrature.
- Aliquot der kompetenten Zellen (100 ul) in sterile 1,5 ml-Röhrchen. Fahren Sie mit den Transformationsschritte unten sofort, oder fügen Glycerin bis zu einer Endkonzentration von 25% (v / v) und bei -80 ° C für die Langzeitlagerung.
- Transformation
- vorsichtig mischen 10 ul denaturiertes Lachssperma-DNA (10 mg / ml) und 1-5 ug der gereinigten Unterbrechungskassette zusammen mit 100 ul kompetenter Zellen und Inkubieren bei 30 ° C für 15 min.
- In 700 ul 40% Polyethylenglykol (PEG) -4000 (gelöst in 0,1 M Lithiumacetat pH 6,0), gut mischen und Inkubation in einem 30 ° C Schüttelinkubator bei 225 rpm für 60 min.
Hinweis: Es ist wichtig, zu verwenden PEG mit einem mittleren Molekulargewicht von 4000, anstelle von PEG-3350 (typischerweise bei der Transformation von herkömmlichen Hefe verwendet). - Hitzeschock Das Transformationsgemisch durch das Rohr in einem 39 ° C Wasserbad für 60 min platziert.
- 1 ml YPD-Medium undbei 30 ° C und 225 Upm für 2 Stunden erholen. Zentrifuge bei 9.000 × g für 1 min bei Raumtemperatur, entfernen Sie den Überstand und das Pellet in 1 ml TE-Puffer.
- Repellet die Zellen durch Zentrifugation bei 9.000 × g für 1 min bei Raumtemperatur und der Überstand verworfen. Resuspendieren des Pellets in 100 ul Puffer TE und Platte auf selektiven Platten (zB Leucin-defizienten Platten), und Inkubation für 2-3 Tage bei 30 ° C.
- Pick 4 bis 10 Einzelkolonien und inokulieren getrennt in 2 ml YPD-Medium. Inkubieren über Nacht in einem 30 ° C Schüttelinkubator bei 225 Umdrehungen pro Minute. Identifizierung positiver Kolonien durch PCR - Analyse der genomischen DNA aus den Trans 22 gemäß Tabelle 5 unter Verwendung von zwei Sätzen von Primern # 55 / # 56 und # 56 / # 57, respectively.
Hinweis: Die nicht linearisiert ich pYLEX1 Vektor in Y. umgewandelt wird lipolytica Po1g kompetente Zellen , um die Transformationseffizienz zu bestimmen , indem die Zahl Zählenkoloniebildenden Einheiten (cfu) pro & mgr; g Plasmid - DNA verwendet 23.
- Kompetente Zellpräparation
2. Marker-Rettung
- Der Bau des Cre-Expressionsplasmid
- Der Bau der pYLEX1-CRE und pYLEX1-HPH
- Design - Primer 20 der PCR , die offene Leserahmen von cre und hph verstärken. Fügen Sie ein zusätzliches Adeninnukleotid vor den Start - Codons in den Forward - Primer # 82 und 84 #, und fügen Sie KpnI Restriktionsstellen stromabwärts der Stop - Codons in den Reverse - Primern # 83 und # 85 PCR die offene Leserahmen von cre verstärken und hph von pSH69 (Zugangsnummer HQ412578) 24 gemäß Tabelle 2.
- Reinige sowohl cre und hph - Fragmente eine PCR Purification Kit nach den Anweisungen des Herstellers. Digest sowohl die gereinigten cre und hph Fragmente mit KpnI wie pro Tabl Enzyme 4. Verdoppeln Sie die pYLEX1 Plasmid mit Pml I und Kpn I Enzyme verdauen gemäß Tabelle 4. Man reinigt den Verdauungsmischung ein PCR - Reinigungs - Kits gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet wird .
- Verwenden Sie T4 - DNA - Ligase gemäß Tabelle 3 die gereinigten und verdaut cre und hph Fragmente PML I / KpnI - Stellen des Y. abzubinden lipolytica Expressionsvektor, wodurch man pYLEX1-CRE und pYLEX1-HPH sind.
- Der Bau der pSL16-CRE-HPH
- PCR amplifizieren den Promotor-Gen-Terminator - Kassette des cre von pYLEX1-CRE Primern 86 # / # 87 flankieren die Sal I / Pst I - Restriktionsstellen gemäß Tabelle 2. Das PCR - Produkt einer PCR Purification Kit Reinige Verwendung gemäß den Anweisungen des Herstellers .
- Doppel verdauen sowohl das gereinigte PCR - Produkt und pSL16-CEN1-1 (227) Plasmid 25 mit Sal I undPst I - Enzyme gemäß Tabelle 4. Man reinigt den Verdauungsmischung ein PCR - Reinigungs - Kits gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet wird . Dann ligieren das gereinigte und verdauten PCR - Produkts in pSL16-CEN1-1 (227) an den entsprechenden Stellen pSL16-CRE unter Verwendung von T4 DNA - Ligase gemäß Tabelle 3 zu schaffen.
- PCR amplifizieren den Promotor-Gen-Terminator - Kassette von hph von pYLEX1-HPH Primern # 88 / # 89 flankieren die Xho I / Bgl II - Restriktionsstellen gemäß Tabelle 2. Man reinige das PCR - Produkt einer PCR - Purification - Kit nach den Anweisungen des Herstellers .
- Doppel verdauen sowohl das gereinigte PCR - Produkt und pSL16-CRE Plasmids mit Xho I und Bgl II - Enzyme gemäß Tabelle 4. Reinige den Verdauungsgemisch ein PCR Purification Kit nach den Anweisungen des Herstellers verwendet wird . Dann ligieren das gereinigte und verdauten PCR-Produkts in pSL16-CRE an dem entsprechendenWebsites pSL16-CRE-HPH unter Verwendung von T4 - DNA - Ligase gemäß Tabelle 3 zu erzeugen.
Anmerkung: Die resultierende Cre Expressionsplasmids pSL16-CRE-HPH, einen selektierbaren Hygromycin B Marker trägt und eine Zentromer und episomal replizierender Vektor (Abbildung 2).
- Doppel verdauen sowohl das gereinigte PCR - Produkt und pSL16-CRE Plasmids mit Xho I und Bgl II - Enzyme gemäß Tabelle 4. Reinige den Verdauungsgemisch ein PCR Purification Kit nach den Anweisungen des Herstellers verwendet wird . Dann ligieren das gereinigte und verdauten PCR-Produkts in pSL16-CRE an dem entsprechendenWebsites pSL16-CRE-HPH unter Verwendung von T4 - DNA - Ligase gemäß Tabelle 3 zu erzeugen.
- Stellen Sie sicher , alle Konstrukte durch Spaltung mit geeigneten Restriktionsenzymen (zB Sal I / Pst I, den Einsatz aus dem Vektor auszuschneiden) gemäß Tabelle 4.
- PCR amplifizieren den Promotor-Gen-Terminator - Kassette des cre von pYLEX1-CRE Primern 86 # / # 87 flankieren die Sal I / Pst I - Restriktionsstellen gemäß Tabelle 2. Das PCR - Produkt einer PCR Purification Kit Reinige Verwendung gemäß den Anweisungen des Herstellers .
- Der Bau der pYLEX1-CRE und pYLEX1-HPH
- Cre-Rekombinase-vermittelte Markerrettung
- Verwandeln pSL16-CRE-HPH in kompetente Zellen des KU70 - Knockout - Stamm nach dem Transformationsprotokoll in Punkt 1.2 beschriebenen. Platte transformierten Zellen auf YPD und Hygromycin B (YPDH) -Platten (enthaltend 400 ug / ml Hygromycin B), und Inkubieren bei 30 ° C für 2-3 Tage.
- Führen Kolonie - PCR gemäß Tabelle 5 unter Verwendung der Primer # 84 / # 85 zu identifizieren positiveKolonien pSL16-CRE-HPH-Plasmid nach der Transformation enthält.
Anmerkung: Der Vorwärts - Primer # 84 und der Rückwärts - Primer # 85 sind innerhalb der kodierenden Region des hph - Gens befindet (Tabelle 1). Nur positive Klone, die ein spezifisches PCR-Produkt in der PCR-Reaktion zu erzeugen. - Wählen Sie einen positiven Klon und impfen in 2 ml YPDH Medium und Inkubation in einem 30 ° C Schüttelinkubator bei 225 rpm über Nacht bis zur Sättigung. Messen Sie die Zelle OD 600 mit einem Spektralphotometer. Ernte der Zellen bei einer OD 600 von ~ 15. Zentrifuge bei 5.000 xg für 5 min bei Raumtemperatur und wäscht einmal mit 2 ml sterilem Wasser.
- Re-inokulieren Zellen in 2 ml YPD - Medium mit einer anfänglichen OD 600 von 0,1 und lassen die Zellen über Nacht in einem 30 ° C Schüttelinkubator bei 225 Upm wachsen. Streak die über Nacht Zellkultur auf YPD - Platten einzelne Kolonien 23 zu isolieren. Replica Platte Kolonien auf YPD, YPDH und Leucin-defizienten Platten 23 Hinweis: Die Kolonien , die sowohl LEU2 - Marker und pSL16-CRE-HPH Plasmid , das nur auf YPD - Platten (Abbildung 3) verloren haben , wachsen können.
3. Löschen von Alkoholdehydrogenase und Alkohol-Oxidase-Gene
- Führen Sie eine Suche auf dem Y. lipolytica Genomdatenbank des Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) mit Hilfe der Gen - Kandidaten für die 26 Löschung zu identifizieren. Geben Sie die Proteinsequenz von S. cerevisiae Alkoholdehydrogenase I in BLAST - Suchwerkzeug (http://www.genome.jp/tools-bin/search_sequence?prog=blast&db=yli&seqid=aa).
Hinweis: Die BLAST - Suchwerkzeug die ähnlichsten Proteinsequenzen in der Y. zurück lipolytica Genomdatenbank. - Konstruiere die Löschkassetten durch PCR mit den Primern # 7 und # 56 (Tabelle 1), und führen Restriktionsenzym - Verdau und Ligationsreaktionen unter Verwendung der gleichen Verfahren wie oben in 1.1 beschrieben.
- PrepNach dem Protokoll in Punkt 1.2 beschriebenen positiven Kolonien # 55, # 58 bis 81 # mit Primern zu identifizieren (Tabelle 1) sind kompetente Zellen des KU70 - Knockout - Stamm, Umwandlungen durchführen und PCR durchführen.
Anmerkung: Als Beispiel wird das Verfahren für die YALI0E17787g Gendeletion ist in den 4 und 5 beschrieben. Die Wirkungen von 1 kb und 2 kb lange homologe Region auf homologe Rekombination Rate berichtet.
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Representative Results
Die linearisierte Y. lipolytica - Expressionsvektor wurde in das Genom von Y. in die pBR Andockplattform eingefügt lipolytica Po1g Stamm von 27 eine einzige Crossover - Rekombination durchführen. Durch die schnelle chemische Transformationsverfahren unter Verwendung der in dieser Studie festgestellt, die linearisierte Y. lipolytica - Expressionsvektor wurde in den Wildtyp - Po1g Stamm bei einer Transformationseffizienz von> 100 KBE / ug DNA erfolgreich transformiert. Ein Knockout - Kassette von 1 kb homologe Sequenzen flankiert wurde in die Po1g Stamm transformiert und das KU70 - Gen wurde erfolgreich gelöscht (Abbildung 1). Hier ist der Vorwärts - Primer # 56 annealt an die Sequenz sich innerhalb des 5' - Homologie - Arm des KU70 Gens. Der reverse Primer # 55 ist innerhalb der kodierenden Region des LEU2 - Marker befindet. Der reverse Primer # 57 ist innerhalb der kodierenden Region des Gens lokalisiert KU70. Wieaus mehr als 200 Kolonien je, nur eine positive Kolonie mit dem gelöschten KU70 - Gen wurde beobachtet, was auf eine sehr geringe Gen - Deletion Rate (<0,5%). Anschließend wurde eine replikative Plasmid , das das Hygromycin B - Resistenzmarker und Cre / loxP - Systems trägt , konstruiert (Figur 2), und der Selektionsmarker - Gens in dem Stamm KU70 knockout wurde schließlich durch die Expression von Cre - Rekombinase (Abbildung 3) entfernt wird . Mit Hilfe des BLAST - Suchwerkzeug, elf mutmaßliche Alkohol - Dehydrogenase Gene und ein Alkohol - Oxidase - Gens wurden in Y. identifiziert lipolytica - Genoms. Die mutmaßlichen Alkohol-Dehydrogenase Gene sind YALI0E17787g, YALI0D25630g, YALI0A16379g, YALI0E15818g, YALI0D02167g, YALI0A15147g, YALI0E07766g, YALI0F09603g, YALI0B10175g, YALI0F08129g, YALI0E07810g. Die mutmaßliche Alkohol-Oxidase-Gen ist YALI0B14014g. Um die Erhöhung der Gen - Deletion Rate nach dem Löschen des KU70 - Gens zu überprüfen, löschten wir einzeln 11 Gene parallel ( mit Ausnahmefür YALI0A16379g) durch die Unterbrechung Kassetten mit langen homologen Sequenzen in der Y. unter Verwendung von lipolytica KU70 Knockout - Stamm (4 und 5). Hier werden die Forward-Primer (P1-F und P2-F) lagern sich an die in der 5'-Homologiearm von Zielgenen befindet Sequenz. Die Rückwärtsprimer (P1-R) innerhalb der kodierenden Region des LEU2 - Marker befindet. Die Rückwärtsprimer (P2-R) innerhalb der kodierenden Region von Zielgenen (Figur 4) befindet. Die Knock-out - Kassetten unterscheiden sich nur geringfügig in den Längen der homologen Sequenzen und die Restriktionsstellen (Tabelle 1). Gendeletion Raten [homologe Rekombination / (homologe Rekombination + nicht-homologe Rekombination)] von 33% -71% erreicht wurden, was auf einen dramatischen Anstieg in der gezielten homologen Rekombination Frequenz über die KU70 Gendeletion. Zum Beispiel war die Löschrate von YALI0E17787g 40% (~ 100 cfu / ug DNA). AußerdemWurde die Möglichkeit einer weiteren Erhöhung der Gendeletion Rate untersucht, wenn längere homologe Sequenzen verwendet wurden. Es zeigte sich, dass die YALI0E17787g Genzerstörungskassette mit 2 kb homologe Sequenzen eine Löschrate von 87,5% ergab (~ 400 KBE / ug DNA). Darüber hinaus wurde das eingeführte Gen LEU2 - Selektionsmarker in den erhaltenen Deletionsmutanten entfernt , indem der Vektor pSL16-CRE-HPH Transformieren (hp4d- cre, hph), wodurch mehrere Runden von Zielgen Manipulationen ermöglicht.
Abbildung 1. Der Bau der KU70 Knockout - Kassette und die KU70 - defizienten Mutante. A. Das KU70 - Knockout - Plasmid T-KO. B. Die schematische Darstellung der KU70 Knockout - Kassette. Vor- und nachgelagerte reRegionen (1 kb) des KU70 Gen kloniert , um eine homologe Rekombination zu 5'- und 3'-Ende der Unterbrechungskassette. Die LEU2 - Expressionskassette wurde zwischen zwei homologen flankierenden Sequenzen. C eingeführt. Gelelektrophorese der KU70 Deletionskassette nach Sac II und Nde I von T-KO Verdauung. L: 1 kb DNA-Leiter; 1: Die KU70 Löschkassette (die erwartete Bandgröße beträgt 4,3 kb) D.. PCR Bestätigung des KU70 Gen - Deletion in Y. lipolytica Po1g. PCR-Produkte wurden aus genomischer DNA von Trans verstärkt (Spuren 1-10) und Wildtyp-Stamm (Spur 11). Lane 7 zeigt eine positive Knockout, während Spur 1 ein falsch positives zeigt. Im oberen Gel, ein Fragment von 500 bp wird mit dem Primersatz erhalten # 56/57 # und ist nur abwesend in den Spuren 1 und 7. Im unteren Gel, die erfolgreichen Vorprägungen ein Fragment von 750 bp erzeugen, die mit erhalten die Primer-set # 55 / # 56 T. 1 kb DNA Ladder: er 750 bp Bande ist nur in der Spur 7. L gesehen Bitte klicken Sie hier eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Schematische Darstellung des Cre - Rekombinase Expressionsplasmid für Markerrettung. Die episomal replizierenden Plasmid pSL16-CRE-HPH trägt eine Cre - Rekombinase (CRE), ein Hygromycin B - Resistenzmarker (HPH), ein Ampicillin - Resistenzgen (Amp), ein Replikationsursprung von Escherichia coli (pMB1), einen Replikationsursprung von Y. lipolytica (ORI1001), ein Zentromer - DNA - Sequenz von Y. lipolytica (CEN1-1) und ein lacZ Gen , das für das Enzym β-Galactosidase. Bitte klicken Sie hier um ein , um zu vergrößern version von dieser Figur.
Abbildung 3. Wachstum Screening positiver Marker-less Y. lipolytica Stämme nach Markerrettung. Die Trans (1-4) wurden verdünnt und auf YPD - Platten entdeckt, YPDH Platten und Leucin-defizienten Platten sind. Nach 3 Tagen Wachstum bei 30 ° C, positive marker-freien Transformanten (1, 3, 4) wachsen nur auf YPD - Platte, die die Exzision des LEU2 Markergen bei der Expression der Cre - Rekombinase und der Verlust des Plasmids anzeigt pSL16- CRE-HPH . A: YPD Platte, B: YPDH Platte, C:. Leucin-defizienten Platte Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Figur 4 Schematische Darstellung einer gezielten Gendeletion und Markerrettungsverfahren. Die Genzerstörungskassette besteht aus einem Selektionsmarker - Gen (LEU2) , flankiert von zwei LoxP - Erkennungsstellen und zwei Ausrichtungsarme (stromauf und stromab flankierenden Sequenzen). Nach der Transformation der Zertrennungskassette in Y. lipolytica Zellen, tritt ein Genaustausches Ereignis über Doppelkreuz homologe Rekombination innerhalb der beiden flankierenden Homologiearme an der geplanten Ortskurve. Zwei Sätze von PCR-Primern wurden verwendet, um die Integration der Unterbrechungskassette (P1-F und P1-R) und gleichzeitigen Löschens der gezielten genomischen Regionen (P2-F und P2-R) zu verifizieren. Schließlich wird der LEU2 - Marker durch die Expression von Cre - Rekombinase entfernt, hinter einer einzigen loxP - Stelle an der chromosomalen Locus zu verlassen. Gezielte Gen-Deletion und Ersatz von YALI0E17787 gene wurde hier als ein Beispiel gezeigt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5. PCR - Bestätigung von YALI0E17787 Genin in Y. lipolytica Po1g. PCR - Produkte wurden amplifiziert aus genomischer DNA von Trans (Spuren 1-4) und Wildtyp-Stamm (Spur 5). Die Bahnen 1, 2 und 4 zeigen positive Vorprägungen, während Spur 3 ein falsch positives zeigt. Im oberen Gel erzeugen die erfolgreiche Vorprägungen ein Fragment von 750 bp, die mit dem Primersatz P1-F und P1-R erhalten wird. Die 750 bp-Bande in den Spuren 1, 2 und 4, aber nicht in den Spuren 3 und 5. Im unteren Gel, ein Fragment von 500 bp erhalten wird mit dem Primersatz P2-F und P2-R und ist nur vorhanden, gesehen in den Bahnen 3 and 5. L:. 1 kb DNA Ladder Bitte klicken Sie hier eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Tabelle 1. Primer in dieser Studie verwendet. Bitte klicken Sie hier um diese Tabelle zum Download bereit .
| PCR - Komponente | ||
| PCR - Materialien | Volumes | Die Endkonzentration |
| PCR-Puffer | 10 ul | 1x |
| dNTP-Mix | 1 ul | 200 & mgr; M |
| Vorwärtsprimer | 2,5 ul | 500 nM </ Td> |
| Reverse-Primer | 2,5 ul | 500 nM |
| DNA-Polymerase | 0,5 ul | 1 U |
| DNA-Vorlage (verdünnt genomische oder Plasmid-DNA) | 0,5-2 ul | 50 ng |
| Steriles Wasser | bis zu 50 & mgr; l | |
| PCR - Bedingungen | ||
| Temperatur | Zeit | Anzahl der Zyklen |
| 98 ° C | 30 sec | 1 |
| 98 ° C | 10 sec | 30 |
| 55 ° C | 30 sec | |
| 72 ° C | 30 sec | |
| 72 ° C | 10 Minuten | 1 |
| Führen Sie die PCR - Amplifikation eines Thermal-Cycler | ||
Tabelle 2. PCR - Set-up und Bedingungen für die High-Fidelity DNA - Polymerase.
| Komponente | |||
| Materialien | Die Endkonzentration | ||
| T4 DNA-Ligase-Puffer | 1x | ||
| Vektor-DNA | 0,03 pmol | ||
| Insert-DNA | 0,15 pmol | ||
| T4 DNA-Ligase | 400 U | ||
| Steriles Wasser | bis zu 20 & mgr; l | ||
| Bedingungen | |||
| Temperatur | Zeit | ||
| 16 ° C | 16 Stunden | ||
| Komponente | |
| Materialien | Die Endkonzentration |
| Restriktionsverdau Puffer | 1x |
| DNA (Plasmid oder PCR-Produkt) | 1 & mgr; g |
| 1. Restriktionsenzym | 5 U |
| 2. Restriktionsenzym (optional) | 5 U |
| Steriles Wasser | bis zu 50 & mgr; l |
| Bedingungen | |
| Temperatur | Zeit |
| 37 ° C | <td> 6 hr|
| Führen Sie einzelne Verdauung mit einem einzigen Restriktionsenzym | |
| Führen doppelten Verdau mit einem Paar von Restriktionsenzymen | |
Tabelle 4. Bedingungen für den Restriktionsenzymverdau von DNA.
| PCR - Komponente | ||
| PCR - Materialien | Volumes | Die Endkonzentration |
| PCR-Puffer | 2,5 ul | 1x |
| dNTP-Mix | 0,5 ul | 200 & mgr; M |
| Vorwärtsprimer | 0,5 ul | 200 nM |
| Reverse Primer | 0,5 ul | 200 nM |
| DNA-Polymerase | 0,2 ul | 1 U |
| DNA-Vorlage (verdünnt genomische oder Plasmid-DNA) | 0,5-2 ul | 50 ng |
| Steriles Wasser | bis zu 25 & mgr; l | |
| PCR - Bedingungen | ||
| Temperatur | Zeit | Anzahl der Zyklen |
| 95 ° C | 5 Minuten | 1 |
| 95 ° C | 30 sec | 30 |
| 50 ° C | 30 sec | |
| 72 ° C | 30 sec | |
| 72 ° C | 10 Minuten | 1 |
| Führen Sie die PCR - Amplifikation ein Thermocycler mit | ||
| Führen Kolonie PCR direkt eine Kolonie als Matrize verwendet, sondern als eine DNA - Probe | ||
Tabelle 5. PCR / Colony - PCR-Bedingungen für die Taq - DNA - Polymerase.
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Discussion
Unser Ziel für diese Studie ist eine schnelle und effiziente Erzeugung von gezielten Gen-Knockout in der Y zu ermöglichen lipolytica Po1g Stamm. Mehrere Überlegungen müssen angegangen werden , um dies zu erreichen. Zunächst wird eine hohe Transformationseffizienz erforderlich. Somit ist eine effiziente und bequeme chemischen Transformationsprotokoll für die Y. lipolytica Po1g Stamm wurde in dieser Studie beschrieben. Die Verwendung von PEG-4000 ist ein kritischer Faktor für die erfolgreiche Transformation dieses Stammes. Keine Transformanten wurden Plasmid - Transformation erhalten wird, wenn PEG-3350 unter Verwendung (für die Transformation von S. cerevisiae) anstelle von PEG-4000. Darüber hinaus Herstellung von kompetenten Zellen frisch hergestellten Zellen unter Verwendung muß eine hohe Transformationseffizienz in diesem Stamm zu erhalten. Zweitens, zu reduzieren nicht-homologe Rekombination und zufällige Integration Ereignisse über dominante NHEJ in diesem Stamm, ein effizientes Transformationsmethode wurde dann die KU7 zu konstruieren beschäftigt0 Knockout - Mutante. Drittens, die Effizienz des Genaustausches durch homologe Rekombination zu verbessern, lange Arme (1 kb) flankieren stromauf und stromab der Zielgene wurden in Gendeletion Kassetten verwendet. Die langen flankierenden homologen Regionen in den Unterbrechungen Kassetten sind für eine effiziente homologe Rekombination in diesem Stamm. Keine positiven Kolonien wurden erhalten , wenn Störung Kassetten mit 50 bp homologen Regionen (ausreichend für eine effiziente homologe Rekombination in S. cerevisiae) verwendet wird . Mit all diese Strategien, das KU70 - Gen des Y. lipolytica Po1g Stamm wurde erfolgreich gelöscht. Dennoch ist es äußerst schwierig , das KU70 knockout Belastung durch sehr hohe Rate von nicht-homologen Rekombination in der Y. zu erhalten lipolytica Po1g Stamm. Es muss darauf geachtet werden, wenn das Antibiotikum Hygromycin B enthält Medienhandhabungs wie Hygromycin B-Licht empfindlich ist. Medien mit degradierten Hygromycin B Verwendung wird in falschen pos führenitives in Schritten 2.2.1 und 2.2.2 und falsch-negative Ergebnisse in Schritt 2.2.7.
Wenn der Stamm KU70 Löschung verwendet wurde gezielte Deletion einzelner Gene zu erzeugen , kodierend Alkoholdehydrogenasen und Alkoholoxidase wurde eine viel höhere Löschrate auf die Deletion des Gens erreicht KU70 verglichen. Es zeigt , dass die Verwendung der KU70 Löschens Plattform Stamm in einem dramatischen Anstieg der homologe Rekombinationsfrequenz resultiert. Nachdem das Problem der sehr niedrige Rate der homologen Rekombination wurde, adressiert Screening von Y. lipolytica Single-Gen - Knockout - Mutanten wurde stark beschleunigt. Wir haben festgestellt, dass die 1 kb Länge der homologen Region für eine gezielte Gen-Deletion effizient genug war. Eine Erhöhung könnte homologe Rekombination Frequenz erreicht werden, wenn homologe Sequenzen unter Verwendung von mehr (2 kb). Bemerkenswert ist, codieren diese Gene Alkoholdehydrogenasen und Alkohol-Oxidase, die die reversible Umwandlung zwischen Alkoholen und ald katalysierenehydes. Die Streichung dieser Gene kann zu einer erhöhten Anhäufung von Biokraftstoffen führen und biochemische Verbindungen, einschließlich kurzkettige Fettsäuren, mittlere Fettsäuren, langkettige Fettsäuren, Hydroxyfettsäuren, Alkohole, Aldehyde und Lipiden. Weitere Studien werden durchgeführt, um diese Möglichkeit zu prüfen.
Ein PCR-vermittelte Gen - Zerstörungsverfahren wurde in Y. berichtet lipolytica Po1d Stamm 28. Jedoch ist dieses Verfahren umständlich und zeitraubend. Eine wesentliche Einschränkung dieses Verfahrens ist die Schwierigkeit, ausreichende Mengen der Gendeletion Kassetten für ein Transformationsexperiment. Eine weitere Einschränkung besteht darin , dass dieses Verfahren auf die URA3 Marker beschränkt ist. Das Verfahren in dieser Studie beschrieben adressiert speziell diese Probleme in der PCR-basierte Technik, durch die Verdauung-Ligatur Ansatz, und das Cre / loxP-Systems. Dieses Verfahren erlaubt die Verwendung von verschiedenen antibiotischen und auxotrophe Marker und damit kehrt istFliese. Es kann in der Y. schnelle Gendeletion erleichtern lipolytica Po1g Stamm. Wir präsentieren hier eine detaillierte Beschreibung des gezielten Einzel Gen - Deletion - Strategie durch homologe Rekombination in Y. lipolytica Po1g Zellen. Jedoch bleibt ein loxP - Stelle als Narbe innerhalb des Genoms nach der erfolgreichen Markerrettung (Abbildung 4). In mehreren Gen-Deletion werden mehrere LoxP- Narben in das Genom eingebracht und diese in genomischer Instabilität führen kann aufgrund möglicher Rekombinationsereignisse, die zwischen den loxP-Sites auftreten können. Trotzdem in dieser Studie konstruierten die Knockout-Stämme zeigte eine sehr gute genetische Stabilität, was darauf hinweist, dass unbeabsichtigte Rekombinationsereignisse nicht zwischen den loxP-Sites auftrat.
Zusammenfassend wurde eine effiziente genetische Transformation Protokoll für die Y. etabliert lipolytica Po1g Stamm. Die gezielte Löschen einzelner Gene in diesem Stamm wurde als Proof of Concept unter Beweis gestellt. die Y. lipolytica Po1g KU70 Löschens Plattform Stamm in dieser Studie konstruierten zeigte sehr effiziente homologe Rekombination Frequenz, die eine einfachere und schnellere Screening der Zielgen Deletionen ermöglicht. Somit stellt diese Plattform Stamm ein effizienteres System und eine bessere Wahl für Anwendungen im Weg Engineering und Stammoptimierung, wenn andere chromosomale Deletionsmutanten zu konstruieren. Die beschriebene Methodik und das KU70 Deletionsstamm konstruiert könnte auch zur Insertion von Zielgenen in spezifische Loci und die Schaffung von ortsspezifischen Mutationen in das Genom angewendet werden.
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Acknowledgments
Wir danken für die finanzielle Unterstützung von der Nationalen Umweltagentur von Singapur (ETRP 1.201.102), die Competitive Research Program der National Research Foundation of Singapore (NRF-CRP5-2009-03), der Agentur für Wissenschaft, Technologie und Forschung von Singapur ( 1324004108), globale F & E-Projekt Programm, das Ministerium für Wissensökonomie, der Republik Korea (N0000677), die Defense Threat Reduction Agency (DTRA, HDTRA1-13-1-0037) und der synthetischen Biologie Initiative der National University of Singapore ( DPRT / 943/09/14).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| Oligonucleotide primers | Integrated DNA Technologies | 25 nmole DNA oligos | |
| Y. lipolytica strain Po1g | Yeastern Biotech | leucine auxotrophic derivative of the wild-type strain W29 (ATCC 20460) | |
| Vector pYLEX1 | Yeastern Biotech | FYY203-5MG | Y. lipolytica expression vector |
| E. coli TOP10 | Invitrogen | For cloning and propagation of plasmids | |
| pGEM-T vector | Promega | A3600 | TA cloning vector |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | For plasmid isolation |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System |
Promega | A9282 | Extract DNA fragments from agarose gels and purify PCR products from an amplification reaction |
| The iProof high-fidelity DNA polymerase |
Bio-Rad | 172-5302 | High-fidelity DNA polymerase |
| BamHI | New England Biolabs | R0136S | Restriction enzyme |
| BglII | New England Biolabs | R0144L | Restriction enzyme |
| KpnI | New England Biolabs | R0142S | Restriction enzyme |
| NdeI | New England Biolabs | R0111S | Restriction enzyme |
| NotI | New England Biolabs | R0189L | Restriction enzyme |
| PmlI | New England Biolabs | R0532S | Restriction enzyme |
| PstI | New England Biolabs | R0140S | Restriction enzyme |
| SacII | New England Biolabs | R0157S | Restriction enzyme |
| SalI | New England Biolabs | R0138S | Restriction enzyme |
| XhoI | New England Biolabs | R0146L | Restriction enzyme |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202L | |
| Taq DNA polymerase | Bio-Rad | M0267L | |
| Ampicillin | Gibco-Life Technologies | 11593-027 | Antibiotics |
| Hygromycin B | PAA | P21-014 | Antibiotics |
| GeneRuler 1 kb DNA ladder | Thermo Scientific | SM0312 | 1 kb DNA ladder |
| PEG4000 | Sigma | 95904-F | |
| Tris | Promega | H5135 | |
| EDTA | Bio-Rad | 161-0729 | |
| Salmon Sperm DNA | Invitrogen | 15-632-011 | |
| Lithium Acetate | Sigma | ||
| Acetic acid | Sigma | ||
| Glass beads (425-600 µm) | Sigma | G8772 | |
| RNAse A | Thermo Scientific | EN0531 | |
| DNA Loading Dye | Thermo Scientific | R0611 | |
| Bacto Yeast Extract | BD | 212750 | |
| Bacto Peptone | BD | 211677 | |
| D-Glucose | 1st Base | BIO-1101 | |
| YNB without amino acids | Sigma | Y0626 | |
| DO Supplement-Leu | Clontech | 630414 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| Difco LB Broth | BD | 244620 | |
| Difco LB Agar | BD | 244520 | |
| Bacto Agar | BD | 214010 | |
| Equipment | |||
| PCR machine | Biorad | T100 Thermal Cycler | |
| Water bath | Memmert | WNB 14 | |
| Stationary/Shaking Incubator | Yihder | LM-570RD | |
| Thermo-shaker | Allsheng | MS-100 | |
| Micro centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Spectrophotometer | Eppendorf | BioPhotometer plus | |
| Gel imager | GE | Amersham Imager 600 |
References
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Genetik Ausgabe 115 Bioengineering Ausgabe Unconventional Hefe,
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