Abstract
Affiniteit zuivering benaderingen zijn succesvol in het isoleren van inheemse complexen voor proteomics karakterisering geweest. Structurele heterogeniteit en een mate van heterogeniteit samenstelling van een complex meestal niet belemmeren vooruitgang bij het uitvoeren van dergelijke studies. Daarentegen zou een complex bestemd voor structurele karakterisering worden gezuiverd in een staat die zowel qua samenstelling en structureel homogeen en bij een hogere concentratie dan vereist voor proteomics. Recent zijn er aanzienlijke vooruitgang bij de toepassing van elektronenmicroscopie voor structuurbepaling van grote macromoleculaire complexen zijn. Dit heeft interesse in benaderingen verhoogde inheemse complexen van voldoende kwaliteit en kwantiteit voor structurele bepaling te zuiveren door elektronenmicroscopie. De Tandem Affinity Purification (TAP) methode is geoptimaliseerd te extraheren en te zuiveren een 18-subunit, ~ 0,8 MDa ribonucleoprotein assemblage uit gist (Saccharomyces cerevisiae)
Introduction
Veel grote cellulaire processen worden uitgevoerd door grote eiwit en eiwit-RNA-complexen 1 uitgevoerd. Een belangrijk knelpunt te voeren biochemische en structurele studies van zulke complexen te verkrijgen van een geschikte kwaliteit (dwz homogeniteit) en bij een geschikte concentratie. Het isoleren van een complex van een natieve bron heeft vele voordelen, waaronder behoud relevante post-transcriptionele en / of translationele modificaties van subeenheden en verzekeren goede complex samenstel. Echter grote cellulaire complexen zijn vaak aanwezig in een cel op een klein aantal kopieën en de zuivering zeer efficiënt moeten zijn en optreden onder fysiologische omstandigheden omgeving te waarborgen complex behouden blijft. Zuiveren van een complex van een eukaryote bron is bijzonder uitdagend en financieel kan worden onbetaalbaar. Zo strategieën of methoden die efficiënt zijn en leveren een homogeen complex zijn zeer gewenst.
Een strategie die issuccesvol in het zuiveren van inheemse complexen van eukaryote cellen voor hun eerste karakterisering is de Tandem Affinity Purification (TAP) methode 2,3. TAP methode werd aanvankelijk ontwikkeld met een natief eiwit van gist (S. cerevisiae) zuiveren complex samenwerkende factor (en) 2. TAP methode gebruikt twee labels, elke tag gefuseerd in tandem om hetzelfde eiwit coderende gensequentie. De labels werden geselecteerd om een behoefte voor kleine en selectieve binding aan een affiniteitshars met actieve handhaven dichtbij fysiologische oplossing in evenwicht te brengen. Dit evenwicht dient stabiele interactie (s) van het gecodeerde eiwit samenwerkende factor (en) voor post-zuivering karakterisering behouden. Het genomisch opgenomen TAP tag aan het uiteinde (C-eindstandige) van een eiwit coderend gen en bestond uit een sequentie die codeert voor een calmoduline-bindend peptide (CBP), gevolgd door Proteïne A - toevoeging van iets meer dan 20 kDa gelabelde eiwit. CBP is kort, 26 aminozuren, en door de ~ 17 kDa eiwit calmoduline (CaM) in aanwezigheid van calcium met een Ko in de orde van 10 -9 M 4. De Proteïne A tag groter is, bestaande uit twee herhalingen van 58 residuen met een korte linker tussen de herhalingen. Elke 58 aminozuur herhaling is erkend door immunoglobuline G (IgG) met een K D ~ 10 -8 M 5. Tussen deze twee labels werd opgenomen een erkenning site voor TEV protease, een endopeptidase van de Tobacco Etch Virus 6,7. Zoals weergegeven in figuur 1, in de eerste affiniteit stap van de werkwijze de TAP gelabeld eiwit gebonden aan een IgG hars via de Proteïne A. De toegevoegde eiwit wordt geëlueerd door op de kolom splitsing na toevoeging van TEV protease, plaatsspecifiek splitsen tussen de twee labels. Dit is een noodzakelijke stap de interactie van IgG en proteïne A is zeer sterk en kan alleen voldoende worden verstoord onder denaturerende oplossingsomstandigheden. Bij gebrek aan een Protein Een tag wordt het eiwit gebonden CaM hars in aanwezigheid van calcium en geëlueerd uit de hars met toevoeging van het metaalion chelerende EGTA (ethyleenglycol-azijnzuur) (figuur 1).
Kort na de invoering van de TAP methode werd in een grootschalig onderzoek gebruikt voor het genereren van een "kaart" van complexe interacties in S. 8 cerevisiae. Belangrijker, als gevolg van deze inspanningen een volledige gist-TAP Tagged open leeskader (ORF) bibliotheek en individuele TAP hebben ORFs 9 kunnen van een commerciële bron. Aldus kan men elke giststam met een gemerkt eiwit voor gist complex te verkrijgen. TAP methode spoorde ook wijzigingen of variaties van de TAP tag, zoals: het gebruik ervan voor de zuivering van complexen uit andere eukaryote evenals bacteriële cellen 10,11; het ontwerp van een "split tag", waarbij het Proteïne A en CBP op verschillende eiwitten 12 worden geplaatst; en de tags veranderd, zodat de noodzaak van de onderzoeker accommoderen, zoals gevoeligheid van het complex Ca2 + of EGTA 13.
Recente ontwikkelingen in zowel instrumentatie en werkwijze hebben geleid tot significante vooruitgang in de toepassing van elektronenmicroscopie (EM) voor structuurbepaling, die hebben geleid tot een hoge, bij atomaire resolutie beelden van macromoleculaire complexen 14. De resolutie verkrijgen van een complex met EM blijft echter afhankelijk van de kwaliteit van het complex onder studie. Deze studie heeft de TAP tag aanpak te zuiveren van S. benut cerevisiae U1 snRNP, een 18-subeenheid (~ 0,8 MDa) laag kopieaantal ribonucleoproteïnecomplex die deel uitmaakt van de spliceosome 15,16. Een aantal maatregelen zijn genomen om dit complex zodanig dat het homogeen en voldoende concentratie zuiveren. Potentiële problemen in diverse stadia van de zuiveringswerkwijze zijn beschreven en strategieën genomen chall overwinnenEnges gemarkeerd. Door het zorgvuldig beoordelen en optimaliseren van stappen in de zuivering, de U1 snRNP gezuiverd is van een kwaliteit en tegen een hoeveelheid die geschikt zijn voor negatieve vlek en elektronenmicroscopie cryo-microscopie (cryo-EM) studies. Een geoptimaliseerde TAP methode protocol voor de zuivering van inheemse complexen voor structurele studies wordt hierin beschreven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Opmerking: Het volgende protocol werd ontwikkeld voor de zuivering van een complex van 4 liter celkweek ongeveer 40 g natgewicht van cellen. Na bereiding moeten alle buffers worden opgeslagen bij 4 ° C en binnen een maand na bereiding. Reductiemiddel en proteaseremmers worden alleen buffers juist voor gebruik.
1. Bereiding van Whole Cell Extract voor Tandem Affinity Purification
- Groei van S. cerevisiae Cells
- Streak de gewenste TAP tag S. cerevisiae stam uit opslag (-80 ° C) op een gist pepton dextrose (YPD) plaat. Incubeer gedurende 3-5 dagen (30 ° C), totdat gistcellen verschijnen wit en pluizig.
- Inoculeer een strook van ongeveer 2 mm 2 van de verse cellen van de plaat in 10 ml YPD medium in een 50 ml conische polypropyleen centrifugebuis. Schud de buis bij 180 omwentelingen per minuut (rpm) gedurende de nacht (30 m ° C).
- Inoculeren 2 ml van de meer dan's nachts cultuur per liter YPD medium in een 2 L Erlenmeyer of erlenmeyer. Schudden bij 180 rpm (30 ° C). Monitor celgroei bij een optische dichtheid van 600 nm (OD 600) tot late log-fase, OD 600 van 1,8 tot 2, gewoonlijk 20-24 uur.
- Oogsten S. cerevisiae Cells
- Oogst cellen door centrifugeren bij 5400 xg gedurende 15 minuten (4 ° C).
- Snel Decanteer het supernatant en houdt cellen bij 4 ° C of op ijs.
- In suspensie liter celpellet met 2 ml gekoeld Lysis Buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 300 mM NaCl, 10 mM KCI, 0,2 mM EDTA, pH 8,0, 5 mM imidazol, pH 8,0; 10% glycerol; 0,1% v / v NP-40). Opschorten cellen door zwenken en / of herhaalde pipetteren met een 10 ml serologische pipet.
Opmerking: Het belang van NP-40 als het gaat om complexe kwaliteit en nazuivering analyse wordt hieronder besproken. - Breng de celsuspensie in een lege 50 ml conische polypropyleen centrifugebuis kEPT op ijs. Was elke centrifugefles met een additionele 2 ml gekoelde Lysis Buffer en aan de celsuspensie in de 50 ml buis.
- Bepaal het natte gewicht van celpellet door weging van de buis af te trekken van het gewicht van de lege buis en de toegevoegde Lysis Buffer.
Opmerking: Een liter celkweek met een OD 600 van 1,8 is ongeveer 10 gram. - Maak een vloeibare stikstof bad in een 50 ml conische polypropyleen centrifugebuis. Trekken gesuspendeerde cellen in een 5 ml spuit. Sluit een 16 G naald op de spuit. Bevries de celsuspensie door het door de spuit / naald cell genereren "druppeltjes". Snelheid van bevriezing moet ongeveer 1 min / ml zijn.
- Bewaar bevroren cel druppeltjes (-80 ° C) of overgaan tot lysis.
- Lyseren van cellen en Lysate Verduidelijking
- Lyseren van de gistcellen met een koffiemolen. Lyse cellen acht tot negen keer met 25 sec slijpen uitbarstingen onder schudden de coffee molen. Voor gebruik pre-koel de koffiemolen met vloeibare stikstof. Elke twee rondes van slijpen, voeg een dun laagje vloeibare stikstof aan de molen en laten verdampen.
- Roer met een vloeibare stikstof gekoelde spatel behoefte om cellen klonteren houden. Wees voorzichtig te ontdooien van de cellen, hetgeen kan resulteren in cel klonteren te voorkomen. De cellen moeten verschijnen als een fijn wit poeder na lysis. Maximaal celpellet van 4 liter gistcultuur (~ 40 g) kan worden gemalen tegelijk.
Noot: Opmerkingen met betrekking Werkwijze lysis worden hieronder besproken. - Beoordeel de mate van cellyse met behulp van een hemocytometer of alternatieve cel telmethode. Om een adequate analyse te bieden, neem dan de volgende voorbeelden: (1) voor lysis; (2) na vier ronden van lysis; en (3) na lysis. Om deze monsters te controleren, neem een kleine hoeveelheid cellen met een vloeibare stikstof gekoelde spatel en plaats in een 1,5 ml buis.
- Zodra de cellen zijn ontdooid, pipet 5 ul cellenen meng met 495 pl water. Als 40-60% lysis van de cellen wordt waargenomen, gaat u naar de volgende stap in het protocol.
Noot: Opmerkingen met betrekking effect van langere lysis worden hieronder besproken. - Als voldoende lysis waargenomen, opslag gelyseerde cellen (-80 ° C) of doorgaan naar de volgende stap.
- Bereid twee 50 ml kegelvormige polypropyleen centrifugebuisjes met elk 15 ml Lysis Buffer, zoals 1 mM fenylmethaansulfonylfluoride (PMSF), 1 mM dithiothreitol (DTT), en een commercieel verkrijgbare cocktail van proteaseremmers.
Opmerking: Als significante proteolyse is waargenomen, overwegen gebruik van een protease deficiënte stam. - Gebruik een vloeibare stikstof gekoelde spatel schep de bevroren gelyseerde cel poeder in de voorbereide 50 ml buizen. Voeg de celpoeder / vast stapsgewijs de Lysis Buffer, die zowel een reductiemiddel en proteaseremmer (s).
- Draai de 50 ml buizen voorzichtig bij kamertemperatuur teneinde ontdooien / ontbinding van de cellen, maar ook om te voorkomen dat luchtbellen de vorming. EENis de cel poeder / vast oplost, voeg extra cel vast / poeder.
- Vult elk van de twee 50 ml buisjes tot elk ongeveer 20 g cellen of alle cellen toegevoegd. Verder ontdooien / oplossen totdat er geen ingevroren cel klonten waargenomen in de 50 ml buizen. Dit duurt ongeveer 50 minuten duren.
- Centrifugeer de zwevende cellysaat gedurende 20 minuten bij 25.000 xg (4 ° C). Gunstig gelyseerde cellen kan een kleine hoeveelheid zwarte neerslag vertonen.
- Breng de 50 ml van de bovenstaande om ultra-centrifuge buizen (26,3 ml buizen gebruikt) polycarbonaat en voeg 10 ul 200 mM PMSF aan elke volle buis.
- Centrifugeer gedurende 1 uur bij 100.000 xg (4 ° C). Vier lagen zichtbaar zijn, van onder naar boven: (1) een harde duidelijke pellet, met ribosomale complexen; (2) een zachte vetrijke pellet; (3) een grote heldere gele getinte laag die het grootste deel van oplosbare eiwitten en complexen van de cel; en (4) een 'geschubd' toplaag bestaande uit lipiden.
- Voer alle subsequent stappen in een koude ruimte (4 ° C). Verwijder zoveel van de top 'geschubd' lipidelaag mogelijk onder toepassing van een 1 ml pipet en gooi. Gebruik een 10 ml serologische pipet tot de meeste van de gele, heldere laag herstellen.
- Herstellen van de laatste paar ml van deze laag met behulp van een 1 ml pipet om te voorkomen dat de onderste twee lagen te verstoren. Vanaf 40 g natte cel pellet wordt ongeveer 48 ml van de middelste laag meestal hersteld en 8 ml lipide laag verwijderd / weggegooid.
Opmerking: kolomzuivering stroom wordt sterk belemmerd door de aanwezigheid van lipiden, waarbij ook de kwaliteit van het complex kan verminderen, hieronder besproken.
2. Kolom Zuivering stap 1: IgG Chromatography
- Hars Evenwicht en Binding
- Bereid een 300 ul IgG-Sepharose suspensie van 40 g celpellet. Snijd het uiteinde van een 1 ml pipet tip vergemakkelijking pipetteren de suspensie. Wassen / equilibreren de IgG hars drie keer met telkens 5 ml IgGD150 BuffeR (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 150 mM NaCl, 150 mM KCl, 1 mM MgCl2, 5 mM imidazool, pH 8, 0,1% v / v NP-40, 1 mM DTT, een proteaseremmer tablet per 50 volume ml).
- Spin tot pellet bij 160 xg (4 ° C) tussen de wasbeurten en verwijder supernatant.
- Draai de IgG hars met de middenfase supernatant en twee mini proteaseremmer tabletten per 40 g cellen met een geschikte rotator, gedurende 2 uur (4 ° C). Dit is de IgG batchoplossing.
- Bereid twee 10 ml poly-prep kolommen voor gebruik door het snijden van het uiteinde van de kolom een vlakke snede produceren. De verpakking en wassen van de kolom door zwaartekracht versnellen, laadt maximaal 200 ui gepakte IgG hars of ~ 25 ml van de IgG batchoplossing per 10 ml kolom.
- Giet de IgG batchoplossing in de kolom en laat bezinken door zwaartekracht. Als sedimentatie langer duurt dan 30 minuten, is er zeer waarschijnlijk was lipide-besmetting bij het herstellen van het midden fase uit de centrifuge tUbes.
- Was de gepakte kolom met vier opeenvolgende 10 ml volumes van IgGD150 Buffer.
- Bereid een 300 ul IgG-Sepharose suspensie van 40 g celpellet. Snijd het uiteinde van een 1 ml pipet tip vergemakkelijking pipetteren de suspensie. Wassen / equilibreren de IgG hars drie keer met telkens 5 ml IgGD150 BuffeR (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 150 mM NaCl, 150 mM KCl, 1 mM MgCl2, 5 mM imidazool, pH 8, 0,1% v / v NP-40, 1 mM DTT, een proteaseremmer tablet per 50 volume ml).
- Op Column TEV Splitsing
- Sluit de onderkant van de kolom en voeg 1 ml IgGD150 buffer en 100 ul van TEV protease (0,6 mg / ml bouillon, mutant variant S219V van TEV geproduceerd in-house). Dicht de top van de kolom en meng gedurende 20 min (18 ° C) met een thermische mixer, schudden bij 750 rpm. Resuspendeer hars en meng opnieuw gedurende 20 min, herhaal opnieuw gedurende een totaal van 1 uur incubatie.
Opmerking: Het is cruciaal om de incubatietijd tot een minimum. - Zet de kolom 4 ° C en elueer het eiwit / complex met zwaartekracht. Elueer de dode-volume met een extra 200 ul van IgGD150 Buffer.
- Sluit de onderkant van de kolom en voeg 1 ml IgGD150 buffer en 100 ul van TEV protease (0,6 mg / ml bouillon, mutant variant S219V van TEV geproduceerd in-house). Dicht de top van de kolom en meng gedurende 20 min (18 ° C) met een thermische mixer, schudden bij 750 rpm. Resuspendeer hars en meng opnieuw gedurende 20 min, herhaal opnieuw gedurende een totaal van 1 uur incubatie.
3. Kolom Zuivering Stap 2: calmoduline affiniteitschromatografie
- Hars Evenwicht en Binding
- Bereid 200 pi calmoduline affiniteit hars per 40 g celpellet. Was de hars drie keer met telkens 5 ml calmoduline bindingsbuffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 150 mM NaCl, 10 mM KCI, 1 mM MgCl2, 5 mM imidazool, pH 8; 2 mM CaCl2; 0,1 % v / v NP-40, 10 mM β-mercaptoethanol), centrifugeren bij 160 xg (4 ° C) tot pellet per wasbeurt.
- Aan elk 1 ml IgG eluaat, voeg 3 volumes Calmodulin Binding Buffer. Het calciumgehalte constant te houden, voeg CaCl 2 en β-mercaptoethanol overeenkomt met het ontbreken van deze bestanddelen in de IgG elutie. Eindconcentraties moet 2 mM CaCl2 en 10 mM β-mercaptoethanol.
- Voeg het monster op de hars en calmoduline bindt gedurende 1 uur (4 ° C) met een buis rotator.
- Verpakking en het elueren van Calmodulin Resin
- Bereid een 2 ml poly-prep kolom per 100 pl calmoduline slurry door het snijden van het einde van de kolom tot vlakke opening te creëren. Laad niet meer dan 100 ul Calmodulin slurry per column de hoeveelheid hars van het monster te minimaliseren in contact komt tijdens elutie.
- Verpak de kolom door de zwaartekracht en was de hars in de kolom driemaal met 5 ml Calmodulin Binding Buffer.
- Elueer eiwit met toevoeging van 200 gl calmoduline elutiebuffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 150 mM NaCl, 10 mM KCI, 1 mM MgCl2, 5 mM imidazool, pH 8,0, 4 mM EGTA, pH 8,0, 0,08% v / v NP-40, 10 mM β-mercaptoethanol). Herhaal zesmaal de toevoeging van 200 pl elutiebuffer Calmodulin.
- Voor eluties 1-3, passen het volume op de kolom en verzamel het eluaat onmiddellijk. Eluering 4, sluit de bodem van de kolom en incubeer met elutiebuffer voor 2,5 minuten en daarna ontsluiten en laat elueren door zwaartekracht. Voor elutie 5, incubeer gedurende 5 minuten en daarna ontsluiten en te elueren. Voor elutie 6, incubeer gedurende 10 minuten en daarna ontsluiten en te elueren.
Opmerking: De integriteit van het complex kan variëren eluties / fracties (zie representatieve resultaten sectie) <./ Li> - Dialyseren eluties 2-6 individueel 's nachts met behulp van een geschikte micro dialyse methode. Dialyseer de fracties tegen dialysebuffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 150 mM NaCl, 10 mM KCI, 1 mM MgCl2, 5 mM imidazool, pH 8, 10 mM β-mercaptoethanol).
Opmerking: NP-40 niet merkbaar passen, of helemaal door het dialysemembraan.
4. Post-Purification Analyses Complex kwaliteit te beoordelen
- Inheemse Gel en zilverkleuring
- Bereid een 4-16% geprefabriceerde natieve gel analyse van het complex volgens de instructies van de fabrikant. Gebruik van een geschikt molecuulgewicht eiwitstandaard en belasting 15 pi van elk van de gedialyseerde Calmodulin elution / fracties op de gel.
- Electrophorese de gel bij 150 V gedurende ongeveer 3 uur (4 ° C).
- Zilverkleuring de gel om de kwaliteit van elk van de zes eluties beoordelen. U kunt ook gebruik maken van even gevoelig commercieelfluorescerende vlek (s). In deze fase, de concentratie van het complex is waarschijnlijk beneden het detectieniveau van Coomassie blauw kleuring.
- Extra Gel Analysis Methods
- Om eiwit door Western blotting te sporen, het oplossen van het complex door middel van SDS of inheemse PAGE en vervolgens sonde de gel voor de Calmodulin Binding Peptide (CBP) epitoop met behulp van een TAP tag antilichaam volgens de instructies van de fabrikant.
- Met een specifieke fluorescentiekleurstof (s), bevestigt de aanwezigheid en integriteit van eiwit en / of nucleïnezuur in een TAP gezuiverde complex. Zorg ervoor dat er geen spectrale overlap wordt gedetecteerd tussen deze vlekken.
- Negative Stain Electron Microscopy Visualization
- Gebruik continu carbon grids glow-ontladen bij -15 mA voor 30 sec, binnen 30 minuten van complexe applicatie.
- Toepassen 3 pl TAP gezuiverde complex (kenmerkend bij een concentratie van 1 nM) op raster. Incubeer gedurende een minuut. blot from de zijkant van het rooster om overtollige buffer te verwijderen.
- Was tweemaal met 20 ul druppels gedemineraliseerd water. Side vlek tussen de wasbeurten.
- Solliciteer grid naar een 50 ui negatieve daling vlek en incubeer gedurende een min. Kleuring met uranyl acetaat (2%) of uranyl formiaat (0,75%) aanbevolen.
Let op: Uranyl zouten en oplossingen zijn zwak radioactief en bevatten heavy metal. Deze moeten met zorg worden behandeld en al het materiaal dat in contact komt met deze oplossingen dienen te worden vernietigd volgende institutionele aanbevolen richtlijnen afval. - Solliciteer grid naar een frisse 50 pi druppel negatieve vlek, zonder te deppen. Incubeer voor een min, daarna side vlek, en ten slotte de lucht drogen en te visualiseren.
- Cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM) Visualisatie
- Uitvoeren cryo-EM TAP gezuiverde complex, maar optimalisatie nodig, volgens het protocol van de fabrikant.
Let op: Aanwezigheid van detergent bij hoge concentraties may belemmeren vooruitgang en wordt hieronder besproken.
- Uitvoeren cryo-EM TAP gezuiverde complex, maar optimalisatie nodig, volgens het protocol van de fabrikant.
5. Complex opslag
- Het voorbereiden van Complex voor opslag
- Concentreer het complex, indien nodig, onder toepassing van een centrifugaal filter met een geschikte molecuulgewicht cut-off van het complex. Spin bij 14.000 xg gedurende stappen van 1 minuut tot de gewenste concentratie is bereikt.
Opmerking: NP-40-concentratie zal toenemen in de concentratie tijdens het concentreren, omdat het niet door het filter noch dialysemembraan niet doorstaat. - Flash bevriezen het complex in 30 gl aliquots in vloeibare stikstof of droogijs gekoelde ethanol bad en bewaar bij -80 ° C.
- Concentreer het complex, indien nodig, onder toepassing van een centrifugaal filter met een geschikte molecuulgewicht cut-off van het complex. Spin bij 14.000 xg gedurende stappen van 1 minuut tot de gewenste concentratie is bereikt.
- Optioneel Post-Zuivering Verwijdering van Wasmiddel
Opmerking: De aanwezigheid van een detergens zoals NP-40 en bij een concentratie boven die van de kritische micelconcentratie kunnen belemmeren of voortgang remmen voor sommige toepassingen. De gevolgen van zijn verwijdering uit de protocol en vervanging door andere additieven of co-oplosmiddelen worden hierna besproken. Als er geen NP-40 gewenst, de mogelijkheid om een commerciële toepassing voor het verwijderen gebruiken, bijvoorbeeld Bio-parels.
- Pre-equilibreert in de handel verkrijgbaar detergent absorberende korrels in Dialyse buffer. Meng vijf korrels per 30 gl complex (meestal 10 nM concentraties).
- Incubeer geëquilibreerd korrels uit stap 5.2.1 TAP gezuiverde complex voor 15 min op ijs. Gebruik complex binnen een paar uur na het verwijderen van het wasmiddel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een gewijzigde TAP methode werd gebruikt voor het zuiveren uit S. cerevisiae de U1 snRNP, een 18-subunit ribonucleoproteïnecomplex. Een eerste TAP zuivering van het complex na het gepubliceerde protocol 2,3 leverde een complex dat heterogene verschenen, migreren drie banden op een met zilver gekleurde natieve polyacrylamidegel (Figuur 2A). Meerdere ronden optimalisatie TAP methode leverde een complex dat primair als een enkele band migreerden op een natieve gel indicatief voor een homogenere samenstel (Figuur 2A). Met fluorescerende kleurstoffen kleur wordt zowel eiwit en nucleïnezuur, werd vastgesteld dat de gezuiverde complex had zowel biopolymeren aanwezig (figuur 2B).
Het gezuiverde complex werd geanalyseerd door SDS PAGE en Western blotting met een TAP tag antilichaam (Figuur 3A). In overeenstemming met de native cagel, het complex gezuiverd volgens het gepubliceerde protocol vertoonde proteolyse van de TAP gelabeld eiwit (Snu71). De hoeveelheid proteolyse echter significant verlaagd met modificaties van de TAP methode. Bijna alle zeventien eiwitten in de U1 snRNP complex werden gescheiden door SDS PAGE en geidentificeerd door MALDI massaspectrometrie (figuur 3B). Behalve de typische en SDS PAGE werd vastgesteld complex kwaliteit in verschillende stadia van de zuivering door negatieve kleuring elektronenmicroscopie (Figuur 4). De monodisperse deeltjes waargenomen in Figuur 4A en B, maar afwezig 4C voorbeelden van goede monster voor structurele studie. Deze analysemethode geleverd kritisch inzicht in de impact van wijzigingen in de TAP methode.
TAP methode vraagt om de opname van het niet-ionogeen detergens NP-40 en op een concentration boven die van zijn kritische micel concentratie (CMC). De robuustheid van de methoden om de kwaliteit van de in het protocol beschreven complex goed aangetoond door een experiment waarbij de zwitterionische surfactant CHAPS, glycerol of geen co-oplosmiddel werd vervangen NP-40 in alle buffers (Figuur 5). Door native PAGE en negatieve vlek EM, de U1 snRNP blijkt het meest homogeen en stabiel in NP-40 met afnemende stabiliteit van CHAPS glycerol geen co-oplosmiddel toegevoegd. Het kan zijn dat de gist U1 snRNP een hydrofoob gezicht en de aanwezigheid van NP-40 voorkomt aggregatie door het bekleden deze oppervlakte. Helaas kan NP-40 niet worden verwijderd door dialyse en concentratie van het complex Aldus concentreert de NP-40. Terwijl de hogere NP-40 bleek niet het complex verstoren, heeft zij negatieve invloed op de bevriezing van het deeltje in glasvocht ijs cryo-EM en grote micel-achtige aggregaten waargenomen. Detergens absorberende korrels werden met succes gebruikt om rerwijderen de meeste NP-40 van de U1 snRNP monster zonder lijkt te beïnvloeden de complexe structuur.
Na de zuivering van het complex met de modificaties beschreven in het protocol, een complex geschikt voor zowel negatieve vlek en cryo-EM werd verkregen, zoals blijkt uit beelden van het gazon deeltjes en onderscheidende representatieve klasgemiddelden (figuur 6).
Figuur 1. Overzicht van de Tandem Affinity Purification (TAP) methode. (A) Schematische voorstelling van de tweestaps TAP methode. Complex plaats (grijs) een TAP hebben subeenheid (zwart; U1 snRNP subeenheid Snu71) genomisch gefuseerd met een sequentie omvattende een calmoduline bindend peptide (CBP, groen), een herkenningsplaats voor het plaats-specifieke protease TEV (blauw), en twee IgG-bindende gebieden van Proteïne A (Pr A , Rood). In de 1e trap wordt cellysaat geïncubeerd met IgG hars en het complex wordt vastgehouden via de interactie met de proteïne A sequentie. Het complex wordt vrijgemaakt uit de hars door TEV gemedieerde klieving. In de 2e trap wordt het complex geïncubeerd met een Calmodulin hars, een Ca2 + afhankelijke reactie. Het complex wordt vrijgegeven door toevoeging van de Ca2 + chelator EGTA. (B) Western blot na een TAP gelabeld eiwit via zuiveringsstappen getoond in (A). Monsters werden genomen cellysaat na de 1e stap en na de 2e stap TAP methode. De reactieve proteïne waargenomen in cellysaat migreert sneller na de 1e stap, na TEV protease-splitsing en daarmee het verlies van de proteïne A sequentie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
ure 2 "src =" / files / ftp_upload / 54389 / 54389fig2.jpg "/>
Figuur 2. Optimalisatie van de TAP methode. (A) Silver gekleurde gel inwoner van TAP gezuiverd complexen. Inheemse PAGE van: eiwit standaard (laan 1); complex gezuiverd volgens originele TAP methode 3 (baan 2), drie banden waargenomen (pijlpunten); drie opeenvolgende eluties uit dezelfde TAP zuivering volgende wijzigingen aan buffer, twee banden waargenomen (pijlpunten) (lanen 3-5); verdere wijzigingen in de TAP-methode, waarbij in de eerste plaats een enkele complexe band migreren bij ~ 800 kDa (laan 6). (B) Analyse van de samenstelling van een gezuiverde complex door kleuring een enkele gel laan met zowel eiwitten en RNA reactieve vlekken. Inheemse PAGE van: eiwit standaard (laan 1) gekleurd met een fluorescerende eiwit vlek; complex afgebeeld met eiwit fluorescentiekleurstof (laan 2), twee banden waargenomen; rijstrook in laan 2, nu afgebeeld met een nucleïnezuur fluorescentiekleurstof (laan 3), twee banden waargenomen; en fluorescerende signaal overleg van gebrandschilderd complex in lanen 2 en 3 (baan 4). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Optimalisatie van TAP-methode. (A) Western blot analyse van verbetering in kwaliteit complexe na TAP hebben subeenheid Snu71 gemerkt met α-TAP antilichaam. Meerdere banden geproteolyseerd hiervan zichtbaar (baan 1), maar verbeteringen vermindering van de hoeveelheid lagere banden aanzienlijk (lanen 2 en 3). (B) als vertegenwoordiger SDS-gel gekleurd met een fluorescent eiwit gel stain. Gel lost 12 van het 17 eiwit subeenheden van het complex. Identiteit van eiwit in de band werd opgericht door middel van massaspectrometrie. Klik hier om een larg bekijkenER versie van deze figuur.
Figuur 4. Voorbeeld Kwaliteit tegen Fasen in de TAP methode beoordeeld door Negative Stain Electron Microscopy Beoordeling door negatieve kleuring elektronenmicroscopie van complexe na:. (A) de 1 ste stap van TAP; (B) de 2e stap van TAP; (C ) complex gedestabiliseerd. Schaal bar, 125 nm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5. Impact op de kwaliteit van het monster van additieven die voor TAP Methode Buffers Lanes. 1 - 4 zijn de eerste vier eluties van de definitieve of 2e stap van TAP zuivering van complex gezuiverd in aanwezigheid van: (A) de niet-ionische detergens nonyl phenoxypolyethoxylethanol (NP-40), geanalyseerd door natieve PAGE (boven) en negatieve kleuring EM (beneden), (B) het zwitterionische detergens 3 - [(3- cholamidopropyl) dimethylammonio] -1-propaansulfonaat (CHAPS), door native PAGE (boven) en negatieve vlek EM (onder) geanalyseerd; (C) glycerol, door native PAGE (boven) en negatieve vlek EM (onderaan) geanalyseerd; en (D) geen additief, door native PAGE (boven) en negatieve vlek EM (onder) geanalyseerd. Schaal bar, 50 nm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6. Visualisatie van TAP methode Gezuiverd Complex. (A) Top, een representatief beeld van een negatieve vlek elektron Micrpy (EM) microscoop. Waargenomen is een grasveld van soortgelijk gevormde deeltjes worden twee boxed, gezuiverd door de geoptimaliseerde TAP methode. Bottom, een selectie van de klasse gemiddelde genomen van de deeltjes die deeltjes onderscheidende kenmerken te benadrukken. Schaal bar, 50 nm. (B) Top, een representatief beeld van een cryo-EM microfoto. Waargenomen zijn regio's van hoger contrast vertegenwoordiger van deeltjes, zie twee van dergelijke regio's boxed. Bottom, klasse gemiddelden van geselecteerde deeltjes bevroren in glasvocht ijs. Schaal bar, 50 nm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De TAP-methode maakt gebruik van twee tags die een behoefte in evenwicht te brengen voor kleine en selectieve binding aan een affiniteit hars met een verlangen om te handhaven in de buurt van fysiologische oplossing omstandigheden. Dit evenwicht dient stabiele interactie (s) van het gecodeerde eiwit samenwerkende factor (en) voor post-zuivering karakterisering behouden. Tevens is een TAP hebben ORFs zijn verkrijgbaar bij een commerciële bron, zodat men elke giststam te verkrijgen met een gemerkt eiwit voor gist complex. De integriteit van een complex en de aanwezigheid van een middel voor gebruik van verschillende gemerkt eiwit subeenheden testen in een complex voor zuivering twee voordelen voor het gebruik van de TAP werkwijze voor het zuiveren van een natief complex. Echter, werd de oorspronkelijke methode TAP protocol niet opgesteld teneinde te garanderen dat de gezuiverde complex qua samenstelling en structureel homogeen. TAP methode is daarom gewijzigd, zoals hierboven beschreven, om dit doel te bereiken.
diversstappen in TAP methode werden beoordeeld aan de optimale aanpak en de voorwaarden voor een compositorisch en structurele homogene complexe zuiveren vast te stellen. Een vroege cruciale stap is cellysis. Deze stap vereist een evenwicht tussen iemands wens voor een hoog rendement en dus maximale lysis, terwijl verzekeren dat het verkregen complex van hoge kwaliteit, dat wil zeggen homogeen. Verschillende benaderingen van lyseren gistcellen werden onderzocht, inclusief het gebruik van een kraal-beater, high pure vloeistof processor, en de bal molen. Gebruik van de goedkopere koffiemolen minder efficiënt dan de andere methoden (40-60% lysis), maar het complex geïsoleerd en gezuiverd verschenen monodisperse terwijl een aantal van deze benaderingen bleek ofwel verstoren deeltjesintegriteit of veroorzaken aggregatiegraad. Uiteindelijk werd een groot aantal cellen niet gelyseerd voege hoogwaardige complex werd verkregen. Terwijl de 40 - 60% lysis is ideaal voor de gist U1 snRNP, is optimalisatie voorgesteld bij de toepassing van dit protocol om een nieuwe biologische complex.
Het is kritisch voor de stappen in de werkwijze die zuivering kunnen versnellen zodat complexe integriteit niet door cellulaire proteasen, subunit dissociatie werd gecompromitteerd zijn als gevolg van verdunning identificeren en uitgebreide incubatie bij 18 ° C gedurende TEV protease splitsing. Een eenvoudige stap om tijd efficiënte zuivering te bereiken was om ervoor te zorgen dat de lipiden niet over te dragen uit de vroege lysaat opheldering, omdat lipiden belemmeren doorstroming tijdens de zwaartekracht zuivering. Andere stappen inclusief het identificeren van een optimale balans van de hoeveelheid hars en kolom grootte / afmetingen voor een efficiënte zuivering en een maximum debiet te bereiken. Een bijzonder kritisch stap was om de tijd van on column splitsing te verminderen door TEV protease. De TEV protease die werd gezuiverd huis vrij en bij een hoge concentratie 17 ervoor zorgen dat het protease / nuclease. Aanzienlijke hoeveelheden TEV protease gebruikt om complete splitsing te verkrijgen binnen een uur.
NHOUD "> In de eerste TAP zuiveringen proteolyse werd waargenomen. Proteolyse tijdens de zuivering kan worden beperkt door efficiënt te werken, het toevoegen van een batterij van remmers, en ook in de zuivering hoog zoutgehalte wasbeurten. Een breed scala aan proteaseremmers over de eerste helft van de zuivering geleverde sterk verbeterde de stabiliteit van de TAP gelabeld eiwit en ontvangen. Daarnaast werd proteolyse geminimaliseerd door meer monovalente concentratie van 300 tot 500 mM in de cel lysis en IgG zuiveringsstappen. Zelfs met de bovenstaande wijzigingen TAP methode opeenvolgende geëlueerde fracties off van de CBP affiniteit hars gevarieerd in de mate van compositorische homogeniteit. Zo selectieve bundeling van de fracties uit de tweede, CBP chromatografiestap, is gerechtvaardigd.Een aspect van TAP methode die speciale aandacht kreeg was het belang van de niet-ionische detergens NP-40 tot complexe zuivering en bij een concentratie boven de CMC. De aanwezigheid van NP-40 bij een concentratie van 0,08% of hoger vertoonde een gunstige invloed op complexe integriteit en de uiteindelijke opbrengst. De schijnbare gunstige effect (en) NP-40 kan deels het gevolg zijn het verminderen van niet-specifieke interacties tussen de hars en complex. Terwijl NP-40 blijkt een gunstig effect tijdens de zuivering kan worden verwijderd na zuivering zonder dat complex aggregatie.
Tenslotte cruciaal voor optimaliseren van de TAP werkwijze voor structurele studie waren verschillende complementaire testen gebruikt om de integriteit en homogeniteit van het complex te evalueren. Deze omvatten lichtverstrooiing en SDS natieve PAGE geprobed met de TAP antilichaam door Western blot en / of gekleurd met fluorescente kleurstoffen, alsmede negatieve kleuring elektronenmicroscopie. De wijzigingen aan de TAP werkwijze die hierin beschreven, leverde een homogene complex in voldoende hoeveelheden voor elektronenmicroscopie. Aanvullende wijzigingen moet worden aangebracht in de werkwijze voor TAP andere complexen, in het bijzonder een afschrikkenling van het belang van de NP-40.
Samenvattend kan de TAP zuiveringswerkwijze worden gebruikt om met succes te zuiveren macromoleculaire complexen van een eukaryotische bron van geschikte kwaliteit voor structurele studie. We hebben een geschikte benadering voor de zuivering van de S. gevestigde cerevisiae U1 snRNP en detail de stappen die zijn getroffen en de redenen voor veel van deze veranderingen. Voor andere complexen, stellen we voor dat de onderzoeker evenzo de stappen in het protocol, dat voldoende hoeveelheden en kwaliteit van complex kan opleveren verkennen. De stappen die moeten worden onderzocht zijn onder andere cellysis, zout en het type additief en concentraties zoals wasmiddel, en de gevoeligheid van het complex aan calcium en metaalchelator EGTA. Voorts is het essentieel voor de lange termijn studies die het complex kan worden ingevroren en ontdooid zonder verstoren structuur. Belangrijkste is dat men verschillende alternatieve manieren tijdens en na zuivering van de structuur van het complex assay. inheemse eennd SDS PAGE, negatieve vlek EM en lichtverstrooiing hebben ons goed in ons onderzoek naar de beste manier om een homogeen complex te zuiveren met behulp van de TAP methode geserveerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| S. cerevisiae TAP tagged strain | Open Biosystems | YSC1177 | This is the primary yeast strain used to develop the TAP protocol. Its background is S288C: ATCC 201388: MATa, his3Δ1, leu2Δ0, met15Δ0, ura3Δ0, SNU71::TAP::HIS3MX6 |
| Coffee grinder | Mr. Coffee | IDS77 | Used for cell lysis |
| Hemocytometer, Bright Line | Hausser Scientific | 3120 | Used to assess cell lysis |
| JA 9.100 centrifuge rotor | Beckman Coulter, Inc. | Used to harvest the yeast cells | |
| JA 20 fixed-angle centrifuge rotor | Beckman Coulter, Inc. | Used to clear the cell extract of non-soluble cellular material | |
| Ti 60 fixed-angle centrifuge rotor | Beckman Coulter, Inc. | Used to further clear the soluble cell extract | |
| Thermomixer | Eppendorf | R5355 | Temperature controlled shaker |
| Novex gel system | Thermo Fisher Scientific | ||
| IgG resin | GE Healthcare | 17-0969-01 | Sepharose 6 fast flow |
| Calmodulin resin | Agilent Technologies, Inc. | 214303 | Affinity resin |
| Protease inhibitor cocktail, mini tablets | Sigma Aldrich | 589297 | Mini cOmplete ultra EDTA-free tablets |
| Protease inhibitor cocktail, large tablets | Sigma Aldrich | 5892953 | cOmplete ultra EDTA-free tablets |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | Dissolved in isopropanol | ||
| 2 ml Bio-spin column | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 7326008 | Used to pack and wash the Calmodulin resin |
| 10 ml poly-prep column | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 7311550 | Used to pack and wash the IgG resin |
| Precast native PAGE Bis-Tris gels | Life Technologies | BN1002 | Novex NativePAGE Bis-Tris 4 - 16% precast polyacrylamide gels |
| NativeMark protein standard | Thermo Fisher Scientific | LC0725 | Unstained protein standard used for native PAGE. Load 7.5 μl for a silver stained gel and 5 μl for a SYPRO Ruby stained gel |
| Precast SDS PAGE Bis-Tris gels | Life Technologies | NP0321 | Novex Nu-PAGE Bis-Tris 4 - 12% precast polyacrylamide gels |
| PageRuler protein standard | Thermo Fisher Scientific | 26614 | Unstained protein standard used for Western blotting |
| SDS running buffer | Life Technologies | NP0001 | 1x NuPAGE MOPS SDS Buffer |
| TAP antibody | Thermo Fisher Scientific | CAB1001 | Primary antibody against CBP tag |
| Secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | 31341 | Goat anti-rabbit alkaline phosphatase conjugated |
| BCIP/NBT | Thermo Fisher Scientific | 34042 | 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate/nitro blue tetrazolium |
| Dialaysis units | Thermo Fisher Scientific | 88401 | Slide-A-Lyzer mini dialysis units |
| Centrifugal filter units, 100kDa MWCO | EMD Millipore | UFC5100008 | Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-100 membrane |
| Detergent absorbing beads | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 1523920 | Bio-bead SM-2 absorbants |
| SYBR Green II | Thermo Fisher Scientific | S-7564 | Flourescent dye for nucleic acid staining, when detecting with SYPRO Ruby present, use excitation wavelength of 488 nm and emission wavelength of 532 nm |
| SYPRO Ruby | Molecular Probes | S-12000 | Flourescent dye for protein staining, when detecting with SYBR Green II present, use excitation wavelength of 457 nm and emission wavelength of 670 nm |
| Copper grids | Electron Microscopy Sciences | G400-CP |
References
- Gavin, A. C., et al. Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes. Nature. 415 (6868), 141-147 (2002).
- Rigaut, G., Shevchenko, A., Rutz, B., Wilm, M., Mann, M., Seraphin, B. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nature Biotechnology. 17 (10), 1030-1032 (1999).
- Puig, O., et al. The tandem affinity purification (TAP) method: A general procedure of protein complex purification. Methods. 24 (3), 218-229 (2001).
- Vaillancourt, P., Zheng, C. F., Hoang, D. Q., Breister, L. Affinity purification of recombinant proteins fused to calmodulin or to calmodulin-binding peptides. Methods Enzymol. 326, 340-362 (2000).
- Braisted, A. C., Wells, J. A. Minimizing a binding domain from protein A. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (12), 5688-5692 (1996).
- Kapust, R. B., et al. Tobacco etch virus protease: mechanism of autolysis and rational design of stable mutants with wild-type catalytic proficiency. Protein Eng. 14 (12), 993-1000 (2001).
- Nallamsetty, S., et al. Efficient site-specific processing of fusion proteins by tobacco vein mottling virus protease in vivo and in vitro. Protein Expr Purif. 38 (1), 108-115 (2004).
- Ghaemmaghami, S., et al. Global analysis of protein expression in yeast. Nature. 425 (6959), 737-741 (2003).
- Howson, R., et al. Construction, verification and experimental use of two epitope-tagged collections of budding yeast strains. Comp Funct Genomics. 6 (1-2), 2-16 (2005).
- Cox, D. M., Du, M., Guo, X., Siu, K. W., McDermott, J. C. Tandem affinity purification of protein complexes from mammalian cells. Biotechniques. 33 (2), 267-268 (2002).
- Gully, D., Moinier, D., Loiseau, L., Bouveret, E. New partners of acyl carrier protein detected in Escherichia coli by tandem affinity purification. FEBS Lett. 548 (1-3), 90-96 (2003).
- Tharun, S. Purification and analysis of the decapping activator Lsm1p-7p-Pat1p complex from yeast. Methods Enzymol. 448, 41-55 (2008).
- Xu, X., Song, Y., Li, Y., Chang, J., Zhang, H., An, L. The tandem affinity purification method: an efficient system for protein complex purification and protein interaction identification. Protein Expr Purif. 72 (2), 149-156 (2010).
- Cheng, Y., Grigorieff, N., Penczek, P. A., Walz, T. A Primer to Single-Particle Cryo-Electron Microscopy. Cell. 161 (3), 438-449 (2015).
- Gottschalk, A., et al. A comprehensive biochemical and genetic analysis of the yeast U1 snRNP reveals five novel proteins. RNA. 4 (4), 374-393 (1998).
- Neubauer, G., Gottschalk, A., Fabrizio, P., Seraphin, B., Luhrmann, R., Mann, M. Identification of the proteins of the yeast U1 small nuclear ribonucleoprotein complex by mass spectrometry. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (2), 385-390 (1997).
- Lucast, L. J., Batey, R. T., Doudna, J. A. Large-scale purification of a stable form of recombinant tobacco etch virus protease. Biotechniques. 30 (3), 544-546 (2001).
