Abstract
Yarrowia lipolytica est une espèce de levure non pathogènes, dimorphes et strictement aérobies. En raison de ses caractéristiques physiologiques distinctifs et caractéristiques métaboliques, cette levure non conventionnelle est non seulement un bon modèle pour l'étude de la nature fondamentale de la différenciation fongique, mais est également une plate-forme microbienne prometteuse pour la production biochimique et diverses applications biotechnologiques, qui nécessitent de nombreuses manipulations génétiques. Cependant, les manipulations génétiques de Y. lipolytica ont été limités en raison de l'absence d'un système de transformation génétique efficace et stable, ainsi que des taux très élevés de recombinaison non homologue qui peut être principalement attribuée au gène KU70. Nous rapportons ici un protocole simple et rapide pour la transformation génétique efficace et pour la suppression du gène en Y. lipolytica Po1g. Tout d' abord, un protocole pour la transformation efficace de l' ADN exogène dans Y. lipolytica Po1g a été créé. Second, pour atteindre le double croisement taux de recombinaison homologue amélioré pour deletion supplémentaire de gènes cibles, le gène KU70 a été supprimée par la transformation d' une cassette de disruption 1 kb portant homologie bras. Troisièmement, mettre en évidence le gène suppression efficacité accrue après la suppression du gène KU70, nous avons supprimé individuellement 11 gènes cibles codant pour l' alcool déshydrogénase et l' alcool oxydase en utilisant les mêmes procédures sur la souche KU70 de plate - forme de KO. On a observé que le taux de recombinaison homologue précise sensiblement augmenté de moins de 0,5% pour la suppression du gène dans KU70 Po1g à 33% -71% pour la suppression d' un gène unique des 11 gènes cibles dans KU70 Po1g Δ. Un plasmide réplicatif portant le marqueur de résistance à l'hygromycine B et le système Cre / loxP a été construit et le gène marqueur de sélection dans les souches de levure knock-out a finalement été éliminé par l'expression de la recombinase Cre pour faciliter des cycles multiples de targemanipulations génétiques ted. Les mutants de délétion d'un gène unique résultant ont des applications potentielles dans les biocarburants et la production biochimique.
Introduction
Contrairement à Saccharomyces cerevisiae, Yarrowia lipolytica, une levure non conventionnelle, peut se développer sous la forme de levure ou mycélium en réponse aux changements des conditions environnementales 1,2. Ainsi, cette levure dimorphique peut être utilisé comme un bon modèle pour l'étude de la différenciation fongique, la morphogenèse et la taxonomie 3,4,5. Il est généralement considéré comme un coffre - fort (GRAS) des espèces de levures, qui est largement utilisé pour produire une variété d'additifs alimentaires , tels que des acides organiques, des polyalcools, des composés aromatiques, des émulsifiants et des agents tensio - actifs 6,7,8,9. Il est un aérobique de obligatoire et une levure oléagineuse bien connu capable d'accumuler naturellement les lipides à des quantités élevées, soit jusqu'à 70% de poids sec des cellules 10. Elle peut aussi utiliser un large éventail de sources de carbone pour la croissance, y compris les différents types de résidus dans le gaspillage de ressources que les nutriments 11,12,13. Toutes ces caractéristiques uniques font Y. lipolytica très attractif pour lesdiverses applications biotechnologiques.
Bien que la totalité de la séquence du génome de Y. lipolytica a été publiée 14,15, manipulation génétique de cette levure non conventionnelle est plus complexe que d' autres espèces de levure. Tout d' abord, la transformation de cette espèce de levure est beaucoup moins efficace en raison de l'absence d'un système de transformation génétique 16,17 stable et efficace. En second lieu , l' intégration génomique laborieuse des cassettes d'expression linéaires est couramment utilisé pour l'expression de gènes d'intérêt car aucun système de plasmide épisomique naturel a été trouvée dans cette levure 18. Troisièmement, la génération de knock-outs génétiques et knock-ins sont limitées parce que le gène efficacité du ciblage par recombinaison homologue précis dans cette levure est faible et la plupart des événements d'intégration se produit à travers l' extrémité non homologue de jonction (NHEJ) 19.
Dans cette étude, nous présentons un protocole de transformation optimisée pour Y. lipolytica KU70, qui code pour une enzyme clé dans la voie NHEJ. En utilisant le protocole de transformation optimisée et la transformation d' une cassette de knock-out linéaire contenant flanquant régions d'homologie de 1 kb du gène de la KU70 Y. lipolytica Po1g a été supprimé. La robustesse de cette méthode de suppression du gène a ensuite été démontrée en ciblant l' alcool déshydrogénase et les gènes de l' alcool oxydase dans la souche Po1g KU70 Δ. On a observé que la souche de deletion KU70 présentait une efficacité nettement plus élevée du gène de la recombinaison médiée par ciblage homologue à celle de la souche Po1g de type sauvage. En outre, une expression réplicatif Cre plasmide portant le marqueur de résistance à l'hygromycine B a été construit pour réaliser le marqueur de sauvetage. Le sauvetage de marqueur facilite plusieurs tours de ciblage de gènes dans ee a obtenu des mutants de deletion de gène. En plus de la suppression des gènes, notre protocole pour la transformation génétique et la suppression du gène décrit ici peut être utilisé pour insérer des gènes à des loci spécifiques et d'introduire des mutations spécifiques au site en Y. lipolytica génome.
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Protocol
1. Génération de Y. lipolytica KU70 délétion Strain
- La construction de la cassette de disruption
Note: Voir le tableau 1 pour toutes les amorces utilisées dans la réaction en chaîne par polymérase (PCR) amplifications.- Conception des amorces 20 pour amplifier par PCR la cassette d'expression LEU2 (voir le tableau 1) à partir d' un Y. Vecteur d'expression lipolytica et d' introduire des sites LoxP dans le sens 5 'et 3' de la cassette LEU2 avec une longue amorce avant (# 1; tableau 1) et une longue amorce inverse (# 2; tableau 1), respectivement. Pour introduire un site de restriction supplémentaire pour les étapes ultérieures du processus de clonage, ajouter un site de restriction Bam HI dans l' amorce # 1.
- Faire la PCR en utilisant un ADN polymérase haute fidélité comme détaillé dans le tableau 2.
- Purifier le produit PCR LoxP-promoteur-LEU2-terminator-LoxP la cassette en utilisant un purificatio PCRn Kit selon les instructions du fabricant. Ajouter des surplombs 3 'A et le produit de PCR purifié selon les instructions du fabricant 21. Utiliser l' ADN T4 ligase pour ligaturer le produit A-tailed PCR dans un vecteur de clonage TA pour donner le plasmide T-LEU2 selon le tableau 3.
- Amplifier par PCR le 1 kb séquence 5 ' en amont du gène en utilisant des amorces KU70 # 3 / # 4 du Y. Po1g lipolytica de l' ADN génomique 22 selon le tableau 2. On purifie le produit PCR en utilisant un kit de purification PCR selon les instructions du fabricant.
- Double digérer à la fois le produit de PCR purifié et T-LEU2 plasmidique avec les enzymes Sac II et Bam HI selon le Tableau 4. Purifier le mélange de digestion en utilisant un kit de purification PCR selon les instructions du fabricant. En utilisant l' ADN ligase T4 pour ligaturer le produit purifié et digéré par PCR au Sac II / Bam HI de sites de T-LEU2 pour donner leplasmide T-LEU2-5E selon le tableau 3.
- Amplifier par PCR la séquence de 1 kb 3 ' en aval du gène en utilisant des amorces KU70 # 5 / # 6 de Y. Po1g lipolytica de l' ADN génomique 22 selon le tableau 2. On purifie le produit PCR en utilisant un kit de purification PCR selon les instructions du fabricant. Double digérer à la fois le produit purifié PCR et le plasmide T-LEU2-5E avec Not I et Nde enzymes I selon le Tableau 4.
- On purifie le mélange de digestion en utilisant un kit de purification de PCR selon les instructions du fabricant. Ensuite, ligaturer purifié et digéré produit PCR à l'Not I / Nde Les sites que je de T-LEU2-5E pour donner le plasmide T-KO en utilisant l' ADN ligase T4 selon le Tableau 3.
- Digest le plasmide T-KO avec Sac II et Nde enzymes I selon le tableau 4 pour produire la cassette de rupture (Figure 1
- Préparation de cellules compétentes et la transformation de Y. souche lipolytica Po1g
- Préparation de cellules compétentes
- Inoculer une colonie de Y. la souche lipolytica Po1g à partir d' une plaque de levure fraîche d' extrait-peptone-dextrose (YPD) dans 10 ml de milieu YPD (1% d' extrait de levure, 2% de peptone, 2% de glucose et 50 mM de tampon citrate pH 4,0) dans un flacon de 100 ml. Incuber dans un incubateur agitateur à 30 ° C à 225 tpm pendant 20 heures jusqu'à saturation (une DO600 d'environ 15, mesurée en utilisant un spectrophotomètre).
- Sédimenter les cellules par centrifugation pendant 5 min à 5000 x g à température ambiante. Laver les cellules avec 20 ml de Tris-EDTA (TE) du tampon (Tris 10 mM, EDTA 1 mM, pH 7,5), et le culot les cellules comme décrit dans l'étape 1.2.1.2. Remettre en suspension les cellules dans 1 ml de 0,1 M d'acétate de lithium (pH 6,0, ajusté avec de l'acide acétique) et incuber pendant 10 min à la chambre temrature.
- Aliquoter les cellules compétentes (100 pi) dans 1,5 ml des tubes stériles. Procéder aux étapes de transformation immédiatement au-dessous, ou ajouter du glycérol à une concentration finale de 25% (v / v) et conserver à -80 ° C pour une conservation à long terme.
- Transformation
- mélanger doucement à 10 ul de l'ADN dénaturé de sperme de saumon (10 mg / ml) et de 1 à 5 ug de la cassette de disruption purifié avec 100 pl de cellules compétentes et on incube à 30 ° C pendant 15 min.
- Ajouter 700 ul de 40% de polyéthylène glycol (PEG) -4000 (dissous dans 0,1 M de lithium acétate pH 6,0), bien mélanger et incuber dans un incubateur agitateur à 30 ° C à 225 rpm pendant 60 min.
Remarque: il est important d'utiliser le PEG avec un poids moléculaire moyen de 4000, au lieu de PEG 3350 (généralement utilisé dans la transformation de la levure classique). - Choc thermique du mélange de transformation en plaçant le tube dans un bain d'eau à 39 ° C pendant 60 min.
- Ajouter 1 ml de milieu YPD etrécupérer pendant 2 heures à 30 ° C et 225 rpm. Centrifuger à 9000 g pendant 1 min à température ambiante, éliminer le surnageant et remettre en suspension le culot dans 1 ml de tampon TE.
- Repellet les cellules par centrifugation à 9000 g pendant 1 min à température ambiante et éliminer le surnageant. Remettre en suspension le culot dans 100 pl de tampon TE et on plaque sur des plaques sélectives (par exemple, des plaques déficientes en leucine) et incuber à 30 ° C pendant 2-3 jours.
- Choisir entre 4 et 10 colonies individuelles et séparément dans inoculer 2 ml de milieu YPD. Incuber une nuit dans un incubateur en secouant à 30 ° C à 225 tours par minute. Identifier les colonies positives par analyse par PCR de l' ADN génomique provenant de 22 transformants selon le tableau 5 en utilisant deux ensembles d'amorces # 55 / # 56 et # 56 / # 57, respectivement.
Note: Le Not I linéarisé pYLEX1 vecteur est transformé en Y. lipolytica Po1g cellules compétentes afin de déterminer l'efficacité de transformation en comptant le nombreunités formant des colonies (ufc) par ug d' ADN plasmidique 23 utilisé.
- Préparation de cellules compétentes
2. Marqueur Rescue
- La construction du plasmide d'expression de Cre
- Construction de pYLEX1-CRE et pYLEX1-HPH
- Conception des amorces 20 pour amplifier par PCR les cadres de cre et hph de lecture ouverts. Ajouter une adénine nucléotide supplémentaire en amont des codons de départ dans les amorces sens # 82 et # 84, et d' insérer des sites de restriction Kpnl en aval des codons d'arrêt dans les amorces inverses # 83 et # 85 amplifier par PCR les trames de cre de lecture ouverts et hph de pSH69 (numéro d' accession HQ412578) 24 selon le tableau 2.
- Purifier les deux cre et des fragments hph en utilisant un kit de purification PCR selon les instructions du fabricant. Digest à la fois les cre et hph fragments purifiés avec Kpn I enzyme selon Table 4. Double digérer le plasmide pYLEX1 avec des enzymes Pml I et Kpn I selon le Tableau 4. Purifier le mélange de digestion en utilisant un kit de purification PCR selon les instructions du fabricant.
- Utilisez l' ADN ligase T4 selon le tableau 3 pour ligaturer les cre et hph fragments purifiés et digérés vers des sites Pml I / Kpn I du Y. vecteur d'expression de lipolytica, donnant pYLEX1-CRE et pYLEX1-HPH, respectivement.
- Construction de pSL16-CRE-HPH
- Amplifier par PCR la cassette promoteur-gène-terminateur de cre partir pYLEX1-CRE en utilisant des amorces # 86 / # 87 flanquant les Sal I / Pst I sites de restriction conformément au Tableau 2. On purifie le produit PCR en utilisant un kit de purification PCR selon les instructions du fabricant .
- Double digérer à la fois le produit de PCR purifié et pSL16-CEN1-1 (227) plasmide 25 avec Sal I etPst I enzymes selon le Tableau 4. Purifier le mélange de digestion en utilisant un kit de purification PCR selon les instructions du fabricant. Ensuite, ligaturer le produit de PCR purifié et digéré dans pSL16-CEN1-1 (227) au niveau des sites correspondant à créer pSL16-CRE en utilisant l' ADN ligase T4 selon le tableau 3.
- Amplifier par PCR la cassette promoteur-gène-terminateur de hph de pYLEX1-HHP en utilisant des amorces # 88 / # 89 flanquant les sites de restriction Xho I / Bgl II selon le tableau 2. On purifie le produit PCR en utilisant un kit de purification PCR selon les instructions du fabricant .
- Double digérer à la fois le produit purifié PCR et pSL16-CRE plasmidique avec les enzymes Xho I et Bgl II selon le Tableau 4. Purifier le mélange de digestion en utilisant un kit de purification PCR selon les instructions du fabricant. Ensuite, ligaturer le produit de PCR purifié et digéré dans pSL16-CRE au correspondantsites pour générer pSL16-CRE-HPH en utilisant l' ADN ligase T4 selon le Tableau 3.
Remarque: Le Cre expression plasmide résultant, pSL16-CRE-HPH, abrite un marqueur hygromycine B sélectionnable et est un vecteur centromérique et la réplication épisomique (Figure 2).
- Double digérer à la fois le produit purifié PCR et pSL16-CRE plasmidique avec les enzymes Xho I et Bgl II selon le Tableau 4. Purifier le mélange de digestion en utilisant un kit de purification PCR selon les instructions du fabricant. Ensuite, ligaturer le produit de PCR purifié et digéré dans pSL16-CRE au correspondantsites pour générer pSL16-CRE-HPH en utilisant l' ADN ligase T4 selon le Tableau 3.
- Vérifiez toutes les constructions par digestion avec des enzymes de restriction appropriées (par exemple, Sal I / Pst I, pour exciser l'insert du vecteur) selon le Tableau 4.
- Amplifier par PCR la cassette promoteur-gène-terminateur de cre partir pYLEX1-CRE en utilisant des amorces # 86 / # 87 flanquant les Sal I / Pst I sites de restriction conformément au Tableau 2. On purifie le produit PCR en utilisant un kit de purification PCR selon les instructions du fabricant .
- Construction de pYLEX1-CRE et pYLEX1-HPH
- Cre recombinase-médiée sauvetage du marqueur
- Transformer pSL16-CRE-HPS dans des cellules compétentes de la souche knockout KU70 suivant le protocole de transformation décrit dans la section 1.2 ci - dessus. Plate transformé cellules sur YPD, plus hygromycine B (YPDH) plaques (contenant 400 ug / ml d'hygromycine B), et incuber à 30 ° C pendant 2-3 jours.
- Effectuer colonie PCR selon le tableau 5 en utilisant des amorces # 84 / # 85 pour identifier positifcolonies contenant pSL16-CRE-HPH plasmidique après transformation.
Note: L'amorce sens n ° 84 et l'amorce inverse # 85 sont situés à l' intérieur de la région codante du gène hph (tableau 1). Seuls les clones positifs de générer un produit de PCR spécifique dans la réaction PCR. - Choisissez un clone positif et inoculer dans 2 ml de milieu YPDH, et incuber dans un incubateur agitateur à 30 ° C à 225 tours par minute pendant une nuit à la saturation. Mesurer la densité optique de la cellule 600 avec un spectrophotomètre. Récolter les cellules à une DO 600 de ~ 15. Centrifuger à 5000 xg pendant 5 min à température ambiante, et laver une fois avec 2 ml d'eau stérile.
- Re-inoculer des cellules dans 2 ml de milieu YPD avec une première DO 600 de 0,1 et permettent aux cellules de se développer dans un incubateur agitateur à 30 ° C à 225 tours par minute pendant la nuit. Streak la culture cellulaire pendant la nuit sur des plaques de YPD pour isoler des colonies isolées 23. Les colonies de la plaque de réplication ONTO YPD, YPDH et les plaques de 23 déficientes en leucine Note: Les colonies qui ont perdu à la fois le marqueur LEU2 et pSL16-CRE-HPH plasmide ne peut se développer sur des plaques de YPD (Figure 3).
3. Suppression de l'alcool déshydrogénase et de l'alcool oxydase Genes
- Effectuer une recherche sur Y. base de données du génome de lipolytica utilisant le Local Alignment Search Tool de base (BLAST) pour identifier les gènes candidats pour la suppression 26. Entrer la séquence de la protéine de S. cerevisiae alcool déshydrogénase I dans l' outil de recherche BLAST (http://www.genome.jp/tools-bin/search_sequence?prog=blast&db=yli&seqid=aa).
Remarque: L'outil de recherche BLAST retourne séquences les protéines les plus semblables dans le Y. la base de données du génome lipolytica. - Construire les cassettes de délétion par PCR avec des amorces # 7 à # 56 (tableau 1), et effectuer une digestion de restriction de l' enzyme et les réactions de ligature en utilisant les mêmes méthodes que celles décrites à la section 1.1 ci - dessus.
- Préparationsont des cellules compétentes de la souche knockout KU70, effectuer des transformations et d' effectuer une PCR pour identifier les colonies positives avec des amorces # 55, # 58 à # 81 (tableau 1) en suivant le protocole décrit dans la section 1.2 ci - dessus.
Note: A titre d'exemple, la procédure de suppression du gène YALI0E17787g est décrite dans les figures 4 et 5. Les effets de 1 kb et 2 kb région homologue sur le taux de recombinaison homologue sont rapportés.
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Representative Results
Y. linéarisé Vecteur d'expression lipolytica a été inséré dans la plate - forme d'arrimage pBR dans le génome de Y. lipolytica souche Po1g en effectuant une simple recombinaison de croisement 27. En utilisant la procédure rapide de transformation chimique établie dans cette étude, le Y. linéarisé vecteur d'expression lipolytica a été transformé avec succès dans la souche Po1g de type sauvage à une efficacité de transformation> 100 ufc / pg d' ADN. Une cassette KO flanqué de 1 kb des séquences homologues a été transformé dans la souche Po1g et le gène KU70 a été supprimé avec succès (Figure 1). Ici, l'amorce sens n ° 56 recuits à la séquence située à l' intérieur du bras 5 'd'homologie du gène KU70. L'amorce antisens n ° 55 est situé à l' intérieur de la région codante du marqueur LEU2. L'amorce inverse # 57 est situé à l' intérieur de la région codante du gène KU70. Commentde plus, sur plus de 200 colonies, une seule colonie positive avec le gène supprimé KU70 a été observée, ce qui suggère un taux de suppression de gène très faible (<0,5%). Ensuite, un plasmide réplicatif portant l'hygromycine B marqueur de résistance et le système Cre / loxP a été construit (figure 2), et le gène marqueur de sélection dans la souche KU70 knock - out a finalement été éliminé par l' expression de la recombinase Cre (figure 3). En utilisant l'outil de recherche BLAST, onze putatifs gènes de l' alcool déshydrogénase et un gène de l'alcool oxydase ont été identifiés dans Y. lipolytica génome. Les gènes de l'alcool déshydrogénase putatifs sont YALI0E17787g, YALI0D25630g, YALI0A16379g, YALI0E15818g, YALI0D02167g, YALI0A15147g, YALI0E07766g, YALI0F09603g, YALI0B10175g, YALI0F08129g, YALI0E07810g. Le gène de l'alcool oxydase putative est YALI0B14014g. Pour vérifier l'augmentation du taux de délétion du gène après la suppression du gène KU70, nous avons supprimé individuellement 11 gènes en parallèle ( à l' exceptionpour YALI0A16379g) en utilisant les cassettes de disruption avec de longues séquences homologues dans le Y. souche knockout lipolytica KU70 (figures 4 et 5). Ici, les amorces sens (P1-P2-F et F) hybrident à la séquence située à l'intérieur du bras 5 'd'homologie des gènes cibles. Les amorces inverses (P1-R) sont situés à l' intérieur de la région codante du marqueur LEU2. Les amorces inverses (P2-R) sont situés à l' intérieur de la région codante des gènes cibles (figure 4). Les cassettes knock-out ne diffèrent que légèrement la longueur des séquences homologues et les sites de restriction (tableau 1). Les taux de suppression de gène [recombinaison homologue / (+ recombinaison homologue recombinaison non homologue)] de 33% -71% ont été obtenus, ce qui suggère une augmentation spectaculaire de la fréquence de recombinaison homologue ciblée sur la délétion du gène de la KU70. Par exemple, le taux de suppression YALI0E17787g était de 40% (~ / pg d'ADN de 100 CFU). en outreLa possibilité d'une nouvelle augmentation du taux de délétion du gène a été étudiée lors de longues séquences homologues ont été utilisées. Elle a montré que la YALI0E17787g cassette de disruption de gène à 2 kb de séquences homologues a donné un taux de suppression de 87,5% (~ 400 CFU / pg d'ADN). En outre, le marqueur de sélection LEU2 gène introduit dans les mutants de deletion obtenus a été éliminé en transformant le vecteur pSL16-CRE-HHP (hp4d- cre, hph), permettant ainsi de multiples séries de manipulations génétiques ciblées.
Figure 1. Construction de la cassette KU70 KO et le KU70 mutant déficient. A. Le KU70 KO plasmide T-KO. B. Le schéma de principe de la cassette KU70 KO. re en amont et en avalgions (1 kb) du gène ont été clonées à KU70 5 'et l' extrémité 3' de la cassette d'interruption pour une recombinaison homologue. La cassette d'expression LEU2 a été insérée entre deux séquences homologues flanquantes. C. L' électrophorèse sur gel de la cassette KU70 de suppression après Sac II et Nde I digestion de T-KO. L: 1 kb ADN Ladder; 1: La cassette KU70 de suppression (la taille de la bande attendue est de 4,3 kb) D.. La confirmation par PCR de la suppression du gène dans KU70 Y. lipolytica Po1g. Les produits de PCR ont été amplifiés à partir d'ADN génomique de transformants (lignes 1-10) et la souche de type sauvage (piste 11). Lane 7 illustre un KO positif, alors que la piste 1 montre un faux positif. Dans le gel de dessus, un fragment de 500 pb est obtenu avec l'ensemble d'amorces # 56 / # 57 et est seulement absent dans les couloirs 1 et 7. Dans le gel de fond, le knock-out avec succès générer un fragment de 750 pb, qui est obtenu avec le jeu d'amorces # 55 / # 56 Til 750 pb bande est seulement vu dans le couloir 7. L:. 1 kb ADN Ladder S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Représentation schématique du Cre plasmide d'expression de recombinase pour le marqueur de sauvetage. Le plasmide à replication épisomique pSL16-CRE-HHP porte une recombinase Cre (CRE), un marqueur de résistance à l' hygromycine B (HPH), un gène de résistance à l'ampicilline (Amp), un l' origine de replication d'Escherichia coli (pMB1), une origine de réplication de Y. lipolytica (ORI1001), une séquence d'ADN centromère de Y. lipolytica (CEN1-1) et un gène lacZ codant pour l'enzyme β-galactosidase. S'il vous plaît cliquer ici pour voir un plus grand version de ce chiffre.
Figure projection de Y. marqueurs moins positifs 3. Croissance souches lipolytica après sauvetage du marqueur. transformants (1-4) ont été dilués et déposés sur des plaques de YPD, plaques de YPDH et des plaques de leucine déficientes, respectivement. Après 3 jours de croissance à 30 ° C, des transformants libres de marqueurs positifs (1, 3, 4) ne peuvent croître sur une plaque YPD, ce qui indique l'excision du gène marqueur LEU2 lors de l' expression de la recombinase Cre et la perte du plasmide pSL16- CRE-HPH a:. plaque YPD, B: plaque de YPDH, C:. plaque de leucine-deficient S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. Diagramme schématique d' une délétion du gène cible et le marqueur procédure de secours. La cassette de disruption de gène est constitué d'un gène marqueur de sélection (LEU2) , flanqué de deux sites de reconnaissance LoxP et deux bras de ciblage (séquences flanquantes en amont et en aval). Après transformation de la cassette de rupture dans Y. les cellules lipolytica, un événement de remplacement de gène a lieu par l' intermédiaire de double recombinaison croisée homologue dans les deux bras flanquants d'homologie au niveau du locus cible. Deux ensembles d'amorces de PCR ont été utilisés pour vérifier l'intégration de la cassette d'interruption (P1 et P1-F-R) et la suppression simultanée des régions génomiques ciblées (P2-F et P2-R). Enfin, le marqueur LEU2 est éliminé par l' expression de la recombinase Cre, laissant un seul site loxP au niveau du locus chromosomique. délétion du gène ciblé et le remplacement des YALI0E17787 gene l' a montré ici comme exemple. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5. confirmation par PCR de disruption génique YALI0E17787 en Y. lipolytica produits Po1g. PCR étaient amplifié à partir d'ADN génomique de transformants (voies 1-4) et souche de type sauvage (piste 5). Les pistes 1, 2 et 4 illustrent débouchures positives, alors que la piste 3 montre un faux positif. Dans le gel top, les KO succès génèrent un fragment de 750 pb, qui est obtenu avec l'ensemble d'amorces P1-F et P1-R. La bande de 750 pb est vu dans les couloirs 1, 2 et 4, mais pas dans les voies 3 et 5. Dans le gel de fond, un fragment de 500 pb est obtenu avec l'ensemble d'amorces P2-F et P2-R et est présent uniquement dans les couloirs 3 and 5. L:. 1 DNA kb Ladder S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Tableau 1. Amorces utilisées dans cette étude. S'il vous plaît cliquer ici pour télécharger ce tableau.
| composante PCR | ||
| matériaux PCR | volumes | La concentration finale |
| un tampon de PCR | 10 ul | 1 fois |
| dNTP mix | 1 ul | 200 um |
| amorce sens | 2,5 ul | 500 nm </ Td> |
| amorce antisens | 2,5 ul | 500 nm |
| ADN polymérase | 0,5 ul | 1 U |
| une matrice d'ADN (dilué génomique ou de l'ADN de plasmide) | 0,5-2 ul | 50 ng |
| L'eau stérile | jusqu'à 50 ul | |
| Les conditions de PCR | ||
| Température | Temps | Nombre de cycles |
| 98 ° C, | 30 sec | 1 |
| 98 ° C, | 10 sec | 30 |
| 55 ° C, | 30 sec | |
| 72 ° C, | 30 sec | |
| 72 ° C, | 10 minutes | 1 |
| Effectuer une amplification par PCR en utilisant un thermal cycleur | ||
Tableau 2. PCR set-up et les conditions de la haute fidélité de l' ADN polymérase.
| Composant | |||
| Matériaux | La concentration finale | ||
| Tampon de ligase de T4 DNA | 1 fois | ||
| ADN vecteur | 0,03 pmol | ||
| Insérer l'ADN | 0,15 pmol | ||
| ADN ligase de T4 | 400 U | ||
| L'eau stérile | jusqu'à 20 ul | ||
| Conditions | |||
| Température | Temps | ||
| 16 ° C, | 16 h | ||
| Composant | |
| Matériaux | La concentration finale |
| tampon de digestion de restriction | 1 fois |
| ADN (plasmide ou PCR produit) | 1 pg |
| 1 er enzyme de restriction | 5 U |
| 2 e enzyme de restriction ( en option) | 5 U |
| L'eau stérile | jusqu'à 50 ul |
| Conditions | |
| Température | Temps |
| 37 ° C, | <td> 6 h|
| Effectuer seule digestion avec une enzyme de restriction unique | |
| Effectuer une double digestion avec une paire d'enzymes de restriction | |
Tableau 4. Conditions de l' enzyme de restriction digestion de l' ADN.
| composante PCR | ||
| matériaux PCR | volumes | La concentration finale |
| un tampon de PCR | 2,5 ul | 1 fois |
| dNTP mix | 0,5 ul | 200 um |
| amorce sens | 0,5 ul | 200 nm |
| Reverse primaire | 0,5 ul | 200 nm |
| ADN polymérase | 0,2 pi | 1 U |
| une matrice d'ADN (dilué génomique ou de l'ADN de plasmide) | 0,5-2 ul | 50 ng |
| L'eau stérile | jusqu'à 25 ul | |
| Les conditions de PCR | ||
| Température | Temps | Nombre de cycles |
| 95 ° C, | 5 min | 1 |
| 95 ° C, | 30 sec | 30 |
| 50 ° C, | 30 sec | |
| 72 ° C, | 30 sec | |
| 72 ° C, | 10 minutes | 1 |
| Effectuer une amplification par PCR en utilisant un cycleur thermique | ||
| Effectuer une PCR sur colonie en utilisant directement une colonie comme matrice, au lieu d'un échantillon d'ADN | ||
Tableau 5. PCR / Colony PCR mis en place et les conditions de l' ADN polymérase Taq.
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Discussion
Notre objectif pour cette étude est de permettre la génération rapide et efficace de KO de gènes ciblés dans le Y. lipolytica souche Po1g. Plusieurs considérations doivent être abordées pour atteindre cet objectif. Tout d'abord, une grande efficacité de transformation est nécessaire. Ainsi, un protocole de transformation chimique efficace et commode pour le Y. souche lipolytica Po1g a été décrite dans cette étude. L'utilisation de PEG-4000 est un facteur critique pour la transformation réussie de cette souche. Aucun transformants ont été obtenus pour la transformation du plasmide lors de l' utilisation de PEG-3350 (pour la transformation de S. cerevisiae) au lieu de PEG-4000. En outre, la préparation des cellules compétentes en utilisant des cellules fraîchement préparées est nécessaire pour obtenir une efficacité de transformation élevée dans cette souche. Deuxièmement, pour réduire la recombinaison et l' intégration aléatoire des événements non homologues via dominante NHEJ dans cette souche, une méthode de transformation efficace a ensuite été utilisé pour construire le KU70 KO mutant. Troisièmement, pour améliorer l'efficacité du remplacement de gène par recombinaison homologue, flanquant à long bras (1 kb) en amont et en aval des gènes cibles ont été utilisées dans des cassettes de délétion du gène. Les régions homologues à long flanquant dans les cassettes de perturbation sont essentielles pour l'efficacité de recombinaison homologue dans cette souche. Pas de colonies positives ont été obtenues lors de l' utilisation des cassettes de perturbation avec 50 pb des régions homologues (suffisantes pour efficace recombinaison homologue chez S. cerevisiae). En utilisant toutes ces stratégies, le gène de Y. KU70 souche lipolytica Po1g a été supprimé. Néanmoins, il est extrêmement difficile d'obtenir la souche KU70 KO en raison du taux très élevé de recombinaison non homologue dans le Y. souche lipolytica Po1g. Des précautions doivent être prises lors de la manipulation du antibiotique hygromycine B contenant les médias que l'hygromycine B est sensible à la lumière. L'utilisation des médias avec dégradé hygromycine B se traduira par de faux positives dans les étapes 2.2.1 et 2.2.2 et de faux négatifs à l'étape 2.2.7.
Lorsque la souche de deletion KU70 a été utilisé pour générer deletion ciblée de gènes codant pour l'alcool déshydrogénase et de l' alcool oxydase, un taux beaucoup plus élevé de suppression a été réalisée par rapport à la suppression du gène KU70. Cela démontre que l'utilisation de la souche de la plate - forme KU70 de suppression a entraîné une augmentation spectaculaire de la fréquence de recombinaison homologue. Après la délivrance du très faible taux de recombinaison homologue a été adressée, le dépistage de Y. mutants knockout monogéniques lipolytica a été fortement accéléré. Nous avons également constaté que la longueur de 1 kb de région homologue était assez efficace pour la suppression du gène ciblé. Une augmentation de la fréquence de recombinaison homologue pourrait être réalisée lors de l'utilisation des séquences plus homologues (2 kb). Notamment, ces gènes codent pour l'alcool déshydrogénase et de l'alcool oxydase, qui catalysent la conversion réversible entre les alcools et les aldehydes. La deletion de ces gènes peut mener à une accumulation accrue de biocarburant et de composés biochimiques, y compris les acides gras à chaîne courte, des acides gras à chaîne moyenne, les acides gras à longue chaîne, des acides gras hydroxylés, des alcools, des aldéhydes et des lipides. D'autres études seront effectuées pour vérifier cette possibilité.
Un procédé de disruption de gène à médiation par PCR a été rapporté en Y. souche lipolytica PO1d 28. Cependant, cette méthode est laborieuse et prend du temps. Une limitation importante de ce procédé est la difficulté d'obtenir des quantités suffisantes de la cassette de deletion de gènes pour une expérience de transformation. Une autre limitation est que cette méthode est limitée au marqueur URA3. La méthode décrite dans cette étude portait spécifiquement ces questions dans la technique à base de PCR en combinant l'approche digestion-ligature et le système Cre / LoxP. Cette méthode permet l'utilisation de différents marqueurs antibiotiques et auxotrophes et est donc plus versatuile. Il peut faciliter la suppression de gène rapide dans le Y. souche lipolytica Po1g. Nous présentons ici une description détaillée de la stratégie de suppression unique gène ciblé par recombinaison homologue dans Y. cellules lipolytica Po1g. Cependant, un site loxP reste comme une cicatrice dans le génome après le sauvetage de marqueur avec succès (Figure 4). Dans délétion multiples gènes, des cicatrices multiples LoxP sont introduites dans le génome, ce qui peut entraîner une instabilité génomique due à des événements de recombinaison potentiels qui peuvent se produire entre les sites LoxP. Néanmoins, les souches knock-out construits dans cette étude ont montré une très bonne stabilité génétique, ce qui indique que des événements de recombinaison non souhaitées ne se produisent pas entre les sites LoxP.
En résumé, un protocole de transformation génétique efficace a été établie pour le Y. souche lipolytica Po1g. La suppression ciblée des gènes uniques dans cette souche a été démontrée comme une preuve de concept. Le Y. lipolytica Po1g KU70 souche de plate - forme de suppression construit dans cette étude a montré très efficace fréquence de recombinaison homologue, ce qui permet un dépistage facile et plus rapide des suppressions de gènes ciblés. Ainsi, cette souche de la plate-forme fournit un système plus efficace et un meilleur choix pour les applications dans l'ingénierie de la voie et l'optimisation des contraintes lors de la construction d'autres mutants chromosomiques de suppression. La méthodologie décrite et la souche de deletion KU70 construite pourraient également être appliqués à l'insertion de gènes cibles dans des loci spécifiques et la création de mutations spécifiques du site dans le génome.
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Acknowledgments
Nous reconnaissons avec gratitude le soutien financier de l'Agence nationale de l'environnement de Singapour (ETRP 1.201.102), le Programme de recherche concurrentielle de la National Research Foundation de Singapour (NRF-CRP5-2009-03), l'Agence pour la science, la technologie et la recherche de Singapour ( 1324004108), global R & D Program Project, le Ministère de l'économie du savoir, la République de Corée (N0000677), la Defense Threat Reduction Agency (DTRA, HDTRA1-13-1-0037) et la biologie synthétique Initiative de l'Université nationale de Singapour ( DPRT / 943/09/14).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| Oligonucleotide primers | Integrated DNA Technologies | 25 nmole DNA oligos | |
| Y. lipolytica strain Po1g | Yeastern Biotech | leucine auxotrophic derivative of the wild-type strain W29 (ATCC 20460) | |
| Vector pYLEX1 | Yeastern Biotech | FYY203-5MG | Y. lipolytica expression vector |
| E. coli TOP10 | Invitrogen | For cloning and propagation of plasmids | |
| pGEM-T vector | Promega | A3600 | TA cloning vector |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | For plasmid isolation |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System |
Promega | A9282 | Extract DNA fragments from agarose gels and purify PCR products from an amplification reaction |
| The iProof high-fidelity DNA polymerase |
Bio-Rad | 172-5302 | High-fidelity DNA polymerase |
| BamHI | New England Biolabs | R0136S | Restriction enzyme |
| BglII | New England Biolabs | R0144L | Restriction enzyme |
| KpnI | New England Biolabs | R0142S | Restriction enzyme |
| NdeI | New England Biolabs | R0111S | Restriction enzyme |
| NotI | New England Biolabs | R0189L | Restriction enzyme |
| PmlI | New England Biolabs | R0532S | Restriction enzyme |
| PstI | New England Biolabs | R0140S | Restriction enzyme |
| SacII | New England Biolabs | R0157S | Restriction enzyme |
| SalI | New England Biolabs | R0138S | Restriction enzyme |
| XhoI | New England Biolabs | R0146L | Restriction enzyme |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202L | |
| Taq DNA polymerase | Bio-Rad | M0267L | |
| Ampicillin | Gibco-Life Technologies | 11593-027 | Antibiotics |
| Hygromycin B | PAA | P21-014 | Antibiotics |
| GeneRuler 1 kb DNA ladder | Thermo Scientific | SM0312 | 1 kb DNA ladder |
| PEG4000 | Sigma | 95904-F | |
| Tris | Promega | H5135 | |
| EDTA | Bio-Rad | 161-0729 | |
| Salmon Sperm DNA | Invitrogen | 15-632-011 | |
| Lithium Acetate | Sigma | ||
| Acetic acid | Sigma | ||
| Glass beads (425-600 µm) | Sigma | G8772 | |
| RNAse A | Thermo Scientific | EN0531 | |
| DNA Loading Dye | Thermo Scientific | R0611 | |
| Bacto Yeast Extract | BD | 212750 | |
| Bacto Peptone | BD | 211677 | |
| D-Glucose | 1st Base | BIO-1101 | |
| YNB without amino acids | Sigma | Y0626 | |
| DO Supplement-Leu | Clontech | 630414 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| Difco LB Broth | BD | 244620 | |
| Difco LB Agar | BD | 244520 | |
| Bacto Agar | BD | 214010 | |
| Equipment | |||
| PCR machine | Biorad | T100 Thermal Cycler | |
| Water bath | Memmert | WNB 14 | |
| Stationary/Shaking Incubator | Yihder | LM-570RD | |
| Thermo-shaker | Allsheng | MS-100 | |
| Micro centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Spectrophotometer | Eppendorf | BioPhotometer plus | |
| Gel imager | GE | Amersham Imager 600 |
References
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