Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Genteknik av en okonventionell Jäst för förnybart biobränsle och biokemisk produktion

Published: September 20, 2016 doi: 10.3791/54371
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2,3, 1,2
1Department of Biochemistry, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, 2NUS Synthetic Biology for Clinical and Technological Innovation (SynCTI), Life Sciences Institute, National University of Singapore, 3Food Science and Chemical Engineering, Singapore Institute of Technology

Abstract

Yarrowia lipolytica är en icke-patogen, dimorfa och strikt aeroba jästarter. På grund av dess utmärkande fysiologiska funktioner och metaboliska egenskaper, är denna okonventionella jäst inte bara en bra modell för att studera den grundläggande karaktären av svamp differentiering men är också en lovande mikrobiell plattform för biokemisk produktion och olika biotekniska tillämpningar, som kräver omfattande genetiska manipulationer. Dock genetiska manipulationer av Y. lipolytica har varit begränsad på grund av avsaknaden av en effektiv och stabil genetisk transformation system samt mycket höga hastigheter av icke-homolog rekombination som kan huvudsakligen hänföras till Ku70 genen. Här rapporterar vi en enkel och snabb protokoll för effektiv genetisk transformation och gendeletion i Y. lipolytica Po1g. Först, ett protokoll för effektiv omvandling av exogent DNA i Y. lipolytica Po1g bildades. Second, för att uppnå den förbättrade dubbel crossover homolog rekombination hastighet för ytterligare deletion av målgener ades Ku70 genen raderas genom transformering av en avbrottskassett som bär 1 kb homologiarmar. För det tredje, för att visa den förbättrade gendeletion effektivitet efter strykningen av Ku70 genen, raderade vi individuellt 11 mål gener som kodar alkoholdehydrogenas och alkoholoxidas med användning av samma förfaranden på Ku70 knockout plattform stam. Det observerades att hastigheten för exakt homolog rekombination ökade avsevärt från mindre än 0,5% för radering av Ku70-genen i Po1g till 33% -71% för den enda gendeletion av de 11 mål gener i Po1g Ku70 Δ. En replikativ plasmid som bär den hygromycin B-resistensmarkören och Cre / LoxP-systemet konstruerades, och selektionsmarkörgen i jästen knockout stammar var så småningom avlägsnas genom uttryck av Cre-rekombinas för att underlätta flera omgångar av targeted genetiska manipulationer. De resulterande enda gen deletionsmutanter har potentiella tillämpningar inom biobränsle och biokemisk produktion.

Introduction

Till skillnad från Saccharomyces cerevisiae, Yarrowia lipolytica, en okonventionell jäst kan växa i form av jäst eller mycel som svar på förändringar i miljöförhållanden 1,2. Således kan detta dimorphic jäst användas som en bra modell för att studera svamp differentiering, morfogenes och taxonomi 3,4,5. Det är allmänt betraktas som en säker (GRAS) jästarter, som ofta används för att tillverka en mängd olika livsmedelstillsatser som organiska syror, polyalkoholer, aromföreningar, emulgeringsmedel och ytaktiva 6,7,8,9. Det är en obligat aerob och en välkänd olje jäst kan naturligtvis ackumulera lipider vid höga halter, det vill säga upp till 70% av celltorrvikt 10. Det kan också utnyttja ett brett spektrum av kolkällor för tillväxt, inklusive olika typer av rester i avfallsresurser som näringsämnen 11,12,13. Alla dessa unika funktioner gör Y. lipolytica mycket attraktivt förolika biotekniska tillämpningar.

Även om hela genomsekvens av Y. lipolytica har publicerats 14,15, är genetisk manipulation av denna okonventionella jäst mer komplex än andra jästarter. För det första är transformation av denna jästarter mycket mindre effektiv på grund av frånvaron av en stabil och effektiv genetisk transformation systemet 16,17. För det andra är arbetskrävande genomisk integrering av linjära expressionskassetter som vanligen används för uttryck av gener av intresse som ingen naturlig episomala plasmid systemet har hittats i denna jäst 18. Tredje generation av genetiska knock-outs och knock-ins är begränsade eftersom genmålsökning effektivitet via exakt homolog rekombination i denna jäst är låg och de flesta integrationshändelser sker genom icke-homolog sammanfogning (NHEJ) 19.

I denna studie rapporterar vi ett optimerat transformationsprotokoll för Y. lipolytica Ku70-genen, som kodar för ett nyckelenzym i den NHEJ-vägen. Genom att använda den optimerade transformationsprotokoll och omvandla en linjär knockout kassett som innehåller flankerande homologiregioner av 1 kb, den Ku70 genen hos Y. lipolytica Po1g har tagits bort. Robust av denna gen radering metodik sedan visat genom att rikta alkoholdehydrogenas och alkoholoxidas gener i Po1g Ku70 Δ stam. Det observerades att den Ku70 deletionsstam uppvisade en betydligt högre verkningsgrad av homolog rekombination förmedlad genmålsökning än den för vildtyp Po1g stam. Dessutom genomfördes ett replika Cre expression plasmid som bär den hygromycin B-resistensmarkören tillverkat för att utföra markör räddning. Markören rädda underlättar flera omgångar av riktad genmodifiering i the erhållna genen deletionsmutanter. Förutom gendeletion, kan våra protokoll för genetisk transformation och gendeletion beskrivs här tillämpas för att infoga gener till specifika loci, och att införa platsspecifika mutationer i Y. lipolytica genomet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Generering av Y. lipolytica Ku70 deletionsstam

  1. Konstruktion av avbrottskassett
    Obs: Se tabell 1 för alla primers som används i polymeraskedjereaktion (PCR) förstärkningar.
    1. Konstruktions primrar 20 för att PCR-amplifiera LEU2-expressionskassett (se tabell 1) från en Y. lipolytica expressionsvektor och införa loxP-ställen i 5'- och 3'-ändarna av LEU2-kassett med en långsträckt främre primer (# 1; tabell 1) och en lång omvänd primer (# 2; tabell 1), respektive. Att införa ett ytterligare restriktionsställe för efterföljande stegen i kloningsprocessen, tillsätt en BamHI-restriktionsställe i primer # 1.
    2. Utför PCR med hjälp av en high-fidelity DNA-polymeras som beskrivs i tabell 2.
    3. Rena PCR-produkten LoxP-promotor-LEU2-terminator-LoxP kassett med hjälp av en PCR purification kit enligt tillverkarens anvisningar. Foga 3'-A-överhäng till den renade PCR-produkten enligt tillverkarens instruktioner 21. Användning av T4-DNA-ligas för att ligera A-tailed PCR-produkt in i en TA-kloningsvektor för att ge plasmiden T-LEU2 enligt tabell 3.
    4. PCR förstärka en kb 5 'uppströms sekvens av Ku70 genen med användning av primers # 3 / # 4 från Y. lipolytica Po1g genomiskt DNA 22 enligt tabell 2. Rena PCR-produkten med användning av ett PCR-reningskit i enlighet med tillverkarens instruktioner.
      1. Double digest både den renade PCR-produkten och T-LEU2-plasmiden med SacI II och BamHI-enzymer enligt tabell 4. Rena digereringsblandningen med användning av ett PCR-reningskit enligt tillverkarens instruktioner. Använd T4 DNA-ligas för att ligera det renade och diger PCR-produkten till Sac II / BamHI-platser i T-LEU2 för att geplasmid T-LEU2-5E enligt tabell 3.
    5. PCR förstärka en kb 3 'nedströms sekvens av Ku70 genen med användning av primers # 5 / # 6 från Y. lipolytica Po1g genomiskt DNA 22 enligt tabell 2. Rena PCR-produkten med användning av ett PCR-reningskit i enlighet med tillverkarens instruktioner. Dubbel smälta både den renade PCR-produkten och T-LEU2-5E plasmiden med Not I och Ndel enzymer som enligt tabell 4.
      1. Rena uppslutningsblandningen med användning av ett PCR-reningskit enligt tillverkarens instruktioner. Därefter ligera det renade och digererade PCR-produkten till den Not I / Nde I-sätena av T-LEU2-5E att ge plasmiden T-KO med användning av T4-DNA-ligas enligt tabell 3.
    6. Smälta plasmiden T-KO med Sac II och Nde I-enzymer enligt tabell 4 för att producera den avbrottskassett (figur 1
  2. Kompetent cellberedningen och omvandling av Y. lipolytica Po1g-stam
    1. Kompetent cell beredning
      1. Inokulera en koloni av Y. lipolytica Po1g stam från en färsk jästextrakt-pepton-dextros (YPD) plattan i 10 ml YPD-medium (1% jästextrakt, 2% pepton, 2% dextros och 50 mM citratbuffert pH 4,0) i en 100 ml kolv. Inkubera i en 30 ° C skakande inkubator vid 225 rpm under 20 h till mättnad (en OD 600 av omkring 15, mätt med användning av en spektrofotometer).
      2. Pellets cellerna genom centrifugering under 5 min vid 5000 xg vid rumstemperatur. Tvätta cellerna med 20 ml Tris-EDTA (TE) buffert (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7,5), och pelletera cellerna såsom beskrivs i steg 1.2.1.2. Resuspendera cellerna i 1 ml 0,1 M litiumacetat (pH 6,0, justerat med ättiksyra), och inkubera i 10 min vid rums tempeperatur.
      3. Alikvot de kompetenta cellerna (100 | il) i sterila 1,5 ml rör. Fortsätt till omvandlings stegen nedan omedelbart, eller lägga till glycerol till en slutlig koncentration av 25% (v / v) och förvara vid -80 ° C för långtidsförvaring.
    2. Omvandling
      1. Blanda försiktigt 10 pl av denaturerat laxsperma-DNA (10 mg / ml) och 1-5 ug av det renade avbrottskassett tillsammans med 100 pl av kompetenta celler, och inkubera vid 30 ° C under 15 min.
      2. Lägg 700 | il av 40% polyetylenglykol (PEG) -4000 (löst i 0,1 M litiumacetat pH 6,0), blanda väl och inkubera i en 30 ° C skakande inkubator vid 225 rpm under 60 min.
        OBS: Det är viktigt att använda PEG med en genomsnittlig molekylvikt av 4000, i stället för PEG-3350 (som typiskt används i omvandlingen av konventionell jäst).
      3. Värmechock transformationsblandningen genom att placera röret i ett 39 ° C vattenbad i 60 min.
      4. Tillsätt 1 ml YPD-medium ochåterhämta sig under 2 h vid 30 ° C och 225 rpm. Centrifugera vid 9000 xg under 1 minut vid rumstemperatur, avlägsna supernatanten och suspendera pelleten i 1 ml TE-buffert.
      5. Repellet cellerna genom centrifugering vid 9000 xg under 1 min vid rumstemperatur och häll bort supernatanten. Återsuspendera pelleten i 100 fil TE-buffert och plattan på selektiva plattor (t.ex. leucin-defekta plattor), och inkubera vid 30 ° C under 2-3 dagar.
      6. Välj 4 till 10 enstaka kolonier och inokulera separat i 2 ml YPD-medium. Inkubera över natten i en 30 ° C skakande inkubator vid 225 rpm. Identifiera positiva kolonier av PCR-analys av genomiskt DNA från trans 22 enligt tabell 5 med två uppsättningar av primers # 55 / # 56 och # 56 / # 57, respektive.
        Obs! Inte jag linjäriserad pYLEX1 vektorn omvandlas till Y. lipolytica Po1g kompetenta celler i syfte att bestämma omvandlingseffektiviteten genom att räkna antaletkolonibildande enheter (cfu) per ug plasmid-DNA som används 23.

2. Marker Rescue

  1. Konstruktion av den Cre-expressionsplasmiden
    1. Konstruktion av pYLEX1-CRE och pYLEX1-HPH
      1. Konstruktions primrar 20 till PCR amplifiera de öppna läsramarna av cre och hph. Lägga till en extra adeninnukleotid uppströms om startkoden i de framåt primrarna # 82 och # 84, och för in Kpnl-restriktionsställen nedströms om stoppkodonen i de omvända primrarna # 83 och # 85. PCR amplifiera de öppna läsramarna av cre och HPH från pSH69 (tillträdesnummer HQ412578) 24 enligt tabell 2.
      2. Rena både cre och HPH fragment med användning av en PCR-reningskit enligt tillverkarens instruktioner. Digest både renade CRE och HPH fragment med Kpnl enzym per table 4. Dubbla smälta pYLEX1 plasmiden med Pml I och Kpn I-enzymer enligt tabell 4. Rena digereringsblandningen med användning av ett PCR-reningskit enligt tillverkarens instruktioner.
      3. Använd T4 DNA-ligas enligt tabell 3 att ligera renade och smälta CRE och HPH fragment till Pml I / Kpnl-ställena i Y. lipolytica expressionsvektor, vilket ger pYLEX1-CRE och pYLEX1-HPH, respektive.
    2. Konstruktion av pSL16-CRE-HPH
      1. PCR amplifiera promotor-genen-terminatorkassetten av cre från pYLEX1-CRE med användning av primers # 86 / # 87 flankerar Sall / Pstl-restriktionsställen som per tabell 2. Rena PCR-produkten med användning av ett PCR-reningskit enligt tillverkarens instruktioner .
        1. Double digest både den renade PCR-produkten och pSL16-CEN1-1 (227) plasmiden 25 med Sal I ochPst I-enzymer enligt tabell 4. Rena digereringsblandningen med användning av ett PCR-reningskit enligt tillverkarens instruktioner. Därefter ligera det renade och diger PCR-produkt i pSL16-CEN1-1 (227) vid motsvarande platser för att skapa pSL16-CRE användning av T4 DNA-ligas enligt tabell 3.
      2. PCR amplifiera promotor-genen-terminatorkassetten av hph från pYLEX1-HPH med användning av primers # 88 / # 89 flankerande de Xho I / Bgl Il-restriktionsställen som per tabell 2. Rena PCR-produkten med användning av ett PCR-reningskit enligt tillverkarens instruktioner .
        1. Double digest både den renade PCR-produkten och pSL16-CRE-plasmiden med Xho I och Bgl Il-enzymer enligt tabell 4. Rena digereringsblandningen med användning av ett PCR-reningskit enligt tillverkarens instruktioner. Sedan ligera det renade och diger PCR-produkt i pSL16-CRE vid motsvarandewebbplatser för att generera pSL16-CRE-HPH användning av T4 DNA-ligas enligt tabell 3.
          Obs: Den resulterande Cre expressionsplasmiden, pSL16-CRE-HPH, hyser en valbar hygromycin B markör och är en centro och episomalt replikerande vektor (Figur 2).
      3. Kontrollera alla konstruktionerna genom digerering med lämpliga restriktionsenzymer (t.ex., Sall / PstI, för att skära ut insatsen från vektorn) enligt tabell 4.
  2. Cre-rekombinas-förmedlad markör rescue
    1. Omvandla pSL16-CRE-HPH i kompetenta celler av Ku70 knockout-stammen efter omvandlingen protokoll som beskrivs i avsnitt 1.2 ovan. Platt transformerad celler på YPD plus hygromycin B (YPDH) plattor (innehållande 400 | ig / ml hygromycin B), och inkubera vid 30 ° C under 2-3 dagar.
    2. Utför koloni PCR enligt tabell 5 använder primers # 84 / # 85 för att identifiera positivakolonier innehållande pSL16-CRE-HPH plasmid efter transformation.
      Obs: Den framåtriktade primern # 84 och den omvända primern # 85 är placerade inuti den kodande regionen av hph-genen (Tabell 1). Endast positiva kloner generera en specifik PCR-produkt i PCR-reaktionen.
    3. Välja en positiv klon och inokulera i 2 ml YPDH medium och inkubera i en 30 ° C skakande inkubator vid 225 rpm över natten till mättnad. Mät cell OD 600 med en spektrofotometer. Skörda cellerna vid en OD 600 av ~ 15. Centrifugera vid 5000 xg under 5 min vid rumstemperatur, och tvätta en gång med 2 ml sterilt vatten.
    4. Åter ympa celler i 2 ml YPD-medium med en initial OD 600 av 0,1 och tillåta cellerna att växa i en 30 ° C skakande inkubator vid 225 rpm över natten. Strimma över natten cellodling på YPD-plattor för att isolera enskilda kolonier 23. Replica plate kolonier på YPD, YPDH, och leucin-defekta plattor 23 Notera: Kolonier som har förlorat både LEU2 markör och pSL16-CRE-HPH plasmid kan bara växa på YPD-plattor (Figur 3).

3. Strykning av alkoholdehydrogenas och alkoholoxidas gener

  1. Gör en sökning på Y. lipolytica genomet databas med de grundläggande lokala Alignment Search Tool (BLAST) för att identifiera genen kandidater för radering 26. Ingång proteinsekvensen av S. cerevisiae alkoholdehydrogenas I i BLAST sökverktyg (http://www.genome.jp/tools-bin/search_sequence?prog=blast&db=yli&seqid=aa).
    Obs: BLAST-sökning verktyget returnerar de mest likartade proteinsekvenser i Y. lipolytica genomet databas.
  2. Konstruera radering kassetter av PCR med primers # 7 till # 56 (tabell 1), och utföra restriktionsenzymklyvning och ligeringsreaktioner med samma metoder som beskrivs i avsnitt 1.1 ovan.
  3. Prepär kompetenta celler av Ku70 knockout-stammen, utföra transformationer och utföra PCR för att identifiera positiva kolonier med primers # 55, # 58 till # 81 (tabell 1) genom att följa det protokoll som beskrivs i avsnitt 1.2 ovan.
    Notera: Som ett exempel, är förfarandet för gendeletion YALI0E17787g beskrivs i figurerna 4 och 5. Effekterna av 1 kb och två kb långa homologa regionen på homolog rekombination kurs, redovisas.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den linjäriserade Y. lipolytica expressionsvektor infördes i pBR dockningsplattform i genomet hos Y. lipolytica Po1g stammen genom att utföra en enda crossover rekombination 27. Genom att använda snabb kemisk omvandling förfarande som fastställs i denna studie, den linjäriserade Y. lipolytica uttryckningsvektor framgångsrikt transformeras in i vildtyp Po1g töjning vid en transformationseffektivitet av> 100 cfu / | ag DNA. En knockout kassett flankerad av en kb homologa sekvenser omvandlades till Po1g stammen och Ku70 genen har tagits bort (Figur 1). Här, den framåtriktade primern # 56 hybridiserar till sekvensen ligger inom 5 "homologiarmen på Ku70 genen. Den omvända primern # 55 är placerad i den kodande regionen av LEU2-markör. Den omvända primer # 57 är placerad inuti den kodande regionen av Ku70 genen. Hurnågonsin, av mer än 200 kolonier, var bara en positiv koloni med den borttagna Ku70 genen observeras, vilket tyder på en mycket låg gendeletion hastighet (<0,5%). Därefter tillsattes en replikativ plasmid som bär den hygromycin B-resistensmarkören och Cre / LoxP system konstruerat (figur 2), och selektionsmarkörgen i Ku70 knockout-stammen var så småningom avlägsnas genom uttryck av Cre-rekombinas (Figur 3). Använda BLAST sökverktyg var elva förmodade alkoholdehydrogenas gener och en alkoholoxidas-genen identifierades i Y. lipolytica genomet. De förmodade alkoholdehydrogenasgener är YALI0E17787g, YALI0D25630g, YALI0A16379g, YALI0E15818g, YALI0D02167g, YALI0A15147g, YALI0E07766g, YALI0F09603g, YALI0B10175g, YALI0F08129g, YALI0E07810g. Den förmodade alkoholoxidasgenen är YALI0B14014g. Att kontrollera höjningen av gendeletion hastigheten efter strykningen av Ku70 genen, raderade vi individuellt 11 gener parallellt (utomför YALI0A16379g) med hjälp av störnings kassetter med långa homologa sekvenser i Y. lipolytica Ku70 knockout-stammen (figurerna 4 och 5). Här, de framåtriktade primrar (P1-F och P2-F) glödga till sekvensen belägen inom 5 'homologiarmen av målgener. De omvända primers (P1-R) är placerade inuti den kodande regionen av LEU2 markör. De omvända primrar (P2-R) är placerade inuti den kodande regionen av målgener (fig 4). Knock-out kassetter skiljer sig endast något i längderna av de homologa sekvenserna och restriktionsställen (tabell 1). Gendeletion priser [homolog rekombination / (homolog rekombination + icke-homolog rekombination)] på 33% -71% uppnåddes, vilket tyder på en dramatisk ökning av riktade homolog rekombination frekvensen över Ku70 gendeletion. Till exempel, deletionen hastigheten YALI0E17787g var 40% (~ 100 cfu / | ag DNA). Dessutom, Möjligheten till ytterligare ökning av gendeletion hastigheten undersöktes när längre homologa sekvenser användes. Den visade att YALI0E17787g genuppbrytningskassetten med 2 kb homologa sekvenser gav en deletion hastighet av 87,5% (~ 400 cfu / | ag DNA). Dessutom var den införda selektionsmarkörgen LEU2 i de erhållna deletionsmutanter avlägsnas genom att transformera vektorn pSL16-CRE-HPH (hp4d- cre, hph), vilket möjliggör flera rundor av målsökta genen manipulationer.

Figur 1
Figur 1. Konstruktion av Ku70 knockout kassetten och Ku70 mutant. A. Den Ku70 knockout plasmiden T-KO. B. Den schematiskt diagram över den Ku70 knockout kassetten. Uppströms och nedströms reregioner (1 kb) av Ku70-genen klonades till 5'- och 3'-änden av störningar kassett för homolog rekombination. LEU2-expressionskassetten insattes mellan två homologa flankerande sekvenser. C. Gelelektrofores av Ku70 radering kassetten efter Sac II och Nde I nedbrytnings från T-KO. L: 1 kb DNA-stege; 1: Ku70 radering kassetten (den förväntade bandet storlek är 4,3 kb) D.. PCR bekräftelse på Ku70 gendeletion i Y. lipolytica Po1g. PCR-produkter amplifierades från genomiskt DNA från transformanter (spår 1-10) och vildtyp-stam (bana 11). Lane 7 illustrerar en positiv knockout, medan bana 1 visar en falsk positiv. I det övre gelén, är ett fragment av 500 bp erhölls med primern set # 56 / # 57 och är bara frånvarande i spår 1 och 7. I det nedre gel, de framgångsrika knockouts generera ett fragment på 750 bp, som erhålls med primern in # 55 / # 56 THan 750 bp bandet bara sett i spår 7. L. 1 kb DNA-stege Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 2
Figur 2. Schematisk beskrivning av Cre-rekombinas expressionsplasmid för markörräddningsaktion. Den episomalt replikerande plasmid pSL16-CRE-HPH bär en Cre-rekombinas (CRE), en hygromycin B-resistensmarkör (HPH), en ampicillinresistensgen (amp), en replikationsursprung från Escherichia coli (pMB1), ett replikationsursprung Y. lipolytica (ORI1001), en centromer-DNA-sekvens av Y. lipolytica (CEN1-1) och en lacZ-gen som kodar för enzymet β-galaktosidas. Klicka här för att se en större versionsionen av denna siffra.

Figur 3
Figur 3. Tillväxt screening av positiv markör mindre Y. lipolytica stammar efter markören räddning. Trans (1-4) späddes och fläckar på YPD-plattor, YPDH plattor och leucin-defekta plattor, respektive. Efter 3 dagar av tillväxt vid 30 ° C, positiva markörfria transformanter (1, 3, 4) kan endast växa på YPD-platta, som anger excision av LEU2-markörgenen vid uttryck av Cre-rekombinas och förlusten av plasmiden pSL16- CRE-HPH A:. YPD-platta, B: YPDH platta, C:. leucin fattiga platta klicka god här för att se en större version av denna siffra.


Figur 4. Skiss av riktade gendeletion och markör räddningsförfarandet. Genuppbrytningskassetten består av ett urval markörgen (LEU2) flankeras av två loxP-igenkänningsställen och två inriktningsarmar (uppströms och nedströms flankerande sekvenser). Efter omvandlingen av avbrottskassett i Y. lipolytica celler, sker en gen ersättnings händelse via dubbel crossover homolog rekombination inom de två flankerande homologiarmar på riktade locus. Två uppsättningar av PCR-primers användes för att verifiera integrationen av avbrottskassett (P1-F och P1-R) och samtidig borttagning av de riktade genomiska regioner (P2-F och P2-R). Slutligen är LEU2 markör avlägsnades genom uttryck av Cre-rekombinas och lämnar efter sig en enda LoxP-ställe vid det kromosomala lokuset. Riktade gendeletion och ersättning av YALI0E17787 GEne visades här som ett exempel. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 5
Figur 5. PCR bekräftelse av YALI0E17787 genavbrott i Y. lipolytica Po1g. PCR-produkterna var amplifierades från genomiskt DNA från transformanter (spår 1-4) och vildtyp-stam (spår 5). Banorna 1, 2 och 4 illustrerar positiva knockouts, medan spår 3 visar en falsk positiv. I det övre gelén, de framgångsrika knockouts generera ett fragment på 750 bp, som erhålls med primeruppsättning P1-F och P1-R. Den 750 bp-bandet ses i banorna 1, 2 och 4, men inte i spår 3 och 5. I det nedre gel, är ett fragment av 500 bp erhölls med primeruppsättning P2-F och P2-R och är endast närvarande i raderna 3 aND 5. L. 1 kb DNA-stege Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Tabell 1. Primrar som användes i denna studie. Klicka Vänligen här för att ladda ned den här tabellen.

PCR-komponent
PCR-material volymer slutkoncentration
PCR-buffert 10 pl 1x
dNTP-blandning 1 pl 200 | iM
framåtriktad primer 2,5 ^ 500 nM </ Td>
omvänd primer 2,5 ^ 500 nM
DNA-polymeras 0,5 ^ 1 U
DNA-templat (utspädd genomiskt eller plasmid-DNA) 0,5-2 | il 50 ng
sterilt vatten upp till 50 | j, l
PCR-betingelser
Temperatur Tid Antal cykler
98 ° C 30 sek 1
98 ° C 10 sek 30
55 ° C 30 sek
72 ° C 30 sek
72 ° C 10 min 1
Utför PCR-amplifiering med hjälp av en thermal cycler

Tabell 2. PCR set-up och villkor för high-fidelity DNA-polymeras.

Tabell 3. DNA-ligering reaktionsbetingelser med användning av T4 DNA-ligas.

Komponent
material slutkoncentration
T4-DNA-ligas-buffert 1x
vektor-DNA 0,03 pmol
insatt DNA 0,15 pmol
T4-DNA-ligas 400 U
sterilt vatten upp till 20 | j, l
Betingelser
Temperatur Tid
16 ° C 16 h
<td> 6 tim
Komponent
material slutkoncentration
Restriktionsdigereringsbuffert 1x
DNA (Plasmid eller PCR-produkt) 1 ^ g
1 st restriktionsenzym 5 U
2: a restriktionsenzym (tillval) 5 U
sterilt vatten upp till 50 | j, l
Betingelser
Temperatur Tid
37 ° C
Utföra enda digerering med ett enda restriktionsenzym
Utföra dubbel digerering med ett par av restriktionsenzymer

Tabell 4. Förhållanden för restriktionsenzymklyvning av DNA.

PCR-komponent
PCR-material volymer slutkoncentration
PCR-buffert 2,5 ^ 1x
dNTP-blandning 0,5 ^ 200 | iM
framåtriktad primer 0,5 ^ 200 nM
reverse-primer 0,5 ^ 200 nM
DNA-polymeras 0,2 | il 1 U
DNA-templat (utspädd genomiskt eller plasmid-DNA) 0,5-2 | il 50 ng
sterilt vatten upp till 25 | j, l
PCR-betingelser
Temperatur Tid Antal cykler
95 ° C 5 min 1
95 ° C 30 sek 30
50 ° C 30 sek
72 ° C 30 sek
72 ° C 10 min 1
Utför PCR-amplifiering med hjälp av en termocykler
Utföra koloni-PCR direkt med användning av en koloni som mall, snarare än ett DNA-prov

Tabell 5. PCR / Colony PCR set-up och villkoren för Taq DNA-polymeras.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vårt mål för denna studie är att möjliggöra snabb och effektiv generering av riktade gen knockouts i Y. lipolytica Po1g stam. Flera faktorer måste åtgärdas för att uppnå detta. För det första är en hög transformationseffektivitet krävs. Således, en effektiv och bekväm kemisk omvandling protokoll för Y. lipolytica Po1g stam beskrivs i denna studie. Användningen av PEG-4000 är en avgörande faktor för den lyckade omvandlingen av denna stam. Inga transformanter erhölls för plasmid transformation vid användning av PEG-3350 (för omvandling av S. cerevisiae) i stället för PEG-4000. Dessutom är framställning av kompetenta celler med användning av nylagade celler som krävs för att uppnå hög omvandlingseffektiviteten i denna stam. För det andra, för att minska icke-homolog rekombination och slumpmässig integration evenemang via dominerande NHEJ i denna stam, var ett effektivt transformationsmetod användes därefter för att konstruera KU70 knockout mutant. Tredje, för att förbättra effektiviteten i genersättning genom homolog rekombination, långa flankerande armar (1 kb) uppströms och nedströms de målgener användes i gendeletion kassetter. De långa flankerande homologa regioner i störnings kassetter är en förutsättning för en effektiv homolog rekombination i denna stam. Inga positiva kolonier erhölls vid användning av störnings kassetter med 50 bp homologa regioner (tillräckligt för effektiv homolog rekombination i S. cerevisiae). Med hjälp av alla dessa strategier, den Ku70 genen hos Y. lipolytica Po1g stammen har tagits bort. Trots detta är det extremt svårt att få Ku70 knockout-stammen på grund av mycket hög grad av icke-homolog rekombination i Y. lipolytica Po1g stam. Man måste vara försiktig vid hantering av antibiotikumet hygromycin B innehållande media som hygromycin B är ljuskänsligt. Använda media med försämrad hygromycin B kommer att resultera i falska positives i steg 2.2.1 och 2.2.2 och falska negativa i steg 2.2.7.

När Ku70 deletionsstam användes för att generera riktad borttagning av enskilda gener som kodar Alkoholdehydrogenas och alkoholoxidas, var en mycket högre radering hastighet uppnås i förhållande till borttagningen av Ku70 genen. Det visar att användningen av Ku70 radering plattform stam resulterade i en dramatisk ökning av homolog rekombination frekvens. Efter frågan om mycket låg homolog rekombination hastighet riktades, screening av Y. lipolytica enda gen knockout-mutanter var mycket påskyndas. Vi noterade också att en kb längd homolog region var effektiv nog för målinriktad gendeletion. En ökning av homolog rekombination frekvens skulle kunna uppnås vid användning av längre homologa sekvenser (2 kb). Noterbart är dessa gener kodar Alkoholdehydrogenas och alkoholoxidas, som katalyserar den reversibla omvandlingen mellan alkoholer och aldehydes. Strykningen av dessa gener kan leda till ökad ackumulering av biobränsle och biokemiska föreningar innefattande kortkedjiga fettsyror, medium-chain fettsyror, långkedjiga fettsyror, hydroxifettsyror, alkoholer, aldehyder och lipider. Ytterligare studier kommer att utföras för att kontrollera denna möjlighet.

En PCR-medierad genavbrott metod har rapporterats i Y. lipolytica Po1d stammen 28. Emellertid är denna metod arbetskrävande och tidskrävande. En viktig begränsning med denna metod är att det är svårt att erhålla tillräckliga mängder av gendeletion kassetter för ett transformationsförsök. En annan begränsning är att denna metod är begränsad till URA3 markör. Den metod som beskrivs i denna studie särskilt riktar dessa frågor i PCR-baserad teknik genom att kombinera uppslutningen-ligationstekniken och Cre / LoxP systemet. Denna metod tillåter användning av olika antibiotika och auxotrofa markörer och därmed är mer versabricka. Det kan underlätta en snabb radering genen i Y. lipolytica Po1g stam. Vi presenterar häri en detaljerad beskrivning av den målsökta single-gendeletion strategi genom homolog rekombination i Y. lipolytica Po1g celler. Men fortfarande ett loxP-ställe som ett ärr inom genomet efter den framgångsrika markören räddning (Figur 4). I flera gendeletion, multipla loxP ärr infördes i genomet och detta kan resultera i genomisk instabilitet på grund av möjliga rekombinationshändelser som kan uppstå mellan loxP-ställen. Ändå knockout stammar konstruerade i denna studie visade mycket god genetisk stabilitet, vilket tyder på att oavsiktliga rekombinationshändelser inte inträffa mellan loxP-ställen.

Sammanfattningsvis har en effektiv genetisk transformation protokoll upprättats för Y. lipolytica Po1g stam. De riktade radering av enskilda gener i denna stam visades som en proof of concept. Y. lipolytica Po1g Ku70 radering plattform stam konstrueras i denna studie visade mycket effektiv homolog rekombination frekvens, vilket möjliggör en enklare och snabbare screening av målgenen strykningar. Således ger denna plattform stam ett effektivare system och ett bättre val för applikationer inom väg teknik och stam optimering vid konstruktion av andra mutanter Kromosomfel. Den beskrivna metoden och det konstruerade Ku70 radering stam kan också tillämpas på införandet av målgener i specifika loci och skapandet av platsspecifika mutationer i genomet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Vi tackar finansieringen stöd från National Environment Agency of Singapore (ETRP 1.201.102), konkurrens Research Program av National Research Foundation i Singapore (NRF-CRP5-2009-03), byrån för vetenskap, teknologi och forskning i Singapore ( 1324004108), Global R & D Project Program, ministeriet för kunskapsekonomin, Republiken Korea (N0000677), Reduction Agency Defense Threat (DTRA, HDTRA1-13-1-0037) och Syntetisk biologi initiativ National University of Singapore ( DPRT / 943/09/14).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent/Material
Oligonucleotide primers Integrated DNA Technologies 25 nmole DNA oligos
Y. lipolytica strain Po1g Yeastern Biotech leucine auxotrophic derivative of the wild-type strain W29 (ATCC 20460)
Vector pYLEX1 Yeastern Biotech FYY203-5MG Y. lipolytica expression vector
E. coli TOP10 Invitrogen For cloning and propagation of plasmids
pGEM-T vector  Promega A3600 TA cloning vector
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen 27106 For plasmid isolation
Wizard SV Gel and
PCR Clean-Up System		 Promega A9282 Extract DNA fragments from agarose gels
and purify PCR products from an amplification reaction
The iProof high-fidelity
DNA polymerase		 Bio-Rad 172-5302 High-fidelity DNA polymerase
BamHI  New England Biolabs R0136S Restriction enzyme
BglII  New England Biolabs R0144L Restriction enzyme
KpnI New England Biolabs R0142S Restriction enzyme
NdeI  New England Biolabs R0111S Restriction enzyme
NotI New England Biolabs R0189L Restriction enzyme
PmlI New England Biolabs R0532S Restriction enzyme
PstI  New England Biolabs R0140S Restriction enzyme
SacII New England Biolabs R0157S Restriction enzyme
SalI New England Biolabs R0138S Restriction enzyme
XhoI New England Biolabs R0146L Restriction enzyme
T4 DNA ligase New England Biolabs M0202L
Taq DNA polymerase  Bio-Rad M0267L
Ampicillin Gibco-Life Technologies 11593-027 Antibiotics
Hygromycin B PAA P21-014 Antibiotics
GeneRuler 1 kb DNA ladder Thermo Scientific SM0312 1 kb DNA ladder
PEG4000 Sigma 95904-F
Tris Promega H5135
EDTA Bio-Rad 161-0729
Salmon Sperm DNA Invitrogen 15-632-011
Lithium Acetate Sigma
Acetic acid Sigma
Glass beads (425-600 µm) Sigma G8772
RNAse A Thermo Scientific EN0531
DNA Loading Dye Thermo Scientific R0611
Bacto Yeast Extract BD 212750
Bacto Peptone BD 211677
D-Glucose 1st Base BIO-1101
YNB without amino acids Sigma Y0626
DO Supplement-Leu Clontech 630414
Glycerol Sigma G5516
Difco LB Broth BD 244620
Difco LB Agar BD 244520
Bacto Agar BD 214010
Equipment
PCR machine Biorad T100 Thermal Cycler
Water bath Memmert WNB 14
Stationary/Shaking Incubator Yihder LM-570RD
Thermo-shaker Allsheng MS-100
Micro centrifuge Eppendorf 5424R
Centrifuge Eppendorf 5810R
Spectrophotometer Eppendorf  BioPhotometer plus
Gel imager GE Amersham Imager 600

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jiménez-Bremont, J. F., Rodrìguez-Hernández, A. A., Rodrìguez-Kessler, M. Development and dimorphism of the yeast Yarrowia lipolytica. Dimorphic fungi: Their importance as models for differentiation and fungal pathogenesis. J, R. uiz-H. errera , 58-66 (2012).
  2. Coelho, M., Amaral, P., Belo, I. Yarrowia lipolytica: an industrial workhorse. Current research, technology and education topics in applied microbiology and microbial biotechnology. Méndez-Vilas, A. , 930-940 (2010).
  3. Martinez-Vazquez, A., et al. Identification of the transcription factor Znc1p, which regulates the yeast-to-hypha transition in the dimorphic yeast Yarrowia lipolytica. Plos One. 8 (6), e66790 (2013).
  4. Richard, M., Quijano, R. R., Bezzate, S., Bordon-Pallier, F., Gaillardin, C. Tagging morphogenetic genes by insertional mutagenesis in the yeast Yarrowia lipolytica. J. Bacteriol. 183 (10), 3098-3107 (2001).
  5. Flores, C. L., Martìnez-Costa, O. H., Sánchez, V., Gancedo, C., Aragòn, J. J. The dimorphic yeast Yarrowia lipolytica possesses an atypical phosphofructokinase: characterization of the enzyme and its encoding gene. Microbiology. 151 (5), 1465-1474 (2005).
  6. Domìnguez, Á, et al. Non-conventional yeasts as hosts for heterologous protein production. Int. Microbiol. 1 (2), 131-142 (1998).
  7. Zinjarde, S. S. Food-related applications of Yarrowia lipolytica. Food Chem. 152, 1-10 (2014).
  8. Finogenova, T., Morgunov, I., Kamzolova, S., Chernyavskaya, O. Organic acid production by the yeast Yarrowia lipolytica: a review of prospects. Appl. Biochem. Micro+. 41 (5), 418-425 (2005).
  9. Groguenin, A., et al. Genetic engineering of the β-oxidation pathway in the yeast Yarrowia lipolytica to increase the production of aroma compounds. J. Mol. Catal. B-Enzym. 28 (2), 75-79 (2004).
  10. Meng, X., et al. Biodiesel production from oleaginous microorganisms. Renew. Energ. 34 (1), 1-5 (2009).
  11. Papanikolaou, S., Aggelis, G. Lipid production by Yarrowia lipolytica growing on industrial glycerol in a single-stage continuous culture. Bioresource Technol. 82 (1), 43-49 (2002).
  12. Tai, M., Stephanopoulos, G. Engineering the push and pull of lipid biosynthesis in oleaginous yeast Yarrowia lipolytica for biofuel production. Metab. Eng. 15, 1-9 (2013).
  13. Liu, H. H., Ji, X. J., Huang, H. Biotechnological applications of Yarrowia lipolytica: Past, present and future. Biotechnol. Adv. 33 (8), 1522-1546 (2015).
  14. Liu, L., Alper, H. S. Draft genome sequence of the oleaginous yeast Yarrowia lipolytica PO1f, a commonly used metabolic engineering host. Genome Announc. 2 (4), e00652-e00614 (2014).
  15. Dujon, B., et al. Genome evolution in yeasts. Nature. 430 (6995), 35-44 (2004).
  16. Chen, D. C., Beckerich, J. M., Gaillardin, C. One-step transformation of the dimorphic yeast Yarrowia lipolytica. Appl. Microbial. Biotechnol. 48 (2), 232-235 (1997).
  17. Wang, J. H., Hung, W., Tsai, S. H. High efficiency transformation by electroporation of Yarrowia lipolytica. J. Microbiol. 49 (3), 469-472 (2011).
  18. Matsuoka, M., et al. Analysis of regions essential for the function of chromosomal replicator sequences from Yarrowia lipolytica. Mol. Gen. Genet. 237 (3), 327-333 (1993).
  19. Kretzschmar, A., et al. Increased homologous integration frequency in Yarrowia lipolytica strains defective in non-homologous end-joining. Curr. Genet. 59 (1-2), 63-72 (2013).
  20. Lorenz, T. C. Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies. J. Vis. Exp. (63), e3998 (2012).
  21. Kobs, G. Cloning blunt-end DNA fragments into the pGEM-T Vector Systems. Promega Notes. 62, 15-18 (1997).
  22. JoVE Science Education Database. Isolating Nucleic Acids from Yeast. Essentials of Biology 1: yeast, Drosophila and C. elegans. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: http://www.jove.com/science-education/5096/isolating-nucleic-acids-from-yeast (2016).
  23. Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques: plating methods. J. Vis. Exp. (63), e3064 (2012).
  24. Hegemann, J. H., Heick, S. B. Delete and repeat: a comprehensive toolkit for sequential gene knockout in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Methods Mol. Biol. 765, 189-206 (2011).
  25. Yamane, T., Sakai, H., Nagahama, K., Ogawa, T., Matsuoka, M. Dissection of centromeric DNA from yeast Yarrowia lipolytica and identification of protein-binding site required for plasmid transmission. J. Biosci. Bioeng. 105 (6), 571-578 (2008).
  26. McGinnis, S., Madden, T. L. BLAST: at the core of a powerful and diverse set of sequence analysis tools. Nucleic Acids Res. 32 ((Web Server issue)), W20-W25 (2004).
  27. Madzak, C., Tréton, B., Blanchin-Roland, S. Strong hybrid promoters and integrative expression/secretion vectors for quasi-constitutive expression of heterologous proteins in the yeast Yarrowia lipolytica. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 2 (2), 207-216 (2000).
  28. Nicaud, J. M., Le Clainche, A., Le Dall, M. T., Wang, H., Gaillardin, C. Yarrowia lipolytica, a yeast model for the genetic studies of hydroxy fatty acids biotransformation into lactones. J. Mol. Catal. B-Enzym. 5 (1), 175-181 (1998).

Tags

Genetik bioteknik okonventionella jäst, genetisk transformation gendeletion genmanipulation homolog rekombination markör räddning
Genteknik av en okonventionell Jäst för förnybart biobränsle och biokemisk produktion
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yu, A. Q., Pratomo, N., Ng, T. K.,… More

Yu, A. Q., Pratomo, N., Ng, T. K., Ling, H., Cho, H. S., Leong, S. S. J., Chang, M. W. Genetic Engineering of an Unconventional Yeast for Renewable Biofuel and Biochemical Production. J. Vis. Exp. (115), e54371, doi:10.3791/54371 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter