Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Genetic Engineering av en ukonvensjonell gjær for fornybar Biodrivstoff og biokjemiske Produksjon

Published: September 20, 2016 doi: 10.3791/54371
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2,3, 1,2
1Department of Biochemistry, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, 2NUS Synthetic Biology for Clinical and Technological Innovation (SynCTI), Life Sciences Institute, National University of Singapore, 3Food Science and Chemical Engineering, Singapore Institute of Technology

Abstract

Yarrowia lipolytica er en ikke-patogene, dimorfe og strengt aerobe gjær arter. På grunn av sin karakteristiske fysiologiske funksjoner og metabolske egenskaper, er denne ukonvensjonelle gjær ikke bare en god modell for studiet av den grunnleggende natur av sopp differensiering, men er også en lovende mikrobiell plattform for biokjemisk produksjon og forskjellige bioteknologiske anvendelser som krever omfattende genetiske manipulasjoner. Men, genetiske manipulasjoner av Y. lipolytica har vært begrenset på grunn av mangel på en effektiv og stabil genetisk transformasjon system samt svært høy forekomst av ikke-homolog rekombinasjon som kan hovedsakelig tilskrives KU70 genet. Her rapporterer vi en enkel og hurtig protokoll for effektiv genetisk transformasjon og for genet delesjon i Y. lipolytica Po1g. Først, en protokoll for effektiv omforming av eksogent DNA inn i Y. lipolytica Po1g ble etablert. Second, for å oppnå forbedret dobbel-crossover homolog rekombinasjon hastighet for ytterligere sletting av målgener ble KU70 genet slettet ved å transformere et avbrudd kassett bærer 1 kb homologi armer. Tredje, for å demonstrere den forbedrede genet sletting effektivitet etter sletting av KU70 genet, vi individuelt slettet 11 mål gener som koder alkohol dehydrogenase og alkoholoksidase bruke de samme prosedyrer på belastningen KU70 knockout-plattformen. Det ble observert at frekvensen av homolog rekombinasjon nøyaktig økt betraktelig, fra mindre enn 0,5% for sletting av KU70 genet i Po1g til 33% -71% for enkelt gen sletting av de 11 målgener i Po1g KU70 Δ. En replikative plasmid som bærer hygromycin B resistens markør og den Cre / loxP-systemet ble konstruert, og den seleksjonsmarkør-genet i gjær knockout-stammer ble til slutt fjernet ved ekspresjon av Cre rekombinase for å legge til rette for av flere runder med TARGEted genetiske manipulasjoner. De resulterende single-genet sletting mutanter har potensielle bruksområder i biobrensel og biokjemisk produksjon.

Introduction

I motsetning til Saccharomyces cerevisiae, Yarrowia lipolytica, en ukonvensjonell gjær, kan vokse i form av gjær eller mycel i respons på endringer i miljøforhold 1,2. Således kan dette dimorf gjær benyttes som en god modell for studiet av sopp differensiering, morfogenese og taksonomi 3,4,5. Det er generelt ansett som en trygg (GRAS) gjær arter, som er mye brukt til å produsere en rekke tilsetningsstoffer som for eksempel organiske syrer, polyalkoholer aroma forbindelser, emulgatorer og tensider 6,7,8,9. Det er en obligat aerob og en velkjent oljeaktige gjær er i stand til å akkumulere naturlig lipider ved høye mengder, dvs. opp til 70% av celletørrvekt 10. Det kan også benytte et bredt spekter av karbonkilder for vekst, inkludert forskjellige typer rester i avfalls ressurser som næringsstoffer 11,12,13. Alle disse unike egenskapene gjør Y. lipolytica svært attraktive forulike bioteknologiske applikasjoner.

Selv om hele genomsekvens av Y. lipolytica har blitt publisert 14,15, genetisk manipulering av denne ukonvensjonelle gjær er mer komplisert enn andre gjærarter. For det første transformasjon av denne gjærarter er mye mindre effektiv på grunn av fraværet av en stabil og effektiv genetiske transformasjonssystem 16,17. For det andre er arbeidskrevende genomisk integrering av lineære ekspresjonskassetter som vanligvis anvendes for ekspresjon av gener av interesse som ikke naturlig episomale plasmid-systemet har blitt funnet i denne gjær 18. Tredje, generering av genetiske knock-outs og knock-ins er begrenset fordi genet targeting effektivitet via nøyaktig homolog rekombinasjon i denne gjæren er lav og de fleste integrering hendelser oppstår gjennom ikke-homolog ende bli (NHEJ) 19.

I denne studien rapporterer vi en optimalisert transformasjon protokoll for Y. lipolytica KU70-genet, som koder for et viktig enzym i reaksjonsveien NHEJ. Ved hjelp av optimalisert transformasjon protokollen og transformere en lineær knockout kassett som inneholder flankerer homologi regioner av 1 kb, den KU70 gen av Y. lipolytica Po1g ble slettet. Robustheten dette genet sletting metodikken ble deretter demonstrert ved å målrette alkohol dehydrogenase og alkohol oksidase gener i Po1g KU70 Δ belastning. Det ble observert at den KU70 stammen slettingen oppviste en betydelig høyere virkningsgrad av homolog rekombinasjon-formidlet gen-targeting enn den til villtype-Po1g belastning. I tillegg ble en replikativ Cre-ekspresjonsplasmid som bærer hygromycin B resistens markør konstruert for å utføre markør redning. Markøren redning forenkler flere runder med genet målretting i the fått genet sletting mutanter. Foruten genet sletting, kan vår protokoll for genetisk transformasjon og genet sletting beskrevet her brukes for å sette inn gener til bestemte loci, og å innføre stedsspesifikke mutasjoner inn i Y. lipolytica genom.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. generasjon Y. lipolytica KU70 Sletting Strain

  1. Byggingen av avbrudd kassett
    NB: Se tabell 1 for alle primerne anvendt i polymerase kjedereaksjon (PCR) amplifikasjoner.
    1. Design primere 20 for PCR amplifisere LEU2 ekspresjonskassetten (se tabell 1) fra en Y. lipolytica ekspresjonsvektor og innføre loxP-seter i 5'- og 3'-endene av den LEU2 kassetten med en lang forover primer (# 1, tabell 1) og en lang revers primer (# 2, tabell 1), henholdsvis. Å innføre en ekstra restriksjonssete for de påfølgende trinnene i kloning prosessen, legger en Bam HI restriksjonssete i primer # 1.
    2. Utføre PCR ved anvendelse av en Hi-Fi-DNA-polymerase som beskrevet i tabell 2.
    3. Rense PCR produktet loxP-promoter-LEU2-terminator-loxP kassett ved hjelp av en PCR purification kit i henhold til produsentens instruksjoner. Legg 3'-A overheng til det rensede PCR produkt i henhold til produsentens instruksjoner 21. Bruk T4 DNA-ligase for å ligere den A-tailed PCR-produkt inn i en TA-kloningsvektor for å gi plasmid T-LEU2 i henhold til tabell 3.
    4. PCR amplifisere 1 kb 5 'oppstrøms sekvensen til KU70-genet ved bruk av primerne # 3 / # 4 fra Y. lipolytica Po1g genomisk DNA 22 pr Tabell 2. Renser PCR produktet ved hjelp av en PCR rensing kit i henhold til produsentens instruksjoner.
      1. Dobbelt fordøye både det rensede PCR-produktet og T-LEU2 plasmid med Sac II og Bam HI-enzymer som per Tabell 4. Rens det fordøyelse blandingen ved hjelp av en PCR-rensesett i henhold til produsentens instruksjoner. Bruke T4 DNA-ligase for å ligere renset og spaltet PCR-produktet til Sac II / Bam HI-stedene i T-LEU2, hvilket gaplasmid T-LEU2-5E som per tabell 3.
    5. PCR amplifisere 1 kb 3 'nedstrøms sekvensen til KU70-genet ved bruk av primerne # 5 / # 6 fra Y. lipolytica Po1g genomisk DNA 22 pr Tabell 2. Renser PCR produktet ved hjelp av en PCR rensing kit i henhold til produsentens instruksjoner. Dobbelt fordøye både renset PCR produkt og T-LEU2-5E plasmid med Not I og NdeI enzymer som per Tabell 4.
      1. Rens fordøyelsen blanding ved hjelp av en PCR rensing kit i henhold til produsentens anvisninger. Deretter ligate renset og spaltet PCR-produktet til Notl / Ndel-setene av T-LEU2-5E for å gi plasmid T-KO ved anvendelse av T4 DNA-ligase i henhold til tabell 3.
    6. Fordøye plasmid T-KO med Sac II og NdeI enzymer som per tabell 4 for å produsere avbrudd kassetten (figur 1
  2. Kompetent celle forberedelse og transformasjon av Y. lipolytica Po1g belastning
    1. Kompetent cellepreparat
      1. Vaksinere en koloni av Y. lipolytica Po1g stamme fra en frisk gjærekstrakt-pepton-glukose (YPD) plate i 10 ml YPD-medium (1% gjærekstrakt, 2% pepton, 2% dekstrose og 50 mM citratbuffer pH 4,0) i en 100 ml kolbe. Inkuber i en 30 ° C risteinkubator ved 225 rpm i 20 timer inntil metning (en OD 600 på omtrent 15, målt ved anvendelse av et spektrofotometer).
      2. Pellet cellene ved sentrifugering i 5 minutter ved 5000 xg ved romtemperatur. Vask cellene med 20 ml Tris-EDTA (TE) buffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7,5), og pellet cellene som beskrevet i trinn 1.2.1.2. Resuspender cellene i 1 ml 0,1 M litiumacetat (pH 6,0, justert med eddiksyre), og inkuber i 10 min ved værelses tempetemperaturen.
      3. Alikvot de kompetente celler (100 ul) i sterile 1,5 ml rør. Fortsett til transformasjon trinnene nedenfor umiddelbart, eller legge glyserol til en sluttkonsentrasjon på 25% (v / v) og oppbevar ved -80 ° C for langtidslagring.
    2. Transformation
      1. Bland forsiktig 10 ul av denaturert laksesperm DNA (10 mg / ml) og 1-5 mikrogram av det rensede avbrytelseskassett sammen med 100 ul kompetente celler, og inkuber ved 30 ° C i 15 min.
      2. Legg 700 ul av 40% polyetylenglykol (PEG) -4000 (oppløst i 0,1 M litiumacetat pH 6,0), bland godt og inkuber i en 30 ° C risteinkubator ved 225 rpm i 60 min.
        Merk: Det er viktig å bruke PEG med en gjennomsnittlig molekylvekt på 4000, i stedet for PEG-3350 (typisk anvendt i transformasjonen av konvensjonelle gjær).
      3. Varmesjokktransformasjonsblandingen ved å plassere røret i et 39 ° C vannbad i 60 min.
      4. Tilsett 1 ml YPD medium ogkomme i 2 timer ved 30 ° C og 225 rpm. Sentrifuger ved 9000 x g i 1 min ved romtemperatur, fjern supernatanten og resuspender pelleten i 1 ml TE-buffer.
      5. Repellet cellene ved sentrifugering ved 9000 x g i 1 min ved romtemperatur og kast supernatanten. Resuspender pelleten i 100 pl TE-buffer og plate på selektive skåler (f.eks, leucin-manglende plater), og inkuber ved 30 ° C i 2-3 dager.
      6. Plukk 4 til 10 enkeltkolonier og vaksinere seg inn i 2 ml YPD medium. Inkuber over natten i en 30 ° C risteinkubator ved 225 rpm. Identifisere positive kolonier ved PCR-analyse av genomisk DNA fra transformantene 22 som angitt i tabell 5 ved bruk av to sett av primere # 55 / # 56 og # 56 / # 57, henholdsvis.
        Merk: Ikke jeg linearisert pYLEX1 vektor er forvandlet til Y. lipolytica Po1g kompetente celler for å bestemme den transformasjonseffektiviteten ved å telle antalletav kolonidannende enheter (cfu) pr ug plasmid-DNA som anvendes 23.

2. Marker Rescue

  1. Byggingen av Cre ekspresjonsplasmidet
    1. Bygging av pYLEX1-CRE og pYLEX1-HPH
      1. Design primere 20 for PCR-amplifisere de åpne leserammer av cre og HPH. Legge til en ekstra adenin-nukleotid oppstrøms for startkodonene i de fremre primere # 82 og # 84, og sette inn Kpn I restriksjonsseter nedstrøms fra stoppkodonene i revers primere # 83 og # 85. PCR amplifisere de åpne leserammer og cre HPH fra pSH69 (tiltredelse antall HQ412578) 24 pr Tabell 2.
      2. Rens både cre og HPH fragmenter ved hjelp av en PCR rensing kit i henhold til produsentens instruksjoner. Digest både renset Grobunn og HPH fragmenter med Kpnl enzymet som per Table fire. Dobbel fordøye pYLEX1 plasmid med PML I og Kpnl enzymer som per Tabell 4. Rens fordøyelsen blanding ved hjelp av en PCR rensing kit i henhold til produsentens anvisninger.
      3. Bruk T4 DNA ligase pr Tabell 3 for å ligere de rensede og fordøyd Grobunn og HPH fragmenter til PML I / Kpn I områder av Y. lipolytica ekspresjonsvektor, hvilket ga pYLEX1-CRE og pYLEX1-HPH, respektivt.
    2. Bygging av pSL16-CRE-HPH
      1. PCR-amplifisere den promoter-gen-terminator kassett av cre fra pYLEX1-CRE bruk av primerne # 86 / # 87 flankerer Sall / Pstl-restriksjonssetene som angitt i tabell 2. Rens det PCR-produktet ved å bruke en PCR-rensesett ifølge fabrikantens instruksjoner .
        1. Dobbelt fordøye både den rensede PCR-produktet og pSL16-CEN1-1 (227) plasmid 25 med Sall ogPst I enzymer som per Tabell 4. Rens fordøyelsen blanding ved hjelp av en PCR rensing kit i henhold til produsentens anvisninger. Deretter ligate renset og fordøyd PCR produktet inn pSL16-CEN1-1 (227) på de tilsvarende områder for å skape pSL16-CRE hjelp T4 DNA ligase som per tabell 3.
      2. PCR-amplifisere den promoter-gen-terminator kassett av HPH fra pYLEX1-HPH bruk av primerne # 88 / # 89 flankerer Xhol / Bgl II-restriksjonssetene som angitt i tabell 2. Rens det PCR-produktet ved å bruke en PCR-rensesett ifølge fabrikantens instruksjoner .
        1. Dobbelt fordøye både renset PCR produkt og pSL16-CRE plasmid med Xho I og Bgl II enzymer som per Tabell 4. Rens fordøyelsen blanding ved hjelp av en PCR rensing kit i henhold til produsentens anvisninger. Deretter ligate renset og spaltet PCR-produkt inn i pSL16-CRE ved den tilsvarendeområder å generere pSL16-CRE-HPH hjelp T4 DNA ligase som per tabell 3.
          Merk: Den resulterende Cre uttrykk plasmid, pSL16-CRE-HPH, havner en valgbar hygromycin B markør og er en centromeric og episomally replikerende vektor (figur 2).
      3. Kontroller alle konstruksjoner av fordøyelsen med passende restriksjonsenzymer (f.eks Sal I / Pst jeg, å skjære innsatsen fra vektor) som per Tabell 4.
  2. Cre rekombinase-mediert markør redning
    1. Transform pSL16-CRE-HPH til kompetente celler av KU70 knockout belastningen følgende transformasjon protokoll beskrevet i punkt 1.2 ovenfor. Plate transformerte celler bort på YPD pluss hygromycin B (YPDH) plater (inneholdende 400 ug / ml hygromycin B), og inkuber ved 30 ° C i 2-3 dager.
    2. Utfør koloni PCR som per tabell 5 ved hjelp av primere # 84 / # 85 for å identifisere positivekolonier som inneholder pSL16-CRE-HPH plasmid etter transformasjon.
      Merk: forover primer # 84 og den reverse primer # 85 er plassert inne i den kodende region av hph-genet (Tabell 1). Kun positive kloner generere et spesifikt PCR-produkt i PCR-reaksjonen.
    3. Plukk en positiv klon og vaksinere i 2 ml YPDH medium, og inkuberes i en 30 ° C risteinkubator ved 225 rpm over natten til metning. Mål cellen OD 600 med et spektrofotometer. Høste celler ved en OD 600 av ~ 15. Sentrifuger ved 5000 xg i 5 min ved romtemperatur, og vaskes en gang med 2 ml sterilt vann.
    4. Re-inokuler celler i 2 ml YPD-medium med en initiell OD 600 på 0,1 og la cellene vokse i en 30 ° C risteinkubator ved 225 rpm over natten. Strek over natten cellekultur på YPD plater for å isolere enkeltkolonier 23. Replica plate kolonier bort på YPD, YPDH og leucin-mangelfull plater 23 Merk: Colonies som har mistet både LEU2 markør og pSL16-CRE-HPH plasmid kan bare vokse på YPD plater (figur 3).

3. Sletting av alkoholdehydrogenase og alkoholoksidase Genes

  1. Utfør et søk på Y. lipolytica genom databasen ved hjelp av Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) for å identifisere genet kandidater for sletting 26. Input proteinsekvensen av S. cerevisiae alkohol dehydrogenase jeg inn BLAST søkeverktøy (http://www.genome.jp/tools-bin/search_sequence?prog=blast&db=yli&seqid=aa).
    Merk: BLAST søkeverktøyet returnerer de tilsvarende proteinsekvenser i Y. lipolytica genom database.
  2. Konstruer sletting kassettene ved PCR med primere # 7 til # 56 (tabell 1), og utføre restriksjonsenzymdigestion og ligation reaksjoner ved hjelp av de samme metodene som er beskrevet i punkt 1.1 ovenfor.
  3. preper kompetente celler av KU70 knockout-stammen, for å utføre transformasjoner og utføre PCR for å identifisere positive kolonier med primere # 55, # 58 og # 81 (tabell 1) ved å følge den protokoll som er beskrevet i avsnitt 1.2 ovenfor.
    Merk: Som et eksempel er fremgangsmåten for den YALI0E17787g genet delesjon som er beskrevet i figurene 4 og 5. Effektene av 1 kb og 2 kb lang homolog region på homolog rekombinasjon hastighet er rapportert.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Det lineariserte Y. lipolytica ekspresjonsvektor ble innsatt i pBR forankringsplattform i genomet av Y. lipolytica Po1g belastningen ved å utføre en enkelt crossover rekombinasjon 27. Ved hjelp av rask kjemisk transformasjon prosedyre etablert i denne studien, det lineariserte Y. lipolytica ekspresjonsvektor ble vellykket transformert inn i villtype-stamme Po1g ved en transformasjonseffektivitet på> 100 cfu / ug DNA. En knockout kassett flankert av en kb homologe sekvenser ble forvandlet til Po1g belastning og KU70 genet ble slettet (figur 1). Her innbefatter den fremre primer # 56 hybridiserer til sekvensen som befinner seg innenfor 5 'homologi armen til KU70 genet. Det motsatte primer # 55 er plassert inne i kodingen regionen i LEU2 markør. Det motsatte primer # 57 er plassert inne i kodingen regionen i KU70 genet. Hvordannoensinne, av over 200 kolonier, var bare en positiv koloni med den slettede KU70 genet observert, noe som tyder på en svært lav genet sletting rate (<0,5%). Deretter ble en replikerende plasmid som bærer hygromycin B resistens markør og Cre / loxP system konstruert (figur 2), og det seleksjonsmarkørgen i KU70 knockout-stammen ble til slutt fjernet ved ekspresjon av Cre rekombinase (figur 3). Ved hjelp av BLAST søk verktøyet ble elleve mulige alkohol-dehydrogenase-gener og en alkohol-oksydase-genet identifisert i Y. lipolytica genom. Den antatte alkohol dehydrogenase gener er YALI0E17787g, YALI0D25630g, YALI0A16379g, YALI0E15818g, YALI0D02167g, YALI0A15147g, YALI0E07766g, YALI0F09603g, YALI0B10175g, YALI0F08129g, YALI0E07810g. Den antatte alkoholoksidase-gen er YALI0B14014g. Hvis du vil kontrollere økningen av genet sletting sats etter sletting av KU70 genet, vi individuelt slettet 11 gener i parallell (unntattfor YALI0A16379g) ved hjelp av avbrudd kassetter med lange homologe sekvenser i Y. lipolytica KU70 knockout stamme (figur 4 og 5). Her, de fremre primere (P1-P2 og F-F) gløding til sekvensen som ligger innenfor 5 'homologi arm av målgener. Den reverse primere (P1-R) er plassert inne i den kodende region av LEU2 markør. Den reverse primere (P2-R) er plassert inne i den kodende region av målgener (figur 4). Knock-out kassetter skiller seg bare litt i lengdene av de homologe sekvenser og restriksjonssetene (tabell 1). Gene delesjons grad [homolog rekombinasjon / (homolog rekombinasjon + ikke-homolog rekombinasjon)] på 33% -71% ble oppnådd, hvilket antyder en dramatisk økning i den målrettede homolog rekombinasjon frekvens over KU70-genet delesjon. For eksempel, delesjon hastighet på YALI0E17787g var 40% (~ 100 cfu / ug DNA). Dessuten, Muligheten for ytterligere økning i genet delesjon hastigheten ble undersøkt når lange homologe sekvenser ble anvendt. Det viste at YALI0E17787g genet avbrudd kassett med to kb homologe sekvenser ga en sletting sats på 87,5% (~ 400 cfu / ug DNA). I tillegg ble det innført seleksjonsmarkørgen LEU2 i de oppnådde delesjonsmutanter fjernet ved å transformere vektoren pSL16-CRE-HPH (hp4d- CRE, HPH), og dermed muliggjør flere runder av målrettede gen-manipulering.

Figur 1
Figur 1. Byggingen av KU70 knockout kassett og KU70 mangel mutant. A. Den KU70 knockout plasmid T-KO. B. Det skjematiske diagram av KU70 knockout kassetten. Oppstrøms og nedstrøms reområder har en (kb) av KU70 genet ble klonet til 5'- og 3'-enden av avbrytelseskassett for homolog rekombinasjon. Den LEU2 ekspresjonskassetten ble satt inn mellom to homologe flankerende sekvenser. C. Gel elektroforese av KU70 sletting kassett etter Sac II og NdeI fordøyelsen fra T-KO. L: 1 kb DNA Ladder; 1: KU70 sletting kassetten (forventet bandet størrelse er 4,3 kb) D.. PCR bekreftelse på KU70 genet sletting i Y. lipolytica Po1g. PCR-produkter ble amplifisert fra genomisk DNA fra transformantene (kolonnene 1-10) og villtypestammen (felt 11). Spor 7 viser en positiv knockout, mens felt 1 viser en falsk positiv. I den øverste gelen, er et fragment på 500 bp oppnådd med primersett # 56 / # 57 og er bare fraværende i felt 1 og 7. I den nedre gel, de vellykkede knockouts genererer et fragment på 750 bp, som oppnås med primer set # 55 / # 56. Than 750 bp bandet er bare sett i lane 7. L:. 1 kb DNA Ladder Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2. Skjematisk fremstilling av Cre recombinase uttrykk plasmid for markør redning. Den episomally replikere plasmid pSL16-CRE-HPH bærer en Cre rekombinase (CRE), en hygromycin B resistens markør (HPH), en ampicillin resistens genet (Amp), en replikasjonsorigo fra Escherichia coli (pMB1), et replikasjonsopprinnelses av Y. lipolytica (ORI1001), en cent DNA-sekvens av Y. lipolytica (CEN1-1) og en lacZ genet som koder for enzymet β-galaktosidase. Klikk her for å se et større version av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. Vekst screening av positive markør-mindre Y. lipolytica stammer etter markør redning. Trans (1-4) ble fortynnet og prikket inn YPD plater, YPDH plater og leucine-mangelfull plater, henholdsvis. Etter 3 dagers vekst ved 30 ° C, positive markør-fri transformantene (1, 3, 4) bare kan vokse på YPD-plate, noe som indikerer at fjerning av LEU2 markørgen ved ekspresjon av Cre rekombinase og tapet av plasmidet pSL16- CRE-HPH A:. YPD plate, B: YPDH plate, C:. leucin-mangelfull plate klikk her for å se en større versjon av dette tallet.


Figur 4. Prinsippskisse av målrettet genet sletting og markør redning prosedyre. Genet avbrudd kassett består av en seleksjonsmarkørgen (LEU2) flankert av to loxP gjenkjenningsseter og to målretting armer (oppstrøms og nedstrøms flankerende sekvenser). Etter transformasjon av avbrudd kassetten inn Y. lipolytica celler, oppstår et gen erstatning hendelsen via dobbel-crossover homolog rekombinasjon innen de to flankerer homologi armene på målrettede locus. To sett av PCR-primere ble brukt for å verifisere integreringen av avbrytelseskassett (P1-F og P1-R) og samtidig delesjon av de målrettede genomiske regioner (P2-F og P2-R). Til slutt blir LEU2 markør fjernes ved ekspresjon av Cre rekombinase, etterlater en enkelt loxP-sete ved kromosomale locus. Målrettet genet sletting og erstatning av YALI0E17787 gene ble vist her som et eksempel. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5
Figur 5. PCR bekreftelse av YALI0E17787 genet avbrudd i Y. lipolytica Po1g. PCR-produkter var amplifisert fra genomisk DNA fra transformantene (kolonnene 1-4) og villtypestammen (felt 5). Baner 1, 2, og 4 illustrerer positive svekkinger, mens spor 3 viser en falsk positiv. I den øverste gel, de vellykkede knockouts genererer et fragment på 750 bp, som oppnås med den primersett P1-F og P1-R. 750 bp båndet er sett i banene 1, 2, og 4, men ikke i feltene 3 og 5. I den nedre gel, er et fragment på 500 bp oppnådd med primersett P2-F og P2-R, og er bare til stede i baner 3 and 5. L:. 1 kb DNA Ladder Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Tabell 1. Primere brukt i denne studien. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

PCR komponent
PCR-materialer volumene Sluttkonsentrasjon konsentrasjon~~POS=HEADCOMP
PCR-buffer 10 ul 1x
dNTP mix 1 mL 200 mikrometer
Forward primer 2,5 mL 500 nM </ Td>
omvendt primer 2,5 mL 500 nM
DNA-polymerase 0,5 ul 1 U
DNA-templat (fortynnet genomisk eller plasmid DNA) 0.5-2 ul 50 ng
sterilt vann opp til 50 ul
PCR-betingelsene
Temperatur Tid Antall sykluser
98 ° C 30 sek 1
98 ° C 10 sek 30
55 ° C 30 sek
72 ° C 30 sek
72 ° C 10 min 1
Utfør PCR forsterkning ved hjelp av en thermal cycler

Tabell 2. PCR oppsett og vilkår for high-fidelity DNA polymerase.

Tabell 3. DNA-ligeringsreaksjonsbetingelser ved bruk av T4 DNA-ligase.

Komponent
materialer Sluttkonsentrasjon konsentrasjon~~POS=HEADCOMP
T4 DNA-ligase Buffer 1x
vektor DNA 0,03 pmol
Sett DNA 0,15 pmol
T4 DNA-ligase 400 U
sterilt vann opp til 20 mL
Forhold
Temperatur Tid
16 ° C 16 timer
<td> 6 hr
Komponent
materialer Sluttkonsentrasjon konsentrasjon~~POS=HEADCOMP
Begrensning fordøyelsen buffer 1x
DNA (Plasmid eller PCR-produkt) 1 mikrogram
1 st restriksjonsenzym 5 U
2. restriksjonsenzym (valgfritt) 5 U
sterilt vann opp til 50 ul
Forhold
Temperatur Tid
37 ° C
Utføre enkelt spaltning med et restriksjonsenzym enkelt
Utføre dobbel fordøyelse med et par av restriksjonsenzymer

Tabell 4. Forhold for restriksjonsenzymoppløsning av DNA.

PCR komponent
PCR-materialer volumene Sluttkonsentrasjon konsentrasjon~~POS=HEADCOMP
PCR-buffer 2,5 mL 1x
dNTP mix 0,5 ul 200 mikrometer
Forward primer 0,5 ul 200 nM
ReveRSE primer 0,5 ul 200 nM
DNA-polymerase 0,2 mL 1 U
DNA-templat (fortynnet genomisk eller plasmid DNA) 0.5-2 ul 50 ng
sterilt vann opp til 25 ul
PCR-betingelsene
Temperatur Tid Antall sykluser
95 ° C 5 min 1
95 ° C 30 sek 30
50 ° C 30 sek
72 ° C 30 sek
72 ° C 10 min 1
Utfør PCR forsterkning ved hjelp av en termosykler
Utføre koloni PCR ved å bruke en koloni som templat, i stedet for en DNA-prøve

Tabell 5. PCR / Colony PCR oppsett og vilkår for Taq DNA polymerase.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vårt mål for denne studien er å muliggjøre rask og effektiv generasjon av målrettede genet knockouts i Y. lipolytica Po1g belastning. Flere hensyn må tas opp for å oppnå dette. Først er en høy transformasjon effektivitet som kreves. Således, en effektiv og enkel kjemisk transformasjon protokoll for Y. lipolytica Po1g stamme ble beskrevet i denne studien. Bruken av PEG-4000 er en kritisk faktor for vellykket transformasjon av denne stammen. Det er ingen transformanter ble oppnådd for plasmid transformasjon ved bruk av PEG-3350 (for transformasjon av S. cerevisiae) i stedet for PEG-4000. I tillegg er fremstillingen av kompetente celler ved hjelp av nylagede celler som kreves for å oppnå høy transformasjonseffektivitet i denne stammen. For det andre, for å redusere ikke-homolog rekombinasjon og tilfeldig integrering hendelser via dominerende NHEJ i denne stamme, ble en effektiv transformasjonsmetoden deretter anvendt for å konstruere KU70 knockout mutant. For det tredje, for å forbedre effektiviteten av generstatning ved homolog rekombinasjon, lang flankerende armer (1 kb) oppstrøms og nedstrøms for de aktuelle gener ble brukt i genet delesjonskassetter. Den lange flankerer homologe regioner i avbrudd kassetter er avgjørende for effektiv homolog rekombinasjon i denne stammen. Ingen positive kolonier ble oppnådd ved bruk av avbrudd kassetter med 50 bp homologe regioner (tilstrekkelige for effektiv homolog rekombinasjon i S. cerevisiae). Ved hjelp av alle disse strategiene, den KU70 gen av Y. lipolytica Po1g belastningen ble slettet. Ikke desto mindre er det ekstremt vanskelig å oppnå den KU70 knockout belastningen på grunn av svært høy grad av ikke-homolog rekombinasjon i Y. lipolytica Po1g belastning. Hensyn må tas ved håndtering av antibiotika hygromycin B inneholder media som hygromycin B er lysfølsom. Ved hjelp av media med degradert hygromycin B vil resultere i falsk positives i trinn 2.2.1 og 2.2.2 og falske negative i trinn 2.2.7.

Når KU70 stammen sjonen ble brukt til å generere målrettet delesjon av individuelle gener som koder for alkohol dehydrogenase og alkohol-oksydase, ble en mye høyere delesjon som oppnås sammenlignet med delesjon av den KU70 genet. Det viser at bruken av KU70 slettingen belastning plattformen resulterte i en dramatisk økning i homolog rekombinasjon frekvens. Etter utstedelsen av svært lav homolog rekombinasjon hastighet var adressert, screening av Y. lipolytica single-genet knockout mutanter ble svært sped opp. Vi har også bemerket at en kb lengde homolog region var effektiv nok for målrettet genet sletting. En økning i homolog rekombinasjon frekvens kan oppnås ved bruk av lengre homologe sekvenser (2 kb). Spesielt er disse gener koder for alkohol dehydrogenase og alkohol-oksydase, som katalyserer den reversible omdannelse mellom alkoholer og aldehydes. Slettingen av disse genene kan føre til økt akkumulering av biobrensel og biokjemiske forbindelser inkludert kortkjedede fettsyrer, middels kjede fettsyrer, langkjedede fettsyrer, hydroksy fettsyrer, alkoholer, aldehyder og lipider. Videre studier vil bli utført for å verifisere denne muligheten.

En PCR-mediert genet avbrudd metoden har blitt rapportert i Y. lipolytica Po1d belastning 28. Imidlertid er denne metoden arbeidskrevende og tidkrevende. En stor begrensning ved denne fremgangsmåten er vanskeligheten med å skaffe tilstrekkelige mengder av genet delesjons kassetter for en transformasjon eksperiment. En annen begrensning er at denne metoden er begrenset til den URA3-markøren. Metoden som beskrives i denne studien spesielt adressert disse problemene i PCR-basert teknikk ved å kombinere den fordøyelse-ligerings tilnærming og den Cre / loxP-systemet. Denne metoden gjør bruk av forskjellige antibiotika og auksotrofe markører, og således er mer versafliser. Det kan lette raske genet sletting i Y. lipolytica Po1g belastning. Vi her presentere en detaljert beskrivelse av målrettet single-genet sletting strategi gjennom homolog rekombinasjon i Y. lipolytica Po1g celler. Det gjenstår imidlertid en loxP området som et arr i genomet etter den vellykkede markør redning (figur 4). I fler genet sletting, er flere loxP arr innført i genomet, og dette kan føre til genomisk ustabilitet på grunn av potensielle rekombinasjon hendelser som kan oppstå mellom loxP nettsteder. Likevel, knockout stammer konstruert i denne studien viste meget god genetisk stabilitet, noe som indikerer at utilsiktede rekombinasjon ikke forekomme mellom loxP nettsteder.

I sammendraget, har en effektiv genetisk transformasjon protokollen er etablert for Y. lipolytica Po1g belastning. Den målrettet sletting av enkeltgener i denne stammen ble demonstrert som et bevis på konseptet. Y. lipolytica Po1g KU70 sletting plattform belastning konstruert i denne studien viste svært effektiv homolog rekombinasjon frekvens, noe som muliggjør en enklere og raskere screening av målrettede genet slettinger. Dermed gir denne plattformen belastningen et mer effektivt system og et bedre valg for applikasjoner i veien engineering og belastning optimalisering når du bygger andre kromosom sletting mutanter. Den beskrevne metode og det konstruerte KU70 belastningen sletting kan også bli brukt til innføring av mål-gener i spesifikke loci og etablering av stedsspesifikke mutasjoner i genomet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Vi erkjenner takknemlig finansieringen støtte fra National Environment Agency of Singapore (ETRP 1.201.102), Konkurranse Research Program av National Research Foundation of Singapore (NRF-CRP5-2009-03), Direktoratet for Science, Technology and Research of Singapore ( 1324004108) Global FoU-prosjektet Program, Ministry of Knowledge Economy, republikken Korea (N0000677), Defense Threat Reduction Agency (DTRA, HDTRA1-13-1-0037) og Syntetisk biologi Initiative av National University of Singapore ( DPRT / 943/09/14).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent/Material
Oligonucleotide primers Integrated DNA Technologies 25 nmole DNA oligos
Y. lipolytica strain Po1g Yeastern Biotech leucine auxotrophic derivative of the wild-type strain W29 (ATCC 20460)
Vector pYLEX1 Yeastern Biotech FYY203-5MG Y. lipolytica expression vector
E. coli TOP10 Invitrogen For cloning and propagation of plasmids
pGEM-T vector  Promega A3600 TA cloning vector
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen 27106 For plasmid isolation
Wizard SV Gel and
PCR Clean-Up System		 Promega A9282 Extract DNA fragments from agarose gels
and purify PCR products from an amplification reaction
The iProof high-fidelity
DNA polymerase		 Bio-Rad 172-5302 High-fidelity DNA polymerase
BamHI  New England Biolabs R0136S Restriction enzyme
BglII  New England Biolabs R0144L Restriction enzyme
KpnI New England Biolabs R0142S Restriction enzyme
NdeI  New England Biolabs R0111S Restriction enzyme
NotI New England Biolabs R0189L Restriction enzyme
PmlI New England Biolabs R0532S Restriction enzyme
PstI  New England Biolabs R0140S Restriction enzyme
SacII New England Biolabs R0157S Restriction enzyme
SalI New England Biolabs R0138S Restriction enzyme
XhoI New England Biolabs R0146L Restriction enzyme
T4 DNA ligase New England Biolabs M0202L
Taq DNA polymerase  Bio-Rad M0267L
Ampicillin Gibco-Life Technologies 11593-027 Antibiotics
Hygromycin B PAA P21-014 Antibiotics
GeneRuler 1 kb DNA ladder Thermo Scientific SM0312 1 kb DNA ladder
PEG4000 Sigma 95904-F
Tris Promega H5135
EDTA Bio-Rad 161-0729
Salmon Sperm DNA Invitrogen 15-632-011
Lithium Acetate Sigma
Acetic acid Sigma
Glass beads (425-600 µm) Sigma G8772
RNAse A Thermo Scientific EN0531
DNA Loading Dye Thermo Scientific R0611
Bacto Yeast Extract BD 212750
Bacto Peptone BD 211677
D-Glucose 1st Base BIO-1101
YNB without amino acids Sigma Y0626
DO Supplement-Leu Clontech 630414
Glycerol Sigma G5516
Difco LB Broth BD 244620
Difco LB Agar BD 244520
Bacto Agar BD 214010
Equipment
PCR machine Biorad T100 Thermal Cycler
Water bath Memmert WNB 14
Stationary/Shaking Incubator Yihder LM-570RD
Thermo-shaker Allsheng MS-100
Micro centrifuge Eppendorf 5424R
Centrifuge Eppendorf 5810R
Spectrophotometer Eppendorf  BioPhotometer plus
Gel imager GE Amersham Imager 600

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jiménez-Bremont, J. F., Rodrìguez-Hernández, A. A., Rodrìguez-Kessler, M. Development and dimorphism of the yeast Yarrowia lipolytica. Dimorphic fungi: Their importance as models for differentiation and fungal pathogenesis. J, R. uiz-H. errera , 58-66 (2012).
  2. Coelho, M., Amaral, P., Belo, I. Yarrowia lipolytica: an industrial workhorse. Current research, technology and education topics in applied microbiology and microbial biotechnology. Méndez-Vilas, A. , 930-940 (2010).
  3. Martinez-Vazquez, A., et al. Identification of the transcription factor Znc1p, which regulates the yeast-to-hypha transition in the dimorphic yeast Yarrowia lipolytica. Plos One. 8 (6), e66790 (2013).
  4. Richard, M., Quijano, R. R., Bezzate, S., Bordon-Pallier, F., Gaillardin, C. Tagging morphogenetic genes by insertional mutagenesis in the yeast Yarrowia lipolytica. J. Bacteriol. 183 (10), 3098-3107 (2001).
  5. Flores, C. L., Martìnez-Costa, O. H., Sánchez, V., Gancedo, C., Aragòn, J. J. The dimorphic yeast Yarrowia lipolytica possesses an atypical phosphofructokinase: characterization of the enzyme and its encoding gene. Microbiology. 151 (5), 1465-1474 (2005).
  6. Domìnguez, Á, et al. Non-conventional yeasts as hosts for heterologous protein production. Int. Microbiol. 1 (2), 131-142 (1998).
  7. Zinjarde, S. S. Food-related applications of Yarrowia lipolytica. Food Chem. 152, 1-10 (2014).
  8. Finogenova, T., Morgunov, I., Kamzolova, S., Chernyavskaya, O. Organic acid production by the yeast Yarrowia lipolytica: a review of prospects. Appl. Biochem. Micro+. 41 (5), 418-425 (2005).
  9. Groguenin, A., et al. Genetic engineering of the β-oxidation pathway in the yeast Yarrowia lipolytica to increase the production of aroma compounds. J. Mol. Catal. B-Enzym. 28 (2), 75-79 (2004).
  10. Meng, X., et al. Biodiesel production from oleaginous microorganisms. Renew. Energ. 34 (1), 1-5 (2009).
  11. Papanikolaou, S., Aggelis, G. Lipid production by Yarrowia lipolytica growing on industrial glycerol in a single-stage continuous culture. Bioresource Technol. 82 (1), 43-49 (2002).
  12. Tai, M., Stephanopoulos, G. Engineering the push and pull of lipid biosynthesis in oleaginous yeast Yarrowia lipolytica for biofuel production. Metab. Eng. 15, 1-9 (2013).
  13. Liu, H. H., Ji, X. J., Huang, H. Biotechnological applications of Yarrowia lipolytica: Past, present and future. Biotechnol. Adv. 33 (8), 1522-1546 (2015).
  14. Liu, L., Alper, H. S. Draft genome sequence of the oleaginous yeast Yarrowia lipolytica PO1f, a commonly used metabolic engineering host. Genome Announc. 2 (4), e00652-e00614 (2014).
  15. Dujon, B., et al. Genome evolution in yeasts. Nature. 430 (6995), 35-44 (2004).
  16. Chen, D. C., Beckerich, J. M., Gaillardin, C. One-step transformation of the dimorphic yeast Yarrowia lipolytica. Appl. Microbial. Biotechnol. 48 (2), 232-235 (1997).
  17. Wang, J. H., Hung, W., Tsai, S. H. High efficiency transformation by electroporation of Yarrowia lipolytica. J. Microbiol. 49 (3), 469-472 (2011).
  18. Matsuoka, M., et al. Analysis of regions essential for the function of chromosomal replicator sequences from Yarrowia lipolytica. Mol. Gen. Genet. 237 (3), 327-333 (1993).
  19. Kretzschmar, A., et al. Increased homologous integration frequency in Yarrowia lipolytica strains defective in non-homologous end-joining. Curr. Genet. 59 (1-2), 63-72 (2013).
  20. Lorenz, T. C. Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies. J. Vis. Exp. (63), e3998 (2012).
  21. Kobs, G. Cloning blunt-end DNA fragments into the pGEM-T Vector Systems. Promega Notes. 62, 15-18 (1997).
  22. JoVE Science Education Database. Isolating Nucleic Acids from Yeast. Essentials of Biology 1: yeast, Drosophila and C. elegans. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: http://www.jove.com/science-education/5096/isolating-nucleic-acids-from-yeast (2016).
  23. Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques: plating methods. J. Vis. Exp. (63), e3064 (2012).
  24. Hegemann, J. H., Heick, S. B. Delete and repeat: a comprehensive toolkit for sequential gene knockout in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Methods Mol. Biol. 765, 189-206 (2011).
  25. Yamane, T., Sakai, H., Nagahama, K., Ogawa, T., Matsuoka, M. Dissection of centromeric DNA from yeast Yarrowia lipolytica and identification of protein-binding site required for plasmid transmission. J. Biosci. Bioeng. 105 (6), 571-578 (2008).
  26. McGinnis, S., Madden, T. L. BLAST: at the core of a powerful and diverse set of sequence analysis tools. Nucleic Acids Res. 32 ((Web Server issue)), W20-W25 (2004).
  27. Madzak, C., Tréton, B., Blanchin-Roland, S. Strong hybrid promoters and integrative expression/secretion vectors for quasi-constitutive expression of heterologous proteins in the yeast Yarrowia lipolytica. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 2 (2), 207-216 (2000).
  28. Nicaud, J. M., Le Clainche, A., Le Dall, M. T., Wang, H., Gaillardin, C. Yarrowia lipolytica, a yeast model for the genetic studies of hydroxy fatty acids biotransformation into lactones. J. Mol. Catal. B-Enzym. 5 (1), 175-181 (1998).

Tags

Genetikk bioteknologi Ukonvensjonelle gjær, genetisk transformasjon genet sletting genetisk manipulering homolog rekombinasjon men da rednings
Genetic Engineering av en ukonvensjonell gjær for fornybar Biodrivstoff og biokjemiske Produksjon
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yu, A. Q., Pratomo, N., Ng, T. K.,… More

Yu, A. Q., Pratomo, N., Ng, T. K., Ling, H., Cho, H. S., Leong, S. S. J., Chang, M. W. Genetic Engineering of an Unconventional Yeast for Renewable Biofuel and Biochemical Production. J. Vis. Exp. (115), e54371, doi:10.3791/54371 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter