Abstract
Yarrowia lipolytica é um não-patogênicos, dimorfismo e estritamente aeróbias espécies de leveduras. Devido às suas características fisiológicas distintas e características metabólicas, esta levedura não convencionais é não só um bom modelo para o estudo da natureza fundamental de diferenciação de fungos, mas é também uma plataforma microbiana promissora para a produção bioquímica e diversas aplicações biotecnológicas, os quais requerem extensivas manipulações genéticas. No entanto, as manipulações genéticas de Y. lipolytica ter sido limitado devido à falta de um sistema de transformação genética eficiente e estável, bem como muito elevadas taxas de recombinação não homóloga que pode ser atribuída principalmente ao gene Ku70. Aqui, descrevemos um protocolo fácil e rápido para a transformação genética eficiente e para a deleção do gene em Y. lipolytica Po1g. Em primeiro lugar, um protocolo para a transformação eficiente do ADN exógeno em Y. lipolytica Po1g foi estabelecida. SecoND, para atingir a taxa de recombinação homóloga de dupla permutação reforçada para posterior eliminação de genes alvo, o gene Ku70 foi eliminado por transformação de uma cassete de disrupção transportando 1 kb braços de homologia. Em terceiro lugar, para demonstrar a eficiência deleção do gene reforçada após a eliminação do gene Ku70, nós apagadas individualmente 11 genes alvo que codificam álcool desidrogenase e álcool oxidase utilizando os mesmos procedimentos sobre a tensão Ku70 plataforma nocaute. Observou-se que a taxa de recombinação homóloga precisa aumentou substancialmente de menos de 0,5% para eliminação do gene Ku70 em Po1g a 33% -71% para a deleção do gene único dos 11 genes-alvo em Po1g Ku70 Δ. Um plasmídeo replicativo que transporta o marcador de resistência a higromicina B e o sistema Cre / LoxP foi construído, e o gene marcador de selecção nas estirpes knockout de levedura foi finalmente removido por expressão da recombinase Cre para facilitar a múltiplas rondas de targeted manipulações genéticas. Os mutantes de deleção de um único gene resultantes têm potenciais aplicações em biocombustíveis e produção bioquímica.
Introduction
Ao contrário de Saccharomyces cerevisiae, Yarrowia lipolytica, uma levedura convencional, pode crescer sob a forma de levedura ou micélio em resposta a alterações das condições ambientais 1,2. Assim, esta levedura dimorphic pode ser usado como um bom modelo para o estudo da diferenciação fúngica, a morfogénese e 3,4,5 taxonomia. É geralmente considerada como uma espécie de levedura seguros (GRAS), que é amplamente utilizado para produzir uma variedade de aditivos alimentares, tais como ácidos orgânicos, poli-álcoois, compostos de aroma, agentes emulsionantes e agentes tensioactivos 6,7,8,9. É um aeróbio obrigatório e uma levedura oleaginosa bem conhecido capaz de acumular lípidos naturalmente em altas quantidades, isto é, até 70% do peso seco da célula 10. Também pode utilizar uma vasta gama de fontes de carbono para o crescimento, incluindo diferentes tipos de resíduos nos recursos usados como nutrientes 11,12,13. Todas estas características únicas fazem Y. lipolytica muito atraente paradiversas aplicações biotecnológicas.
Apesar de toda a sequência do genoma da Y. lipolytica foi publicada 14,15, manipulação genética desta levedura não convencional é mais complexa do que outras espécies de levedura. Em primeiro lugar, esta transformação de espécies de levedura é muito menos eficiente devido à ausência de um sistema de transformação genética 16,17 estável e eficiente. Em segundo lugar, a integração genómica laboriosa de cassetes de expressão lineares é normalmente usado para a expressão de genes de interesse que nenhum sistema de plasmídeo epissomal natural foi encontrado nesta levedura 18. Em terceiro lugar, geração de knock-out genéticos e knock-ins são limitados porque o gene alvo eficiência através de recombinação homóloga precisas neste levedura é baixa ea maioria dos eventos de integração ocorrer até o final não homóloga juntar (NHEJ) 19.
Neste estudo, nós relatamos um protocolo de transformação otimizada para o Y. lipolytica Ku70, que codifica uma enzima chave na via NHEJ. Usando o protocolo de transformação optimizado e transformando uma cassete nocaute linear contendo regiões de homologia flanqueadoras de 1 kb, do gene da Ku70 Y. lipolytica Po1g foi excluído com sucesso. A robustez desta metodologia deleção do gene foi então demonstrado pela segmentação álcool desidrogenase e genes de álcool oxidase na estirpe Po1g Ku70 Δ. Observou-se que a estirpe de eliminação Ku70 exibiram uma eficiência consideravelmente mais elevada de genes mediada por recombinação homóloga segmentação do que a da estirpe de tipo selvagem Po1g. Além disso, um plasmídeo de expressão de Cre replicativa que transporta o marcador de resistência à higromicina B foi construída para efectuar recuperação do marcador. A recuperação do marcador facilita várias rodadas de gene alvo in the obtidos os mutantes de deleção do gene. Além deleção do gene, o nosso protocolo para a transformação genética e a deleção do gene aqui descrita pode ser aplicada para inserir genes para loci específicos, e para introduzir mutações específicas do local em Y. genoma lipolytica.
