Abstract
Yarrowia lipolytica является непатогенные, диморфные и строго аэробные виды дрожжей. Благодаря своим отличительным физиологических особенностей и метаболических характеристик, этот нетрадиционный дрожжей является не только хорошей моделью для изучения фундаментальной природы грибковой дифференциации, но и является перспективным микробная платформой для биохимического производства и различных биотехнологических применений, требующих обширных генетических манипуляций. Тем не менее, генетические манипуляции Y. lipolytica были ограничены в связи с отсутствием эффективной и стабильной генетической трансформации системы, а также очень высокие показатели не-гомологичной рекомбинации , которые могут быть в основном отнесены к гену Ku70. Здесь мы сообщаем простой и быстрый протокол для эффективной генетической трансформации и делеции гена в Y. lipolytica Po1g. Во- первых, это протокол для эффективной трансформации экзогенной ДНК в Y. lipolytica Po1g был создан. Secoго, для достижения повышенной скорости гомологичной рекомбинации двойной кроссовер для дальнейшего удаления генов - мишеней, ген Ku70 был удален путем преобразования кассеты с разрывом , несущий 1 кб гомологий руки. В- третьих, чтобы продемонстрировать эффективность повышенную делеции гена после удаления гена Ku70, мы индивидуально удалены 11 целевых генов , кодирующих алкогольдегидрогеназы и алкогольоксидазы , используя те же процедуры на штамм Ku70 Нокаут платформы. Было отмечено, что скорость точной гомологической рекомбинации существенно увеличилась с менее чем 0,5%, для удаления гена Ku70 в Po1g до 33% -71% для одного делеции гена из 11 генов - мишеней в Po1g Ku70 А. Репликативной плазмиду, несущую маркер устойчивости к гигромицину B и система Cre / LoxP была построена, и ген селекции маркера в штаммах дрожжей нокаутных был в конечном счете удалены путем экспрессии Cre рекомбиназой для облегчения проведения множества раундов щитомTed генетические манипуляции. Полученные мутанты с делецией одного гена имеют потенциальное применение в биотопливе и биохимического производства.
Introduction
В отличие от Saccharomyces CEREVISIAE, Yarrowia lipolytica, нетрадиционным дрожжей, может расти в виде дрожжей или мицелия в ответ на изменения условий окружающей среды 1,2. Таким образом, этот диморфизм дрожжи могут быть использованы в качестве хорошей модели для изучения грибкового дифференцировки, формообразования и систематики 3,4,5. Это , как правило , считается безопасным (GRAS) видов дрожжей, которые широко используются для производства различных пищевых добавок , таких как органические кислоты, многоатомные, ароматические соединения, эмульгаторы и поверхностно -активные вещества 6,7,8,9. Это облигатные аэробной и хорошо известный маслянистую дрожжи способны естественным образом накапливать липиды в больших количествах, то есть, вплоть до 70% от сухого веса 10 клеток. Он также может использовать широкий спектр источников углерода для роста, в том числе различные виды остатков в ресурсах отходов в качестве питательных веществ , 11,12,13. Все эти уникальные особенности делают Y. lipolytica очень привлекательным дляразличные биотехнологические приложения.
Несмотря на то, всю последовательность генома Y. lipolytica опубликованных 14,15, генетические манипуляции этого нетрадиционного дрожжей является более сложным , чем у других видов дрожжей. Во- первых, преобразование этих дрожжей вида значительно менее эффективен из - за отсутствия стабильной и эффективной генетической трансформации системы 16,17. Во- вторых, кропотливое геномная интегрирование линейных кассет экспрессии обычно используется для экспрессии генов , представляющих интерес , как ни одна система плазмида природные эписомная не найдено в этих дрожжей 18. В- третьих, поколение генетических нокауты и постучать модули ограничены , потому что ген ориентации эффективность с помощью точной гомологичной рекомбинации в этих дрожжей является низким , и большинство событий интеграции происходят через негомологичной конец соединительной (NHEJ) 19.
В данном исследовании мы сообщаем оптимизированный протокол преобразования для Y. lipolytica Ku70, который кодирует ключевой фермент в пути NHEJ. Используя оптимизированный протокол преобразования и преобразования линейного нокаутирующий кассету , содержащую фланговые области гомологии в 1 кб, ген Ku70 из Y. lipolytica Po1g был успешно удален. Надежность этой методики удаления гена затем продемонстрирована путем пристреливать алкогольдегидрогеназы и гены алкогольоксидазы в штамм Po1g Ku70 Д. Было отмечено , что удаление штамма Ku70 проявляли значительно более высокую эффективность гомологичной рекомбинации генов-опосредованной ориентации , чем у дикого типа Po1g штамма. Кроме того, замещающий Плазмиду экспрессии Cre несущий маркер устойчивости к гигромицину B был построен для выполнения маркера спасение. Маркер спасательных облегчает несколько раундов гена адресности-гое получены мутанты делеции гена. Помимо делеции гена, наш протокол для генетической трансформации и делеции гена , описанного здесь , могут быть применены для вставки генов в специфические локусы, а также ввести сайт-специфические мутации в Y. lipolytica генома.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Генерация Y. lipolytica Ku70 Удаление Штамм
- Строительство кассеты с разрывом
Примечание: смотри таблицу 1 для всех используемых праймеров в полимеразной цепной реакции (ПЦР) усилений.- Дизайн праймеров 20 для ПЦР - амплификации экспрессии LEU2 кассету (см таблицу 1) из Y. Вектор экспрессии lipolytica и ввести LoxP сайтов в 5'- и 3' - концы LEU2 кассеты с длинной прямой праймер (# 1, таблица 1) и длинной обратного праймера (# 2, таблица 1), соответственно. Для того, чтобы ввести дополнительный сайт рестрикции для последующих этапов процесса клонирования, добавить сайт рестрикции Bam HI сайт в праймер # 1.
- Выполните ПЦР с использованием ДНК - полимеразы с высокой точностью воспроизведения , как подробно описано в таблице 2.
- Очищают продукт ПЦР LoxP-промотор-LEU2-терминатор-LoxP кассета с использованием purificatio PCRп комплект в соответствии с инструкциями изготовителя. Добавить свесы 3'-A к очищенного продукта ПЦР в соответствии с инструкциями изготовителя 21. Использование ДНК - лигазы Т4 для лигирования A-белохвост ПЦР - продукт в клонирующий вектор ТА с получением плазмиды Т-leu2 согласно Таблице 3.
- ПЦР - амплификации 1 т.п.н. 5 'вверх по течению последовательности гена Ku70 с использованием праймеров # 3 / # 4 из Y. lipolytica Po1g геномную ДНК 22 в соответствии с таблицей 2. Очищают продукт ПЦР с использованием набора для очистки ПЦР в соответствии с инструкциями изготовителя.
- Двойной переваривать как очищенный продукт ПЦР и Т-LEU2 плазмиду с ферментами Sac II и Bam HI согласно Таблице 4. Очищают переваривания смеси с использованием набора для очистки ПЦР в соответствии с инструкциями изготовителя. С помощью ДНК - лигазы Т4 для лигирования Очищенный и переваривают ПЦР - продукта в Sac II / Bam HI сайты T-LEU2 с получениемплазмида T-LEU2-5E согласно Таблице 3.
- ПЦР - амплификации 1 кб 'вниз по течению последовательность гена Ku70 3 с использованием праймеров # 5 / # 6 из Y. lipolytica Po1g геномную ДНК 22 в соответствии с таблицей 2. Очищают продукт ПЦР с использованием набора для очистки ПЦР в соответствии с инструкциями изготовителя. Двойной переваривать как очищенный продукт ПЦР и Т-LEU2-5E плазмиду с Not I и NDE I ферментов в соответствии с таблицей 4.
- Очищают смесь переваривания с использованием набора для очистки ПЦР в соответствии с инструкциями изготовителя. Затем, перевязывать очищенный и переваривают ПЦР - продукта в Not I / Nde I - сайты T-LEU2-5E с получением плазмиды Т-KO с использованием ДНК - лигазы Т4 в соответствии с таблицей 3.
- Дайджест плазмиды Т-KO с Sac II и Nde I ферментов в соответствии с таблицей 4 для получения кассеты с разрывом (рис 1
- Подготовка Компетентная клеток и превращение Y. штамм lipolytica Po1g
- подготовка Компетентная клеток
- Привить колонии Y. штамм lipolytica Po1g из свежей дрожжевой экстракт-пептон-декстроза (YPD) пластины в 10 мл среды YPD (1% дрожжевого экстракта, 2% пептона, 2% декстрозы и 50 мМ цитратный буфер рН 4,0) в 100 мл колбе. Выдержите в качалке инкубаторе 30 ° C при 225 оборотах в минуту в течение 20 ч до уровня насыщения (OD 600 около 15, измеренная с помощью спектрофотометра).
- Гранул клетки центрифугированием в течение 5 мин при 5000 х г при комнатной температуре. Промывают клетки с 20 мл Трис-ЭДТА (ТЕ) буфера (10 мМ Трис, 1 мМ ЭДТА, рН 7,5), и осадка клеток, как описано в шаге 1.2.1.2. Ресуспендируют клеток в 1 мл 0,1 М ацетата лития (рН 6,0, настроенная с помощью уксусной кислоты), и инкубируют в течение 10 мин при комнатной Tempeратура.
- Аликвотировать компетентных клеток (100 мкл) в стерильные 1,5 мл пробирки. Перейдите к шагам преобразования ниже немедленно, или добавить глицерин до конечной концентрации 25% (об / об) и хранят при -80 ° С в течение длительного хранения.
- трансформация
- Аккуратно смешайте 10 мкл денатурированной ДНК спермы лосося (10 мг / мл) и 1-5 мкг очищенного кассеты с разрывом вместе со 100 мкл компетентных клеток, и инкубировали при 30 ° С в течение 15 мин.
- Добавьте 700 мкл 40% полиэтиленгликоля (ПЭГ) -4000 (растворенного в 0,1 М ацетата лития рН 6,0), хорошо перемешивают и инкубируют в качалке инкубаторе 30 ° C при 225 оборотах в минуту в течение 60 мин.
Примечание: Важно использовать ПЭГ со средней молекулярной массой 4000, а не PEG-3350 (обычно используется в преобразовании обычных дрожжей). - Теплового шока и трансформированные смеси, поместив трубку в водяной бане при 39 ° С в течение 60 мин.
- Добавить 1 мл YPD среды ивосстановить в течение 2 ч при температуре 30 ° C и 225 оборотов в минуту. Центрифуга при 9000 х г в течение 1 мин при комнатной температуре, удалите супернатант и ресуспендируют осадок в 1 мл ТЕ-буфера.
- Repellet клетки центрифугированием при 9000 х г в течение 1 мин при комнатной температуре и отбросить супернатант. Ресуспендируют осадок в 100 мкл ТЕ - буфера и пластину на селективных планшетах (например, лейцин-дефицитных пластин), и инкубируют при температуре 30 ° C в течение 2-3 дней.
- Pick 4 до 10 отдельных колоний и прививают по отдельности в 2 мл среды YPD. Выдержите в течение ночи в шейкере инкубаторе 30 ° C при 225 оборотах в минуту. Выявление положительных колоний с помощью ПЦР - анализа геномной ДНК из трансформантов 22 согласно таблице 5 , с использованием двух наборов праймеров # 55 / # 56 и # 56 / # 57, соответственно.
Примечание: Не я линеаризованный вектор pYLEX1 превращается в Y. lipolytica Po1g компетентные клетки с целью определения эффективности трансформации путем подсчета числаколониеобразующих единиц (КОЕ) на мкг плазмидной ДНК использовали 23.
- подготовка Компетентная клеток
2. Маркер спасения
- Конструирование плазмиды экспрессии Cre
- Строительство pYLEX1-CRE и pYLEX1-ПВД
- Дизайн праймеров 20 для ПЦР - амплификации открытые рамки считывания CRE и ПВД. Добавить дополнительный аденин нуклеотид перед старт - кодонов в прямых праймеров # 82 и # 84, и вставить сайты рестрикции Kpn I ниже по потоку от стоп - кодонов в обратных праймеров # 83 и # 85. ПЦР - амплификации открытые рамки считывания CRE и ПВД от pSH69 (инвентарный номер HQ412578) 24 в соответствии с таблицей 2.
- Очищают как CRE и фрагменты РВД с использованием набора для очистки ПЦР в соответствии с инструкциями изготовителя. Digest и очищенного CRE и РВД фрагменты с Kpn I фермента согласно TABLе 4. Двойной переварить pYLEX1 плазмиду с ферментами Pml I и кф I в соответствии с таблицей 4. Очищают переваривания смеси с использованием набора для очистки ПЦР в соответствии с инструкциями изготовителя.
- Использование ДНК - лигазы Т4 в соответствии с таблицей 3 для лигирования очищенные и переваривают CRE и HPH фрагменты сайтов Pml I / Kpn I в Y. Вектор для экспрессии lipolytica, получая pYLEX1-CRE и pYLEX1-HPH, соответственно.
- Строительство pSL16-CRE-ПВД
- ПЦР - амплификации промотор-ген-терминатор кассету CRE из pYLEX1-CRE с использованием праймеров # 86 / # 87 фланговые сайты Sal I / Pst I ограничение, в соответствии с таблицей 2. Очищают продукт ПЦР с использованием набора для очистки ПЦР в соответствии с инструкциями изготовителя ,
- Двойной переваривать как очищенный продукт ПЦР и pSL16-CEN1-1 (227) плазмиды 25 с Sal I иPst I ферменты в соответствии с таблицей 4. Очищают смесь переваривания с использованием набора для очистки ПЦР в соответствии с инструкциями изготовителя. Затем, перевязывать очищенный и переваренной ПЦР - продукт в pSL16-CEN1-1 (227) , расположенных на соответствующих сайтах для создания pSL16-CRE с использованием ДНК - лигазы Т4 в соответствии с таблицей 3.
- ПЦР - амплификации промотор-ген-терминатор кассету ПВД из pYLEX1-ПВД с использованием праймеров , # 88 / # 89 фланкирующих сайтов рестрикции Xho I / Bgl II согласно Таблице 2. Очищают продукт ПЦР с использованием набора для очистки ПЦР в соответствии с инструкциями изготовителя ,
- Двойной переваривать как очищенный продукт ПЦР и pSL16-CRE плазмиду с ферментами Xho I и Bgl II в соответствии с таблицей 4. Очищают переваривания смеси с использованием набора для очистки ПЦР в соответствии с инструкциями изготовителя. Затем, лигирование очищенный и переваривают продукта ПЦР в pSL16-CRE в соответствующийсайты для создания pSL16-CRE-HPH с использованием ДНК - лигазы Т4 в соответствии с таблицей 3.
Примечание: Полученное выражение плазмиду Cre, pSL16-CRE-РВД, таит в себе селективный маркер гигромицину B и является центромерная и эписомально тиражирование вектор (рисунок 2).
- Двойной переваривать как очищенный продукт ПЦР и pSL16-CRE плазмиду с ферментами Xho I и Bgl II в соответствии с таблицей 4. Очищают переваривания смеси с использованием набора для очистки ПЦР в соответствии с инструкциями изготовителя. Затем, лигирование очищенный и переваривают продукта ПЦР в pSL16-CRE в соответствующийсайты для создания pSL16-CRE-HPH с использованием ДНК - лигазы Т4 в соответствии с таблицей 3.
- Проверьте все конструкции расщеплением соответствующими ферментами рестрикции (например, Sal I / Pst I, акцизным вставку из вектора) в соответствии с таблицей 4.
- ПЦР - амплификации промотор-ген-терминатор кассету CRE из pYLEX1-CRE с использованием праймеров # 86 / # 87 фланговые сайты Sal I / Pst I ограничение, в соответствии с таблицей 2. Очищают продукт ПЦР с использованием набора для очистки ПЦР в соответствии с инструкциями изготовителя ,
- Строительство pYLEX1-CRE и pYLEX1-ПВД
- Cre рекомбиназа-опосредованной маркер спасательного
- Transform pSL16-CRE-HPH в компетентные клетки штамма нокаутных Ku70 в соответствии с протоколом , описанным в трансформации разделе 1.2 выше. Пластинчатые трансформированные клетки на YPD плюс гигромицину B (YPDH) пластины (содержащей 400 мкг / мл гигромицину В), и инкубируют при температуре 30 ° C в течение 2-3 дней.
- Выполняют колонии PCR в соответствии с таблицей 5 с использованием праймеров # 84 / # 85 , чтобы определить положительныйколонии, содержащие pSL16-CRE-HPH плазмиды после трансформации.
Примечание: Прямой праймер # 84 и обратный праймер # 85 расположены внутри кодирующей области гена л.с.ч (таблица 1). Только положительные клоны генерируют конкретный продукт ПЦР в ПЦР-реакции. - Выберите позитивный клон и прививают в 2 мл YPDH среды, и инкубируют в качалке инкубаторе 30 ° C при 225 оборотах в минуту в течение ночи до насыщения. Измерьте оптическую плотность клеток 600 с помощью спектрофотометра. Сбора клеток при OD 600 ~ 15. Центрифуга при 5000 х г в течение 5 мин при комнатной температуре, и мыть один раз с 2 мл стерильной воды.
- Повторное инокуляции клеток в 2 мл среды YPD с начальной OD 600 0.1 и позволяют клеткам расти в качалке инкубаторе 30 ° C при 225 оборотах в минуту в течение ночи. Streak Ночную культуру клеток на YPD пластин для выделения отдельных колоний 23. Реплика пластины колоний на YPD, YPDH и лейцин-дефицитных пластины 23 Примечание: Колонии, которые потеряли обоих LEU2 маркер и pSL16-CRE-HPH плазмиду могут расти только на YPD пластин (рисунок 3).
3. Удаление алкогольдегидрогеназы и алкогольоксидазы Гены
- Выполнить поиск по Y. базы данных генома lipolytica с использованием Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) для определения кандидатов для удаления генов 26. Входные белковая последовательность S. CEREVISIAE алкогольдегидрогеназы I в поисковой BLAST инструмент (http://www.genome.jp/tools-bin/search_sequence?prog=blast&db=yli&seqid=aa).
Примечание: Инструмент поиска BLAST возвращает наиболее сходные последовательности белка в Y. lipolytica генома базы данных. - Построить делеция кассеты с помощью ПЦР с праймерами # 7 до # 56 (таблица 1), а также выполнять расщепления ферментами рестрикции и реакции лигирования с использованием тех же методов , как описано в разделе 1.1 выше.
- приготовительныйкомпетентные клетки штамма Ku70 нокаута, осуществлять преобразования и выполнять ПЦР для выявления положительных колоний с использованием праймеров # 55, # 58, # 81 (таблица 1), следуя протоколу , описанному в разделе 1.2 выше.
Примечание: В качестве примера, процедура для удаления гена YALI0E17787g описана на фигурах 4 и 5. Эффекты 1 кб и 2 кб длинной гомологичной области по гомологичной скорости рекомбинации сообщается.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Линеаризованная Ю.В. Выражение lipolytica вектор был вставлен в док - платформу PBR в геноме Y. lipolytica штамм Po1g путем выполнения одной рекомбинации кроссовера 27. Используя быструю процедуру химического превращения , установленный в данном исследовании, линеаризованная Y. Выражение lipolytica вектор был успешно преобразован в дикого типа штамма Po1g при эффективности трансформации> 100 КОЕ / мкг ДНК. Нокаут кассеты по бокам 1 кб гомологичных последовательностей трансформировали в штамм Po1g и ген Ku70 был успешно удален (Рисунок 1). Здесь, прямой праймер # 56 отжигов в последовательности , расположенной в пределах 5 'гомологии плеча гена Ku70. Обратный праймер # 55 расположен внутри кодирующей области LEU2 маркера. Обратный праймер # 57 расположен внутри кодирующей области гена Ku70. Каккогда - либо, из более чем 200 колоний, наблюдалась только одна положительная колония с удаленным геном Ku70, что указывает на очень низкую скорость удаления гена (<0,5%). Впоследствии, замещающий плазмиду , несущую B маркер устойчивости к гигромицину и система Cre / LoxP была построена (рисунок 2), и ген - маркер выбора в штамме Ku70 нокаута был в конечном счете удалены путем экспрессии Cre рекомбиназой (рисунок 3). С помощью инструмента поиска BLAST, одиннадцать предполагаемых генов алкогольдегидрогеназы и один ген оксидазы спирта были идентифицированы в Y. lipolytica генома. Предполагаемые гены алкогольдегидрогеназы являются YALI0E17787g, YALI0D25630g, YALI0A16379g, YALI0E15818g, YALI0D02167g, YALI0A15147g, YALI0E07766g, YALI0F09603g, YALI0B10175g, YALI0F08129g, YALI0E07810g. Ген мнимый спирта оксидаза YALI0B14014g. Для того, чтобы проверить увеличение скорости удаления гена после удаления гена Ku70, мы индивидуально удалены 11 генов параллельно ( за исключениемдля YALI0A16379g) с помощью срыву кассеты с длинными гомологичными последовательностями в Y. lipolytica Ku70 Нокаут штамм (4 и 5). Здесь, праймеры (Р1-Р2 и F-F), отжигают в последовательности, расположенной в пределах 5 'гомологии плеча генов-мишеней. Обратные праймеры (P1-R) расположены внутри кодирующей области LEU2 маркера. Обратные праймеры (P2-R) расположены внутри кодирующей области генов - мишеней (рис 4). Выбивание кассеты лишь незначительно отличаются по длинам гомологичных последовательностей и сайтами рестрикции (таблица 1). Ставки делеции гена были достигнуты [гомологичной рекомбинации / (гомологичной рекомбинации + негомологичный рекомбинации)] на 33% -71%, что свидетельствует о резком увеличении направленной гомологичной частоты рекомбинации по сравнению с делецией гена Ku70. Например, скорость удаление YALI0E17787g составила 40% (~ 100 КОЕ / мкг ДНК). более того, Возможность дальнейшего увеличения скорости делеции гена исследовалось, когда использовались более длинные гомологичные последовательности. Оно показало, что разрушение гена YALI0E17787g кассету с 2 килобайта гомологичными последовательностями дал скорость удаления 87,5% (~ 400 КОЕ / мкг ДНК). Кроме того, введен маркер селекции гена LEU2 в полученных мутантов с делецией удаляли с последующей трансформацией вектора pSL16-CRE-HPH (hp4d- CRE, HPH), что позволяет несколько раундов целенаправленных манипуляций генов.
Рисунок 1. Конструкция Ku70 нокаута кассеты и Ku70 дефицитный мутантный. A. Ku70 Нокаут плазмиду T-KO. B. Схематическая диаграмма Ku70 нокаута кассеты. Вверх по течению и вниз по течению повторногионов (1 т.п.н.) гена Ku70 были клонированы в 5'- и 3'-конца кассеты с разрывом для гомологичной рекомбинации. Выражение LEU2 , кассета была вставлена между двумя гомологичными фланкирующими последовательностями. C. Гель - электрофорез в Ku70 удаления кассеты после Sac II и Nde я переваривания из T-KO. L: 1 кб ДНК лестницы; 1: Ku70 удаление кассеты (ожидаемый размер полосы 4,3 кб) D.. ПЦР подтверждение гена Ku70 удаления в Y. lipolytica Po1g. Продукты ПЦР амплифицировали из геномной ДНК трансформантов (дорожки 1-10) и штамма дикого типа (дорожка 11). Полоса 7 иллюстрирует положительный нокаутом, в то время как полоса 1 показывает ложный положительный результат. В верхнем геле, фрагмент 500 п.н., полученный с помощью набора праймеров # 56 / # 57 и отсутствует только в дорожках 1 и 7. В нижнем геле, успешные нокаутов генерируют фрагмент 750 пар оснований, который получен с набор праймеров # 55 / # 56 Tон 750 п.н. полоса виден только на дорожке 7. L:. 1 кб ДНК Ladder Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. Принципиальная схема экспрессии плазмиды рекомбиназа Cre для маркера спасения. Эписомально тиражирование плазмиду pSL16-CRE-HPH несет рекомбиназу Cre (CRE), сопротивление гигромицина маркер (РВД), ген устойчивости к ампициллину (Amp), А.Н. начало репликации Escherichia coli (pMB1), ориджин репликации Y. lipolytica (ORI1001), последовательность ДНК центромеры Y. lipolytica (CEN1-1) и ген LacZ , кодирующий фермент -галактозидазы. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы увидеть увеличенную верSion этой фигуры.
Рисунок 3. Скрининг Рост положительного маркера менее Y. lipolytica штаммы после маркера спасения. Трансформанты (1-4) разводили и наносили на YPD пластин, YPDH пластин и лейцин-дефицитных пластинок, соответственно. После 3 дней роста при 30 ° С, положительных маркеров свободных трансформантов (1, 3, 4) могут расти только на YPD пластине, что указывает на иссечение гена LEU2 маркера при экспрессии рекомбиназы Cre и потери плазмиды pSL16- CRE-HPH A:. YPD пластина, B: YPDH пластины, C:. лейцин-дефицитных пластина Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4. Принципиальная схема целевого делеции гена и процедуры спасения маркера. Разрушение гена кассета состоит из гена маркера селекции (LEU2) обрамленная двумя сайтами узнавания LoxP и два таргетинга оружия (вверх и вниз по фланкирующие последовательности). После трансформации кассеты с разрывом в Y. lipolytica клетки, событие происходит замещение гена с помощью двойного кроссинговера гомологичной рекомбинации в двух фланговых плечами гомологии в целевом локусе. Два набора праймеров для ПЦР для проверки интеграции кассеты с разрывом (P1-F и P1-R) и конкурентной делеции целевых геномных областей (P2-F и P2-R), были использованы. И, наконец, LEU2 , маркер удаляется путем экспрессии Cre рекомбиназы, оставляя за один сайт LoxP в хромосомном локусе. Целенаправленное удаление гена и замена YALI0E17787 гепе было показано здесь в качестве примера. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 5. ПЦР подтверждение разрушения гена YALI0E17787 в Y. продукты lipolytica Po1g. ПЦР амплифицировали из геномной ДНК трансформантов (полосы 1-4) и штамма дикого типа (дорожка 5). Дорожки 1, 2 и 4 иллюстрируют положительные нокаутов, в то время как полоса 3 показывает ложный положительный результат. В верхнем геле, успешные нокаутов генерируют фрагмент 750 пар оснований, который получают с помощью набора праймеров Р1-Р и Р1-Р. Полоса 750 п.н. виден на дорожках 1, 2 и 4, но не в дорожках 3 и 5. В нижнем геле, фрагмент 500 пар оснований получают с помощью набора праймеров Р2-Р и Р2-Р и присутствует только в дорожках 3 Aй 5. L:. 1 кб ДНК Ladder Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Таблица 1. Праймеры , используемые в данном исследовании. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы загрузить эту таблицу.
| компонент ПЦР | ||
| ПЦР - материалы | тома | Конечная концентрация |
| ПЦР-буфер | 10 мкл | 1x |
| дНТФ смесь | 1 мкл | 200 мкМ |
| Прямой праймер | 2,5 мкл | 500 нМ </ TD> |
| Обратный праймер | 2,5 мкл | 500 нмоль |
| ДНК-полимеразы | 0,5 мкл | 1 U |
| ДНК-матрицы (разбавленный геномной или плазмидной ДНК) | 0.5-2 мкл | 50 нг |
| Стерильная вода | до 50 мкл | |
| условия проведения ПЦР | ||
| температура | Время | Количество циклов |
| 98 ° C | 30 сек | 1 |
| 98 ° C | 10 сек | 30 |
| 55 ° C | 30 сек | |
| 72 ° C | 30 сек | |
| 72 ° C | 10 минут | 1 |
| Выполните ПЦР - амплификации с использованием термаль циклователь | ||
Таблица 2. ПЦР установка и условия для ДНК - полимеразы высокой точности.
| Компонент | |||
| материалы | Конечная концентрация | ||
| ДНК-лигазы Т4 Буфер | 1x | ||
| Вектор ДНК | 0,03 пмоль | ||
| Вставка ДНК | 0,15 пмоль | ||
| ДНК-лигазы Т4 | 400 U | ||
| Стерильная вода | до 20 мкл | ||
| условия | |||
| температура | Время | ||
| 16 ° C | 16 ч | ||
| Компонент | |
| материалы | Конечная концентрация |
| Ограничение буфера пищеварения | 1x |
| ДНК (плазмиды или продукт ПЦР) | 1 мкг |
| 1 - го фермента рестрикции | 5 U |
| 2 - й ограничительного фермента (необязательно) | 5 U |
| Стерильная вода | до 50 мкл |
| условия | |
| температура | Время |
| 37 ° C | <TD> 6 ч|
| Выполнение одного перевариванию с одним ферментом рестрикции | |
| Выполнение двойного расщепления с парой ферментов рестрикции | |
Таблица 4. Условия расщепления ферментами рестрикции ДНК.
| компонент ПЦР | ||
| ПЦР - материалы | тома | Конечная концентрация |
| ПЦР-буфер | 2,5 мкл | 1x |
| дНТФ смесь | 0,5 мкл | 200 мкМ |
| Прямой праймер | 0,5 мкл | 200 нМ |
| ReveРГП праймер | 0,5 мкл | 200 нМ |
| ДНК-полимеразы | 0,2 мкл | 1 U |
| ДНК-матрицы (разбавленный геномной или плазмидной ДНК) | 0.5-2 мкл | 50 нг |
| Стерильная вода | до 25 мкл | |
| условия проведения ПЦР | ||
| температура | Время | Количество циклов |
| 95 ° C | 5 мин | 1 |
| 95 ° C | 30 сек | 30 |
| 50 ° C | 30 сек | |
| 72 ° C | 30 сек | |
| 72 ° C | 10 минут | 1 |
| Выполните ПЦР - амплификации с использованием амплификатор | ||
| Выполните ПЦР колоний непосредственно , используя колонию в качестве матрицы, а не образец ДНК | ||
Таблица 5. ПЦР / ПЦР колоний настройки и условия для Taq ДНК - полимеразы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Наша цель данного исследования заключается в обеспечении быстрого и эффективного формирования целевых нокауты генов в Y. lipolytica Po1g штамм. Несколько соображений необходимо решить для достижения этой цели. Во-первых, требуется высокая эффективность преобразования. Таким образом, эффективный и удобный протокол химического преобразования для Y. lipolytica Po1g штамм был описан в данном исследовании. Применение ПЭГ-4000 является критическим фактором для успешной трансформации этого штамма. Нет трансформанты не были получены для трансформации плазмидами при использовании ПЭГ-3350 (для трансформации S.cerevisiae , ) вместо PEG-4000. Кроме того, подготовка компетентных клеток с использованием и свежеприготовленные клетки необходимо, чтобы получить высокую эффективность трансформации этого штамма вируса. Во- вторых, сократить непроизводительные гомологичной рекомбинации и случайной интеграции событий через доминантного NHEJ в этом штамме, эффективный метод преобразования затем используется для построения KU70 Нокаут мутант. В-третьих, с целью повышения эффективности замены гена с помощью гомологичной рекомбинации, длинные фланкирующие рычаги (1 т.п.н.) на входе и выходе генов-мишеней были использованы в делеции гена кассет. Длинные фланговые гомологичные регионы срыву кассетами имеют важное значение для эффективной гомологичной рекомбинации в этом штамме. Нет положительных колоний не были получены при использовании Срыв кассеты с 50 н.п. гомологичных областей (достаточных для эффективной гомологичной рекомбинации в S.cerevisiae , ). Используя все эти стратегии, то Ku70 ген Y. lipolytica Po1g штамм был успешно удален. Тем не менее, это чрезвычайно трудно получить штамм Ku70 выбивки из - за очень высокой скорости , не гомологичной рекомбинации в Y. lipolytica Po1g штамм. Необходимо соблюдать осторожность при обращении с антибиотиками гигромицину В средах, содержащих в качестве гигромицину B чувствителен к свету. Использование носителей с деградированных гигромицину B приведет к ложному позitives на этапах 2.2.1 и 2.2.2 и ложноотрицательных на этапе 2.2.7.
Когда удаление штамма Ku70 был использован для создания целенаправленного удаления отдельных генов , кодирующих алкогольдегидрогеназы и алкоголь - оксидазы, гораздо более высокая скорость удаления была достигнута по сравнению с удалением гена Ku70. Это свидетельствует о том , что использование Ku70 удаления платформы штамма привело к резкому увеличению гомологичной частоты рекомбинации. После того, как вопрос о очень низкой скорости гомологичной рекомбинации был адресован, скрининг Y. lipolytica одного гена нокаут мутанты высоко ускорен. Мы также отметили, что длина 1 кб гомологичной области был достаточно эффективен для целенаправленного удаления гена. Увеличение гомологичной частоты рекомбинации может быть достигнута при использовании более гомологичных последовательностей (2 Кб). Примечательно, что эти гены кодируют алкогольдегидрогеназы и алкоголь-оксидазы, которые катализируют обратимое преобразование между спиртами и ралдомehydes. Удаление этих генов может привести к увеличению накопления биотопливе и биохимических соединений, в том числе и жирных кислот с короткой цепью, средней цепи жирных кислот, длинноцепочечные жирные кислоты, гидроксильные жирных кислот, спиртов, альдегидов и липидов. Дальнейшие исследования будут проводиться для проверки этой возможности.
Метод разрушение гена ПЦР-опосредованный сообщалось в Y. штамм lipolytica Po1d 28. Тем не менее, этот метод является трудоемким и занимает много времени. Одним из основных ограничений этого метода является трудность получения достаточных количеств делеции кассет генов в течение одного эксперимента по трансформации. Другим ограничением является то, что этот метод ограничивается URA3 маркером. Описанный в данном исследовании метод конкретно рассмотрены эти вопросы в методике ПЦР на основе путем комбинирования подход переваривание-Лигирование и систему Cre / LoxP. Этот метод позволяет использовать различные антибиотические и ауксотрофных маркеров и, таким образом, является более Versaкафельная плитка. Это может способствовать быстрому делеции гена в Y. lipolytica Po1g штамм. Мы здесь , представить подробное описание целевой стратегии удаления одного гена с помощью гомологичной рекомбинации в Y. lipolytica Po1g клетки. Тем не менее, один LoxP сайт остается рубец внутри генома после успешного спасения маркера (рисунок 4). В делеции нескольких генов, множественные рубцы LoxP введены в геном, и это может привести к нестабильности генома из-за потенциальных событий рекомбинации, которые могут возникнуть между LoxP сайтов. Тем не менее, нокаута штаммы, построенные в этом исследовании, показали очень хорошую генетическую стабильность, что свидетельствует о том, что незапланированные события рекомбинации не происходило между LoxP сайтов.
Таким образом, эффективный генетический протокол трансформации был создан для Y. lipolytica Po1g штамм. Целенаправленное удаление отдельных генов этого штамма вируса была продемонстрирована как доказательство концепции. Y, lipolytica Po1g Ku70 удаления платформы штамма построена в данном исследовании показали очень эффективной гомологичной частоты рекомбинации, что позволяет легче и быстрее скрининг целевых делеции гена. Таким образом, эта платформа зажим обеспечивает более эффективную систему и является лучшим выбором для применения в затрагивающего пути проектирования и оптимизации деформации при возведении других мутантов хромосомной удаления. Описанная методика и сконструированную Ku70 делеция штамм также может быть применено к вставке генов - мишеней в специфические локусы и создание мутаций конкретных участков в геном.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Мы выражаем глубокую признательность за финансовую поддержку со стороны Национального агентства по окружающей среде Сингапура (ПОПК 1201102), Конкурентный Программа исследований Национального исследовательского фонда Сингапура (NRF-CRP5-2009-03), Агентства по науке, технологиям и исследованиям Сингапура ( 1324004108), Global R & D Программа проекта, Министерство экономики знаний, Республика Корея (N0000677), Агентство по уменьшению угрозы обороны (DTRA, HDTRA1-13-1-0037) и Синтетическая биология Инициатива Национального университета Сингапура ( DPRT / 943/09/14).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| Oligonucleotide primers | Integrated DNA Technologies | 25 nmole DNA oligos | |
| Y. lipolytica strain Po1g | Yeastern Biotech | leucine auxotrophic derivative of the wild-type strain W29 (ATCC 20460) | |
| Vector pYLEX1 | Yeastern Biotech | FYY203-5MG | Y. lipolytica expression vector |
| E. coli TOP10 | Invitrogen | For cloning and propagation of plasmids | |
| pGEM-T vector | Promega | A3600 | TA cloning vector |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | For plasmid isolation |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System |
Promega | A9282 | Extract DNA fragments from agarose gels and purify PCR products from an amplification reaction |
| The iProof high-fidelity DNA polymerase |
Bio-Rad | 172-5302 | High-fidelity DNA polymerase |
| BamHI | New England Biolabs | R0136S | Restriction enzyme |
| BglII | New England Biolabs | R0144L | Restriction enzyme |
| KpnI | New England Biolabs | R0142S | Restriction enzyme |
| NdeI | New England Biolabs | R0111S | Restriction enzyme |
| NotI | New England Biolabs | R0189L | Restriction enzyme |
| PmlI | New England Biolabs | R0532S | Restriction enzyme |
| PstI | New England Biolabs | R0140S | Restriction enzyme |
| SacII | New England Biolabs | R0157S | Restriction enzyme |
| SalI | New England Biolabs | R0138S | Restriction enzyme |
| XhoI | New England Biolabs | R0146L | Restriction enzyme |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202L | |
| Taq DNA polymerase | Bio-Rad | M0267L | |
| Ampicillin | Gibco-Life Technologies | 11593-027 | Antibiotics |
| Hygromycin B | PAA | P21-014 | Antibiotics |
| GeneRuler 1 kb DNA ladder | Thermo Scientific | SM0312 | 1 kb DNA ladder |
| PEG4000 | Sigma | 95904-F | |
| Tris | Promega | H5135 | |
| EDTA | Bio-Rad | 161-0729 | |
| Salmon Sperm DNA | Invitrogen | 15-632-011 | |
| Lithium Acetate | Sigma | ||
| Acetic acid | Sigma | ||
| Glass beads (425-600 µm) | Sigma | G8772 | |
| RNAse A | Thermo Scientific | EN0531 | |
| DNA Loading Dye | Thermo Scientific | R0611 | |
| Bacto Yeast Extract | BD | 212750 | |
| Bacto Peptone | BD | 211677 | |
| D-Glucose | 1st Base | BIO-1101 | |
| YNB without amino acids | Sigma | Y0626 | |
| DO Supplement-Leu | Clontech | 630414 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| Difco LB Broth | BD | 244620 | |
| Difco LB Agar | BD | 244520 | |
| Bacto Agar | BD | 214010 | |
| Equipment | |||
| PCR machine | Biorad | T100 Thermal Cycler | |
| Water bath | Memmert | WNB 14 | |
| Stationary/Shaking Incubator | Yihder | LM-570RD | |
| Thermo-shaker | Allsheng | MS-100 | |
| Micro centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Spectrophotometer | Eppendorf | BioPhotometer plus | |
| Gel imager | GE | Amersham Imager 600 |
References
- Jiménez-Bremont, J. F., Rodrìguez-Hernández, A. A., Rodrìguez-Kessler, M. Development and dimorphism of the yeast Yarrowia lipolytica. Dimorphic fungi: Their importance as models for differentiation and fungal pathogenesis. J, R. uiz-H. errera , 58-66 (2012).
- Coelho, M., Amaral, P., Belo, I. Yarrowia lipolytica: an industrial workhorse. Current research, technology and education topics in applied microbiology and microbial biotechnology. Méndez-Vilas, A. , 930-940 (2010).
- Martinez-Vazquez, A., et al. Identification of the transcription factor Znc1p, which regulates the yeast-to-hypha transition in the dimorphic yeast Yarrowia lipolytica. Plos One. 8 (6), e66790 (2013).
- Richard, M., Quijano, R. R., Bezzate, S., Bordon-Pallier, F., Gaillardin, C. Tagging morphogenetic genes by insertional mutagenesis in the yeast Yarrowia lipolytica. J. Bacteriol. 183 (10), 3098-3107 (2001).
- Flores, C. L., Martìnez-Costa, O. H., Sánchez, V., Gancedo, C., Aragòn, J. J. The dimorphic yeast Yarrowia lipolytica possesses an atypical phosphofructokinase: characterization of the enzyme and its encoding gene. Microbiology. 151 (5), 1465-1474 (2005).
- Domìnguez, Á, et al. Non-conventional yeasts as hosts for heterologous protein production. Int. Microbiol. 1 (2), 131-142 (1998).
- Zinjarde, S. S. Food-related applications of Yarrowia lipolytica. Food Chem. 152, 1-10 (2014).
- Finogenova, T., Morgunov, I., Kamzolova, S., Chernyavskaya, O. Organic acid production by the yeast Yarrowia lipolytica: a review of prospects. Appl. Biochem. Micro+. 41 (5), 418-425 (2005).
- Groguenin, A., et al. Genetic engineering of the β-oxidation pathway in the yeast Yarrowia lipolytica to increase the production of aroma compounds. J. Mol. Catal. B-Enzym. 28 (2), 75-79 (2004).
- Meng, X., et al. Biodiesel production from oleaginous microorganisms. Renew. Energ. 34 (1), 1-5 (2009).
- Papanikolaou, S., Aggelis, G. Lipid production by Yarrowia lipolytica growing on industrial glycerol in a single-stage continuous culture. Bioresource Technol. 82 (1), 43-49 (2002).
- Tai, M., Stephanopoulos, G. Engineering the push and pull of lipid biosynthesis in oleaginous yeast Yarrowia lipolytica for biofuel production. Metab. Eng. 15, 1-9 (2013).
- Liu, H. H., Ji, X. J., Huang, H. Biotechnological applications of Yarrowia lipolytica: Past, present and future. Biotechnol. Adv. 33 (8), 1522-1546 (2015).
- Liu, L., Alper, H. S. Draft genome sequence of the oleaginous yeast Yarrowia lipolytica PO1f, a commonly used metabolic engineering host. Genome Announc. 2 (4), e00652-e00614 (2014).
- Dujon, B., et al. Genome evolution in yeasts. Nature. 430 (6995), 35-44 (2004).
- Chen, D. C., Beckerich, J. M., Gaillardin, C. One-step transformation of the dimorphic yeast Yarrowia lipolytica. Appl. Microbial. Biotechnol. 48 (2), 232-235 (1997).
- Wang, J. H., Hung, W., Tsai, S. H. High efficiency transformation by electroporation of Yarrowia lipolytica. J. Microbiol. 49 (3), 469-472 (2011).
- Matsuoka, M., et al. Analysis of regions essential for the function of chromosomal replicator sequences from Yarrowia lipolytica. Mol. Gen. Genet. 237 (3), 327-333 (1993).
- Kretzschmar, A., et al. Increased homologous integration frequency in Yarrowia lipolytica strains defective in non-homologous end-joining. Curr. Genet. 59 (1-2), 63-72 (2013).
- Lorenz, T. C. Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies. J. Vis. Exp. (63), e3998 (2012).
- Kobs, G. Cloning blunt-end DNA fragments into the pGEM-T Vector Systems. Promega Notes. 62, 15-18 (1997).
- JoVE Science Education Database. Isolating Nucleic Acids from Yeast. Essentials of Biology 1: yeast, Drosophila and C. elegans. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: http://www.jove.com/science-education/5096/isolating-nucleic-acids-from-yeast (2016).
- Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques: plating methods. J. Vis. Exp. (63), e3064 (2012).
- Hegemann, J. H., Heick, S. B. Delete and repeat: a comprehensive toolkit for sequential gene knockout in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Methods Mol. Biol. 765, 189-206 (2011).
- Yamane, T., Sakai, H., Nagahama, K., Ogawa, T., Matsuoka, M. Dissection of centromeric DNA from yeast Yarrowia lipolytica and identification of protein-binding site required for plasmid transmission. J. Biosci. Bioeng. 105 (6), 571-578 (2008).
- McGinnis, S., Madden, T. L. BLAST: at the core of a powerful and diverse set of sequence analysis tools. Nucleic Acids Res. 32 ((Web Server issue)), W20-W25 (2004).
- Madzak, C., Tréton, B., Blanchin-Roland, S. Strong hybrid promoters and integrative expression/secretion vectors for quasi-constitutive expression of heterologous proteins in the yeast Yarrowia lipolytica. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 2 (2), 207-216 (2000).
- Nicaud, J. M., Le Clainche, A., Le Dall, M. T., Wang, H., Gaillardin, C. Yarrowia lipolytica, a yeast model for the genetic studies of hydroxy fatty acids biotransformation into lactones. J. Mol. Catal. B-Enzym. 5 (1), 175-181 (1998).
Tags
Генетика выпуск 115 биоинженерии выпуск Нетрадиционные дрожжи,
Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.
