Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

הנדסה גנטית של שמרים לא קונבנציונליים עבור Biofuel מתחדשת והפקה ביוכימיים

Published: September 20, 2016 doi: 10.3791/54371
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2,3, 1,2
1Department of Biochemistry, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, 2NUS Synthetic Biology for Clinical and Technological Innovation (SynCTI), Life Sciences Institute, National University of Singapore, 3Food Science and Chemical Engineering, Singapore Institute of Technology

Abstract

Yarrowia lipolytica הוא מין שמרים שאינם פתוגניים, דימורפית ו אירובית בהחלט. בשל התכונות הפיזיולוגיות הייחודיות שלה מאפיינים מטבוליים, שמרים הלא השיגרתי הזה הוא לא רק מודל טוב ללימוד של הטבע הבסיסי של בידול פטרייתי אבל הוא גם פלטפורמה מיקרוביאלי מבטיחה לייצור ביוכימיים יישומים ביוטכנולוגיים שונים, הדורשים מניפולציות גנטיות נרחבות. עם זאת, מניפולציות גנטיות של י ' lipolytica היה מוגבל בשל העדר מערכת טרנספורמציה גנטית יעילה ויציבה כמו גם שיעור גבוה מאוד של רקומבינציה שאינו הומולוגי שניתן לייחס בעיקר גן KU70. כאן אנו מדווחים פרוטוקול קל ומהיר עבור השינוי הגנטי היעיל למחיקת גני י lipolytica Po1g. פרוטוקול ראשית, עבור השינוי היעיל של ה- DNA אקסוגני לתוך י ' lipolytica Po1g הוקמה. SecoND, כדי להשיג את השיעור ההומולוגי פעמים המוצלבות המשופר למחיקה נוספת של גני המטרה, גן KU70 נמחק על ידי הפיכת קלטת שיבוש נושאת 1 נשק הומולוגית kb. שלישית, כדי להדגים את יעילות מחיקת גן המשופרת לאחר המחיקה של גן KU70 מחקנו בנפרד 11 גני מטרת קידוד dehydrogenase אלכוהול מונואמין אלכוהול באמצעות אותם ההליכים על זן הפלטפורמה בנוקאאוט KU70. היה נראה כי השיעור הומולוגי מדויק גדילה בצורה ניכרת מפחות מ -0.5% למחיקה של גן KU70 ב Po1g ל -33% -71% עבור מחיקת הגן היחידה של 11 גני יעד Po1g KU70 Δ. פלסמיד בשכפול הדנ"א נושא את סמן התנגדות B hygromycin ומערכת Cre / LoxP נבנה, ואת גן סמן בחירה זני בנוקאאוט שמרים בסופו של דבר הוסר על ידי ביטוי של recombinase Cre כדי להקל סבבים רבים של targeמניפולציות גנטיות טד. מוטציות מחיקת גן יחיד וכתוצאה מכך יש יישומים פוטנציאליים דלק ביולוגי וייצור ביוכימיים.

Introduction

בניגוד שמר אפייה, Yarrowia lipolytica, גידול שמרים בלתי שיגרתי, יכול לגדול בצורה של שמרים או תפטיר בתגובה לשינויי 1,2 תנאים סביבתיים. לפיכך, שמרים דימורפית זה יכול לשמש כמודל טוב ללימוד של בידול פטרייתי, morphogenesis ו 3,4,5 הטקסונומיה. זה נחשב בדרך כלל כמין שמרים בטוח (GRAS), שנמצא בשימוש נרחב כדי לייצר מגוון רחב של תוספי מזון כגון חומצות אורגניות, polyalcohols, תרכובות הארומה, מתחלבים פעילי שטח 6,7,8,9. זהו aerobe מחייבים וכן שמרים oleaginous ידועים מסוגל צבירת שומנים באופן טבעי לסכומים גבוהים, כלומר, עד 70% של תא יבש משקל 10. זה גם יכול לנצל קשת רחבה של מקורות פחמן לצמיחה, כולל סוגים שונים של שאריות לבזבז משאבים כיסודות הזנה 11,12,13. כל תכונות ייחודיות אלה הופכים י lipolytica מאוד אטרקטיבי עבוריישומים ביוטכנולוגיים שונים.

למרות רצף הגנום כולו של י ' lipolytica כבר פורסם 14,15, מניפולציה גנטית של השמרים הלא השיגרתי הזה היא יותר מורכבת מאשר מיני שמרים אחרים. ראשית, טרנספורמציה של מינים שמרים זה הוא הרבה פחות יעיל בשל העדר של 16,17 מערכת טרנספורמציה גנטית יציב ויעיל. שנית, אינטגרציה הגנומי מייגעת של קלטות ביטוי ליניארי משמשת בדרך כלל את הביטוי של גנים של עניין כמו אין מערכת פלסמיד episomal הטבעי כבר נמצאה שמרים זה 18. שלישית, דור-outs הדפיקה הגנטי ולהפיל-ins מוגבל בגלל ההתמקדות בגנים יעילה באמצעות רקומבינציה הומולוגי מדויק בשמרים זה הנו נמוכים ביותר אירועי האינטגרציה להתרחש באמצעות הצטרפותו קצה שאינו הומולוגי (NHEJ) 19.

במחקר זה, אנו מדווחים על פרוטוקול טרנספורמציה אופטימיזציה עבור י lipolytica KU70, אשר מקודד אנזים מפתח בנתיב NHEJ. באמצעות פרוטוקול טרנספורמציה אופטימיזציה והפיכת קלטת בנוקאאוט ליניארי המכילה איגוף אזורי הומולוגיה של 1 קילו, גן KU70 של י ' lipolytica Po1g נמחק בהצלחה. חוסנו של המתודולוגיה המחיקה הגן הזה אז הודגם על ידי מיקוד dehydrogenase אלכוהול וגנים מונואמין אלכוהול זן Δ KU70 Po1g. היה נראה כי זן מחיקת KU70 הציג יעילות גבוהה באופן משמעותי של גן בתיווך הומולוגי מיקוד מזו של זן Po1g wild-type. בנוסף, פלסמיד ביטוי בשכפול הדנ"א Cre נושא את סמן התנגדות B hygromycin נבנה לבצע הצלת סמן. הצלת הסמן מקלה סבבים רבים של גן המיקוד ב הדואר המתקבל מוטנטים מחיקת גן. מלבד מחיקת גן, הפרוטוקול שלנו לטרנספורמציה הגנטי מחיקת גן המתואר כאן ניתן ליישם להכניס גני לוקוסים ספציפיים, וכדי להציג מוטציות ספציפיות לאתר לתוך י ' הגנום lipolytica.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

דור 1. של י ' זנים מחיקים KU70 lipolytica

  1. בנייה של הקלטת שיבוש
    הערה: ראה טבלה 1 עבור כל פריימרים המשמשים תגובת שרשרת פולימראז הרחבות (PCR).
    1. פריימרים עיצוב 20 עד PCR להגביר את קלטת ביטוי LEU2 (ראו טבלה 1) מתוך י ' וקטור ביטוי lipolytica ולהציג אתרי LoxP לתוך 5 'ו 3' מסתיים של הקלטת LEU2 עם פריימר קדימה ארוך (# 1; טבלה 1) פריימר הפוכה ארוך (# 2; טבלה 1), בהתאמה. כדי להציג את אתר מגבלה נוסף על הצעדים הבאים של תהליך השיבוט, להוסיף את אתר מגבלה בם HI ב פריימר # 1.
    2. בצע PCR באמצעות DNA פולימרז באיכות גבוהה כמפורט בטבלה 2.
    3. לטהר את קלטת PCR המוצר LoxP-האמרגן-LEU2-terminator-LoxP באמצעות purificatio PCRערכת n על פי הוראות היצרן. להוסיף 3'-A המסוכך על מוצר PCR מטוהר פי הוראות היצרן 21. השתמש T4 DNA האנזים ולקשור המוצר PCR זנב a ל וקטור שיבוט ת"א להניב הפלסמיד T-LEU2 לפי טבלה 3.
    4. PCR להגביר את רצף הזרם 5 '1 kb של הגן KU70 באמצעות פריימרים # 3 / # 4 מן י lipolytica Po1g הדנ"א הגנומי 22 לפי טבלה 2. לטהר את מוצר ה- PCR באמצעות ערכת טיהור PCR פי הוראות היצרן.
      1. Double לעכל הוא מוצר PCR מטוהר פלסמיד T-LEU2 עם Sac השנייה בם HI אנזימים לפי טבלת 4. לטהר את תערובת העיכול באמצעות ערכת טיהור PCR לפי הוראות יצרן. השתמש האנזים T4 DNA ולקשור מטוהרים מתעכל המוצר PCR אל Sac II / Bam HI האתרים של T-LEU2 להניבפלסמיד T-LEU2-5E לפי טבלה 3.
    5. PCR להגביר את רצף במורד 3 '1 kb של הגן KU70 באמצעות פריימרים # 5 / # 6 מן י lipolytica Po1g הדנ"א הגנומי 22 לפי טבלה 2. לטהר את מוצר ה- PCR באמצעות ערכת טיהור PCR פי הוראות היצרן. Double לעכל הוא מוצר PCR מטוהר פלסמיד T-LEU2-5E עם לא אני חס"ם אני אנזימים לפי טבלת 4.
      1. לטהר את תערובת העיכול באמצעות ערכת טיהור PCR לפי הוראות יצרן. לאחר מכן, ולקשור את מטוהרים מתעכל המוצר PCR אל לא אני / חס"ם אני האתרים של T-LEU2-5E להניב הפלסמיד T-KO באמצעות האנזים T4 DNA על פי טבלה 3.
    6. לעכל את הפלסמיד T-KO עם Sac השנייה חס"ם אני אנזימים לפי טבלה 4 כדי לייצר את הקלטת הפרעה (איור 1
  2. הכנת תא מוסמכת וטרנספורמציה של י ' זן lipolytica Po1g
    1. הכנת תא מוסמכת
      1. לחסן מושבה של י ' lipolytica Po1g זן מהצלחת תמצית-peptone דקסטרוז שמרים טריים (YPD) ב 10 מ"ל של מדיום YPD (1% תמצית שמרים, 2% peptone, 2% דקסטרוז ו -50 מ"מ pH חיץ ציטראט 4.0) בבקבוק 100 מ"ל. דגירה באינקובטור רועד 30 מעלות צלזיוס ב 225 סל"ד במשך 20 שעות עד הרוויה (OD של 600 על 15, נמדד באמצעות ספקטרופוטומטר).
      2. גלולת התאים על ידי צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 5000 XG בטמפרטורת חדר. שוטפים את התאים עם 20 מ"ל טריס-EDTA (TE) חיץ (10 מ"מ טריס, 1 mM EDTA, pH 7.5), ו גלולה התאים כמתואר בשלב 1.2.1.2. Resuspend התאים 1 מ"ל של 0.1 מ 'אצטט ליתיום (pH 6.0, מותאם עם חומצה אצטית), דגירה במשך 10 דקות ב בטמפה בחדרrature.
      3. Aliquot התאים המוסמכים (100 μl) לתוך צינורות 1.5 מיליליטר סטרילי. והמשך לביצוע הפעולות טרנספורמציה מתחת מיד, או להוסיף גליצרול לריכוז סופי של 25% (v / v) ולאחסן ב -80 ° C עבור אחסון לטווח ארוך.
    2. טרנספורמציה
      1. בעדינות מערבבת 10 μl של ה- DNA זרע סלמון המפוגל (10 מ"ג / מיליליטר) ו 1-5 מיקרוגרם של הקלטת השיבוש מטוהרת יחד עם 100 μl של תאים מוסמכים, לדגור על 30 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות.
      2. הוסף 700 μl של פוליאתילן גליקול 40% (PEG) -4000 (מומס pH אצטט 0.1 M ליתיום 6.0), מערבבים היטב דגירה באינקובטור רועד 30 מעלות צלזיוס ב 225 סל"ד במשך 60 דקות.
        הערה: חשוב להשתמש PEG עם משקל מולקולרי ממוצע של 4000, במקום-3350 PEG (משמש בדרך כלל את הטרנספורמציה של שמרים קונבנציונאלי).
      3. מחממים לזעזע את תערובת הטרנספורמציה על ידי הנחת הצינור באמבט מים C ° 39 במשך 60 דקות.
      4. הוסף 1 מ"ל בינוני YPD ולהתאושש במשך שעה 2 ב 30 מעלות צלזיוס, 225 סל"ד. צנטריפוגה ב 9,000 XG עבור 1 דקות בטמפרטורת החדר, להסיר את supernatant ו resuspend גלולה ב 1 מ"ל של חיץ TE.
      5. Repellet את התאים על ידי צנטריפוגה ב 9000 XG במשך 1 דקות בטמפרטורת החדר וזורקים supernatant. Resuspend גלולה ב 100 μl של חיץ TE צלחת לצלחות סלקטיבית (למשל, צלחות לאוצין מחסר), לדגור על 30 מעלות צלזיוס במשך 2-3 ימים.
      6. פיק 4 עד 10 מושבות אחת לחסן בנפרד לתוך 2 מ"ל של מדיום YPD. דגירת לילה חממה רועדת 30 מעלות צלזיוס ב 225 סל"ד. זיהוי מושבות חיוביות על ידי ניתוח PCR של הדנ"א הגנומי מן transformants 22 לפי לוח 5 באמצעות שתי קבוצות של פריימרים 55 # / # 56 ו- # 56 / # 57, בהתאמה.
        הערה: לא אני לינארית וקטור pYLEX1 הופך י lipolytica Po1g תאים מוסמכים כדי לקבוע את יעילות השינוי על ידי ספירת המספרשל הקמת יחידות המושבה (CFU) לכל פלסמיד מיקרוגרם DNA בשימוש 23.

