Rensning af Native komplekser for Strukturel Study Ved hjælp af en Tandem Affinity Tag Metode
Summary
The Tandem Affinity Purification (TAP) method has been used extensively to isolate native complexes from cellular extract, primarily eukaryotic, for proteomics. Here, we present a TAP method protocol optimized for purification of native complexes for structural studies.
Abstract
Affinity rensning tilgange har kunnet isolere indfødte komplekser for proteomisk karakterisering. Strukturel heterogenitet og en grad af kompositorisk heterogenitet en kompleks normalt ikke hindrer fremskridt i at gennemføre sådanne undersøgelser. Derimod bør et kompleks bestemt til strukturel karakterisering oprenses i en tilstand, der er både deres sammensætning og strukturelt homogen samt ved en højere koncentration end nødvendigt for proteomics. For nylig har der været betydelige fremskridt i anvendelsen af elektronmikroskopi for struktur bestemmelse af store makromolekylære komplekser. Dette har øget interessen for tilgange til at rense indfødte komplekser af tilstrækkelig kvalitet og mængde for strukturel bestemmelse ved elektronmikroskopi. Den (TAP) metode Tandem Affinity Purification er optimeret til at udtrække og rense en 18-underenhed, ~ 0,8 MDa ribonucleoprotein samling fra spirende gær (Saccharomyces cerevisiae) </em> egnet til negativ plet og elektronmikroskopi cryo mikroskopi. Heri er detaljeret de ændringer der er foretaget i TAP-metoden, begrundelsen for at gøre disse ændringer, og de tilgange taget til analyse for et deres sammensætning og strukturelt homogen kompleks.
Introduction
Mange store cellulære processer udføres af store protein og protein-RNA-komplekser 1. En betydelig flaskehals for udførelse biofysiske og strukturelle studier af sådanne komplekser er at opnå dem af en sådan kvalitet (dvs. homogenitet), og i en passende koncentration. Isolering af et kompleks fra en nativ kilde har mange fordele, herunder fastholdelse relevante post-transkriptionelle og / eller translationelle modifikationer af underenheder og forsikring ordentlig kompleks samling. Men store cellulære komplekser er ofte til stede i en celle ved et lavt kopiantal og oprensningen skal være højeffektive og forekommer under tæt fysiologiske betingelser for at sikre kompleks integritet bevares. Oprensning af et kompleks fra en eukaryot kilde er særligt udfordrende og kan være økonomisk prohibitiv. Således er strategier eller metoder, der er effektive og giver en homogen kompleks meget ønsket.
En strategi, der har væretsucces med oprensning native komplekser fra eukaryote celler for deres første karakterisering er Tandem Affinity Purification (TAP) metode 2,3. TAP metode blev oprindeligt udviklet til at oprense et nativt protein fra knopskydende gær (S. cerevisiae) i kompleks med interagerende faktor (er) 2. TAP metode anvendes to tags, hvert mærke fusioneret i tandem til det samme protein-kodende gensekvens. Mærkerne blev valgt således, at afbalancere et behov for stram og selektiv binding til en affinitet harpiks med et ønske om at opretholde nær fysiologisk opløsning betingelser. Denne balance tjener til at bevare en stabil interaktion (er) af det mærkede protein med interagerende faktor (er) for post-rensning karakterisering. Den genomisk inkorporeret TAP tag blev placeret for enden (C-terminal) af et protein-kodende gen og bestod af en sekvens, der koder for et calmodulinbindende peptid (CBP) efterfulgt af protein A – en tilsætning af lidt over 20 kDa til den mærkede protein. CBP er kort, 26 aminosyrer, og anerkendt af ~ 17 kDa protein calmodulin (CAM) i tilstedeværelse af calcium med en K D på i størrelsesordenen 10 -9 M 4. Protein A tag er større, bestående af to gentagelser af 58 rester med en kort linker mellem gentagelserne. Hver 58 aminosyrer gentagelse er anerkendt af immunglobulin G (IgG) med et K D ~ 10 -8 M 5. Mellem disse to tags blev indarbejdet en anerkendelse site for TEV protease, en endopeptidase fra Tobacco Etch Virus 6,7. Som illustreret i figur 1, i den første affinitet trin i fremgangsmåden TAP mærkede protein er bundet til en IgG harpiks via protein A. Det mærkede protein elueres ved på søjle spaltning ved tilsætning af TEV-protease, stedspecifikt spaltning mellem de to mærker. Dette er et nødvendigt skridt som interaktionen af IgG og protein A er meget stærk og kan kun være tilstrækkeligt forstyrret under denaturerende opløsning betingelser. Mangler en Protein Et tag proteinet bundet til CaM harpiks i nærvær af calcium og elueres fra denne harpiks med tilsætning af metalionen chelatoren EGTA (ethylenglycol tetraeddikesyre) (figur 1).
Snart efter indførelsen af den TAP-metoden, blev det brugt i en omfattende undersøgelse for at generere et "kort" af komplekse interaktioner i S. cerevisiae 8. Vigtigere er det, som en konsekvens af denne indsats en hel gær-TAP Tagged Open Reading Frame (ORF) bibliotek samt individuel TAP mærkede ORF 9 er tilgængelige fra en kommerciel kilde. Således kan man opnå nogen gærstamme med et mærket protein til enhver gær kompleks. Den TAP-metoden ansporede også modifikationer eller variationer af TAP-tag, herunder: dets anvendelse til rensning af komplekser fra andre eukaryote samt bakterieceller 10,11; udformningen af en "split tag", hvor protein A og CBP er placeret på forskellige proteiner 12; og tags ændret, således at imødekomme behovet for investigator, såsom følsomhed af komplekset til Ca2 + eller EGTA 13.
Nylige fremskridt i både instrumentering og metode har ført til betydelige fremskridt i anvendelsen af elektronmikroskopi (EM) for struktur bestemmelse, der har ført til høj, tæt atomare opløsning billeder af makromolekylære komplekser 14. Resolutionen opnåelig af et kompleks af EM forbliver dog betinget af kvaliteten af komplekset, der undersøges. Denne undersøgelse har udnyttet TAP tag tilgang til oprensning fra S. cerevisiae U1 snRNP, en 18-underenhed (~ 0,8 MDA) lavkopiantals ribonukleoproteinkompleks der er en del af spliceosome 15,16. Der er taget en række skridt til at rense denne komplekse sådan, at det er homogent og af en passende koncentration. Potentielle problemer på forskellige stadier af oprensningen er beskrevet og taget strategier til at overvinde challEnges fremhævet. Ved omhyggeligt at vurdere og optimere trin i oprensningen, U1 snRNP renset, er af en kvalitet og til en mængde egnet til negativ plet og elektron cryo mikroskopi (cryo-EM) undersøgelser. En optimeret TAP metodeprotokollen til oprensning af indfødte komplekser til strukturelle studier er beskrevet heri.
Protocol
Representative Results
Discussion
TAP fremgangsmåde anvender to koder, som afbalancerer et behov for stram og selektiv binding til en affinitet harpiks med et ønske om at opretholde nær fysiologisk opløsning betingelser. Denne balance tjener til at bevare en stabil interaktion (er) af det mærkede protein med interagerende faktor (er) for post-rensning karakterisering. Desuden individuel TAP mærkede ORF'er er tilgængelige fra en kommerciel kilde, så man kan opnå nogen gærstamme med et mærket protein til enhver gær kompleks. Bevare integri…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors are grateful for the support and advice of Nikolaus Grigorieff. We thank Anna Loveland, Axel Brilot, Chen Xu, and Mike Rigney for helpful discussions and EM guidance. This work was funded by the National Science Foundation, Award No. 1157892. The Brandeis EM facility is supported by National Institutes of Health grant P01 GM62580.
Materials
| S. cerevisiae TAP tagged strain | Open Biosystems | YSC1177 | This is the primary yeast strain used to develop the TAP protocol. Its background is S288C: ATCC 201388: MATa, his3Δ1, leu2Δ0, met15Δ0, ura3Δ0, SNU71::TAP::HIS3MX6 |
| Coffee grinder | Mr. Coffee | IDS77 | Used for cell lysis |
| Hemocytometer, Bright Line | Hausser Scientific | 3120 | Used to assess cell lysis |
| JA 9.100 centrifuge rotor | Beckman Coulter, Inc. | Used to harvest the yeast cells | |
| JA 20 fixed-angle centrifuge rotor | Beckman Coulter, Inc. | Used to clear the cell extract of non-soluble cellular material | |
| Ti 60 fixed-angle centrifuge rotor | Beckman Coulter, Inc. | Used to further clear the soluble cell extract | |
| Thermomixer | Eppendorf | R5355 | Temperature controlled shaker |
| Novex gel system | Thermo Fisher Scientific | ||
| IgG resin | GE Healthcare | 17-0969-01 | Sepharose 6 fast flow |
| Calmodulin resin | Agilent Technologies, Inc. | 214303 | Affinity resin |
| Protease inhibitor cocktail, mini tablets | Sigma Aldrich | 589297 | Mini cOmplete ultra EDTA-free tablets |
| Protease inhibitor cocktail, large tablets | Sigma Aldrich | 5892953 | cOmplete ultra EDTA-free tablets |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | Dissolved in isopropanol | ||
| 2 mL Bio-spin column | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 7326008 | Used to pack and wash the Calmodulin resin |
| 10 mL poly-prep column | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 7311550 | Used to pack and wash the IgG resin |
| Precast native PAGE Bis-Tris gels | Life Technologies | BN1002 | Novex NativePAGE Bis-Tris 4-16% precast polyacrylamide gels |
| NativeMark protein standard | Thermo Fisher Scientific | LC0725 | Unstained protein standard used for native PAGE. Load 7.5 μL for a silver stained gel and 5 μL for a SYPRO Ruby stained gel |
| Precast SDS PAGE Bis-Tris gels | Life Technologies | NP0321 | Novex Nu-PAGE Bis-Tris 4-12% precast polyacrylamide gels |
| PageRuler protein standard | Thermo Fisher Scientific | 26614 | Unstained protein standard used for Western blotting |
| SDS running buffer | Life Technologies | NP0001 | 1x NuPAGE MOPS SDS Buffer |
| TAP antibody | Thermo Fisher Scientific | CAB1001 | Primary antibody against CBP tag |
| Secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | 31341 | Goat anti-rabbit alkaline phosphatase conjugated |
| BCIP/NBT | Thermo Fisher Scientific | 34042 | 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate/nitro blue tetrazolium |
| Dialaysis units | Thermo Fisher Scientific | 88401 | Slide-A-Lyzer mini dialysis units |
| Centrifugal filter units, 100kDa MWCO | EMD Millipore | UFC5100008 | Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-100 membrane |
| Detergent absorbing beads | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 1523920 | Bio-bead SM-2 absorbants |
| SYBR Green II | Thermo Fisher Scientific | S-7564 | Flourescent dye for nucleic acid staining, when detecting with SYPRO Ruby present, use excitation wavelength of 488 nm and emission wavelength of 532 nm |
| SYPRO Ruby | Molecular Probes | S-12000 | Flourescent dye for protein staining, when detecting with SYBR Green II present, use excitation wavelength of 457 nm and emission wavelength of 670 nm |
| Copper grids | Electron Microscopy Sciences | G400-CP |
References
- Gavin, A. C., et al. Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes. Nature. 415 (6868), 141-147 (2002).
- Rigaut, G., Shevchenko, A., Rutz, B., Wilm, M., Mann, M., Seraphin, B. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nature Biotechnology. 17 (10), 1030-1032 (1999).
- Puig, O., et al. The tandem affinity purification (TAP) method: A general procedure of protein complex purification. Methods. 24 (3), 218-229 (2001).
- Vaillancourt, P., Zheng, C. F., Hoang, D. Q., Breister, L. Affinity purification of recombinant proteins fused to calmodulin or to calmodulin-binding peptides. Methods Enzymol. 326, 340-362 (2000).
- Braisted, A. C., Wells, J. A. Minimizing a binding domain from protein A. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (12), 5688-5692 (1996).
- Kapust, R. B., et al. Tobacco etch virus protease: mechanism of autolysis and rational design of stable mutants with wild-type catalytic proficiency. Protein Eng. 14 (12), 993-1000 (2001).
- Nallamsetty, S., et al. Efficient site-specific processing of fusion proteins by tobacco vein mottling virus protease in vivo and in vitro. Protein Expr Purif. 38 (1), 108-115 (2004).
- Ghaemmaghami, S., et al. Global analysis of protein expression in yeast. Nature. 425 (6959), 737-741 (2003).
- Howson, R., et al. Construction, verification and experimental use of two epitope-tagged collections of budding yeast strains. Comp Funct Genomics. 6 (1-2), 2-16 (2005).
- Cox, D. M., Du, M., Guo, X., Siu, K. W., McDermott, J. C. Tandem affinity purification of protein complexes from mammalian cells. Biotechniques. 33 (2), 267-268 (2002).
- Gully, D., Moinier, D., Loiseau, L., Bouveret, E. New partners of acyl carrier protein detected in Escherichia coli by tandem affinity purification. FEBS Lett. 548 (1-3), 90-96 (2003).
- Tharun, S. Purification and analysis of the decapping activator Lsm1p-7p-Pat1p complex from yeast. Methods Enzymol. 448, 41-55 (2008).
- Xu, X., Song, Y., Li, Y., Chang, J., Zhang, H., An, L. The tandem affinity purification method: an efficient system for protein complex purification and protein interaction identification. Protein Expr Purif. 72 (2), 149-156 (2010).
- Cheng, Y., Grigorieff, N., Penczek, P. A., Walz, T. A Primer to Single-Particle Cryo-Electron Microscopy. Cell. 161 (3), 438-449 (2015).
- Gottschalk, A., et al. A comprehensive biochemical and genetic analysis of the yeast U1 snRNP reveals five novel proteins. RNA. 4 (4), 374-393 (1998).
- Neubauer, G., Gottschalk, A., Fabrizio, P., Seraphin, B., Luhrmann, R., Mann, M. Identification of the proteins of the yeast U1 small nuclear ribonucleoprotein complex by mass spectrometry. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (2), 385-390 (1997).
- Lucast, L. J., Batey, R. T., Doudna, J. A. Large-scale purification of a stable form of recombinant tobacco etch virus protease. Biotechniques. 30 (3), 544-546 (2001).
