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Genetics

अक्षय जैव ईंधन और जैव रासायनिक उत्पादन के लिए एक अपरंपरागत खमीर की जेनेटिक इंजीनियरिंग

Published: September 20, 2016 doi: 10.3791/54371
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2,3, 1,2
1Department of Biochemistry, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, 2NUS Synthetic Biology for Clinical and Technological Innovation (SynCTI), Life Sciences Institute, National University of Singapore, 3Food Science and Chemical Engineering, Singapore Institute of Technology

Abstract

Yarrowia lipolytica एक, गैर रोगजनक द्विरूपी और कड़ाई से एरोबिक खमीर प्रजातियों है। अपनी विशिष्ट शारीरिक विशेषताओं और चयापचय विशेषताओं के कारण, इस अपरंपरागत खमीर न केवल फंगल भेदभाव के मौलिक प्रकृति के अध्ययन के लिए एक अच्छा मॉडल है, लेकिन यह भी जैव रासायनिक उत्पादन और विभिन्न जैव प्रौद्योगिकी अनुप्रयोगों, जो व्यापक आनुवंशिक जोड़तोड़ की आवश्यकता के लिए एक आशाजनक माइक्रोबियल मंच है। हालांकि, वाई के आनुवंशिक जोड़तोड़ lipolytica एक कुशल और स्थिर आनुवंशिक परिवर्तन प्रणाली की कमी के रूप में अच्छी तरह से गैर मुताबिक़ पुनर्संयोजन की दर बहुत अधिक है कि मुख्य रूप KU70 जीन को जिम्मेदार ठहराया जा सकता है के कारण सीमित कर दिया गया है। यहाँ, हम कुशल आनुवंशिक परिवर्तन के लिए और वाई में जीन विलोपन के लिए एक आसान और तेजी से प्रोटोकॉल की रिपोर्ट lipolytica Po1g। सबसे पहले, वाई में exogenous डीएनए के कुशल परिवर्तन के लिए एक प्रोटोकॉल lipolytica Po1g स्थापित किया गया था। सेकोएन डी, लक्ष्य जीन के आगे हटाने के लिए बढ़ाया डबल-विदेशी मुताबिक़ पुनर्संयोजन दर प्राप्त करने के लिए, KU70 जीन 1 केबी अनुरूपता हथियार ले जा रहे एक व्यवधान कैसेट बदलने से हटाया गया था। तीसरा, KU70 जीन के हटाए जाने के बाद बढ़ाया जीन विलोपन दक्षता प्रदर्शित करने के लिए, हम व्यक्तिगत रूप से शराब डिहाइड्रोजनेज और शराब oxidase KU70 पीटकर मंच तनाव पर एक ही प्रक्रियाओं का उपयोग एन्कोडिंग 11 लक्ष्य जीन नष्ट कर दिया। यह देखा गया है कि सटीक मुताबिक़ पुनर्संयोजन की दर हटाने के लिए कम से कम 0.5% से काफी वृद्धि हुई Po1g KU70 Δ में 11 लक्ष्य जीन की एकल जीन विलोपन के लिए Po1g में KU70 जीन 33% -71% तक की। एक replicative hygromycin बी प्रतिरोध मार्कर और रचनात्मक / LoxP प्रणाली को ले जाने प्लाज्मिड निर्माण किया गया था, और खमीर पीटकर उपभेदों में चयन मार्कर जीन अंततः targe के कई दौर की सुविधा के लिए Cre recombinase की अभिव्यक्ति से हटा दिया गया थाटेड आनुवंशिक जोड़तोड़। जिसके परिणामस्वरूप एकल जीन विलोपन म्यूटेंट जैव ईंधन और जैव रासायनिक उत्पादन में संभावित आवेदन किया है।

Introduction

Saccharomyces cerevisiae, Yarrowia lipolytica, एक अपरंपरागत खमीर के विपरीत, पर्यावरण की स्थिति 1,2 में बदलाव के जवाब में खमीर या फुई के रूप में विकसित कर सकते हैं। इस प्रकार, इस द्विरूपी खमीर कवक भेदभाव, morphogenesis और वर्गीकरण 3,4,5 के अध्ययन के लिए एक अच्छा मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। यह आम तौर पर एक सुरक्षित (GRAS) खमीर प्रजातियों, जो व्यापक रूप से इस तरह के कार्बनिक अम्ल, polyalcohols, सुगंध यौगिकों, पायसीकारी और surfactants 6,7,8,9 के रूप में खाद्य additives की एक किस्म के उत्पादन के लिए प्रयोग किया जाता है के रूप में माना जाता है। यह एक लाचार aerobe और एक अच्छी तरह से जाना जाता है चिकना खमीर स्वाभाविक रूप से उच्च मात्रा में लिपिड जमते में सक्षम है, यानी, अप सेल सूखी वजन 10 से 70% करने के लिए है। यह भी पोषक तत्वों 11,12,13 के रूप में अपशिष्ट संसाधनों में अवशेष के विभिन्न प्रकार सहित, विकास के लिए कार्बन सूत्रों की एक व्यापक स्पेक्ट्रम का उपयोग कर सकते हैं। इन अद्वितीय सुविधाओं के सभी वाई बनाना lipolytica के लिए बहुत आकर्षकविभिन्न जैव प्रौद्योगिकी अनुप्रयोगों।

हालांकि वाई के पूरे जीनोम अनुक्रम lipolytica 14,15 प्रकाशित किया गया है, इस अपरंपरागत खमीर की आनुवंशिक हेरफेर अन्य खमीर प्रजातियों की तुलना में अधिक जटिल है। सबसे पहले, यह खमीर प्रजातियों के परिवर्तन एक स्थिर और कुशल आनुवंशिक परिवर्तन प्रणाली 16,17 के अभाव के कारण बहुत कम ही कुशल है। दूसरा, रैखिक अभिव्यक्ति कैसेट की श्रमसाध्य जीनोमिक एकीकरण सामान्यतः के रूप में कोई प्राकृतिक episomal प्लाज्मिड प्रणाली इस खमीर 18 में पाया गया है हित के जीनों की अभिव्यक्ति के लिए प्रयोग किया जाता है। तीसरा, आनुवंशिक तोड़े बहिष्कार और दस्तक-इन की पीढ़ी सीमित कर रहे हैं, क्योंकि जीन इस खमीर में सटीक मुताबिक़ पुनर्संयोजन के माध्यम से दक्षता को लक्षित कम है और सबसे एकीकरण घटनाओं गैर मुताबिक़ अंत में शामिल होने के (NHEJ) 19 के माध्यम से हो।

इस अध्ययन में, हम वाई के लिए एक अनुकूलित परिवर्तन प्रोटोकॉल रिपोर्ट lipolytica KU70 जीन है, जो NHEJ मार्ग में एक महत्वपूर्ण एंजाइम को कूटबद्ध नष्ट कर दिया। अनुकूलित परिवर्तन प्रोटोकॉल का उपयोग और 1 केबी का अनुरूपता क्षेत्रों flanking, वाई के KU70 जीन से युक्त एक रेखीय पीटकर कैसेट बदलने से lipolytica Po1g सफलतापूर्वक नष्ट कर दिया गया था। इस जीन विलोपन कार्यप्रणाली की मजबूती तो Po1g KU70 Δ तनाव में शराब डिहाइड्रोजनेज और शराब oxidase जीन को निशाना द्वारा प्रदर्शन किया गया। यह देखा गया है कि KU70 विलोपन तनाव जंगली प्रकार Po1g तनाव की तुलना में लक्षित कर मुताबिक़ पुनर्संयोजन की मध्यस्थता जीन की एक काफी उच्च दक्षता का प्रदर्शन किया। इसके अलावा, एक replicative Cre अभिव्यक्ति hygromycin बी प्रतिरोध मार्कर ले जाने प्लाज्मिड मार्कर बचाव प्रदर्शन करने के लिए निर्माण किया गया था। मार्कर बचाव वीं में लक्षित जीन के कई दौर की सुविधाई जीन विलोपन म्यूटेंट प्राप्त की। जीन विलोपन इसके अलावा, आनुवंशिक परिवर्तन और जीन विलोपन यहाँ वर्णित के लिए हमारे प्रोटोकॉल विशिष्ट लोकी के लिए जीन डालने के लिए, और वाई में साइट विशेष उत्परिवर्तन लागू करने के लिए लागू किया जा सकता lipolytica जीनोम।

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Protocol

1. वाई की पीढ़ी lipolytica KU70 विलोपन तनाव

  1. व्यवधान कैसेट का निर्माण
    नोट: पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) amplifications में प्रयुक्त सभी प्राइमरों के लिए 1 टेबल देखें।
    1. डिजाइन प्राइमरों 20 LEU2 अभिव्यक्ति कैसेट बढ़ाना पीसीआर एक वाई से (1 टेबल देखें) क्रमश:; और एक लंबे रिवर्स प्राइमर (तालिका 1 # 2); lipolytica अभिव्यक्ति वेक्टर और 5 'और 3' में LoxP साइटों का परिचय एक लंबे आगे प्राइमर (तालिका 1 # 1) के साथ LEU2 कैसेट के समाप्त होता है। क्लोनिंग की प्रक्रिया के बाद के चरणों के लिए एक अतिरिक्त प्रतिबंध साइट को पेश करने के लिए, # 1 प्राइमर में एक Bam HI प्रतिबंध साइट जोड़ें।
    2. के रूप में 2 टेबल में विस्तृत एक उच्च निष्ठा डीएनए पोलीमरेज़ का उपयोग पीसीआर प्रदर्शन करना।
    3. पीसीआर उत्पाद शुद्ध LoxP-प्रमोटर LEU2-टर्मिनेटर-LoxP कैसेट एक पीसीआर purificatio का उपयोग करn किट निर्माता के निर्देशों के अनुसार। निर्माता के निर्देशों के अनुसार 21 शुद्ध पीसीआर उत्पाद के लिए 3'-ए overhangs जोड़ें। उपयोग टी -4 डीएनए ligase एक टीए क्लोनिंग वेक्टर में एक पूंछ पीसीआर उत्पाद ligate प्रति 3 टेबल के रूप में प्लाज्मिड टी LEU2 उपज के लिए।
    4. पीसीआर वाई से प्राइमरों का उपयोग # 3/4 # KU70 जीन की 1 केबी 5 'अपस्ट्रीम अनुक्रम बढ़ाना lipolytica Po1g प्रति 2 टेबल के रूप में जीनोमिक डीएनए 22। पीसीआर उत्पाद निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक पीसीआर शुद्धि किट का उपयोग कर शुद्ध।
      1. डबल को पचाने शुद्ध पीसीआर उत्पाद और प्रति तालिका 4 के रूप में सैक द्वितीय और बेम HI एंजाइमों के साथ टी-LEU2 प्लाज्मिड दोनों। निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक पीसीआर शुद्धि किट का उपयोग पाचन मिश्रण शुद्ध। उपज के लिए शुद्ध ligate के लिए टी -4 डीएनए ligase का प्रयोग करें और सैक द्वितीय के लिए पीसीआर उत्पाद पचा / टी LEU2 की Bam HI साइटोंप्रति 3 टेबल के रूप में प्लाज्मिड टी LEU2-5E।
    5. पीसीआर वाई से प्राइमरों का उपयोग # 5/6 # KU70 जीन की 1 केबी 3 'नीचे की ओर अनुक्रम बढ़ाना lipolytica Po1g प्रति 2 टेबल के रूप में जीनोमिक डीएनए 22। पीसीआर उत्पाद निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक पीसीआर शुद्धि किट का उपयोग कर शुद्ध। डबल को पचाने शुद्ध पीसीआर उत्पाद और नहीं मैं और Nde मैं प्रति तालिका 4 के रूप में एंजाइमों के साथ टी-LEU2-5E प्लाज्मिड दोनों।
      1. निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक पीसीआर शुद्धि किट का उपयोग पाचन मिश्रण शुद्ध। फिर, शुद्ध ligate और नहीं मैं / NDE मैं टी LEU2-5E की साइटों प्लाज्मिड टी-KO प्रति 3 टेबल के रूप में टी -4 डीएनए ligase का उपयोग कर उपज के लिए पीसीआर उत्पाद पच।
    6. प्लाज्मिड सैक द्वितीय और Nde मैं एंजाइमों के साथ टी-KO डाइजेस्ट प्रति तालिका 4 के रूप में व्यवधान कैसेट के उत्पादन के लिए (चित्रा 1
  2. सक्षम सेल तैयारी और वाई के परिवर्तन lipolytica Po1g तनाव
    1. सक्षम सेल तैयारी
      1. वाई की एक कॉलोनी टीका लगाना YPD माध्यम के 10 मिलीलीटर (1% खमीर निकालने, 2% peptone, 2% डेक्सट्रोज और 50 मिमी साइट्रेट बफर पीएच 4.0) एक 100 मिलीलीटर कुप्पी में एक ताजा खमीर निकालने-peptone-डेक्सट्रोज (YPD) थाली से lipolytica Po1g तनाव। संतृप्ति तक 20 घंटा (एक आयुध डिपो के बारे में 15 के 600, एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग मापा जाता है) के लिए 225 rpm पर एक 30 डिग्री सेल्सियस मिलाते इनक्यूबेटर में सेते हैं।
      2. कमरे के तापमान पर 5000 XG पर 5 मिनट के लिए centrifuging द्वारा गोली कोशिकाओं। 20 मिलीलीटर Tris EDTA (ते) बफर (10 मिमी Tris, 1 मिमी EDTA, 7.5 पीएच) के साथ कोशिकाओं को धो लें, और कदम 1.2.1.2 में वर्णित के रूप में गोली कोशिकाओं। 0.1 एम लिथियम एसीटेट के 1 मिलीलीटर (पीएच 6.0, एसिटिक एसिड के साथ समायोजित) में कोशिकाओं resuspend, और कमरे न्यू यॉर्क पर 10 मिनट के लिए सेतेrature।
      3. बाँझ 1.5 मिलीलीटर ट्यूबों में सक्षम कोशिकाओं (100 μl) विभाज्य। तुरंत नीचे परिवर्तन कदम आगे बढ़ना है, या लंबी अवधि के भंडारण के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर 25% की एक अंतिम एकाग्रता (वी / वी) और स्टोर करने के ग्लिसरॉल जोड़ें।
    2. परिवर्तन
      1. धीरे विकृत सामन शुक्राणु डीएनए (10 मिलीग्राम / एमएल) और 1-5 माइक्रोग्राम शुद्ध व्यवधान कैसेट के 10 μl एक साथ मिश्रण सक्षम कोशिकाओं के 100 μl के साथ, और 15 मिनट के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
      2. 40% पॉलीथीन ग्लाइकोल (खूंटी) -4000 (0.1 एम लिथियम एसीटेट 6.0 पीएच में भंग) के 700 μl जोड़ें, मिश्रण अच्छी तरह से और 60 मिनट के लिए 225 rpm पर एक 30 डिग्री सेल्सियस मिलाते इनक्यूबेटर में सेते हैं।
        नोट: यह खूंटी 3350 (आमतौर पर पारंपरिक खमीर के परिवर्तन में प्रयोग किया जाता है) के बजाय 4000 की औसत आणविक वजन के साथ खूंटी का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है।
      3. हीट 60 मिनट के लिए एक 39 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में ट्यूब डाल द्वारा परिवर्तन मिश्रण झटका।
      4. 1 मिलीलीटर YPD मध्यम जोड़ें और30 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटा और 225 आरपीएम के लिए ठीक हो। कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए 9000 XG पर अपकेंद्रित्र, तैरनेवाला निकालें और ते बफर के 1 मिलीलीटर में गोली resuspend।
      5. कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए 9000 XG पर centrifugation द्वारा कोशिकाओं Repellet और सतह पर तैरनेवाला त्यागें। ते बफर के 100 μl में गोली Resuspend और चयनात्मक प्लेट (जैसे, leucine की कमी प्लेट) पर थाली, और 2-3 दिनों के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
      6. 10 एकल कालोनियों के लिए 4 उठाओ और YPD मध्यम 2 मिलीलीटर में अलग से टीका लगाना। 225 rpm पर एक 30 डिग्री सेल्सियस मिलाते इनक्यूबेटर में रातोंरात सेते हैं। जीनोमिक डीएनए के पीसीआर विश्लेषण द्वारा सकारात्मक कालोनियों में क्रमश: प्रति तालिका 5 प्राइमरों # 55 / # 56 के दो सेट, और # 56 / # 57 का उपयोग कर के रूप में transformants 22 से पहचानें।
        नोट: ऐसा नहीं है कि मैं linearized pYLEX1 वेक्टर वाई में तब्दील हो जाता है आदेश संख्या की गणना के द्वारा परिवर्तन दक्षता का निर्धारण करने में lipolytica Po1g सक्षम कोशिकाओंमाइक्रोग्राम प्रति प्लाज्मिड कॉलोनी बनाने इकाइयों (CFU) के डीएनए 23 का इस्तेमाल किया।

2. मार्कर बचाव

  1. Cre प्लाज्मिड अभिव्यक्ति का निर्माण
    1. pYLEX1-सीआरई और pYLEX1-HPH का निर्माण
      1. डिजाइन प्राइमरों 20 रचनात्मक और HPH का खुला पढ़ने फ्रेम बढ़ाना पीसीआर। एक अतिरिक्त adenine न्यूक्लियोटाइड शुरुआत कोडोन के ऊपर आगे प्राइमरों # 82 और # 84 में जोड़ें, और Kpn मैं प्रतिबंध साइटों रिवर्स प्राइमरों # 83 और # 85 में स्टॉप कोडोन के बहाव पीसीआर सीआरई का खुला पढ़ने फ्रेम बढ़ाना डालने और प्रति 2 टेबल के रूप में pSH69 (परिग्रहण संख्या HQ412578) 24 से HPH।
      2. दोनों रचनात्मक और HPH टुकड़े निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक पीसीआर शुद्धि किट का उपयोग कर शुद्ध। डाइजेस्ट दोनों Kpn के साथ शुद्ध रचनात्मक और HPH टुकड़े मैं Tabl प्रति के रूप में एंजाइमई 4। डबल प्रति तालिका 4 के रूप में पीएमएल मैं और Kpn मैं एंजाइमों के साथ pYLEX1 प्लाज्मिड को पचाने। निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक पीसीआर शुद्धि किट का उपयोग पाचन मिश्रण शुद्ध।
      3. वाई की पीएमएल मैं / Kpn मैं साइटों को शुद्ध और पच रचनात्मक और HPH टुकड़े ligate के रूप में टी -4 डीएनए ligase का प्रयोग तालिका 3 प्रति lipolytica अभिव्यक्ति वेक्टर, pYLEX1-सीआरई और pYLEX1-HPH क्रमश: उपज।
    2. pSL16-सीआरई-HPH का निर्माण
      1. पीसीआर प्राइमरों का उपयोग # 86 pYLEX1-सीआरई से सीआरई के प्रमोटर-जीन-टर्मिनेटर कैसेट बढ़ाना / # 87 प्रति 2 टेबल के रूप में साल मैं / पीएसटी मैं प्रतिबंध साइटों flanking। निर्माता के निर्देशों के अनुसार पीसीआर उत्पाद एक पीसीआर शुद्धि किट का उपयोग कर शुद्ध ।
        1. डबल को पचाने शुद्ध पीसीआर उत्पाद दोनों और साल मैं और साथ pSL16-CEN1-1 (227) प्लाज्मिड 25पीएसटी प्रति तालिका 4 के रूप में मैं एंजाइमों। निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक पीसीआर शुद्धि किट का उपयोग पाचन मिश्रण शुद्ध। फिर, प्रति 3 टेबल के रूप में टी -4 डीएनए ligase का उपयोग कर pSL16-सीआरई बनाने के लिए इसी स्थलों पर pSL16-CEN1-1 (227) में शुद्ध और पच पीसीआर उत्पाद ligate।
      2. पीसीआर प्राइमरों का उपयोग pYLEX1-HPH से HPH के प्रमोटर-जीन-टर्मिनेटर कैसेट बढ़ाना # 88 / # 89 प्रति 2 टेबल के रूप में Xho मैं / BGL द्वितीय प्रतिबंध साइटों flanking। निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक पीसीआर शुद्धि किट का उपयोग पीसीआर उत्पाद शुद्ध ।
        1. डबल को पचाने शुद्ध पीसीआर उत्पाद और प्रति तालिका 4 के रूप में Xho मैं और BGL द्वितीय एंजाइमों के साथ pSL16-सीआरई प्लाज्मिड दोनों। निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक पीसीआर शुद्धि किट का उपयोग पाचन मिश्रण शुद्ध। फिर, इसी पर pSL16-सीआरई में शुद्ध और पच पीसीआर उत्पाद ligateसाइटों प्रति 3 टेबल के रूप में टी -4 डीएनए ligase का उपयोग कर pSL16-सीआरई-HPH उत्पन्न करते हैं।
          नोट: जिसके परिणामस्वरूप रचनात्मक अभिव्यक्ति प्लाज्मिड, pSL16-सीआरई-HPH, एक चयन hygromycin बी मार्कर बंदरगाहों और एक centromeric और episomally नकल वेक्टर (चित्रा 2) है।
      3. उचित प्रतिबंध एंजाइमों (जैसे, साल मैं / पीएसटी मैं, वेक्टर से सम्मिलित करने के लिए आबकारी) प्रति तालिका 4 के रूप में साथ पाचन द्वारा सभी निर्माणों की जाँच करें।
  2. Cre recombinase की मध्यस्थता मार्कर बचाव
    1. ऊपर अनुभाग 1.2 में वर्णित परिवर्तन प्रोटोकॉल के बाद KU70 पीटकर तनाव के सक्षम कोशिकाओं में pSL16-सीआरई-HPH रूपांतरण। YPD प्लस hygromycin बी पर थाली बदल कोशिकाओं (YPDH) प्लेट (युक्त 400 माइक्रोग्राम / एमएल hygromycin बी), और 2-3 दिनों के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    2. प्राइमरों # 84 का उपयोग कर प्रति तालिका 5 के रूप में कॉलोनी पीसीआर प्रदर्शन / # 85 की पहचान के लिए सकारात्मकपरिवर्तन के बाद pSL16-सीआरई-HPH प्लाज्मिड युक्त कालोनियों।
      नोट: आगे # प्राइमर 84 और रिवर्स प्राइमर # 85 HPH जीन (1 टेबल) की कोडिंग क्षेत्र के अंदर स्थित हैं। केवल सकारात्मक क्लोन पीसीआर प्रतिक्रिया में एक विशिष्ट पीसीआर उत्पाद उत्पन्न करते हैं।
    3. एक सकारात्मक क्लोन उठाओ और YPDH मध्यम 2 मिलीलीटर में टीका लगाना, और संतृप्ति के लिए रात में 225 rpm पर एक 30 डिग्री सेल्सियस मिलाते इनक्यूबेटर में सेते हैं। एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के साथ सेल 600 आयुध डिपो उपाय। ~ 15 के एक आयुध डिपो 600 पर कोशिकाओं फसल। कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 5000 XG पर अपकेंद्रित्र, और बाँझ पानी के 2 मिलीलीटर के साथ एक बार धो लें।
    4. एक प्रारंभिक आयुध डिपो के 600 0.1 के साथ YPD मध्यम 2 मिलीलीटर में कोशिकाओं को फिर से टीका लगाना और कोशिकाओं को रातोंरात 225 rpm पर एक 30 डिग्री सेल्सियस मिलाते इनक्यूबेटर में विकसित करने के लिए अनुमति देते हैं। स्ट्रीक YPD प्लेटों पर रात भर सेल संस्कृति एकल कालोनियों 23 को अलग-थलग करने के लिए। YPD, YPDH पर प्रतिकृति प्लेट कालोनियों और leucine की कमी प्लेटों 23 नोट: कालोनियों कि दोनों LEU2 मार्कर खो दिया है और pSL16-सीआरई-HPH प्लाज्मिड केवल YPD प्लेटों पर विकसित कर सकते हैं (चित्रा 3)।

3. शराब डिहाइड्रोजनेज और शराब oxidase जीन का विलोपन

  1. वाई पर एक खोज प्रदर्शन lipolytica जीनोम डेटाबेस बेसिक स्थानीय संरेखण खोज उपकरण (ब्लास्ट) का उपयोग विलोपन 26 के लिए जीन उम्मीदवारों की पहचान करने के लिए। इनपुट एस के प्रोटीन अनुक्रम बम विस्फोट खोज उपकरण में cerevisiae शराब डिहाइड्रोजनेज मैं (http://www.genome.jp/tools-bin/search_sequence?prog=blast&db=yli&seqid=aa)।
    नोट: ब्लास्ट खोज उपकरण वाई में सबसे अधिक इसी तरह प्रोटीन दृश्यों रिटर्न lipolytica जीनोम डेटाबेस।
  2. साथ प्राइमरों # 7 # 56 (1 टेबल) के लिए पीसीआर द्वारा विलोपन कैसेट का निर्माण, और प्रतिबंध एंजाइम पाचन और बंधाव प्रतिक्रियाओं से ऊपर धारा 1.1 में वर्णित के रूप में एक ही तरीके का उपयोग करते हुए प्रदर्शन करते हैं।
  3. प्रस्तुत करने काKU70 पीटकर तनाव के सक्षम कोशिकाओं रहे हैं, परिवर्तनों बाहर ले जाने और प्रोटोकॉल के ऊपर धारा 1.2 में वर्णित का पालन करके प्राइमरों # 55, # 58 # 81 (1 टेबल) के साथ सकारात्मक कालोनियों की पहचान करने के लिए पीसीआर प्रदर्शन करते हैं।
    नोट: एक उदाहरण के रूप में, YALI0E17787g जीन विलोपन के लिए प्रक्रिया आंकड़े 4 और 5 में वर्णित है। मुताबिक़ पुनर्संयोजन दर पर 1 केबी और 2 KB लंबे मुताबिक़ क्षेत्र के प्रभाव को रिपोर्ट कर रहे हैं।

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Representative Results

Linearized वाई lipolytica अभिव्यक्ति वेक्टर वाई के जीनोम में PBR डॉकिंग मंच में डाला गया था एक भी विदेशी पुनर्संयोजन 27 के प्रदर्शन से lipolytica Po1g तनाव। तेजी से रासायनिक परिवर्तन की प्रक्रिया के इस अध्ययन में स्थापित, linearized वाई का उपयोग करके lipolytica अभिव्यक्ति वेक्टर सफलतापूर्वक> 100 CFU / माइक्रोग्राम डीएनए के एक परिवर्तन दक्षता में जंगली प्रकार Po1g तनाव में तब्दील हो गया था। एक पीटा कैसेट 1 केबी मुताबिक़ दृश्यों से घिरे Po1g तनाव में तब्दील हो गया था और KU70 जीन सफलतापूर्वक (चित्रा 1) नष्ट कर दिया गया था। इधर, आगे प्राइमर # 56 KU70 जीन के 5 'अनुरूपता बांह के भीतर स्थित अनुक्रम को anneals। रिवर्स प्राइमर # 55 LEU2 मार्कर की कोडिंग क्षेत्र के अंदर स्थित है। रिवर्स प्राइमर # 57 KU70 जीन की कोडिंग क्षेत्र के अंदर स्थित है। किस तरहकभी 200 से अधिक कालोनियों में से केवल एक को नष्ट कर दिया KU70 जीन के साथ सकारात्मक कॉलोनी मनाया गया, एक बहुत कम जीन विलोपन दर (<0.5%) का सुझाव दे। बाद में, एक replicative hygromycin बी प्रतिरोध मार्कर और रचनात्मक / LoxP प्रणाली को ले जाने प्लाज्मिड (चित्रा 2) का निर्माण किया गया था, और KU70 पीटकर तनाव में चयन मार्कर जीन अंततः (चित्रा 3) Cre recombinase की अभिव्यक्ति से हटा दिया गया था। बम विस्फोट खोज उपकरण का उपयोग, ग्यारह ख्यात शराब डिहाइड्रोजनेज जीन और एक शराब oxidase जीन वाई में पहचान की गई lipolytica जीनोम। ख्यात शराब डिहाइड्रोजनेज जीन YALI0E17787g, YALI0D25630g, YALI0A16379g, YALI0E15818g, YALI0D02167g, YALI0A15147g, YALI0E07766g, YALI0F09603g, YALI0B10175g, YALI0F08129g, YALI0E07810g हैं। ख्यात शराब oxidase जीन YALI0B14014g है। KU70 जीन के हटाए जाने के बाद जीन विलोपन दर में वृद्धि करने के लिए, हम व्यक्तिगत रूप से नष्ट कर दिया समानांतर में 11 जीन (सिवायYALI0A16379g) वाई में लंबे मुताबिक़ दृश्यों के साथ व्यवधान कैसेट का उपयोग करके के लिए lipolytica KU70 पीटकर तनाव (आंकड़े 4 और 5)। इधर, आगे प्राइमरों (P1-एफ और p2-एफ) लक्ष्य जीन के 5 'अनुरूपता बांह के भीतर स्थित अनुक्रम को पानी रखना। रिवर्स प्राइमरों (P1-आर) LEU2 मार्कर की कोडिंग क्षेत्र के अंदर स्थित हैं। रिवर्स प्राइमरों (p2-आर) (चित्रा 4) लक्ष्य जीन की कोडिंग क्षेत्र के अंदर स्थित हैं। नाक आउट कैसेट मुताबिक़ दृश्यों और प्रतिबंध साइटों (तालिका 1) की लंबाई में केवल थोड़ा भिन्न होते हैं। जीन विलोपन दरों [मुताबिक़ पुनर्संयोजन / (मुताबिक़ पुनर्संयोजन + गैर-मुताबिक़ पुनर्संयोजन)] 33% -71% की, प्राप्त किया गया KU70 जीन विलोपन पर लक्षित मुताबिक़ पुनर्संयोजन आवृत्ति में एक नाटकीय वृद्धि का सुझाव दे। उदाहरण के लिए, YALI0E17787g का विलोपन दर 40% थी (~ 100 CFU / माइक्रोग्राम डीएनए)। और भी, जीन विलोपन दर में और वृद्धि की संभावना है जब लंबे समय तक मुताबिक़ दृश्यों का इस्तेमाल किया गया जांच की गई। यह पता चला है कि 2 KB मुताबिक़ दृश्यों के साथ YALI0E17787g जीन व्यवधान कैसेट (~ 400 CFU / माइक्रोग्राम डीएनए) 87.5% की दर विलोपन दे दी है। इसके अलावा, शुरू की प्राप्त विलोपन म्यूटेंट में चयन मार्कर जीन LEU2 वेक्टर pSL16-सीआरई-HPH बदलने से हटा दिया गया था (सीआरई hp4d-, HPH), इस प्रकार लक्षित जीन जोड़तोड़ के कई दौर सक्षम करने से।

आकृति 1
चित्रा 1. KU70 पीटकर कैसेट के निर्माण और KU70 कमी उत्परिवर्ती। ए। KU70 पीटकर प्लाज्मिड टी-KO। बी। KU70 पीटकर कैसेट के योजनाबद्ध आरेख। अपस्ट्रीम और डाउनस्ट्रीम पुनKU70 जीन की gions (1 KB) 5'- और मुताबिक़ पुनर्संयोजन के लिए व्यवधान कैसेट की 3'अंत को क्लोन किया गया। LEU2 अभिव्यक्ति कैसेट दो मुताबिक़ flanking दृश्यों के बीच डाला गया था। सी। सैक द्वितीय और Nde के बाद KU70 विलोपन कैसेट मैं टी-KO से पाचन की जेल वैद्युतकणसंचलन। एल: 1 केबी डीएनए सीढ़ी; 1: KU70 विलोपन कैसेट (उम्मीद बैंड आकार 4.3 केबी है) डी।। वाई में KU70 जीन विलोपन की पीसीआर पुष्टि lipolytica Po1g। पीसीआर उत्पादों transformants की जीनोमिक डीएनए (1-10 गलियों) और जंगली प्रकार के तनाव (लेन 11) से परिलक्षित किया गया। लेन 7 एक सकारात्मक पीटकर दिखाता है, जबकि लेन 1 एक झूठी सकारात्मक पता चलता है। शीर्ष जेल में, 500 बीपी का एक टुकड़ा प्राइमर सेट # 56 / # 57 और गलियों 1 और 7 नीचे जेल में ही अनुपस्थित है, सफल नॉकआउट 750 बीपी का एक टुकड़ा है, जिसके साथ प्राप्त की है उत्पन्न साथ प्राप्त की है प्राइमर सेट # 55 / # 56. टीवह 750 बीपी बैंड में ही लेन 7. एल देखा जाता है:। 1 केबी डीएनए सीढ़ी कृपया यहाँ यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. मार्कर बचाव के लिए Cre recombinase प्लाज्मिड अभिव्यक्ति के योजनाबद्ध आरेख। Episomally नकल प्लाज्मिड pSL16-सीआरई-HPH एक Cre recombinase (सीआरई), एक hygromycin बी प्रतिरोध मार्कर (HPH), एक एम्पीसिलीन प्रतिरोध जीन (एएमपी), एक भालू कोलाई (pMB1) की प्रतिकृति की उत्पत्ति, वाई की एक प्रतिकृति मूल lipolytica (ORI1001), वाई के एक गुणसूत्रबिंदु डीएनए अनुक्रम lipolytica (CEN1-1) और एक lacZ जीन β-galactosidase एंजाइम एन्कोडिंग। देखें एक बड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करेंयह आंकड़ा के सायन।

चित्र तीन
चित्रा सकारात्मक मार्कर-कम वाई 3. विकास स्क्रीनिंग मार्कर बचाव के बाद lipolytica उपभेदों। transformants (1-4) पतला और क्रमशः YPD प्लेटें, YPDH प्लेटें और leucine की कमी प्लेटों पर देखा गया था। 30 डिग्री सेल्सियस, सकारात्मक मार्कर से मुक्त transformants में विकास के 3 दिन बाद (1, 3, 4) केवल YPD थाली है, जो Cre recombinase और प्लाज्मिड के नुकसान की अभिव्यक्ति पर LEU2 मार्कर जीन के छांटना इंगित करता है पर विकसित कर सकते हैं pSL16- सीआरई-HPH एक:। YPD थाली, बी: YPDH थाली, सी:। leucine की कमी प्लेट यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।


चित्रा 4. लक्षित जीन विलोपन और मार्कर बचाव प्रक्रिया के योजनाबद्ध आरेख। जीन व्यवधान कैसेट एक चयन मार्कर जीन (LEU2) दो LoxP मान्यता साइटों और दो ​​को निशाना हथियार (अपस्ट्रीम और डाउनस्ट्रीम flanking दृश्यों) से घिरे होते हैं। वाई में व्यवधान कैसेट के परिवर्तन के बाद lipolytica कोशिकाओं, एक जीन प्रतिस्थापन घटना को निशाना बनाया ठिकाना पर दो flanking अनुरूपता हथियार के भीतर डबल-विदेशी मुताबिक़ पुनर्संयोजन के माध्यम से होता है। पीसीआर प्राइमरों के दो सेट व्यवधान कैसेट (P1-एफ और P1-आर) और लक्षित जीनोमिक क्षेत्रों (P2-एफ और p2-आर) के समवर्ती विलोपन के एकीकरण को सत्यापित करने के लिए इस्तेमाल किया गया। अंत में, LEU2 मार्कर Cre recombinase की अभिव्यक्ति से निकाल दिया जाता है, गुणसूत्र ठिकाना पर एक भी LoxP साइट पीछे छोड़ रहा है। लक्षित जीन विलोपन और YALI0E17787 जीई के प्रतिस्थापनne यहाँ एक उदाहरण के रूप में दिखाया गया था। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5. पीसीआर वाई में YALI0E17787 जीन विघटन की पुष्टि lipolytica Po1g। पीसीआर उत्पादों थे transformants की जीनोमिक डीएनए (गलियों 1-4) और जंगली प्रकार के तनाव (लेन 5) से परिलक्षित। लेन 1, 2, और 4, सकारात्मक नॉकआउट उदाहरण देकर स्पष्ट करते हुए 3 लेन एक झूठी सकारात्मक पता चलता है। शीर्ष जेल में सफल नॉकआउट 750 बीपी, जो प्राइमर सेट P1-एफ और P1-आर के साथ प्राप्त की है का एक टुकड़ा उत्पन्न करते हैं। 750 बीपी बैंड गलियों 1, 2 में देखा जाता है, और 4, लेकिन गलियों 3 और 5 के नीचे जेल में, 500 बीपी का एक टुकड़ा प्राइमर सेट P2-एफ और p2 आर के साथ प्राप्त की है और केवल मौजूद है नहीं गलियों 3 एक मेंएन डी 5. एल:। 1 केबी डीएनए सीढ़ी यहां यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

तालिका 1. इस अध्ययन में इस्तेमाल प्राइमरों। इस तालिका डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

पीसीआर घटक
पीसीआर सामग्री वॉल्यूम अंतिम एकाग्रता
पीसीआर बफर 10 μl 1x
dNTP मिश्रण 1 μl 200 सुक्ष्ममापी
आगे प्राइमर 2.5 μl 500 एनएम </ Td>
रिवर्स प्राइमर 2.5 μl 500 एनएम
डीएनए पोलीमरेज़ 0.5 μl 1 यू
डीएनए टेम्पलेट (जीनोमिक पतला या प्लास्मिड डीएनए) 0.5-2 μl 50 एनजी
जीवाणुरहित जल अप करने के लिए 50 μl
पीसीआर की स्थिति
तापमान पहर चक्रों की संख्या
98 डिग्री सेल्सियस 30 सेकंड 1
98 डिग्री सेल्सियस 10 सेकंड 30
55 डिग्री सेल्सियस 30 सेकंड
72 डिग्री सेल्सियस 30 सेकंड
72 डिग्री सेल्सियस दस मिनट 1
एक थेर्म का उपयोग करते हुए पीसीआर प्रवर्धन प्रदर्शन करनाअल साइक्लर

तालिका 2 पीसीआर सेट अप और उच्च निष्ठा डीएनए पोलीमरेज़ के लिए शर्तें।

तालिका 3. डीएनए बंधाव प्रतिक्रिया की स्थिति टी -4 डीएनए ligase का उपयोग कर।

अंग
सामग्री अंतिम एकाग्रता
टी -4 डीएनए ligase बफर 1x
वेक्टर डीएनए 0.03 pmol
सम्मिलित डीएनए 0.15 pmol
टी -4 डीएनए ligase 400 U
जीवाणुरहित जल अप करने के लिए 20 μl
शर्तेँ
तापमान पहर
16 डिग्री सेल्सियस 16 घंटा
<टीडी> 6 घंटा
अंग
सामग्री अंतिम एकाग्रता
प्रतिबंध पाचन बफर 1x
डीएनए (प्लाज्मिड या पीसीआर उत्पाद) 1 माइक्रोग्राम
1 सेंट प्रतिबंध एंजाइम 5 U
2 एन डी प्रतिबंध एंजाइम (वैकल्पिक) 5 U
जीवाणुरहित जल अप करने के लिए 50 μl
शर्तेँ
तापमान पहर
37 डिग्री सेल्सियस
एक भी प्रतिबंध एंजाइम के साथ ही पाचन प्रदर्शन करना
प्रतिबंध एंजाइमों की एक जोड़ी के साथ डबल पाचन प्रदर्शन करना

तालिका 4 डीएनए के प्रतिबंध एंजाइम पाचन के लिए शर्तें।

पीसीआर घटक
पीसीआर सामग्री वॉल्यूम अंतिम एकाग्रता
पीसीआर बफर 2.5 μl 1x
dNTP मिश्रण 0.5 μl 200 सुक्ष्ममापी
आगे प्राइमर 0.5 μl 200 एनएम
ReveRSE प्राइमर 0.5 μl 200 एनएम
डीएनए पोलीमरेज़ 0.2 μl 1 यू
डीएनए टेम्पलेट (जीनोमिक पतला या प्लास्मिड डीएनए) 0.5-2 μl 50 एनजी
जीवाणुरहित जल अप करने के लिए 25 μl
पीसीआर की स्थिति
तापमान पहर चक्रों की संख्या
95 डिग्री सेल्सियस 5 मिनट 1
95 डिग्री सेल्सियस 30 सेकंड 30
50 डिग्री सेल्सियस 30 सेकंड
72 डिग्री सेल्सियस 30 सेकंड
72 डिग्री सेल्सियस दस मिनट 1
एक थर्मल cycler का उपयोग करते हुए पीसीआर प्रवर्धन प्रदर्शन करना
कॉलोनी पीसीआर सीधे टेम्पलेट के रूप में एक कॉलोनी का उपयोग कर प्रदर्शन करना नहीं बल्कि एक डीएनए नमूने की तुलना

सारणी 5. पीसीआर / कॉलोनी पीसीआर सेट अप और Taq डीएनए पोलीमरेज़ के लिए शर्तें।

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Discussion

इस अध्ययन के लिए हमारा उद्देश्य के वाई में लक्षित जीन नॉकआउट की त्वरित और कुशल पीढ़ी को सक्षम करने के लिए है lipolytica Po1g तनाव। कई कारणों से इस लक्ष्य को हासिल करने के लिए संबोधित करने की जरूरत है। सबसे पहले, एक उच्च परिवर्तन दक्षता की आवश्यकता है। इस प्रकार, एक कुशल और सुविधाजनक वाई के लिए रासायनिक परिवर्तन प्रोटोकॉल lipolytica Po1g तनाव इस अध्ययन में बताया गया था। खूंटी-4000 का उपयोग इस तनाव के सफल परिवर्तन के लिए एक महत्वपूर्ण कारक है। जब (एस cerevisiae के परिवर्तन के लिए) खूंटी-3350 का उपयोग कर खूंटी-4000 के बजाय कोई transformants प्लाज्मिड परिवर्तन के लिए प्राप्त किया गया। इसके अलावा, हौसले से तैयार कोशिकाओं का उपयोग सक्षम कोशिकाओं की तैयारी इस तनाव में उच्च परिवर्तन दक्षता प्राप्त करने के लिए आवश्यक है। दूसरा, इस तनाव में प्रमुख NHEJ के माध्यम से गैर मुताबिक़ पुनर्संयोजन और यादृच्छिक एकीकरण की घटनाओं को कम करने के लिए, एक कुशल परिवर्तन विधि तो KU7 निर्माण करने के लिए नियुक्त किया गया था0 पीटकर उत्परिवर्ती। तीसरा, मुताबिक़ पुनर्संयोजन द्वारा जीन प्रतिस्थापन की दक्षता में सुधार करने के लिए, लंबे समय से हथियार (1 KB) flanking नदी के ऊपर और लक्ष्य जीन के बहाव के जीन विलोपन कैसेट में इस्तेमाल किया गया। व्यवधान कैसेट में लंबे flanking मुताबिक़ क्षेत्रों इस तनाव में कुशल मुताबिक़ पुनर्संयोजन के लिए आवश्यक हैं। जब 50 बीपी मुताबिक़ क्षेत्रों (एस cerevisiae में कुशल मुताबिक़ पुनर्संयोजन के लिए पर्याप्त) के साथ व्यवधान कैसेट का उपयोग कर कोई सकारात्मक कालोनियों प्राप्त किया गया। इन सभी रणनीतियों का उपयोग करना, वाई के KU70 जीन lipolytica Po1g तनाव सफलतापूर्वक नष्ट कर दिया गया था। बहरहाल, यह बहुत मुश्किल है वाई में गैर मुताबिक़ पुनर्संयोजन के बहुत उच्च दर के कारण KU70 पीटकर तनाव प्राप्त करने के लिए lipolytica Po1g तनाव। केयर जब मीडिया वाले hygromycin बी के रूप में प्रकाश के प्रति संवेदनशील है एंटीबायोटिक hygromycin बी से निपटने के लिए लिया जाना चाहिए। अपमानित hygromycin बी के साथ मीडिया का इस्तेमाल कर झूठी स्थिति में परिणाम होगाकदम 2.2.1 में itives और 2.2.2 और 2.2.7 कदम में झूठी नकारात्मक।

जब KU70 विलोपन तनाव व्यक्ति शराब डीहाइड्रोजनेज और शराब oxidase एन्कोडिंग जीन की लक्षित विलोपन उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया गया था, एक बहुत अधिक विलोपन दर KU70 जीन का विलोपन की तुलना में हासिल की थी। यह दर्शाता है कि KU70 विलोपन मंच तनाव का उपयोग मुताबिक़ पुनर्संयोजन आवृत्ति में एक नाटकीय वृद्धि हुई। बाद बहुत कम मुताबिक़ पुनर्संयोजन दर के मुद्दे को संबोधित किया गया था, वाई की स्क्रीनिंग lipolytica एकल जीन पीटा म्यूटेंट अत्यधिक ऊपर निकल गया था। हम यह भी कहा कि मुताबिक़ क्षेत्र के 1 केबी लंबाई लक्षित जीन विलोपन के लिए पर्याप्त कुशल था। मुताबिक़ पुनर्संयोजन आवृत्ति में वृद्धि हुई है जब लंबे समय तक मुताबिक़ दृश्यों (2 KB) का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता है। विशेष रूप से, इन जीनों शराब डीहाइड्रोजनेज और शराब oxidase, जो एल्कोहल और ald के बीच प्रतिवर्ती रूपांतरण उत्प्रेरित सांकेतिक शब्दों में बदलनाehydes। इन जीनों का विलोपन जैव ईंधन की बढ़ती हुई संचय और लघु श्रृंखला फैटी एसिड होता है, मध्यम श्रृंखला फैटी एसिड होता है, लंबी श्रृंखला फैटी एसिड होता है, हाइड्रोक्सी फैटी एसिड, एल्कोहल, एल्डीहाइड और लिपिड सहित जैव रासायनिक यौगिकों के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। आगे के अध्ययन से इस संभावना को सत्यापित करने के लिए प्रदर्शन किया जाएगा।

पीसीआर की मध्यस्थता जीन व्यवधान विधि वाई में सूचित किया गया है lipolytica Po1d तनाव 28। हालांकि, इस विधि कठिन और समय लेने वाली है। इस विधि से एक प्रमुख सीमा एक परिवर्तन के प्रयोग के लिए जीन विलोपन कैसेट के लिए पर्याप्त मात्रा में प्राप्त करने की कठिनाई है। एक और सीमा है कि इस विधि URA3 मार्कर के लिए सीमित है। विधि इस अध्ययन में वर्णित विशेष रूप से पाचन-बंधाव दृष्टिकोण और रचनात्मक / LoxP प्रणाली के संयोजन से पीसीआर आधारित तकनीक में इन मुद्दों को संबोधित किया। इस विधि अलग एंटीबायोटिक और auxotrophic मार्कर के उपयोग की अनुमति देता है और इस प्रकार अधिक विपरीत हैटाइल। यह वाई में तेजी से जीन विलोपन सुविधा कर सकते हैं lipolytica Po1g तनाव। हम साथ साथ वाई में मुताबिक़ पुनर्संयोजन के माध्यम से लक्षित एकल जीन विलोपन रणनीति का विस्तृत विवरण पेश lipolytica Po1g कोशिकाओं। हालांकि, एक LoxP साइट जीनोम के भीतर एक निशान सफल मार्कर बचाव (चित्रा 4) के बाद के रूप में बनी हुई है। एकाधिक जीन विलोपन में, कई LoxP निशान जीनोम में पेश कर रहे हैं और इस संभावित पुनर्संयोजन घटनाओं है कि LoxP साइटों के बीच हो सकता है की वजह जीनोमिक अस्थिरता में हो सकता है। बहरहाल, पीटकर इस अध्ययन में निर्माण उपभेदों बहुत अच्छा आनुवंशिक स्थिरता से पता चला है, यह दर्शाता है कि अनायास ही पुनर्संयोजन घटनाओं LoxP साइटों के बीच घटित नहीं था।

सारांश में, एक कुशल आनुवंशिक परिवर्तन प्रोटोकॉल वाई के लिए स्थापित किया गया है lipolytica Po1g तनाव। इस तनाव में एकल जीन की लक्षित विलोपन अवधारणा के एक सबूत के रूप में प्रदर्शन किया गया। Y। lipolytica Po1g KU70 विलोपन मंच तनाव इस अध्ययन में निर्माण बहुत ही कुशल मुताबिक़ पुनर्संयोजन आवृत्ति है, जो लक्षित जीन विलोपन का एक आसान और तेजी से जांच के लिए सक्षम बनाता दिखाया। इस प्रकार, इस मंच तनाव एक अधिक कुशल प्रणाली और मार्ग इंजीनियरिंग और तनाव अनुकूलन जब अन्य गुणसूत्र विलोपन म्यूटेंट के निर्माण में अनुप्रयोगों के लिए एक बेहतर विकल्प प्रदान करता है। वर्णित पद्धति और निर्माण KU70 विलोपन तनाव भी विशिष्ट स्थलों में लक्ष्य जीन की प्रविष्टि और जीनोम में साइट विशेष म्यूटेशन के निर्माण के लिए लागू किया जा सकता है।

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Acknowledgments

हम कृतज्ञता सिंगापुर (ETRP 1201102) के राष्ट्रीय पर्यावरण एजेंसी से धन समर्थन स्वीकार करते हैं, सिंगापुर के नेशनल रिसर्च फाउंडेशन (एनआरएफ-CRP5-2009-03), विज्ञान, प्रौद्योगिकी और सिंगापुर के अनुसंधान के लिए एजेंसी के प्रतियोगी अनुसंधान कार्यक्रम ( 1324004108), वैश्विक अनुसंधान एवं विकास परियोजना कार्यक्रम, ज्ञान अर्थव्यवस्था मंत्रालय, कोरिया गणराज्य (N0000677), डिफेंस थ्रेट रिडक्शन एजेंसी (DTRA, HDTRA1-13-1-0037) और सिंथेटिक बायोलॉजी सिंगापुर के राष्ट्रीय विश्वविद्यालय के पहल ( DPRT / 943/09/14)।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent/Material
Oligonucleotide primers Integrated DNA Technologies 25 nmole DNA oligos
Y. lipolytica strain Po1g Yeastern Biotech leucine auxotrophic derivative of the wild-type strain W29 (ATCC 20460)
Vector pYLEX1 Yeastern Biotech FYY203-5MG Y. lipolytica expression vector
E. coli TOP10 Invitrogen For cloning and propagation of plasmids
pGEM-T vector  Promega A3600 TA cloning vector
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen 27106 For plasmid isolation
Wizard SV Gel and
PCR Clean-Up System		 Promega A9282 Extract DNA fragments from agarose gels
and purify PCR products from an amplification reaction
The iProof high-fidelity
DNA polymerase		 Bio-Rad 172-5302 High-fidelity DNA polymerase
BamHI  New England Biolabs R0136S Restriction enzyme
BglII  New England Biolabs R0144L Restriction enzyme
KpnI New England Biolabs R0142S Restriction enzyme
NdeI  New England Biolabs R0111S Restriction enzyme
NotI New England Biolabs R0189L Restriction enzyme
PmlI New England Biolabs R0532S Restriction enzyme
PstI  New England Biolabs R0140S Restriction enzyme
SacII New England Biolabs R0157S Restriction enzyme
SalI New England Biolabs R0138S Restriction enzyme
XhoI New England Biolabs R0146L Restriction enzyme
T4 DNA ligase New England Biolabs M0202L
Taq DNA polymerase  Bio-Rad M0267L
Ampicillin Gibco-Life Technologies 11593-027 Antibiotics
Hygromycin B PAA P21-014 Antibiotics
GeneRuler 1 kb DNA ladder Thermo Scientific SM0312 1 kb DNA ladder
PEG4000 Sigma 95904-F
Tris Promega H5135
EDTA Bio-Rad 161-0729
Salmon Sperm DNA Invitrogen 15-632-011
Lithium Acetate Sigma
Acetic acid Sigma
Glass beads (425-600 µm) Sigma G8772
RNAse A Thermo Scientific EN0531
DNA Loading Dye Thermo Scientific R0611
Bacto Yeast Extract BD 212750
Bacto Peptone BD 211677
D-Glucose 1st Base BIO-1101
YNB without amino acids Sigma Y0626
DO Supplement-Leu Clontech 630414
Glycerol Sigma G5516
Difco LB Broth BD 244620
Difco LB Agar BD 244520
Bacto Agar BD 214010
Equipment
PCR machine Biorad T100 Thermal Cycler
Water bath Memmert WNB 14
Stationary/Shaking Incubator Yihder LM-570RD
Thermo-shaker Allsheng MS-100
Micro centrifuge Eppendorf 5424R
Centrifuge Eppendorf 5810R
Spectrophotometer Eppendorf  BioPhotometer plus
Gel imager GE Amersham Imager 600

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References

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आनुवंशिकी अंक 115 जैव अभियांत्रिकी अंक अपरंपरागत खमीर, आनुवंशिक परिवर्तन जीन विलोपन आनुवंशिक हेरफेर मुताबिक़ पुनर्संयोजन मार्कर बचाव
अक्षय जैव ईंधन और जैव रासायनिक उत्पादन के लिए एक अपरंपरागत खमीर की जेनेटिक इंजीनियरिंग
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Yu, A. Q., Pratomo, N., Ng, T. K.,… More

Yu, A. Q., Pratomo, N., Ng, T. K., Ling, H., Cho, H. S., Leong, S. S. J., Chang, M. W. Genetic Engineering of an Unconventional Yeast for Renewable Biofuel and Biochemical Production. J. Vis. Exp. (115), e54371, doi:10.3791/54371 (2016).

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