2. מרקר הצלה

  1. בנייה של פלסמיד ביטוי Cre
    1. בניית pYLEX1-CRE ו pYLEX1-השרוולים
      1. פריימרים עיצוב 20 עד PCR להגביר את מסגרות קריאה פתוחה של cre ואת שרוולי. הוסף נוקלאוטיד אדנין נוסף במעלה הזרם של קודונים התחלה של פריימרים קדימה 82 # ו # 84, והכנס אתרי הגבלה Kpn לי במורד הזרם של קודונים עצירה פריימרים הפוכה # 83 ו # 85. PCR להגביר את מסגרות קריאה פתוחה של cre ו שרוולים מ pSH69 (HQ412578 מספר הצטרפות) 24 לפי טבלה 2.
      2. לטהר הן cre ושברי שרוולים באמצעות ערכת טיהור PCR פי הוראות היצרן. תקציר הן שברי cre ואת שרוולי מטוהרים עם Kpn שאני האנזים לפי Tablדואר 4. להכפיל לעכל את הפלסמיד pYLEX1 עם PML אני Kpn שאני אנזימים לפי טבלה 4. לטהר את התערובת העיכול באמצעות ערכת טיהור PCR לפי הוראות היצרן.
      3. השתמש אנזים T4 DNA על פי טבלה 3 ולקשור את שברי המטוהרים מתעכלים cre ואת השרוולים לאתרי PML I / Kpn א 'של י' וקטור ביטוי lipolytica, מניב pYLEX1-CRE ו pYLEX1-שרוולים, בהתאמה.
    2. בניית pSL16-CRE-השרוולים
      1. PCR להגביר את הקלטת גן-terminator האמרגן של cre מ pYLEX1-CRE באמצעות פריימרים 86 # / # 87 איגוף באתרי הגבלה סאל I / Pst לי לפי טבלה 2. לטהר את מוצר ה- PCR באמצעות ערכת טיהור PCR פי הוראות היצרן .
        1. Double לעכל הן המוצר PCR מטוהרים pSL16-CEN1-1 (227) פלסמיד 25 עם סאל אניPst שאני אנזימים לפי טבלה 4. לטהר את התערובת העיכול באמצעות ערכת טיהור PCR לפי הוראות היצרן. לאחר מכן, ולקשור את מוצר ה- PCR המטוהר מעוכל אל pSL16-CEN1-1 (227) באתרים המתאימים ליצור pSL16-CRE באמצעות אנזים T4 DNA על פי טבלה 3.
      2. PCR להגביר את הקלטת הגן-terminator האמרגן של שרוולים מ pYLEX1-שרוולים באמצעות פריימרים # 88 / # 89 איגוף באתרי ההגבלה Xho I / BGL השנייה לפי טבלה 2. לטהר את מוצר ה- PCR באמצעות ערכת טיהור PCR פי הוראות היצרן .
        1. Double לעכל הוא מוצר PCR מטוהר פלסמיד pSL16-CRE עם Xho I ו- II BGL אנזימים לפי טבלת 4. לטהר את תערובת העיכול באמצעות ערכת טיהור PCR לפי הוראות יצרן. לאחר מכן, ולקשור את המוצר המטוהר מתעכל PCR לתוך pSL16-CRE בבית המקבילאתרים ליצור pSL16-CRE-שרוולים באמצעות אנזים T4 DNA על פי טבלה 3.
          הערה: פלסמיד הביטוי Cre וכתוצאה מכך, pSL16-CRE-השרוולים, מטפח סמן לבחירת hygromycin B ו- הוא וקטור centromeric ו episomally המשכפל (איור 2).
      3. אמת את כל המבנים על ידי עיכול עם אנזימי הגבלה המתאים (למשל, סאל I / Pst לי, שיחתוך את הכנס מפני וקטור) לפי טבלה 4.
  2. הצלת סמן recombinase בתיווך Cre
    1. Transform pSL16-CRE-שרוולים לתאי מוסמכות של הזן בנוקאאוט KU70 בעקבות פרוטוקול השינוי בסעיף 1.2 לעיל. פלייט טרנספורמציה תאים על YPD בתוספת hygromycin B (YPDH) צלחות (המכיל 400 מיקרוגרם / מ"ל ​​ב hygromycin), לדגור על 30 מעלות צלזיוס במשך 2-3 ימים.
    2. בצע המושבה PCR לפי טבלה 5 פריימרים באמצעות # 84 / # 85 לזהות חיוביתמושבות המכילות pSL16-CRE-שרוולי פלסמיד לאחר שינוי.
      הערה: קדימה פריימר 84 # ואת ממוקמי פריימר ההפוך 85 # שבתחומי אזור הקידוד של גני שרוולים (טבלה 1). רק שיבוטים חיוביים ליצור מוצר PCR ספציפי תגובת PCR.
    3. בחר שיבוט חיובי לחסן לתוך 2 מיליליטר של מדיום YPDH, דגירה באינקובטור רועד 30 מעלות צלזיוס ב 225 סל"ד לילה לרוויה. מדוד את התא OD 600 עם ספקטרופוטומטר. קציר התאים ב OD של 600 ~ 15. צנטריפוגה ב 5000 XG במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, ולשטוף פעם עם 2 מ"ל של מים סטריליים.
    4. Re-לחסן תאים לתוך 2 מ"ל של מדיום YPD עם OD הראשונית 600 של 0.1 ולאפשר לתאים לגדול חממה רועד 30 מעלות צלזיוס ב 225 סל"ד לילה. Streak התרבות התא לילה לצלחות YPD לבודד מושבות אחת 23. מושבות צלחת Replica על YPD, YPDH, וצלחות לאוצין מחסר 23 הערה: מושבות שאבדו הן סמן LEU2 ו פלסמיד pSL16-CRE-השרוולים יכול לגדול רק על צלחות YPD (איור 3).

מחיקת 3. dehydrogenase אלכוהול אלכוהול מונואמין גנים

  1. בצע חיפוש על י ' מסד נתוני הגנום lipolytica באמצעות כלי חיפוש יישור המקומיים הבסיסיים (יפציץ) לזהות מועמדי הגן למחיקה 26. קלט את רצף החלבון של ס dehydrogenase אלכוהול cerevisiae לי לתוך כלי חיפוש תפציץ (http://www.genome.jp/tools-bin/search_sequence?prog=blast&db=yli&seqid=aa).
    הערה: כלי החיפוש יפציץ מחזיר את רצפי חלבונים הדומים ביותר י מסד נתוני הגנום lipolytica.
  2. לבנות את הקלטות המחיקות על ידי PCR עם פריימרים מספר 7 56 # (טבלה 1), ולבצע עיכול אנזים הגבלה ותגובות קשירה באמצעות אותן השיטות כמתוארות בסעיף 1.1 לעיל.
  3. Prepהם תאים מוסמכים של הזן בנוקאאוט KU70, לבצע טרנספורמציות ולבצע PCR לזהות מושבות חיוביות עם פריימרים # 55, # 58 כדי # 81 (טבלה 1) על ידי ביצוע הפרוטוקול המתואר בסעיף 1.2 לעיל.
    הערה: כדוגמא, את הליך מחיקת גן YALI0E17787g מתואר איורי 4 ו -5. ההשפעות של 1 קילו ו 2 קילו ארוך באזור ההומולוגי על שיעור הומולוגי מדווחות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

י 'לינארית וקטור ביטוי lipolytica הוכנס לתוך פלטפורמת עגינה PBR בגנום של י ' lipolytica Po1g זן על ידי ביצוע רקומבינציה מוצלב יחיד 27. באמצעות הליך השינוי הכימי המהיר הוקם בשינה במחקר זה, י 'לינארית וקטור ביטוי lipolytica הפך בהצלחה לתוך זן Po1g wild-type בכל יעילות השינוי של> 100 CFU / מיקרוגרם DNA. קלטת בנוקאאוט המוקפת רצפים הומולוגיים 1 kb הפכה לזן Po1g ואת גן KU70 נמחק בהצלחה (איור 1). הנה, קדימה פריימר # 56 anneals לרצף ממוקם במרחק של 5 הומולוגיה "הזרוע של גן KU70. בעלי מירב פריימר הפוכה 55 ממוקמת בתוך אזור הקידוד של סמן LEU2. היפך פריימר 57 # ממוקם בתוך אזור הקידוד של גן KU70. אֵיךפעם, מתוך למעלה מ -200 מושבות, רק מושבה חיובית אחד עם גן KU70 נמחק נצפתה, דבר המצביע על שיעור מחיקת גן נמוך מאוד (<0.5%). בהמשך לכך, פלסמיד בשכפול הדנ"א נושא את סמן התנגדות B hygromycin ומערכת Cre / LoxP נבנה (איור 2), ואת גן סמן הבחירה בזן עכברים בנוקאאוט KU70 בסופו של דבר הוסר על ידי ביטוי Cre recombinase (איור 3). שימוש באפשרות החיפוש יפציץ, עשרה גני dehydrogenase האלכוהול משוערים וגן מונואמין אלכוהול אחת אותרו י הגנום lipolytica. גני dehydrogenase האלכוהול המשוערים הם YALI0E17787g, YALI0D25630g, YALI0A16379g, YALI0E15818g, YALI0D02167g, YALI0A15147g, YALI0E07766g, YALI0F09603g, YALI0B10175g, YALI0F08129g, YALI0E07810g. גן מונואמין האלכוהול המשוער הוא YALI0B14014g. כדי לאמת את הגידול של שיעור מחיקה גן לאחר המחיקה של גן KU70, אנחנו בנפרד נמחקנו 11 גנים במקביל (למעטעבור YALI0A16379g) באמצעות קלטות השיבוש עם רצפים הומולוגיים ארוכים י זן בנוקאאוט KU70 lipolytica (איורים 4 ו -5). הנה, פריימרים קדימה (P1-F ו- P2-F) לחשל רצף ממוקם בתוך הזרוע 5 'הומולוגיה של גני מטרה. פריימרים ההפוכים (P1-R) ממוקמים בתוך אזור הקידוד של סמן LEU2. פריימרים ההפוכים (P2-R) ממוקמים בתוך אזור הקידוד של גני המטרה (איור 4). קסטות נוק-אאוט נבדלים זה מזה רק מעט אורכי רצפים הומולוגיים ואת אתרי הגבלה (טבלה 1). שיעורי מחיקת ג'ין [הומולוגי / (הומולוגי + רקומבינציה שאינו הומולוגי)] של 33% -71% הושגו, דבר המצביע על עלייה דרמטית בשכיחות ההומולוגית הממוקדת על מחיקת גן KU70. למשל, שיעור המחיקה של YALI0E17787g היה 40% (~ 100 DNA CFU / מיקרוגרם). יתר על כן, את האפשרות של עלייה נוספת בשיעור מחיקת גן נחקרת כאשר שמשו רצפים הומולוגיים יותר. הוא הראה כי קלטת השיבוש הגנטי YALI0E17787g עם רצפים הומולוגיים 2 kb נתנה שיעור מחיקה של 87.5% (~ 400 CFU / DNA מיקרוגרם). בנוסף, LEU2 גן סמן הבחירה הציג מוטנטים המחיקים שהושגו הוסר על ידי הפיכת וקטור pSL16-CRE-השרוולים (hp4d- cre, שרוולים), ובכך לאפשר סבבים רבים של מניפולציות גן ממוקדות.

איור 1
איור 1. בנייה של הקלטת בנוקאאוט KU70 ואת KU70 לוקה מוטציה. A. ההשתקה KU70 פלסמיד T-KO. B. תרשים סכמטי של קלטת בנוקאאוט KU70. מחדש במעלה או במורדgions (1 KB) של הגן KU70 היו משובטים כדי 5'- ו 3'-end של הקלטת שיבוש עבור הומולוגיים. הקלטת ביטוי LEU2 הוכנסה בין שני רצפי איגוף הומולוגיים. C. ג'ל אלקטרופורזה של קלטת מחיקת KU70 לאחר Sac השנייה חס"ם אני אכול מ- T-KO. L: 1 kb סולם DNA; 1: הקלטת המחיקה KU70 (בגודל הלהקה הצפוי הוא 4.3 kb) D.. אישור ה- PCR של מחיקת גן KU70 ב י lipolytica Po1g. מוצרי ה- PCR היו מוגברים מ- DNA הגנומי של transformants (נתיבי 1-10) ומתח wild-type (מסלול 11). ליין 7 ממחיש בנוקאאוט חיובית, בעוד מסלול 1 מראה חיובי כוזב. בתוך הג'ל העליון, שבר של 500 נ"ב מתקבל עם פריימר להגדיר # 56 / # 57 והוא נעדר רק מסלולי 1 ו 7. ג'ל התחתון, knockouts המוצלח ליצור שבר של 750 נ"ב, אשר מתקבל עם פריימר להגדיר 55 # / # 56. Tהוא 750 להקה נ"ב נתפס רק בנתיב 7. L:. 1 kb סולם DNA אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
תרשים סכמטי באיור 2. של פלסמיד recombinase ביטוי Cre להצלת סמן. הפלסמיד משכפל episomally pSL16-CRE-שרוולי נושאת recombinase Cre (CRE), סמן התנגדות hygromycin B (שרוולים), גן התנגדות אמפיצילין (AMP), גידול מקורו של שכפול של Escherichia coli (pMB1), מוצא שכפול של י ' lipolytica (ORI1001), רצף DNA centromere של י ' lipolytica (CEN1-1) ואת גן lacZ המקודד את האנזים β-galactosidase. אנא לחץ כאן כדי להציג גדול Ver שיאון של נתון זה.

איור 3
הקרנת צמיחת איור 3. י סמנו-פחות חיוביים זני lipolytica אחרי הצלת סמן. transformants (1-4) דוללו ואיתר לצלחות YPD, צלחות YPDH וצלחות לאוצין מחסר, בהתאמה. לאחר 3 ימים של צמיחה בקצב של 30 ° C, transformants סמן ללא חיובי (1, 3, 4) יכול לגדול רק על הצלחת YPD, המצביע על כריתה של הגן סמן LEU2 על הביטוי של recombinase Cre ואובדן פלסמיד pSL16- CRE-שרוולי ת:. צלחת YPD, B: צלחת YPDH, C:. צלחת לקוי לאוצין אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

בתוך-page = "1"> איור 4
איור 4. תרשים סכמטי של מחיקת גן ממוקדת סמן הליך הצלה. הקלטת השיבוש הגנטי מורכבת גן סמן בחירה (LEU2) ולצדו שני אתרי הכרת LoxP ושתי זרועות מיקוד (במעלה או במורד רצפי איגוף). לאחר השינוי של הקלטת הפרעה לתוך י ' תאי lipolytica, אירוע החלפת גן מתרחש באמצעות רקומבינציה הומולוגי פעמים מוצלבים בתוך זרועות הומולוגית איגוף השנייה ב הלוקוס הממוקד. שני סטים של פריימרים PCR שימשו כדי לאמת שילוב של הקלטת הפרעה (P1-F ו P1-R) ומחיקה במקביל של אזורים הגנומי ממוקד (P2-F ו- P2-R). לבסוף, הסמן LEU2 הוסר על ידי ביטוי של recombinase Cre, והותיר אחריו אתר LoxP יחיד על מוקד כרומוזומליות. מחיקת גן ממוקדת והחלפת YALI0E17787 gene הוצגה כאן כדוגמה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5
אישור איור 5. PCR של שיבוש גנטי YALI0E17787 ב י lipolytica Po1g. מוצרי ה- PCR היו מוגבר של הדנ"א הגנומי של transformants (נתיבי 1-4) ומתח wild-type (מסלול 5). Lanes 1, 2, ו -4 להמחיש knockouts חיובית, ואילו השביל 3 מראה חיובי כוזב. בתוך הג'ל העליון, knockouts המוצלח ליצור שבר של 750 נ"ב, אשר מתקבל עם פריימר להגדיר P1-F ו P1-R. להקת 750 נ"ב נתפסה מסלולי 1, 2, ו -4, אבל לא במסלולי 3 ו -5 בתוך הג'ל התחתון, שבר של 500 נ"ב מתקבל עם פריימר להגדיר P2-F ו- P2-R והוא רק הווה במסלולים 3nd 5. L:. סולם DNA kb 1 אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

טבלה 1. Primers השתמשו במחקר זה. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הטבלה.

רכיב ה- PCR
חומרי PCR כרכים ריכוז סופי
חיץ PCR 10 μl 1x
תמהיל dNTP 1 μl 200 מיקרומטר
פריימר קדימה 2.5 μl 500 ננומטר </ Td>
פריימר הפוך 2.5 μl 500 ננומטר
DNA פולימראז 0.5 μl 1 U
תבנית ה- DNA (בדילול גנומית או פלסמיד דנ"א) 0.5-2 μl 50 ng
מים סטריליים עד 50 μl
תנאי PCR
טֶמפֶּרָטוּרָה זְמַן מספר מחזורי
98 ° C 30 שניות 1
98 ° C 10 שניות 30
55 ° C 30 שניות
72 ° C 30 שניות
72 ° C 10 דק ' 1
בצע הגברת PCR באמצעות תרםCycler אל

טבלת 2. PCR הגדרה ותנאי DNA פולימרז באיכות הגבוהה.

תנאי תגובת לוח 3. DNA קשירה באמצעות אנזים T4 DNA.

רְכִיב
חומרים ריכוז סופי
T4 DNA אנזים הצפה 1x
וקטור DNA 0.03 pmol
הכנס DNA 0.15 pmol
האנזים T4 DNA 400 U
מים סטריליים עד 20 μl
תנאים
טֶמפֶּרָטוּרָה זְמַן
16 ° C 16 שעות
<td> 6 שעות
רְכִיב
חומרים ריכוז סופי
חיץ עיכול הגבלה 1x
DNA (מוצר פלסמיד או PCR) 1 מיקרוגרם
1 אנזים הגבלה st 5 U
2 אנזים הגבלה nd (אופציונלי) 5 U
מים סטריליים עד 50 μl
תנאים
טֶמפֶּרָטוּרָה זְמַן
37 ° C
בצע עיכול יחיד עם אנזים הגבלה אחת
בצע עיכול כפול עם זוג אנזימי הגבלה

לוח 4. תנאים לעיכול אנזים הגבלה של DNA.

רכיב ה- PCR
חומרי PCR כרכים ריכוז סופי
חיץ PCR 2.5 μl 1x
תמהיל dNTP 0.5 μl 200 מיקרומטר
פריימר קדימה 0.5 μl 200 ננומטר
Reveפריימר RSE 0.5 μl 200 ננומטר
DNA פולימראז 0.2 μl 1 U
תבנית ה- DNA (בדילול גנומית או פלסמיד דנ"א) 0.5-2 μl 50 ng
מים סטריליים עד 25 μl
תנאי PCR
טֶמפֶּרָטוּרָה זְמַן מספר מחזורי
95 ° C 5 דקות 1
95 ° C 30 שניות 30
50 ° C 30 שניות
72 ° C 30 שניות
72 ° C 10 דק ' 1
בצע הגברת PCR באמצעות Cycler תרמית
בצע המושבה PCR ישירות באמצעות מושבה כתבנית, ולא דגימת DNA

לוח 5: PCR / מושבת PCR הגדרה ותנאי פולימראז תקי DNA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

המטרה שלנו עבור מחקר זה היא לאפשר לדור מהיר ויעיל של נוקאאוט גנטי ממוקד י lipolytica Po1g זן. מספר שיקולים צורך לטפל כדי להשיג זאת. ראשית, יעילות שינוי גבוה נדרשת. לפיכך, פרוטוקול טרנספורמציה כימית יעיל ונוח עבור י lipolytica Po1g זן תואר במחקר זה. השימוש-4000 PEG מהווה גורם קריטי עבור טרנספורמציה המוצלחת של זן זה. אין transformants התקבלו לטרנספורמציה פלסמיד בעת שימוש PEG-3350 (עבור הטרנספורמציה של cerevisiae ס) במקום PEG-4000. בנוסף, הכנת תאים מוסמכים באמצעות תאים מוכנים טרי נדרשה כדי להשיג יעילות שינוי גבוהה בנימה זו. שנית, כדי להפחית רקומבינציה שאינו הומולוגיים ואירועי שילוב אקראי באמצעות NHEJ הדומיננטי זן זה, שיטת שינוי יעילה הועסקה מכן לבנות את KU70 מוטציה בנוקאאוט. שלישית, כדי לשפר את היעילות של החלפת גנים על ידי רקומבינציה הומולוגי, ארוך איגוף הנשק (1 KB) במעלה או במורד הזרם של גני המטרה שמש קלטות מחיקת גן. האזורים ההומולוגיים ארוכת האיגוף של קלטות השיבוש חיוניים הומולוגי יעילה זן זה. אין מושבות חיוביות התקבלו כאשר באמצעות קלטות שיבוש עם 50 נ"ב אזורים הומולוגיים (מספיק עבור הומולוגיים יעילים cerevisiae ס). באמצעות כל האסטרטגיות הללו, גן KU70 של י ' זן lipolytica Po1g נמחק בהצלחה. אף על פי כן, זה מאוד קשה להשיג את המתח בנוקאאוט KU70 בשל שיעור גבוה מאוד של רקומבינציה שאינו הומולוגי ב י זן lipolytica Po1g. יש להקפיד בעת טיפול B hygromycin האנטיביוטי המכיל תקשורת כמו B hygromycin רגיש לאור. שימוש בחומרים עם B hygromycin המושפל יגרום pos שוואitives ב 2.2.1 צעדי 2.2.2 וגם שלילי שווא בשלב 2.2.7.

כאשר זן מחיקת KU70 שמש ליצור מחיקה ממוקדת של גנים בודדים קידוד דהידרוגנאז אלכוהול מונואמין אלכוהול, שיעור מחיקה הרבה יותר גבוה הושג לעומת המחיקה של גן KU70. זה מוכיח כי השימוש של זן פלטפורמת מחיקת KU70 ביאה לעלייה דרמטית בתדירות הומולוגית. לאחר הנפקת שיעור הומולוגי נמוך מאוד טופלה, הקרנת י מוטציות בגן יחיד בנוקאאוט lipolytica הייתה האיצו מאוד. כן ציינו כי אורך 1 kb של אזור ההומולוגי היה יעיל מספיק למחיקת גן ממוקדת. גידול בתדירות הומולוגית יכול להיות מושגת כאשר באמצעות רצפים הומולוגיים יותר (2 KB). יש לציין, הגנים האלה לקודד דהידרוגנאז אלכוהול מונואמין אלכוהול, אלה מאיצים את ההמרה ההפיכה בין כהלים ו תלדehydes. המחיקות של הגנים האלה יכולים לגרום להצטברות מוגברת של דלקים ביולוגיים ושל תרכובות ביוכימיות כולל חומצות שומן קצרות שרשרת, חומצות שומן בינוני-שרשרת, חומצות שומן ארוכות שרשרת, חומצות שומן הידרוקסי, כהלים, אלדהידים ושומנים. מחקרים נוספים יבוצעו לאמת את האפשרות הזאת.

שיטת שיבוש גנטי בתיווך PCR דווחה י lipolytica Po1d זן 28. עם זאת, שיטה זו היא מייגע זמן רב. מגבלה עיקרית אחת של שיטה זו היא הקושי להשיג כמויות מספיקות של קלטות מחיקת גן ניסוי שינוי אחד. מגבלה נוספת היא כי שיטה זו מוגבלת על מנת לסמן את URA3. השיטה המתוארת במחקר זה במיוחד סוגיות אלה בטכניקה המבוססת PCR ידי שילוב גישת עיכול-הקשירה ומערכת Cre / LoxP. שיטה זו מאפשרת את השימוש של סמנים אנטיביוטיקה auxotrophic שונים ובכך הוא יותר ולהיפךאָרִיחַ. זה יכול להקל על מחיקת גן מהירה י זן lipolytica Po1g. אנו בזאת להציג תיאור מפורט של אסטרטגית המחיקה חד הגן הממוקד באמצעות רקומבינציה הומולוגי י תאי lipolytica Po1g. עם זאת, אתר LoxP אחד נשאר כמו צלקת בתוך הגנום לאחר חילוץ הסמן המוצלח (איור 4). למחיקת מספר-גן, צלקות LoxP מרובות המוכנסים הגנום וזה עלול לגרום לאי-יציבות גנומית בשל אירועי רקומבינציה פוטנציאל שיכול להתרחש בין אתרי LoxP. עם זאת, זני בנוקאאוט נבנו במחקר זה הראה יציבות גנטית טובה מאוד, המציין כי אירועי רקומבינציה לא מכוונים לא עלו בין אתרי LoxP.

לסיכום, פרוטוקול שינוי גנטי יעיל הוקם עבור י זן lipolytica Po1g. המחיקות הממוקדות של גנים בודדים בנימה זו הודגמו בתור הוכחה של קונספט. ה- Y. lipolytica Po1g KU70 זן פלטפורמה מחיקה נבנה במחקר זה הראה תדירויות הומולוגיות מאוד יעילות, המאפשר הקרנה קלה ומהירה של מחיקות הגן הממוקדות. לפיכך, זן פלטפורמה זו מספק מערכת יעילה יותר בחירה טובה יותר עבור יישומים בהנדסת מסלול ואופטימיזציה זן בעת ​​בניית מוטנטים מחיקה כרומוזומליות אחר. המתודולוגיה המתוארת לבין זן מחיקת KU70 נבנה יכולים לחול גם על החדרת גנים לתוך יעד לוקוסים ספציפיים ויצירת מוטציות ספציפי אתר לתוך הגנום.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

אנו בתודה להכיר תמיכת המימון מהסוכנות להגנת הסביבה הלאומית של סינגפור (ETRP 1,201,102), תכנית המחקר התחרותית של הקרן הלאומית למחקר של סינגפור (NRF-CRP5-2009-03), הסוכנות למדע, טכנולוגיה ומחקר של סינגפור ( 1324004108), גלובל מו"פ פרויקט תכנית, משרד כלכלת ידע, הרפובליקה של קוריאה (N0000677), סוכנות הפחתת איום הביטחון (DTRA, HDTRA1-13-1-0037) ואת הביולוגיה הסינטתית היוזמת של האוניברסיטה הלאומית של סינגפור ( DPRT / 943/09/14).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent/Material
Oligonucleotide primers Integrated DNA Technologies 25 nmole DNA oligos
Y. lipolytica strain Po1g Yeastern Biotech leucine auxotrophic derivative of the wild-type strain W29 (ATCC 20460)
Vector pYLEX1 Yeastern Biotech FYY203-5MG Y. lipolytica expression vector
E. coli TOP10 Invitrogen For cloning and propagation of plasmids
pGEM-T vector  Promega A3600 TA cloning vector
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen 27106 For plasmid isolation
Wizard SV Gel and
PCR Clean-Up System		 Promega A9282 Extract DNA fragments from agarose gels
and purify PCR products from an amplification reaction
The iProof high-fidelity
DNA polymerase		 Bio-Rad 172-5302 High-fidelity DNA polymerase
BamHI  New England Biolabs R0136S Restriction enzyme
BglII  New England Biolabs R0144L Restriction enzyme
KpnI New England Biolabs R0142S Restriction enzyme
NdeI  New England Biolabs R0111S Restriction enzyme
NotI New England Biolabs R0189L Restriction enzyme
PmlI New England Biolabs R0532S Restriction enzyme
PstI  New England Biolabs R0140S Restriction enzyme
SacII New England Biolabs R0157S Restriction enzyme
SalI New England Biolabs R0138S Restriction enzyme
XhoI New England Biolabs R0146L Restriction enzyme
T4 DNA ligase New England Biolabs M0202L
Taq DNA polymerase  Bio-Rad M0267L
Ampicillin Gibco-Life Technologies 11593-027 Antibiotics
Hygromycin B PAA P21-014 Antibiotics
GeneRuler 1 kb DNA ladder Thermo Scientific SM0312 1 kb DNA ladder
PEG4000 Sigma 95904-F
Tris Promega H5135
EDTA Bio-Rad 161-0729
Salmon Sperm DNA Invitrogen 15-632-011
Lithium Acetate Sigma
Acetic acid Sigma
Glass beads (425-600 µm) Sigma G8772
RNAse A Thermo Scientific EN0531
DNA Loading Dye Thermo Scientific R0611
Bacto Yeast Extract BD 212750
Bacto Peptone BD 211677
D-Glucose 1st Base BIO-1101
YNB without amino acids Sigma Y0626
DO Supplement-Leu Clontech 630414
Glycerol Sigma G5516
Difco LB Broth BD 244620
Difco LB Agar BD 244520
Bacto Agar BD 214010
Equipment
PCR machine Biorad T100 Thermal Cycler
Water bath Memmert WNB 14
Stationary/Shaking Incubator Yihder LM-570RD
Thermo-shaker Allsheng MS-100
Micro centrifuge Eppendorf 5424R
Centrifuge Eppendorf 5810R
Spectrophotometer Eppendorf  BioPhotometer plus
Gel imager GE Amersham Imager 600

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jiménez-Bremont, J. F., Rodrìguez-Hernández, A. A., Rodrìguez-Kessler, M. Development and dimorphism of the yeast Yarrowia lipolytica. Dimorphic fungi: Their importance as models for differentiation and fungal pathogenesis. J, R. uiz-H. errera , 58-66 (2012).
  2. Coelho, M., Amaral, P., Belo, I. Yarrowia lipolytica: an industrial workhorse. Current research, technology and education topics in applied microbiology and microbial biotechnology. Méndez-Vilas, A. , 930-940 (2010).
  3. Martinez-Vazquez, A., et al. Identification of the transcription factor Znc1p, which regulates the yeast-to-hypha transition in the dimorphic yeast Yarrowia lipolytica. Plos One. 8 (6), e66790 (2013).
  4. Richard, M., Quijano, R. R., Bezzate, S., Bordon-Pallier, F., Gaillardin, C. Tagging morphogenetic genes by insertional mutagenesis in the yeast Yarrowia lipolytica. J. Bacteriol. 183 (10), 3098-3107 (2001).
  5. Flores, C. L., Martìnez-Costa, O. H., Sánchez, V., Gancedo, C., Aragòn, J. J. The dimorphic yeast Yarrowia lipolytica possesses an atypical phosphofructokinase: characterization of the enzyme and its encoding gene. Microbiology. 151 (5), 1465-1474 (2005).
  6. Domìnguez, Á, et al. Non-conventional yeasts as hosts for heterologous protein production. Int. Microbiol. 1 (2), 131-142 (1998).
  7. Zinjarde, S. S. Food-related applications of Yarrowia lipolytica. Food Chem. 152, 1-10 (2014).
  8. Finogenova, T., Morgunov, I., Kamzolova, S., Chernyavskaya, O. Organic acid production by the yeast Yarrowia lipolytica: a review of prospects. Appl. Biochem. Micro+. 41 (5), 418-425 (2005).
  9. Groguenin, A., et al. Genetic engineering of the β-oxidation pathway in the yeast Yarrowia lipolytica to increase the production of aroma compounds. J. Mol. Catal. B-Enzym. 28 (2), 75-79 (2004).
  10. Meng, X., et al. Biodiesel production from oleaginous microorganisms. Renew. Energ. 34 (1), 1-5 (2009).
  11. Papanikolaou, S., Aggelis, G. Lipid production by Yarrowia lipolytica growing on industrial glycerol in a single-stage continuous culture. Bioresource Technol. 82 (1), 43-49 (2002).
  12. Tai, M., Stephanopoulos, G. Engineering the push and pull of lipid biosynthesis in oleaginous yeast Yarrowia lipolytica for biofuel production. Metab. Eng. 15, 1-9 (2013).
  13. Liu, H. H., Ji, X. J., Huang, H. Biotechnological applications of Yarrowia lipolytica: Past, present and future. Biotechnol. Adv. 33 (8), 1522-1546 (2015).
  14. Liu, L., Alper, H. S. Draft genome sequence of the oleaginous yeast Yarrowia lipolytica PO1f, a commonly used metabolic engineering host. Genome Announc. 2 (4), e00652-e00614 (2014).
  15. Dujon, B., et al. Genome evolution in yeasts. Nature. 430 (6995), 35-44 (2004).
  16. Chen, D. C., Beckerich, J. M., Gaillardin, C. One-step transformation of the dimorphic yeast Yarrowia lipolytica. Appl. Microbial. Biotechnol. 48 (2), 232-235 (1997).
  17. Wang, J. H., Hung, W., Tsai, S. H. High efficiency transformation by electroporation of Yarrowia lipolytica. J. Microbiol. 49 (3), 469-472 (2011).
  18. Matsuoka, M., et al. Analysis of regions essential for the function of chromosomal replicator sequences from Yarrowia lipolytica. Mol. Gen. Genet. 237 (3), 327-333 (1993).
  19. Kretzschmar, A., et al. Increased homologous integration frequency in Yarrowia lipolytica strains defective in non-homologous end-joining. Curr. Genet. 59 (1-2), 63-72 (2013).
  20. Lorenz, T. C. Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies. J. Vis. Exp. (63), e3998 (2012).
  21. Kobs, G. Cloning blunt-end DNA fragments into the pGEM-T Vector Systems. Promega Notes. 62, 15-18 (1997).
  22. JoVE Science Education Database. Isolating Nucleic Acids from Yeast. Essentials of Biology 1: yeast, Drosophila and C. elegans. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: http://www.jove.com/science-education/5096/isolating-nucleic-acids-from-yeast (2016).
  23. Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques: plating methods. J. Vis. Exp. (63), e3064 (2012).
  24. Hegemann, J. H., Heick, S. B. Delete and repeat: a comprehensive toolkit for sequential gene knockout in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Methods Mol. Biol. 765, 189-206 (2011).
  25. Yamane, T., Sakai, H., Nagahama, K., Ogawa, T., Matsuoka, M. Dissection of centromeric DNA from yeast Yarrowia lipolytica and identification of protein-binding site required for plasmid transmission. J. Biosci. Bioeng. 105 (6), 571-578 (2008).
  26. McGinnis, S., Madden, T. L. BLAST: at the core of a powerful and diverse set of sequence analysis tools. Nucleic Acids Res. 32 ((Web Server issue)), W20-W25 (2004).
  27. Madzak, C., Tréton, B., Blanchin-Roland, S. Strong hybrid promoters and integrative expression/secretion vectors for quasi-constitutive expression of heterologous proteins in the yeast Yarrowia lipolytica. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 2 (2), 207-216 (2000).
  28. Nicaud, J. M., Le Clainche, A., Le Dall, M. T., Wang, H., Gaillardin, C. Yarrowia lipolytica, a yeast model for the genetic studies of hydroxy fatty acids biotransformation into lactones. J. Mol. Catal. B-Enzym. 5 (1), 175-181 (1998).

Tags

גנטיקה גיליון 115 Bioengineering גיליון שמרים לא קונבנציונליים, שינוי גנטי מחיקת גן מניפולציה גנטית הומולוגי הצלה סמן
הנדסה גנטית של שמרים לא קונבנציונליים עבור Biofuel מתחדשת והפקה ביוכימיים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yu, A. Q., Pratomo, N., Ng, T. K.,… More

Yu, A. Q., Pratomo, N., Ng, T. K., Ling, H., Cho, H. S., Leong, S. S. J., Chang, M. W. Genetic Engineering of an Unconventional Yeast for Renewable Biofuel and Biochemical Production. J. Vis. Exp. (115), e54371, doi:10.3791/54371 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter