Abstract
Yarrowia lipolytica es una especie de levadura no patógena, dimórficos y estrictamente aerobios. Debido a sus características fisiológicas distintivas y características metabólicas, esta levadura no convencional no sólo es un buen modelo para el estudio de la naturaleza fundamental de la diferenciación de hongos pero es también una plataforma microbiana prometedor para la producción bioquímica y diversas aplicaciones biotecnológicas, que requieren extensas manipulaciones genéticas. Sin embargo, las manipulaciones genéticas de Y. lipolytica han sido limitados debido a la falta de un sistema de transformación genética eficiente y estable, así como tasas muy altas de recombinación no homóloga que se puede atribuir principalmente al gen KU70. Aquí, se presenta un protocolo de fácil y rápido para la transformación genética eficiente y para la deleción del gen de Y. lipolytica Po1g. En primer lugar, un protocolo para la transformación eficiente de ADN exógeno en Y. lipolytica Po1g se estableció. Second, para lograr la tasa de recombinación homóloga de doble cruce mejorado para una mayor eliminación de los genes diana, el gen KU70 se eliminó mediante la transformación de una casete de interrupción que lleva 1 brazos kb de homología. En tercer lugar, para demostrar la mayor eficiencia de la supresión de genes después de la supresión del gen KU70, hemos suprimido de forma individual 11 genes diana que codifican la alcohol deshidrogenasa y alcohol oxidasa utilizando los mismos procedimientos en la cepa plataforma nocaut KU70. Se observó que la tasa de recombinación homóloga precisa aumentó sustancialmente de menos de 0,5% para su eliminación del gen KU70 en Po1g al 33% -71% para la sola supresión de genes de los 11 genes diana en Po1g KU70 Δ. Un plásmido de replicación que lleva el marcador de resistencia a higromicina B y el sistema Cre / loxP se construyó, y el gen marcador de selección en las cepas de levadura knockout se eliminó finalmente mediante la expresión de la recombinasa Cre para facilitar múltiples rondas de TargeTED manipulaciones genéticas. Los mutantes de deleción de un solo gen resultantes tienen aplicaciones potenciales en la producción de biocombustibles y bioquímicos.
Introduction
A diferencia de Saccharomyces cerevisiae, Yarrowia lipolytica, una levadura convencional, puede crecer en forma de levadura o micelio en respuesta a cambios en las condiciones del medio ambiente 1,2. Por lo tanto, esta levadura dimórfica se puede utilizar como un buen modelo para el estudio de la diferenciación de hongos, la morfogénesis y la 3,4,5 taxonomía. Generalmente se considera como una caja fuerte especies de levadura (GRAS), que se utiliza ampliamente para producir una variedad de aditivos de alimentos tales como ácidos orgánicos, polialcoholes, compuestos de aroma, emulsionantes y agentes tensioactivos 6,7,8,9. Es un aerobio obligado y una levadura oleaginosa conocido capaz de acumular naturalmente lípidos en altas cantidades, es decir, hasta el 70% del peso seco de células 10. También se puede utilizar un amplio espectro de fuentes de carbono para el crecimiento, incluyendo diferentes tipos de residuos en los recursos de los residuos como nutrientes 11,12,13. Todas estas características únicas hacen Y. lipolytica muy atractivo paradiversas aplicaciones biotecnológicas.
Aunque toda la secuencia del genoma de la Y. lipolytica ha sido publicada 14,15, la manipulación genética de esta levadura no convencional es más compleja que otras especies de levadura. En primer lugar, la transformación de esta especie de levadura es mucho menos eficiente debido a la ausencia de un sistema de 16,17 transformación genética estable y eficiente. En segundo lugar, la integración genómica laborioso de casetes de expresión lineales se utiliza comúnmente para la expresión de genes de interés ya que ningún sistema plásmido episomal natural se ha encontrado en esta levadura 18. En tercer lugar, la generación de genéticos knock-outs y knock-ins están limitados debido a que el gen de la eficiencia de la focalización mediante recombinación homóloga precisa en esta levadura es baja y la mayoría de los eventos de integración se produce a través de extremos no homólogos (NHEJ) 19.
En este estudio, se presenta un protocolo de transformación optimizada para la Y. lipolytica KU70, que codifica una enzima clave en la vía NHEJ. Al utilizar el protocolo de transformación optimizada y la transformación de un casete nocaut lineal que contiene regiones de homología flanqueantes de 1 kb, el gen de la KU70 Y. lipolytica Po1g se ha eliminado correctamente. La robustez de esta metodología de supresión de genes se demostró posteriormente por la orientación de la alcohol deshidrogenasa y los genes de alcohol oxidasa en la cepa Po1g KU70 Δ. Se observó que la supresión cepa KU70 exhibió una considerablemente mayor eficiencia de la recombinación de genes mediada homóloga de orientación que la de la cepa de tipo salvaje Po1g. Además, un plásmido replicativo expresión Cre que lleva el marcador de resistencia a higromicina B fue construido para llevar a cabo rescate de marcador. El rescate de marcador facilita múltiples rondas de mutagénesis dirigida en THe obtuvo supresión de genes mutantes. Además de la supresión de genes, nuestro protocolo para la transformación genética y la deleción del gen descrito aquí se puede aplicar para insertar genes a loci específicos, y para introducir mutaciones específicas de sitio en el Y. lipolytica genoma.
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Protocol
1. Generación de la Y. La cepa lipolytica KU70 Supresión
- Construcción de la casete de interrupción
Nota: Véase la Tabla 1 para todos los cebadores utilizados en las amplificaciones de reacción en cadena de la polimerasa (PCR).- Cebadores de diseño 20 para amplificar por PCR el casete de expresión LEU2 (véase la Tabla 1) a partir de una Y. vector de expresión lipolytica y introducir sitios LoxP en el 5 'y 3' de la casete LEU2 con un cebador hacia adelante largo (# 1, Tabla 1) y un cebador inverso de largo (# 2, Tabla 1), respectivamente. Para introducir un sitio de restricción adicional para las etapas posteriores del proceso de clonación, añadir un sitio de restricción BamHI en el cebador # 1.
- Realizar PCR utilizando un ADN polimerasa de alta fidelidad como se detalla en la Tabla 2.
- Se purifica el producto de PCR LoxP-promotor-LEU2-terminador-LoxP casete utilizando un Purificatio PCRn kit de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Añadir voladizos 3'-A para el producto de PCR purificado de acuerdo con las instrucciones del fabricante 21. El uso de ADN ligasa de T4 para ligar el producto de PCR A-cola en un vector de clonación TA para dar el plásmido T-LEU2 según la Tabla 3.
- Amplificar por PCR el 1 kb 5 'secuencia arriba del gen KU70 usando los cebadores # 3 / # 4 de la Y. lipolytica Po1g ADN genómico 22 según la Tabla 2. Se purifica el producto de PCR usando un kit de purificación de PCR de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Doble digerir tanto el producto de PCR purificado y el plásmido T-LEU2 con enzimas Sac II y Bam HI según la Tabla 4. Se purifica la mezcla de digestión usando un kit de purificación de PCR según las instrucciones del fabricante. Utilice ADN T4 ligasa para ligar el purificado y digerido producto de la PCR a la Sac II / sitios Bam HI de T-LEU2 para dar elplásmido T-LEU2-5E según la Tabla 3.
- Amplificar por PCR el 1 kb 3 'secuencia abajo del gen KU70 utilizando los cebadores # 5 / # 6 de la Y. lipolytica Po1g ADN genómico 22 según la Tabla 2. Se purifica el producto de PCR usando un kit de purificación de PCR de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Doble digerir tanto el producto purificado de PCR y el plásmido T-LEU2-5E con Not I y Nde I enzimas según la Tabla 4.
- Se purifica la mezcla de digestión usando un kit de purificación de PCR según las instrucciones del fabricante. Entonces, ligar el digerido y purificado producto de PCR con el Not I / Nde I sitios de T-LEU2-5E para dar lugar al plásmido T-KO usando ADN ligasa de T4 según la Tabla 3.
- Digerir el plásmido T-KO con Sac II y Nde I enzimas según la Tabla 4 para producir el módulo de fragmentación (Figura 1
- Preparación de células competentes y la transformación de Y. cepa lipolytica Po1g
- preparación de células competentes
- Se inocula una colonia de Y. cepa lipolytica Po1g de una placa de levadura fresca extracto-peptona-dextrosa (YPD) en 10 ml de medio YPD (1% de extracto de levadura, 2% de peptona, 2% de dextrosa y 50 mM de tampón de citrato de pH 4,0) en un matraz de 100 ml. Incubar en una incubadora de agitación 30 ° C a 225 rpm durante 20 h hasta saturación (un OD 600 de aproximadamente 15, medido utilizando un espectrofotómetro).
- Sedimentar las células por centrifugación durante 5 min a 5000 xg a temperatura ambiente. Se lavan las células con 20 ml de Tris-EDTA (TE) tampón (Tris 10 mM, EDTA 1 mM, pH 7,5), y sedimentar las células como se describe en el paso 1.2.1.2. Resuspender las células en 1 ml de acetato de 0,1 M de litio (pH 6,0, ajustado con ácido acético), y se incuba durante 10 min a tempe habitaciónratura.
- Alícuota de las células competentes (100 mu l) en tubos de 1,5 ml estériles. Continúe con los pasos de transformación por debajo de inmediato, o añadir glicerol a una concentración final de 25% (v / v) y se almacena a -80 ° C para el almacenamiento a largo plazo.
- Transformación
- Mezclar suavemente 10 l de ADN desnaturalizado de esperma de salmón (10 mg / ml) y 1 a 5 g de la casete de interrupción purificada junto con 100 l de células competentes, y se incuba a 30 ° C durante 15 min.
- Añadir 700 l de glicol 40% de polietileno (PEG) -4000 (disuelto en 0,1 M de litio de acetato de pH 6,0), se mezcla bien y se incuba en un incubador con agitación a 30 ° C a 225 rpm durante 60 min.
Nota: Es importante utilizar PEG con peso molecular medio de 4000, en lugar de PEG-3350 (utilizado normalmente en la transformación de la levadura convencional). - Choque térmico de la mezcla de transformación colocando el tubo en un baño de agua a 39 ° durante 60 minutos.
- Añadir 1 ml de medio YPD yrecuperar durante 2 horas a 30 ° C y 225 rpm. Centrifugar a 9000 xg durante 1 min a temperatura ambiente, eliminar el sobrenadante y resuspender el sedimento en 1 ml de tampón TE.
- Repellet las células por centrifugación a 9000 xg durante 1 min a temperatura ambiente y descartar el sobrenadante. Resuspender el precipitado en 100 l de tampón TE y la placa en placas selectivas (por ejemplo, placas de leucina deficientes), y se incuba a 30 ° C durante 2-3 días.
- Pick 4 a 10 colonias individuales y inocular por separado en 2 ml de medio YPD. Incubar toda la noche en una incubadora de agitación 30 ° C a 225 rpm. Identificar las colonias positivas por análisis de PCR de ADN genómico de los transformantes 22 según la Tabla 5 usando dos conjuntos de cebadores # 55 / # 56, y # 56 / # 57, respectivamente.
Nota: El no me linealizado pYLEX1 vector se transforma en Y. lipolytica Po1g células competentes con el fin de determinar la eficiencia de transformación contando el númerode unidades formadoras de colonias (UFC) por g de ADN plásmido utilizado 23.
- preparación de células competentes
2. Marcador de rescate
- Construcción del plásmido de expresión Cre
- Construcción de pYLEX1-CRE y pYLEX1-HPH
- Cebadores de diseño 20 para amplificar por PCR los marcos de lectura abierta de la CRE y HPH. Añadir un nucleótido de adenina extra de aguas arriba de los codones de inicio en los cebadores hacia adelante # 82 y # 84, e insertar sitios de restricción Kpn I aguas abajo de los codones de terminación en los cebadores inversos # 83 y # 85. amplificar por PCR los marcos de lectura abierta de la CRE y HPH de pSH69 (número de acceso HQ412578) 24, como se indica en la Tabla 2.
- Purificar tanto cre y fragmentos HPH utilizando un kit de purificación de PCR de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Recopilación tanto los fragmentos cre y HPH purificadas con Kpn I enzima según Table 4. doble digestión del plásmido con las enzimas pYLEX1 Pml I y Kpn I según la Tabla 4. Se purifica la mezcla de digestión usando un kit de purificación de PCR según las instrucciones del fabricante.
- Utilice ADN ligasa de T4 según la Tabla 3 para ligar los fragmentos de CRE y HPH purificados y digeridos a sitios Pml I / Kpn I de la Y. vector de expresión lipolytica, produciendo pYLEX1-CRE y pYLEX1-HPH, respectivamente.
- Construcción de pSL16-CRE-HPH
- Amplificar por PCR el casete de promotor-gen-terminador de cre de pYLEX1-CRE utilizando los cebadores # 86 / # 87 que flanquean los sitios de restricción Sal I / Pst I según la Tabla 2. Se purifica el producto de PCR usando un kit de purificación de PCR de acuerdo con las instrucciones del fabricante .
- Doble digerir tanto el producto de PCR purificado y pSL16-CEN1-1 (227) plásmido 25 con Sal I yPst I enzimas según la Tabla 4. Purificar la mezcla de digestión usando un kit de purificación de PCR según las instrucciones del fabricante. Entonces, ligar el producto de PCR purificado y digerido en pSL16-CEN1-1 (227) en los sitios correspondientes para crear pSL16-CRE utilizando ADN ligasa de T4 según la Tabla 3.
- Amplificar por PCR el casete de promotor-gen-terminador de hph de pYLEX1-HPH utilizando los cebadores # 88 / # 89 que flanquean los sitios de restricción Xho I / Bgl II según la Tabla 2. Se purifica el producto de PCR usando un kit de purificación de PCR de acuerdo con las instrucciones del fabricante .
- Doble digerir tanto el producto purificado de PCR y el plásmido pSL16-CRE con las enzimas Xho I y Bgl II según la Tabla 4. Se purifica la mezcla de digestión usando un kit de purificación de PCR según las instrucciones del fabricante. Entonces, ligar el producto de PCR purificado y digerido en pSL16-CRE en el correspondientesitios para generar pSL16-CRE-HPH utilizando ADN ligasa de T4 según la Tabla 3.
Nota: El plásmido de expresión Cre resultante, pSL16-CRE-HPH, alberga un marcador de higromicina B seleccionable y es un vector episomal centromérica y replicación (Figura 2).
- Doble digerir tanto el producto purificado de PCR y el plásmido pSL16-CRE con las enzimas Xho I y Bgl II según la Tabla 4. Se purifica la mezcla de digestión usando un kit de purificación de PCR según las instrucciones del fabricante. Entonces, ligar el producto de PCR purificado y digerido en pSL16-CRE en el correspondientesitios para generar pSL16-CRE-HPH utilizando ADN ligasa de T4 según la Tabla 3.
- Verificar todas las construcciones de la digestión con enzimas de restricción apropiadas (por ejemplo, Sal I / Pst I, para cortar el inserto del vector) según la Tabla 4.
- Amplificar por PCR el casete de promotor-gen-terminador de cre de pYLEX1-CRE utilizando los cebadores # 86 / # 87 que flanquean los sitios de restricción Sal I / Pst I según la Tabla 2. Se purifica el producto de PCR usando un kit de purificación de PCR de acuerdo con las instrucciones del fabricante .
- Construcción de pYLEX1-CRE y pYLEX1-HPH
- Cre recombinasa mediada por rescate de marcador
- Transformar pSL16-CRE-HPH en células competentes de la cepa knockout KU70 siguiendo el protocolo de transformación descrito en el apartado 1.2 anterior. células de la placa transformado Onto YPD más higromicina B (YPDH) placas (que contiene 400 mg / ml de higromicina B), y se incuba a 30 ° C durante 2-3 días.
- Llevar a cabo la PCR de colonias según la Tabla 5 utilizando los cebadores # 84 / # 85 para identificar positivolas colonias que contienen el plásmido pSL16-CRE-HPH después de la transformación.
Nota: El cebador directo # 84 y el cebador inverso # 85 están situados dentro de la región codificante del gen HPH (Tabla 1). Sólo clones positivos generan un producto de PCR específico en la reacción de PCR. - Elija un clon positivo e inocular en 2 ml de medio YPDH, e incubar en una incubadora de agitación 30 ° C a 225 rpm durante la noche a la saturación. Medir la OD de células 600 con un espectrofotómetro. Recoger las células a una densidad óptica de 600 ~ 15. Centrifugar a 5000 xg durante 5 min a temperatura ambiente, y se lava una vez con 2 ml de agua estéril.
- Células Re-inocular en 2 ml de medio YPD con una DO inicial 600 de 0,1 y permiten a las células crecer en una incubadora de agitación 30 ° C a 225 rpm durante la noche. Pasar la noche a la mañana el cultivo de células en placas de YPD para aislar colonias individuales 23. Colonias de placa Replica Onto YPD, YPDH, y placas de leucina deficientes 23 Nota: Las colonias que han perdido tanto el marcador LEU2 y pSL16-CRE-HPH plásmido sólo puede crecer en placas de YPD (Figura 3).
3. Supresión de la alcohol deshidrogenasa y alcohol oxidasa Genes
- Realizar una búsqueda en la Y. la base de datos del genoma lipolytica utilizando la herramienta de alineación de búsqueda local Básica (BLAST) para identificar los genes candidatos para su eliminación 26. Introduzca la secuencia de la proteína de S. alcohol deshidrogenasa cerevisiae I en la herramienta de búsqueda BLAST (http://www.genome.jp/tools-bin/search_sequence?prog=blast&db=yli&seqid=aa).
Nota: La herramienta de búsqueda BLAST devuelve las secuencias de proteínas más similares en el Y. la base de datos del genoma lipolytica. - Construir los casetes de deleción por PCR con los cebadores # 7 al # 56 (Tabla 1), y llevar a cabo la digestión con enzimas de restricción y reacciones de ligación utilizando los mismos métodos que se describe en el apartado 1.1 anterior.
- Deberesson células competentes de la cepa knockout KU70, llevar a cabo transformaciones y llevar a cabo la PCR para identificar las colonias positivas con los cebadores # 55, # 58 y # 81 (Tabla 1), siguiendo el protocolo descrito en el apartado 1.2 anterior.
Nota: Como ejemplo, el procedimiento para la deleción del gen YALI0E17787g se describe en las figuras 4 y 5. Se informaron los efectos de 1 kb y 2 kb región homóloga larga en la tasa de recombinación homóloga.
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Representative Results
La Y. linealizado vector de expresión lipolytica se insertó en la plataforma de acoplamiento pBR en el genoma de Y. lipolytica Po1g cepa mediante la realización de una sola recombinación de cruce 27. Al utilizar el procedimiento de transformación química rápida establecido en este estudio, la Y. linealizado vector de expresión lipolytica se transformó con éxito en la cepa de tipo salvaje Po1g a una eficiencia de transformación de> 100 ufc / g de ADN. Un casete de nocaut flanqueado por secuencias homólogas 1 kb se transformó en la cepa Po1g y el gen KU70 se ha eliminado correctamente (Figura 1). Aquí, el cebador # 56 se hibrida con la secuencia situada dentro del brazo 5 'de homología del gen KU70. El cebador inverso # 55 se encuentra dentro de la región codificante del marcador LEU2. El cebador inverso # 57 se encuentra dentro de la región codificante del gen KU70. Cómonunca, de más de 200 colonias, se observó sólo una colonia positiva con el gen KU70 suprimido, lo que sugiere una tasa de supresión de genes muy baja (<0,5%). Posteriormente, un plásmido replicativo que lleva el marcador de resistencia a higromicina B y el sistema Cre / loxP se construyó (Figura 2), y el gen marcador de selección en la cepa knockout KU70 se eliminó finalmente mediante la expresión de la recombinasa Cre (Figura 3). Con la herramienta de búsqueda BLAST, once genes putativos alcohol deshidrogenasa y un gen de alcohol oxidasa fueron identificados en Y. lipolytica genoma. Los genes putativos alcohol deshidrogenasa son YALI0E17787g, YALI0D25630g, YALI0A16379g, YALI0E15818g, YALI0D02167g, YALI0A15147g, YALI0E07766g, YALI0F09603g, YALI0B10175g, YALI0F08129g, YALI0E07810g. El gen de la alcohol oxidasa putativo es YALI0B14014g. Para verificar el aumento de la tasa de eliminación de genes después de la supresión del gen KU70, hemos suprimido de forma individual 11 genes en paralelo (exceptopara YALI0A16379g) mediante el uso de los casetes de interrupción con secuencias homólogas largas en el Y. knockout cepa lipolytica KU70 (Figuras 4 y 5). Aquí, los cebadores directos (P1-P2 y F-F) hibridan con la secuencia situada dentro del brazo 5 'de homología de los genes diana. Los cebadores inversos (P1-R) se encuentran dentro de la región codificante del marcador LEU2. Los cebadores inversos (P2-R) se encuentran dentro de la región de codificación de los genes diana (Figura 4). Los casetes de knock-out difieren sólo ligeramente en las longitudes de las secuencias homólogas y los sitios de restricción (Tabla 1). Las tasas de supresión de genes se alcanzaron [recombinación homóloga / (recombinación homóloga + recombinación no homóloga)] de 33% -71%, lo que sugiere un aumento dramático en la frecuencia de recombinación homóloga dirigida sobre la supresión de genes KU70. Por ejemplo, la tasa de eliminación de YALI0E17787g era 40% (~ 100 ufc / g de ADN). además, Se investigó la posibilidad de un aumento adicional en el gen de tasa de eliminación cuando se utilizaron secuencias homólogas más largos. Se demostró que el casete de interrupción de genes con secuencias homólogas YALI0E17787g 2 kb dio una tasa de eliminación del 87,5% (~ 400 ufc / g de ADN). Además, el marcador de selección LEU2 gen introducido en los mutantes de deleción obtenidos se eliminó mediante la transformación del vector pSL16-CRE-HPH (hp4d- cre, HPH), lo que permite que múltiples rondas de manipulaciones gen diana.
Figura 1. Construcción de la casete de KU70 knockout y la KU70 mutante deficiente. A. El plásmido KU70 nocaut T-KO. B. El diagrama esquemático de la casete KU70 nocaut. re aguas arriba y aguas abajoregiones (1 kb) del gen de KU70 se clonaron a 5 'y extremo 3' de la casete de interrupción para la recombinación homóloga. Se insertó el casete de expresión LEU2 entre las secuencias que flanquean dos homólogos. C. La electroforesis en gel de la casete KU70 su eliminación después de Sac II y Nde I digestión de T-KO. L: 1 kb de ADN de escalera; 1: El casete KU70 eliminación (de la talla esperada es de 4,3 kb) D.. Confirmación por PCR del gen de supresión KU70 en Y. lipolytica Po1g. Los productos de PCR se amplificaron a partir de ADN genómico de los transformantes (carriles 1-10) y cepa de tipo salvaje (carril 11). Carril 7 ilustra un nocaut positivo, mientras que el carril 1 muestra un falso positivo. En el gel de la parte superior, un fragmento de 500 pb se obtiene con el conjunto de cebadores # 56 / # 57 y sólo está ausente en los carriles 1 y 7. En la parte inferior del gel, los agujeros ciegos de éxito generar un fragmento de 750 pb, que se obtiene con el conjunto de cebadores # 55 / # 56 T750 pb que la banda sólo se ve en el carril 7. L:. 1 kb de ADN de escalera Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Diagrama esquemático del plásmido de expresión de la recombinasa Cre para el rescate de marcador. El plásmido episomal replicar pSL16-CRE-HPH lleva una recombinasa Cre (CRE), un marcador de resistencia a higromicina B (HPH), un gen de resistencia a la ampicilina (Amp), una origen de replicación de Escherichia coli (pMB1), un origen de replicación de Y. lipolytica (ORI1001), una secuencia de ADN centrómero de Y. lipolytica (CEN1-1) y un gen lacZ que codifica la enzima β-galactosidasa. Haga clic aquí para ver una mayor versión de esta figura.
Figura 3. Crecimiento de detección de Y. marker-menos positiva cepas lipolytica después de rescate de marcador. transformantes (1-4) se diluyeron luego se colocan sobre placas de YPD, placas y placas de leucina YPDH deficientes, respectivamente. Después de 3 días de crecimiento a 30 ° C, los transformantes libre de marcador positivo (1, 3, 4) sólo puede crecer en la placa de YPD, que indica la escisión del gen marcador LEU2 tras la expresión de la recombinasa Cre y la pérdida de plásmido pSL16- CRE-HPH a:. placa de YPD, B: placa YPDH, C:.-leucina placa deficiente Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Diagrama esquemático de la deleción génica dirigida y el procedimiento de rescate de marcador. El casete de interrupción de genes consta de un gen marcador de selección (LEU2) flanqueado por dos sitios de reconocimiento LoxP y dos brazos de orientación (secuencias flanqueantes aguas arriba y aguas abajo). Después de la transformación de la casete de interrupción en Y. células lipolytica, un evento de la sustitución de genes se produce a través de doble cruce recombinación homóloga dentro de los dos brazos de homología flanqueantes en el locus diana. Dos conjuntos de cebadores de PCR se utilizaron para verificar la integración del casete de interrupción (P1-F y P1-R) y la eliminación simultánea de las regiones genómicas específicas (P2-F y P2-R). Finalmente, el marcador LEU2 se elimina por la expresión de Cre recombinasa, dejando atrás un sitio LoxP solo en el locus cromosómico. Targeted gen de supresión y sustitución de YALI0E17787 gene se muestra aquí como un ejemplo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5. Confirmación de la PCR del gen interrupción YALI0E17787 en Y. productos lipolytica Po1g. PCR fueron amplificado a partir de ADN genómico de los transformantes (carriles 1-4) y cepa de tipo salvaje (carril 5). Los carriles 1, 2, y 4 ilustran knockouts positivos, mientras que el carril 3 muestra un falso positivo. En el gel de la parte superior, los agujeros ciegos de éxito generar un fragmento de 750 pb, que se obtiene con el conjunto de cebadores P1-F y P1-R. La banda de 750 pb se observa en los carriles 1, 2, y 4, pero no en los carriles 3 y 5. En la parte inferior del gel, un fragmento de 500 pb se obtiene con el conjunto de cebadores P2-F y P2-R y sólo está presente en los carriles 3 and 5. L:. 1 kb de ADN de escalera Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Tabla 1. Los cebadores usados en este estudio. Por favor, haga clic aquí para descargar la tabla.
| componente de RCF | ||
| materiales de PCR | volúmenes | La concentración final |
| tampón de PCR | 10 l | 1x |
| mezcla de dNTP | 1 l | 200 micras |
| cebador directo | 2,5 l | 500 nM </ Td> |
| cebador inverso | 2,5 l | 500 nM |
| ADN polimerasa | 0,5 l | 1 U |
| molde de ADN (diluido genómico o de ADN plásmido) | 0,5-2 l | 50 ng |
| Agua esteralizada | hasta 50 l | |
| Las condiciones de PCR | ||
| Temperatura | Hora | Número de ciclos |
| 98 ° C | 30 segundos | 1 |
| 98 ° C | 10 sec | 30 |
| 55 ° C | 30 segundos | |
| 72 ° C | 30 segundos | |
| 72 ° C | 10 minutos | 1 |
| Realizar la amplificación por PCR usando un thermal ciclador | ||
Tabla 2. PCR puesta a punto y las condiciones para la ADN polimerasa de alta fidelidad.
| Componente | |||
| materiales | La concentración final | ||
| T4 ADN ligasa Buffer | 1x | ||
| El ADN del vector | 0,03 pmol | ||
| ADN inserto | 0,15 pmol | ||
| ADN ligasa T4 | 400 U | ||
| Agua esteralizada | hasta 20 l | ||
| condiciones | |||
| Temperatura | Hora | ||
| 16 ° C | 16 horas | ||
| Componente | |
| materiales | La concentración final |
| tampón de digestión de restricción | 1x |
| DNA (plásmido o el producto de PCR) | 1 g |
| 1 con enzimas de restricción st | 5 U |
| 2 nd enzima de restricción (opcional) | 5 U |
| Agua esteralizada | hasta 50 l |
| condiciones | |
| Temperatura | Hora |
| 37 ° C | <td> 6 horas|
| Realizar sola digestión con una enzima de restricción único | |
| Realizar digestión doble con un par de enzimas de restricción | |
Tabla 4. Condiciones para la digestión con enzimas de restricción de ADN.
| componente de RCF | ||
| materiales de PCR | volúmenes | La concentración final |
| tampón de PCR | 2,5 l | 1x |
| mezcla de dNTP | 0,5 l | 200 micras |
| cebador directo | 0,5 l | 200 nM |
| reveimprimación rse | 0,5 l | 200 nM |
| ADN polimerasa | 0.2 l | 1 U |
| molde de ADN (diluido genómico o de ADN plásmido) | 0,5-2 l | 50 ng |
| Agua esteralizada | hasta 25 l | |
| Las condiciones de PCR | ||
| Temperatura | Hora | Número de ciclos |
| 95 ° C | 5 minutos | 1 |
| 95 ° C | 30 segundos | 30 |
| 50 ° C | 30 segundos | |
| 72 ° C | 30 segundos | |
| 72 ° C | 10 minutos | 1 |
| Realizar amplificación por PCR utilizando un termociclador | ||
| Realizar colonia PCR directamente a través de una colonia como molde, en lugar de una muestra de ADN | ||
Tabla 5. PCR / PCR de colonias configuración y las condiciones de Taq ADN polimerasa.
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Discussion
Nuestro objetivo para este estudio es permitir la generación rápida y eficiente de los knockouts de genes dirigidos en el Y. lipolytica cepa Po1g. Varias consideraciones deben ser abordados para lograr esto. En primer lugar, se requiere una alta eficacia de transformación. Por lo tanto, un protocolo de transformación química eficiente y conveniente para el Y. cepa lipolytica Po1g se describió en este estudio. El uso de PEG-4000 es un factor crítico para la transformación exitosa de esta cepa. No se obtuvieron transformantes para la transformación del plásmido utilizando PEG-3350 (para la transformación de S. cerevisiae) en lugar de PEG-4000. Además, se requiere la preparación de células competentes usando células recién preparadas para obtener una alta eficiencia de transformación en esta cepa. En segundo lugar, para reducir la recombinación e integración aleatoria eventos no homólogas vía NHEJ dominante en esta raza, a continuación, se empleó un método de transformación eficiente para construir el KU70 knockout mutante. En tercer lugar, para mejorar la eficiencia de la sustitución de genes por recombinación homóloga, de largo brazos flanqueantes (1 kb) aguas arriba y aguas abajo de los genes diana se utilizaron en casetes de supresión de genes. Las regiones homólogas que flanquean largo de los casetes de interrupción son esenciales para la recombinación homóloga eficiente en esta cepa. No hay colonias positivas se obtuvieron cuando se utilizan casetes de interrupción con regiones homólogas de 50 pb (suficientes para la recombinación homóloga eficiente en S. cerevisiae). El uso de todas estas estrategias, el gen de la KU70 Y. cepa lipolytica Po1g se ha eliminado correctamente. Sin embargo, es extremadamente difícil obtener la cepa knockout KU70 debido a la alta tasa de recombinación no homóloga en el Y. cepa lipolytica Po1g. Se debe tener cuidado al manipular el antibiótico higromicina B que contiene medios de comunicación como la higromicina B es sensible a la luz. El uso de material con degradada higromicina B dará lugar a falsos positives en los pasos 2.2.1 y 2.2.2 y falsos negativos en el paso 2.2.7.
Cuando se utilizó la supresión cepa KU70 para generar orientados supresión de genes individuales que codifican deshidrogenasas de alcohol y el alcohol oxidasa, se logró una tasa de eliminación mucho más alta en comparación con la deleción del gen KU70. Se demuestra que el uso de la cepa plataforma KU70 eliminación dio como resultado un aumento dramático en la frecuencia de recombinación homóloga. Después se abordó la cuestión de la tasa de recombinación homóloga muy baja, la detección de Y. lipolytica de un solo gen mutantes knockout fue altamente aceleradas. También hemos observado que la longitud de 1 kb región homóloga era lo suficientemente eficiente para la deleción del gen específico. Un aumento en la frecuencia de recombinación homóloga se puede lograr utilizando las secuencias más largas homólogas (2 kb). En particular, estos genes codifican alcohol deshidrogenasas y alcohol oxidasa, que catalizan la conversión reversible entre alcoholes y aldehydes. La eliminación de estos genes puede conducir a una mayor acumulación de biocombustibles y compuestos bioquímicos que incluyen ácidos grasos de cadena corta, ácidos grasos de cadena media, ácidos grasos de cadena larga, ácidos grasos hidroxilados, alcoholes, aldehídos y lípidos. se llevarán a cabo más estudios para verificar esta posibilidad.
Un método de interrupción de genes mediada por PCR ha sido reportado en Y. cepa lipolytica Po1d 28. Sin embargo, este método es laborioso y consume mucho tiempo. Una limitación principal de este método es la dificultad de obtener cantidades suficientes de los casetes de deleción de genes para un experimento de transformación. Otra limitación es que este método está limitado a el marcador URA3. El método descrito en este estudio abordó específicamente estas cuestiones en la técnica basada en la PCR mediante la combinación del enfoque de digestión-ligación y el sistema Cre / loxP. Este método permite el uso de diferentes marcadores de antibióticos y auxotróficas y por lo tanto es más versaazulejo. Se puede facilitar la rápida supresión de genes en el Y. cepa lipolytica Po1g. Nos en el presente documento presenta una descripción detallada de la estrategia de eliminación de un solo gen objetivo a través de recombinación homóloga en Y. células lipolytica Po1g. Sin embargo, un sitio LoxP se mantiene como una cicatriz en el genoma después del rescate marcador éxito (Figura 4). En deleción del gen múltiple, cicatrices LoxP se introducen en el genoma y esto puede resultar en inestabilidad genómica debido a eventos de recombinación potenciales que pueden ocurrir entre los sitios LoxP. Sin embargo, las cepas knockout construidos en este estudio mostraron una muy buena estabilidad genética, lo que indica que los eventos de recombinación no deseados no se produjeron entre los sitios LoxP.
En resumen, un protocolo de transformación genética eficiente se ha establecido para el Y. cepa lipolytica Po1g. La eliminación selectiva de genes individuales en esta cepa se demostró como una prueba de concepto. la Y. lipolytica Po1g KU70 cepa plataforma deleción construida en este estudio mostró frecuencia de recombinación homóloga muy eficiente, que permite una detección más fácil y más rápida de las deleciones de genes específicos. Por lo tanto, esta cepa plataforma proporciona un sistema más eficiente y una mejor elección para las aplicaciones en la ingeniería de vía y la optimización de la tensión en la construcción de otros mutantes de deleción cromosómica. La metodología descrita y la supresión construido cepa KU70 también podrían aplicarse a la inserción de los genes diana en loci específicos y la creación de mutaciones específicas de sitio en el genoma.
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Acknowledgments
Agradecemos el apoyo financiero de la Agencia Nacional de Medio Ambiente de Singapur (ETRP 1.201.102), el Programa de Investigación Competitiva de la Fundación Nacional de Investigación de Singapur (NRF-CRP5-2009-03), la Agencia para la Ciencia, Tecnología e Investigación de Singapur ( 1324004108), Global I + D Programa de Proyectos, el Ministerio de Economía del conocimiento, la República de Corea (N0000677), la Agencia de Reducción de Amenazas a la Defensa (DTRA, HDTRA1-13-1-0037) y la Iniciativa de la biología sintética de la Universidad Nacional de Singapur ( DPRT / 943/09/14).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| Oligonucleotide primers | Integrated DNA Technologies | 25 nmole DNA oligos | |
| Y. lipolytica strain Po1g | Yeastern Biotech | leucine auxotrophic derivative of the wild-type strain W29 (ATCC 20460) | |
| Vector pYLEX1 | Yeastern Biotech | FYY203-5MG | Y. lipolytica expression vector |
| E. coli TOP10 | Invitrogen | For cloning and propagation of plasmids | |
| pGEM-T vector | Promega | A3600 | TA cloning vector |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | For plasmid isolation |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System |
Promega | A9282 | Extract DNA fragments from agarose gels and purify PCR products from an amplification reaction |
| The iProof high-fidelity DNA polymerase |
Bio-Rad | 172-5302 | High-fidelity DNA polymerase |
| BamHI | New England Biolabs | R0136S | Restriction enzyme |
| BglII | New England Biolabs | R0144L | Restriction enzyme |
| KpnI | New England Biolabs | R0142S | Restriction enzyme |
| NdeI | New England Biolabs | R0111S | Restriction enzyme |
| NotI | New England Biolabs | R0189L | Restriction enzyme |
| PmlI | New England Biolabs | R0532S | Restriction enzyme |
| PstI | New England Biolabs | R0140S | Restriction enzyme |
| SacII | New England Biolabs | R0157S | Restriction enzyme |
| SalI | New England Biolabs | R0138S | Restriction enzyme |
| XhoI | New England Biolabs | R0146L | Restriction enzyme |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202L | |
| Taq DNA polymerase | Bio-Rad | M0267L | |
| Ampicillin | Gibco-Life Technologies | 11593-027 | Antibiotics |
| Hygromycin B | PAA | P21-014 | Antibiotics |
| GeneRuler 1 kb DNA ladder | Thermo Scientific | SM0312 | 1 kb DNA ladder |
| PEG4000 | Sigma | 95904-F | |
| Tris | Promega | H5135 | |
| EDTA | Bio-Rad | 161-0729 | |
| Salmon Sperm DNA | Invitrogen | 15-632-011 | |
| Lithium Acetate | Sigma | ||
| Acetic acid | Sigma | ||
| Glass beads (425-600 µm) | Sigma | G8772 | |
| RNAse A | Thermo Scientific | EN0531 | |
| DNA Loading Dye | Thermo Scientific | R0611 | |
| Bacto Yeast Extract | BD | 212750 | |
| Bacto Peptone | BD | 211677 | |
| D-Glucose | 1st Base | BIO-1101 | |
| YNB without amino acids | Sigma | Y0626 | |
| DO Supplement-Leu | Clontech | 630414 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| Difco LB Broth | BD | 244620 | |
| Difco LB Agar | BD | 244520 | |
| Bacto Agar | BD | 214010 | |
| Equipment | |||
| PCR machine | Biorad | T100 Thermal Cycler | |
| Water bath | Memmert | WNB 14 | |
| Stationary/Shaking Incubator | Yihder | LM-570RD | |
| Thermo-shaker | Allsheng | MS-100 | |
| Micro centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Spectrophotometer | Eppendorf | BioPhotometer plus | |
| Gel imager | GE | Amersham Imager 600 |
References
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Genética No. 115 Bioingeniería Emisión la levadura no convencional,
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