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Protocol
1. Geração do Y. lipolytica Ku70 Supressão Strain
- Construção da cassete de disrupção
Nota: Ver Tabela 1 para todos os iniciadores utilizados na reacção em cadeia da polimerase (PCR) amplificações.- 20 conceber iniciadores para amplificar por PCR a cassete de expressão LEU2 (ver Tabela 1) a partir de um Y. vector de expressão lipolytica e introduzir sítios loxP em 5 'e 3' da cassete de LEU2 com um iniciador para a frente longo (# 1; Tabela 1) e um iniciador inverso de comprimento (# 2; Tabela 1), respectivamente. Para introduzir um sítio de restrição adicional para os passos subsequentes do processo de clonagem, adicionar um sítio de restrição BamHI no iniciador # 1.
- Executar PCR utilizando uma ADN polimerase de alta fidelidade, conforme detalhado na Tabela 2.
- Purificar o produto PCR LoxP-promotor-LEU2-terminator-LoxP cassete usando um purificatio PCRN kit de acordo com as instruções do fabricante. Adicionar saliências 3'-A para o produto de PCR purificado de acordo com as instruções do fabricante 21. A utilização de ADN-ligase de T4 para ligar o produto de PCR de cauda A num vector de clonagem TA para produzir o plasmídeo de T-LEU2 conforme indicado na Tabela 3.
- Amplificar por PCR de 1 kb a sequência 5 'a montante do gene Ku70 utilizando os iniciadores # 3 / # 4 do Y. lipolytica Po1g ADN genómico de 22 conforme indicado na Tabela 2. Purifica-se o produto de PCR utilizando um kit de purificação de PCR de acordo com as instruções do fabricante.
- Digestão dupla tanto o produto de PCR purificado e plasmídeo T-LEU2 com enzimas Sac II e Bam Hl conforme indicado na Tabela 4. Purifica-se a mistura de digestão usando um kit de purificação de PCR de acordo com as instruções do fabricante. Use DNA ligase de T4 para ligar o purificado e digerido produto de PCR para o SacII / locais Bam HI de t-LEU2 para se obter oplasmídeo T-LEU2-5E conforme Tabela 3.
- Amplificar por PCR a 1 kb 'sequência a jusante 3' do gene utilizando iniciadores Ku70 # 5 / # 6 do Y. lipolytica Po1g ADN genómico de 22 conforme indicado na Tabela 2. Purifica-se o produto de PCR utilizando um kit de purificação de PCR de acordo com as instruções do fabricante. Duplo digerir tanto o produto PCR purificado e plasmídeo T-LEU2-5E com Not I e Nde I enzimas conforme tabela 4.
- Purifica-se a mistura de digestão usando um kit de purificação de PCR de acordo com as instruções do fabricante. Em seguida, ligar o purificado e digerido produto de PCR ao Not I / Nde locais I da T-LEU2-5E para produzir o plasmídeo T-KO usando DNA ligase de T4 de acordo com a Tabela 3.
- Digerir o plasmídeo T-KO com Sac II e Nde I enzimas de acordo com a Tabela 4 para produzir o cassete de disrupção (Figura 1
- Preparação de células competentes e transformação de Y. estirpe lipolytica Po1g
- preparação de células competentes
- Inocular uma colônia de Y. estirpe lipolytica Po1g a partir de uma placa fresca de extracto de levedura-peptona-dextrose (YPD) em 10 ml de meio YPD (1% de extracto de levedura, 2% de peptona, 2% de dextrose e 50 mM de tampão de citrato de pH 4,0) em um balão de 100 ml. Incubar numa incubadora com agitação a 30 ° C a 225 rpm durante 20 horas até à saturação (uma DO600 de cerca de 15, medido usando um espectrofotómetro).
- Agregar as células por centrifugação durante 5 min a 5000 xg à temperatura ambiente. Lavam-se as células com 20 ml de tampão Tris-EDTA (TE) de tampão (Tris 10 mM, EDTA 1 mM, pH 7,5), e sedimentar as células tal como descrito no passo 1.2.1.2. Ressuspender as células em 1 ml de acetato de lítio 0,1 M (pH 6,0, ajustado com ácido acético), e incubar durante 10 minutos a tempe quartorature.
- Alíquota as células competentes (100 uL) em tubos de 1,5 ml estéreis. Avance para os passos de transformação imediatamente a seguir, ou adicionar glicerol a uma concentração final de 25% (v / v) e armazenar a -80 ° C para armazenamento a longo prazo.
- Transformação
- Misturar suavemente 10 ul de ADN de esperma de salmão desnaturado (10 mg / ml) e 1-5 ug de a cassete de disrupção purificada juntamente com 100 ul de células competentes, e incuba-se a 30 ° C durante 15 min.
- Adicionar 700 ul de polietileno glicol a 40% (PEG) -4000 (dissolvido em 0,1 M de lítio de acetato, pH 6,0), misturar bem e incubar numa incubadora com agitação a 30 ° C a 225 rpm durante 60 min.
Nota: É importante a utilização de PEG com um peso molecular médio de 4000, em vez de PEG-3350 (tipicamente utilizado na transformação de levedura convencional). - Choque térmico a mistura de transformação, colocando o tubo num banho de água a 39 ° C durante 60 min.
- Adicionar 1 ml de meio YPD erecuperar durante 2 horas a 30 ° C e 225 rpm. Centrifugar a 9.000 xg durante 1 min à temperatura ambiente, remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 1 ml de tampão TE.
- Repellet as células por centrifugação a 9000 xg durante 1 min à temperatura ambiente e desprezar o sobrenadante. Ressuspender o sedimento em 100 ul de tampão TE e placa sobre placas selectivas (por exemplo, placas de leucina-deficiente), e incuba-se a 30 ° C durante 2-3 dias.
- Escolha de 4 a 10 colónias individuais e inocular separadamente em 2 ml de meio YPD. Incubar durante a noite numa incubadora de agitação de 30 ° C a 225 rpm. Identificar as colónias positivas por análise de PCR de ADN genómico a partir dos transformantes 22 conforme indicado na Tabela 5, utilizando dois conjuntos de iniciadores # 55 / # 56, e # 56 / # 57, respectivamente.
Nota: O Not I linearizado pYLEX1 vector é transformado em Y. lipolytica Po1g células competentes, a fim de determinar a eficiência de transformação através da contagem do númerode unidades formadoras de colónias (CFU) por ug de ADN plasmídeo utilizado 23.
- preparação de células competentes
2. recuperação do marcador
- Construção do plasmídeo de expressão de Cre
- Construção de pYLEX1-CRE e pYLEX1-HPH
- 20 conceber iniciadores para amplificar por PCR os enquadramentos de leitura abertos de CRE e HPH. Adicionar um nucleótido adenina adicional a montante dos códons de iniciação nos primers para a frente # 82 e # 84, e insira os locais de restrição Kpn I a jusante dos códons de parada nos iniciadores reversos # 83 e # 85. PCR amplificar as grelhas de leitura aberta de cre e HPH de pSH69 (número de acesso HQ412578) 24 conforme Tabela 2.
- Purifica-se ambos os fragmentos HPH utilizando um kit de purificação de PCR de acordo com as instruções do fabricante e CRE. Digest ambos os fragmentos CRE e HPH purificado com Kpnl enzima, como por Table 4. dupla digestão do plasmídeo com as enzimas de pYLEX1 Pml I e Kpn I, como por Tabela 4. Purifica-se a mistura de digestão usando um kit de purificação de PCR de acordo com as instruções do fabricante.
- Use DNA ligase de T4 de acordo com a Tabela 3 para ligar as cre e HPH fragmentos purificados e digeridos para sites Pml I / Kpn I do Y. lipolytica vector de expressão, originando pYLEX1-CRE e pYLEX1-HPH, respectivamente.
- Construção de pSL16-CRE-HPH
- Amplificar por PCR a cassete promotor-gene-terminador de CRE a partir pYLEX1-CRE utilizando os iniciadores # 86 / # 87 flanqueando os locais de restrição Sal I / Pst I como na Tabela 2. Purifica-se o produto de PCR utilizando um kit de purificação de PCR de acordo com as instruções do fabricante .
- Digestão dupla tanto o produto de PCR purificado e pSL16-CEN1-1 (227) 25 plasmídeo com Sall eEnzimas Pst I como na Tabela 4. Purifica-se a mistura de digestão usando um kit de purificação de PCR de acordo com as instruções do fabricante. Em seguida, ligar o produto de PCR purificado e digerido em pSL16-CEN1-1 (227) nos locais correspondentes para criar pSL16-CRE utilizando ligase de DNA de T4 de acordo com a Tabela 3.
- Amplificar por PCR a cassete promotor-gene-terminador de HPH de pYLEX1-HPH utilizando os iniciadores # 88 / # 89 flanqueando os locais de restrição Xho I / Bgl II conforme indicado na Tabela 2. Purifica-se o produto de PCR utilizando um kit de purificação de PCR de acordo com as instruções do fabricante .
- Digestão dupla tanto o produto de PCR purificado e plasmídeo pSL16-CRE com enzimas Xho I e Bgl II conforme a Tabela 4. Purifica-se a mistura de digestão usando um kit de purificação de PCR de acordo com as instruções do fabricante. Em seguida, ligar o produto de PCR purificado e digerido em pSL16 por CRE na correspondentesites para gerar pSL16-CRE-HPH utilizando ligase de DNA de T4 de acordo com a Tabela 3.
Nota: O plasmídeo resultante expressão de Cre, pSL16-CRE-HPH, abriga um marcador seleccionável de higromicina B e é um vector epissomal centromérica e replicando (Figura 2).
- Digestão dupla tanto o produto de PCR purificado e plasmídeo pSL16-CRE com enzimas Xho I e Bgl II conforme a Tabela 4. Purifica-se a mistura de digestão usando um kit de purificação de PCR de acordo com as instruções do fabricante. Em seguida, ligar o produto de PCR purificado e digerido em pSL16 por CRE na correspondentesites para gerar pSL16-CRE-HPH utilizando ligase de DNA de T4 de acordo com a Tabela 3.
- Verificar todas as construções por digestão com enzimas de restrição apropriadas (por exemplo, Sal I / Pst I, para excisar o inserto do vector) conforme indicado na Tabela 4.
- Amplificar por PCR a cassete promotor-gene-terminador de CRE a partir pYLEX1-CRE utilizando os iniciadores # 86 / # 87 flanqueando os locais de restrição Sal I / Pst I como na Tabela 2. Purifica-se o produto de PCR utilizando um kit de purificação de PCR de acordo com as instruções do fabricante .
- Construção de pYLEX1-CRE e pYLEX1-HPH
- Cre resgate de marcador mediada por recombinase
- Transformar pSL16-CRE-HPH em células competentes da estirpe knockout Ku70 seguindo o protocolo de transformação descrito no ponto 1.2 acima. Placa transformadas células nas YPD mais higromicina B (YPDH) placas (contendo 400 ug / ml de higromicina B), e incuba-se a 30 ° C durante 2-3 dias.
- Realizam colônia PCR conforme a Tabela 5, utilizando os iniciadores # 84 / # 85 para identificar positivacolónias contendo o plasmídeo pSL16-CRE-HPH após transformação.
Nota: A frente iniciador # 84 e o iniciador reverso # 85 estão localizados dentro da região de codificação do gene HPH (Tabela 1). Apenas os clones positivos gerar um produto de PCR específico na reacção de PCR. - Escolher um clone positivo e inocular em 2 ml de meio YPDH, e incubar numa incubadora com agitação a 30 ° C a 225 rpm durante a noite até à saturação. Medir a OD de células 600 com um espectrofotômetro. Colher as células a uma DO 600 de ~ 15. Centrifugar a 5.000 xg durante 5 min à temperatura ambiente, e lava-se uma vez com 2 ml de água estéril.
- As células re-inocular em 2 ml de meio YPD com uma DO 600 de 0,1 inicial e permitir que as células a crescer num incubador com agitação a 30 ° C a 225 rpm durante a noite. Espalhar a cultura de células durante a noite em placas de YPD para isolar colónias individuais 23. Colónias placa réplica Onto YPD, YPDH e placas de leucina com deficiência de 23 Nota: As colónias que perderam o marcador LEU2 e ambos pSL16-CRE-HPH plasmídeo só pode crescer em placas de YPD (Figura 3).
3. Supressão de álcool-desidrogenase e álcool oxidase Genes
- Realizar uma pesquisa sobre o Y. banco de dados de genoma lipolytica utilizando o local Alignment Tool Pesquisa Básica (BLAST) para identificar os genes candidatos para exclusão 26. Entrada a sequência da proteína de S. cerevisiae álcool desidrogenase I em ferramenta de pesquisa BLAST (http://www.genome.jp/tools-bin/search_sequence?prog=blast&db=yli&seqid=aa).
Nota: A ferramenta de pesquisa BLAST retorna as sequências proteicas mais similares na Y. banco de dados de genoma lipolytica. - Construir as cassetes de eliminação por PCR com os iniciadores # 7 # 56 (Tabela 1), e realizar a digestão de restrição enzimática e reacções de ligação, utilizando os mesmos métodos, como descrito na secção 1.1 acima.
- Preparaçãosão células competentes da estirpe knockout Ku70, realizar transformações e realizar PCR para identificar as colónias positivas com iniciadores # 55, # 58 e # 81 (Tabela 1), seguindo o protocolo descrito no ponto 1.2 acima.
Observação: Como um exemplo, o procedimento para a deleção do gene YALI0E17787g é descrito nas Figuras 4 e 5. Os efeitos de 1 kb e 2 kb de comprimento região homóloga na taxa de recombinação homóloga são relatados.
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Representative Results
A Y. linearizado vector de expressão lipolytica foi inserido na plataforma de encaixe pBR no genoma de Y. lipolytica cepa Po1g através da realização de um único recombinação de crossover 27. Ao utilizar o processo de transformação química rápida estabelecido neste estudo, a Y. linearizado vector de expressão lipolytica foi transformado com sucesso para a estirpe de tipo selvagem Po1g a uma eficiência de transformação de> 100 CFU / ug de ADN. Uma cassete nocaute flanqueada por sequências homólogas de 1 kb foi transformado na estirpe Po1g e o gene Ku70 foi eliminado com sucesso (Figura 1). Aqui, o iniciador para a frente # 56 emparelha com a sequência localizada no interior do braço 5 'de homologia do gene Ku70. O iniciador reverso # 55 está localizada dentro da região de codificação do marcador de LEU2. O iniciador reverso # 57 está localizada dentro da região de codificação do gene de Ku70. Comonunca, de mais de 200 colónias, foi observada apenas uma colónia positiva com o gene Ku70 suprimido, o que sugere uma taxa de deleção do gene de muito baixo (<0,5%). Subsequentemente, um plasmídeo replicativo que transporta o marcador de resistência a higromicina B e o sistema Cre / LoxP foi calculado (Figura 2), e o gene marcador de selecção na estirpe knockout Ku70 foi finalmente removido por expressão da recombinase Cre (Figura 3). Usando a ferramenta da busca BLAST, onze genes álcool desidrogenase putativos e um gene de oxidase de álcool foram identificados em Y. genoma lipolytica. Os genes de álcool desidrogenase putativos são YALI0E17787g, YALI0D25630g, YALI0A16379g, YALI0E15818g, YALI0D02167g, YALI0A15147g, YALI0E07766g, YALI0F09603g, YALI0B10175g, YALI0F08129g, YALI0E07810g. O gene da oxidase do álcool putativo é YALI0B14014g. Para verificar o aumento da taxa de deleção do gene após a eliminação do gene Ku70, nós apagadas individualmente 11 genes em paralelo (exceptopara YALI0A16379g) utilizando as cassetes de rompimento com sequências homólogas longas no Y. lipolytica Ku70 estirpe knockout (Figuras 4 e 5). Aqui, os iniciadores directos (P1-P2 e F-F) emparelham com a sequência localizada no interior do braço 5 'de homologia de genes alvo. Os iniciadores inversos (P1-R) estão localizados dentro da região codificante do marcador de LEU2. Os iniciadores inversos (P2-P) estão localizados dentro da região de codificação de genes alvo (Figura 4). As cassetes de knock-out diferem apenas ligeiramente em comprimentos das sequências homólogas e os locais de restrição (Tabela 1). Taxas de deleção do gene foram alcançados [recombinação homóloga / (+ recombinação homóloga recombinação não homóloga)] de 33% -71%, o que sugere um aumento dramático na frequência de recombinação homóloga alvo através da deleção do gene de Ku70. Por exemplo, a taxa de eliminação de YALI0E17787g foi de 40% (~ 100 CFU / ug do ADN). além disso, A possibilidade de aumento adicional na taxa de deleção do gene foi investigado quando foram usadas sequências homólogas longas. Ele mostrou que a cassete de disrupção de genes com sequências homólogas YALI0E17787g 2 kb deu uma taxa de supressão de 87,5% (~ 400 CFU / ug do ADN). Além disso, a LEU2 gene marcador de selecção introduzida nos mutantes de deleção obtidos foi removido por transformar o vector pSL16-CRE-HPH (hp4d- CRE, HPH), permitindo assim que vários ciclos de manipulações gene alvo.
Figura 1. Construção da cassete Ku70 knockout ea Ku70 mutante deficiente. A. O plasmídeo Ku70 knockout T-KO. B. O diagrama esquemático da cassete Ku70 nocaute. re a montante ea jusantegiões (1 kb) do gene Ku70 foram clonadas a 5 'e da extremidade 3' da cassete de disrupção para a recombinação homóloga. Foi inserida a cassete de expressão LEU2 entre duas sequências de f lanqueamento homólogas. C. Eletroforese em gel da cassete Ku70 eliminação após Sac II e Nde I digestão de T-KO. G: 1 kb de DNA Ladder; 1: A cassete Ku70 exclusão (o tamanho da faixa esperada é de 4,3 kb) D.. Confirmação por PCR do gene de supressão Ku70 em Y. lipolytica Po1g. Os produtos de PCR foram amplificados a partir de ADN genómico de transformantes (Pistas 1-10) e estirpe de tipo selvagem (pista 11). Pista 7 ilustra um nocaute positivo, enquanto que a pista 1 mostra um falso positivo. No gel superior, um fragmento de 500 pb foi obtido com o conjunto de iniciadores # 56 / # 57 e só está ausente nas pistas 1 e 7. Na parte inferior do gel, os furos de sucesso gerar um fragmento de 750 pb, o qual é obtido com o primer set # 55 / # 56 Tele 750 pb banda só é visto na pista 7. L:. 1 kb DNA Ladder Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Diagrama esquemático do plasmídeo de expressão da recombinase Cre para recuperação do marcador. O plasmídeo epissomal replicar pSL16-CRE-HPH carrega uma recombinase Cre (CRE), um marcador de resistência à higromicina B (HPH), um gene de resistência à ampicilina (AMP), um origem de replicação da Escherichia coli (pMB1), uma origem de replicação de Y. lipolytica (ORI1001), uma sequência de ADN de Y. centrómero lipolytica (CEN1-1) e um gene lacZ que codifica a enzima β-galactosidase. Por favor clique aqui para ver uma maior version desta figura.
Figura 3. Crescimento rastreio de Y. marcador de menos positiva cepas lipolytica após recuperação do marcador. transformantes (1-4) foram diluídas e viu em placas de YPD, placas YPDH e placas de leucina-deficiente, respectivamente. Após 3 dias de crescimento a 30 ° C, os transformantes livre de marcador positivo (1, 3, 4) só pode crescer na placa de YPD, o que indica a excisão do gene marcador LEU2 aquando da expressão da recombinase Cre e a perda do plasmídeo pSL16- CRE-HPH a:. placa de YPD, B: placa YPDH, C:. placa leucina deficiente por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Diagrama esquemático da deleção do gene alvo e o processo de resgate de marcador. A cassete de disrupção do gene consiste em um gene marcador de selecção (LEU2) flanqueado por dois locais de reconhecimento LoxP e dois braços de segmentação (sequências de f lanqueamento a montante e a jusante). Após a transformação da cassete de disrupção em Y. células lipolytica, um evento de substituição do gene ocorre através de dupla permutação recombinação homóloga dentro dos dois braços de homologia flanqueadoras no locus alvo. Dois conjuntos de iniciadores de PCR foram utilizados para verificar a integração da cassete de disrupção (P1-P1 e F-R) e eliminação simultânea de regiões genómicas específicas (P2-F e P2-P). Finalmente, o marcador LEU2 é removido por expressão da recombinase Cre, deixando para trás um único sítio loxP no locus cromossómico. deleção do gene alvo e substituição de YALI0E17787 gene foi mostrado aqui como um exemplo. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. PCR confirmação de interrupção génica YALI0E17787 em Y. produtos lipolytica Po1g. PCR eram amplificado a partir de ADN genómico de transformantes (pistas 1-4) e estirpe de tipo selvagem (pista 5). As pistas 1, 2 e 4 ilustram orifícios positivos, enquanto a pista 3 mostra um falso positivo. No gel superior, os furos de sucesso gerar um fragmento de 750 pb, a qual é obtida com o conjunto de iniciadores P1 e P1-F-R. A banda de 750 pb é visto nas pistas 1, 2, e 4, mas não nas pistas 3 e 5. Na parte inferior do gel, um fragmento de 500 pb foi obtido com o conjunto de iniciadores P2 e P2-M-R e está presente apenas nas pistas 3 and 5. L:. 1 DNA kb Escada Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tabela 1. Os iniciadores utilizados neste estudo. Por favor clique aqui para baixar esta tabela.
| componente PCR | ||
| materiais de PCR | Volumes | A concentração final |
| O tampão de RCP | 10 ul | 1x |
| mistura de dNTP | 1 ul | 200 uM |
| iniciador directo | 2,5 ul | 500 nM </ Td> |
| iniciador inverso | 2,5 ul | 500 nM |
| DNA polimerase | 0,5 ul | 1 L |
| molde de ADN (genómico ou diluída ADN de plasmídeo) | 0,5-2 ul | 50 ng |
| água estéril | até 50 ul | |
| As condições de PCR | ||
| Temperatura | Tempo | Número de ciclos |
| 98 ° C | 30 seg | 1 |
| 98 ° C | 10 seg | 30 |
| 55 ° C | 30 seg | |
| 72 ° C | 30 seg | |
| 72 ° C | 10 min | 1 |
| Efectue a amplificação por PCR utilizando um THERMal cycler | ||
Tabela 2. PCR set-up e as condições para a DNA polimerase de alta fidelidade.
| Componente | |||
| materiais | A concentração final | ||
| De tampão ligase do DNA de T4 | 1x | ||
| DNA vector | 0,03 pmol | ||
| ADN inserido | 0,15 pmol | ||
| DNA ligase de T4 | 400 U | ||
| água estéril | até 20 ul | ||
| condições | |||
| Temperatura | Tempo | ||
| 16 ° C | 16 hr | ||
| Componente | |
| materiais | A concentração final |
| tampão de digestão de restrição | 1x |
| ADN (plasmídeo ou produto de PCR) | 1 ug |
| Uma enzima de restrição St | 5 L |
| 2 nd enzima de restrição (opcional) | 5 L |
| água estéril | até 50 ul |
| condições | |
| Temperatura | Tempo |
| 37 ° C | <td> 6 horas|
| Realizar único digestão com uma enzima de restrição única | |
| Realizar digestão dupla com um par de enzimas de restrição | |
Tabela 4. Condições para a digestão com enzimas de restrição de ADN.
| componente PCR | ||
| materiais de PCR | Volumes | A concentração final |
| O tampão de RCP | 2,5 ul | 1x |
| mistura de dNTP | 0,5 ul | 200 uM |
| iniciador directo | 0,5 ul | 200 nM |
| Reverse iniciador | 0,5 ul | 200 nM |
| DNA polimerase | 0,2 ul | 1 L |
| molde de ADN (genómico ou diluída ADN de plasmídeo) | 0,5-2 ul | 50 ng |
| água estéril | até 25 ul | |
| As condições de PCR | ||
| Temperatura | Tempo | Número de ciclos |
| 95 ° C | 5 min | 1 |
| 95 ° C | 30 seg | 30 |
| 50 ° C | 30 seg | |
| 72 ° C | 30 seg | |
| 72 ° C | 10 min | 1 |
| Realizar a amplificação por PCR usando um termociclador | ||
| Realizar PCR de colónia usando uma colónia directamente como molde, em vez de uma amostra de DNA | ||
Tabela 5. PCR / PCR Colony set-up e as condições de Taq DNA polimerase.
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Discussion
O nosso objectivo para este estudo é permitir a geração rápida e eficiente de nocaute de genes alvo do Y. lipolytica Po1g tensão. Várias considerações devem ser abordadas para conseguir isso. Em primeiro lugar, uma elevada eficiência de transformação é necessária. Assim, um protocolo de transformação química eficiente e conveniente para o Y. lipolytica Po1g estirpe foi descrito no presente estudo. O uso de PEG-4000 é um fator crítico para a transformação bem sucedida desta estirpe. Sem transformantes foram obtidos por transformação do plasmídeo quando utilizando PEG-3350 (para a transformação de S. cerevisiae), em vez de PEG-4000. Além disso, a preparação de células competentes, utilizando células preparadas de fresco é necessária para obter alta eficiência de transformação nesta estirpe. Em segundo lugar, para reduzir a recombinação e integração aleatória eventos não-homólogos via NHEJ dominante neste esforço, um método de transformação eficiente foi então utilizado para construir o KU70 knockout mutante. Em terceiro lugar, para melhorar a eficiência de substituição do gene por recombinação homóloga, a longo flanqueando braços (1 kb) a montante e a jusante dos genes alvo foram utilizados em cassetes de deleção do gene. Os longo regiões de f lanqueamento homólogas nas cassetes de rompimento são essenciais para recombinação homóloga eficiente nesta estirpe. Sem colónias positivas foram obtidos quando usando cassetes de rompimento com 50 pb regiões homólogas (suficientes para recombinação homóloga eficiente em S. cerevisiae). Utilizando todas estas estratégias, o gene da Ku70 Y. lipolytica Po1g cepa foi excluído com sucesso. No entanto, é extremamente difícil obter a estirpe knockout Ku70 devido à elevada taxa de recombinação não homóloga no Y. estirpe lipolytica Po1g. Cuidados devem ser tomados ao manusear o antibiótico higromicina B contendo mídia como higromicina B é sensível à luz. O uso de mídia com degradada higromicina B irá resultar em falso positives em passos 2.2.1 e 2.2.2 e falsos negativos na etapa 2.2.7.
Quando a estirpe de eliminação Ku70 foi usada para gerar eliminação sistemática de genes individuais que codificam álcool desidrogenases e oxidase de álcool, uma taxa de eliminação muito mais elevada foi obtida com a deleção do gene Ku70. Isto demonstra que a utilização da estirpe plataforma Ku70 deleção resultou em um aumento dramático na frequência de recombinação homóloga. Após a emissão da muito baixa taxa de recombinação homóloga foi abordado, o rastreio de Y. lipolytica de um único gene mutantes knockout foi altamente acelerado. Observamos, também, que o comprimento de 1 kb da região homóloga foi eficiente o suficiente para deleção do gene alvejado. Um aumento na frequência de recombinação homóloga pode ser conseguido quando se utiliza mais sequências homólogas (2 kb). Notavelmente, estes genes codificam álcool desidrogenases e álcool oxidase, que catalisam a conversão reversível entre álcoois e aldehydes. A eliminação destes genes pode levar a uma acumulação de biocombustível e compostos bioquímicos, incluindo ácidos gordos de cadeia curta, ácidos gordos de cadeia média, ácidos gordos de cadeia longa, ácidos hidroxi-gordos, álcoois, aldeídos e lípidos. Novos estudos serão realizados para verificar esta possibilidade.
Um método de rompimento de genes mediada por PCR foi reportado em Y. lipolytica Po1d estirpe 28. No entanto, este método é trabalhoso e demorado. Uma grande limitação deste método é a dificuldade de obter quantidades suficientes das cassetes de deleção do gene para uma experiência de transformação. Outra limitação é que este método é limitado para o marcador URA3. O método descrito neste estudo dirigida especificamente estes problemas na técnica baseada em PCR, combinando a abordagem digestão-ligadura e o sistema Cre / LoxP. Este método permite a utilização de diferentes marcadores antibiótico e auxotróf icos e, portanto, é mais versatelha. Pode facilitar a deleção do gene na rápida Y. estirpe lipolytica Po1g. Nós apresentamos aqui uma descrição detalhada da estratégia de deleção alvo de um único gene por recombinação homóloga em Y. células lipolytica Po1g. No entanto, um sítio loxP permanece como uma cicatriz dentro do genoma após a recuperação do marcador bem sucedida (Figura 4). Na deleção de vários genes, múltiplas cicatrizes LoxP são introduzidos no genoma, o que pode resultar em instabilidade genómica, devido a possíveis acontecimentos de recombinação que podem ocorrer entre os locais loxP. No entanto, as estirpes knockout construídas neste estudo mostraram muito boa estabilidade genética, indicando que eventos de recombinação não intencionais não ocorreu entre os locais loxP.
Em resumo, um protocolo de transformação genética eficaz foi estabelecida para o Y. estirpe lipolytica Po1g. Para a eliminação sistemática de genes individuais em esta estirpe foi demonstrado como uma prova de conceito. a Y. lipolytica Po1g Ku70 estirpe plataforma de exclusão construído neste estudo mostrou muito eficiente frequência de recombinação homóloga, que permite uma seleção mais fácil e mais rápido das deleções de genes-alvo. Assim, esta estirpe plataforma fornece um sistema mais eficiente e uma melhor escolha para aplicações em engenharia via e otimização de tensão ao construir outros mutantes cromossômica supressão. A metodologia descrita com a estirpe construída eliminação Ku70 também poderia ser aplicada para a inserção de genes alvo em loci específicos e a criação de mutações específicas do local no genoma.
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Acknowledgments
Agradecemos o apoio financeiro da Agência Nacional de Meio Ambiente de Singapura (ETRP 1.201.102), o Programa de Pesquisa Competitiva da Fundação Nacional de Pesquisa de Singapura (NRF-CRP5-2009-03), a Agência de Ciência, Tecnologia e Pesquisa de Cingapura ( 1324004108), a global Programa de P & D do Projeto, o Ministério da Economia do Conhecimento, a República da Coreia (N0000677), a Agência de Redução de defesa contra ameaças (DTRA, HDTRA1-13-1-0037) e da Biologia sintética Iniciativa da Universidade Nacional de Cingapura ( PRPD / 943/09/14).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| Oligonucleotide primers | Integrated DNA Technologies | 25 nmole DNA oligos | |
| Y. lipolytica strain Po1g | Yeastern Biotech | leucine auxotrophic derivative of the wild-type strain W29 (ATCC 20460) | |
| Vector pYLEX1 | Yeastern Biotech | FYY203-5MG | Y. lipolytica expression vector |
| E. coli TOP10 | Invitrogen | For cloning and propagation of plasmids | |
| pGEM-T vector | Promega | A3600 | TA cloning vector |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | For plasmid isolation |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System |
Promega | A9282 | Extract DNA fragments from agarose gels and purify PCR products from an amplification reaction |
| The iProof high-fidelity DNA polymerase |
Bio-Rad | 172-5302 | High-fidelity DNA polymerase |
| BamHI | New England Biolabs | R0136S | Restriction enzyme |
| BglII | New England Biolabs | R0144L | Restriction enzyme |
| KpnI | New England Biolabs | R0142S | Restriction enzyme |
| NdeI | New England Biolabs | R0111S | Restriction enzyme |
| NotI | New England Biolabs | R0189L | Restriction enzyme |
| PmlI | New England Biolabs | R0532S | Restriction enzyme |
| PstI | New England Biolabs | R0140S | Restriction enzyme |
| SacII | New England Biolabs | R0157S | Restriction enzyme |
| SalI | New England Biolabs | R0138S | Restriction enzyme |
| XhoI | New England Biolabs | R0146L | Restriction enzyme |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202L | |
| Taq DNA polymerase | Bio-Rad | M0267L | |
| Ampicillin | Gibco-Life Technologies | 11593-027 | Antibiotics |
| Hygromycin B | PAA | P21-014 | Antibiotics |
| GeneRuler 1 kb DNA ladder | Thermo Scientific | SM0312 | 1 kb DNA ladder |
| PEG4000 | Sigma | 95904-F | |
| Tris | Promega | H5135 | |
| EDTA | Bio-Rad | 161-0729 | |
| Salmon Sperm DNA | Invitrogen | 15-632-011 | |
| Lithium Acetate | Sigma | ||
| Acetic acid | Sigma | ||
| Glass beads (425-600 µm) | Sigma | G8772 | |
| RNAse A | Thermo Scientific | EN0531 | |
| DNA Loading Dye | Thermo Scientific | R0611 | |
| Bacto Yeast Extract | BD | 212750 | |
| Bacto Peptone | BD | 211677 | |
| D-Glucose | 1st Base | BIO-1101 | |
| YNB without amino acids | Sigma | Y0626 | |
| DO Supplement-Leu | Clontech | 630414 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| Difco LB Broth | BD | 244620 | |
| Difco LB Agar | BD | 244520 | |
| Bacto Agar | BD | 214010 | |
| Equipment | |||
| PCR machine | Biorad | T100 Thermal Cycler | |
| Water bath | Memmert | WNB 14 | |
| Stationary/Shaking Incubator | Yihder | LM-570RD | |
| Thermo-shaker | Allsheng | MS-100 | |
| Micro centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Spectrophotometer | Eppendorf | BioPhotometer plus | |
| Gel imager | GE | Amersham Imager 600 |
References
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