Abstract
Affinity подходы очистки были успешными в выделении родных комплексов для протеомики характеристик. Структурная неоднородность и степень композиционной неоднородности комплекса обычно не препятствуют прогрессу в проведении таких исследований. В отличие от этого, комплекс, предназначенный для структурной характеристики должны быть очищены в состоянии, которое является как композиционно и структурно однородными, а также при более высокой концентрации, чем требуется для протеомики. В последнее время были достигнуты значительные успехи в области применения электронной микроскопии для определения структуры крупных макромолекулярных комплексов. Это повысило интерес к подходам, чтобы очистить собственные комплексы достаточного количества и качества для структурного определения с помощью электронной микроскопии. Метод Tandem Affinity очистки (TAP) была оптимизирована для извлечения и очистки 18-субъединицу, ~ 0,8 МДа рибонуклеопротеиновый сборка из почкующихся дрожжей (Saccharomyces CEREVISIAE)
Introduction
Многие крупные клеточные процессы осуществляются крупные белковые и белково-РНК комплексов 1. Существенным препятствием для проведения биофизических и структурных исследований таких комплексов их получения подходящего качества (то есть, однородности) и при соответствующей концентрации. Разделительный комплекс из природного источника имеет много преимуществ, в том числе сохранение соответствующих пост-транскрипционные и / или трансляционные модификации субъединиц и надлежащего страхования сложной сборки. Тем не менее, крупные клеточные комплексы часто присутствуют в клетке при низком числе копий, и очистку должны быть высокоэффективным и происходят в условиях, близких физиологических условиях для обеспечения сложной целостность сохраняется. Очищающий комплекс из эукариотической источника является особенно сложным и может быть финансово запретительной. Таким образом, стратегии или методы, которые являются эффективными и дают однородный комплекс являются весьма желательны.
Стратегия, которая былауспешно очистки родных комплексов из эукариотических клеток для их первоначальной характеристике является метод Tandem Affinity очистки (TAP) 2,3. Метод TAP был первоначально разработан для очистки нативного белка из почкующихся дрожжей (S. CEREVISIAE) в комплексе с взаимодействующими фактор (ы) 2. Метод ТАР используются две метки, каждый тэг, слитый в тандеме с той же кодирующей белок последовательности гена. Теги были выбраны таким образом, чтобы сбалансировать потребность в жесткой и селективное связывание с аффинным смолой с желанием поддерживать почти физиологических условиях в растворе. Этот баланс служит для сохранения устойчивого взаимодействия (ов) меченого белка с взаимодействующими фактора (ов) для определения характеристик после очистки. Genomically включены ТАР тег был помещен в конце (С-концевой) гена кодирующей белок и состоит из последовательности, кодирующей кальмодулин связывающий пептид (CBP), а затем белок А - добавление чуть более 20 кДа, к помеченным белок. CBP короткая, 26 аминокислот, и распознаваться ~ 17 кДа белок Кальмодулин (САМ) в присутствии кальция с K D порядка 10 -9 М 4. Белок Тег больше, состоящий из двух повторах 58 остатков с коротким линкером между повторами. Каждый повтор 58 аминокислоты признается иммуноглобулина G (IgG) с K D ~ 10 -8 М 5. Между этими двумя тегами был включен сайт узнавания для TEV протеазы, эндопептидазы из вируса табачной Etch 6,7. Как показано на фиг.1, на первой стадии аффинной метода ПВР меченый белок связывается с IgG смолы с помощью Протеин А. меченый белок элюируют на колонке с расщеплением при добавлении TEV протеазы, сайт-специфически отщеплением между две метки. Это является необходимым шагом, как взаимодействие IgG и белок А является очень сильным и может быть адекватно возмущенных только в денатурирующих условиях решения. Не имея Protein теге, белок связывается с СаМ смолой в присутствии кальция и элюируют из смолы с добавлением металлического иона хелатор EGTA (этиленгликоль этилендиаминтетрауксусной кислоты) (рисунок 1).
Вскоре после того, как введение метода TAP, он был использован в крупномасштабном исследовании , чтобы сгенерировать "карту" сложных взаимодействий в S. CEREVISIAE 8. Важно отметить, что в результате этих усилий библиотека все дрожжи-TAP Tagged открытой рамки считывания (ORF), а также индивидуальной TAP помеченный ORF , 9 доступны из коммерческих источников. Таким образом, можно получить любой штамм дрожжей с меченый белок для любого дрожжевого комплекса. Метод TAP также стимулировало модификации или вариации TAP тега, в том числе: ее использование для очистки комплексов из других эукариотических, а также бактериальных клеток 10,11; дизайн "Половину метки", в котором белок А и ТПС размещаются на различных белков 12; и таГ.С. изменена, с тем, чтобы удовлетворить потребность исследователя, такие как чувствительность комплекса к Са 2+ или EGTA 13.
Последние достижения в области как инструментария и методологии привели к значительному прогрессу в области применения электронной микроскопии (ЭМ) для определения структуры, которые привели к высоким, близким к изображениям с атомарным разрешением макромолекулярных комплексов 14. Разрешение можно получить из комплекса Е.М., однако, по-прежнему зависит от качества комплекса при исследовании. Это исследование использовало подход TAP тег , чтобы очистить от S. CEREVISIAE и1 snRNP, 18-субъединица (~ 0,8 МДА) с низким числом копий рибонуклеопротеиновый комплекс , который является частью сплайсосома 15,16. Ряд шагов были приняты, чтобы очистить этот комплекс таким образом, что она однородна и адекватной концентрации. Потенциальные проблемы, возникающие на различных стадиях очистки описаны и стратегии, направленные на преодоление Challenges выделены. Путем тщательной оценки и оптимизации шаги в очистке, то U1 snRNP очищают имеет качество и в количестве, подходящем для отрицательного пятна и электронной микроскопии (крио крио-ЭМ) исследований. Оптимизированный ТАР протокол метод очистки нативных комплексов для структурных исследований описан здесь.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Примечание: Следующий протокол был разработан для очистки комплекса из 4 л клеточной культуры, приблизительно 40 г сырого веса клеток. После приготовления, все буферы должны храниться при температуре 4 ° С и использовать в течение месяца со дня их получения. Восстанавливающие ингибиторы протеазы агента и добавляются только буферы непосредственно перед использованием.
1. Получение полного клеточного экстракта для Tandem Affinity очистки
- Рост S. CEREVISIAE Клетки
- Streak желаемый TAP помеченный S. CEREVISIAE штамм от хранения (-80 ° C) на дрожжевой пептон декстроза (YPD) пластины. Выдержите в течение 3 - 5 дней (30 ° С), пока дрожжевые клетки не появляются белые и пушистые.
- Инокулируйте полоса размером примерно 2 мм 2 -х из свежих клеток из пластины в 10 мл YPD сред в 50 мл коническую полипропиленовую центрифужную пробирку. Встряхивать пробирку при 180 оборотов в мин (оборотов в минуту) в течение ночи (30 м ° С).
- Привить 2 мл за кадромночь культуры на литр YPD сред в 2 л Эрленмейера или коническую колбу. Встряска при 180 оборотах в минуту (30 ° C). Монитор не рост клеток при оптической плотности 600 нм (OD 600) до поздней лог - фазы, OD 600 от 1,8 до 2, обычно 20 - 24 часов.
- Сбор С. CEREVISIAE Клетки
- Урожай клеток путем центрифугирования при 5,400 мкг в течение 15 мин (4 ° С).
- Быстро сливают надосадочную жидкость и сохранить клетки при 4 ° С или на льду.
- Приостановка каждый литр клеточного осадка с помощью 2 мл охлажденной лизирующего буфера (10 мМ Трис-HCl, рН 8,0; 300 мМ NaCl, 10 мМ KCl, 0,2 мМ ЭДТА, рН 8,0; 5 мМ имидазола, рН 8,0; 10% глицерина, 0,1% об / об NP-40). Приостановить клеток с помощью закрученного и / или повторить пипеткой с использованием 10 мл серологические пипетки.
Примечание: Важность NP-40, как она относится к сложному качества и анализ после очистки обсуждается ниже. - Передача клеточной суспензии в пустой 50 мл конической полипропиленовой центрифужной пробирке кЕРТ на льду. Промыть каждую бутылку центрифуг с дополнительными 2 мл охлажденного лизирующего буфера и добавить к суспензии клеток в 50 мл трубки.
- Определение сырого веса клеточного осадка путем взвешивания трубки и вычитанием веса пустой трубы, а также добавлены лизирующего буфера.
Примечание: Литр культуры клеток , имеющей наружный диаметр 600 1,8 составляет примерно 10 г. - Создать ванну жидкого азота в 50 мл коническую полипропиленовую центрифужную пробирку. Draw суспендированные клетки в 5 мл шприца. Подключите 16 G иглу шприца. Замораживание суспензии клеток путем пропускания его через шприц / иглу, чтобы генерировать клетка "капли". Скорость замораживания должна составлять приблизительно 1 мин / мл.
- Хранить капли замороженных клеток (-80 ° C) или перейти к лизису.
- Лизирующий клетки и лизат Разъяснение
- Lyse дрожжевые клетки, используя кофемолку. Лизировать клетки от восьми до девяти раз с 25 сек размола очередями, а встряхивая грОффи мясорубки. Перед использованием предварительно охладить кофемолку с жидким азотом. Каждые два раунда шлифования, добавить неполную слой жидкого азота в мясорубке и дать ей испариться.
- Перемешать с жидким азотом охлажденным шпателем по мере необходимости, чтобы держать клетки от слипания. Соблюдайте осторожность, чтобы предотвратить таяние клеток, которые могут привести к клеточной слипания. Клетки должны появиться в виде тонкого белого порошка следующего лизиса. Максимальный осадок клеток из 4 л культуры дрожжей (~ 40 г) могут быть измельчены в то время.
Примечание: Замечания относительно метода лизиса обсуждаются ниже. - Оценить степень лизиса клеток с использованием гемоцитометра или альтернативный метод подсчета клеток. Для того, чтобы обеспечить адекватный анализ, принимать следующие образцы: (1) перед лизисом; (2) после четырех раундов лизиса; и (3) после лизиса. Для проверки этих образцов, возьмите небольшое количество клеток с жидким азотом охлажденным шпателем и поместить в 1,5 мл трубки.
- После того, как клетки размораживают, пипеткой 5 мкл клетоки смешать с 495 мкл воды. Если 40 - наблюдается 60% лизис клеток, переходите к следующему шагу в протоколе.
Примечание: данные наблюдений в отношении влияния длительных периодов лизиса обсуждаются ниже. - После того, как адекватный лизис наблюдается, магазин лизируют клетки (-80 ° С) или перейти к следующему шагу.
- Приготовьте два 50 мл коническую полипропиленовые центрифужные пробирки каждый с 15 мл лизирующего буфера, в том числе 1 мМ фенилметансульфонилфторид (ФМСФ), 1 мМ дитиотреитола (ДТТ), и коммерчески доступный коктейль ингибиторов протеазы.
Примечание: Если наблюдается значительная протеолиза, рассмотреть вопрос об использовании протеазы дефицитный штамм. - С помощью жидкого азота охлажденного лопаточку, чтобы выкопать замороженного лизису порошка клеток в подготовленные 50 мл пробирки. Добавьте порошок клеток / твердое вещество с приращением до лизирующего буфера, содержащие как восстановитель и ингибитор (ы) протеазы.
- Поворот 50 мл пробирки осторожно при комнатной температуре, с тем, чтобы растопить / растворения клеток, но и для предотвращения образования пузырей.S порошок клеток / твердые растворяется, добавляют дополнительной ячейки твердый / порошок.
- Заполните каждую из двух 50 мл пробирок, пока каждый не имеет приблизительно 20 г клеток или всех клеток, добавленных. Продолжить оттаивание / растворяющимися пока нет замороженных сгустки клеток наблюдали в 50 мл пробирки. Это должно занять приблизительно 50 мин.
- Центрифуга подвешенный лизата клеток в течение 20 мин при 25000 мкг (4 ° С). Хорошо лизированных клеток могут проявлять небольшое количество черного осадка.
- Перенесите 50 мл супернатанта поликарбонатные ультра-центрифужные пробирки (26,3 мл пробирки, используемые) и добавляют 10 мкл 200 мМ ФМСФ в каждую полную пробирку.
- Центрифуга в течение 1 ч при 100000 х г (4 ° C). Четыре слоя должны быть видны, снизу вверх: (1) твердый осадок ясно, содержащий рибосомные комплексы; (2) мягкий с высоким содержанием липидов гранул; (3) большой прозрачный желтый окрашенными слой, содержащий большую часть растворимых белков и комплексов ор клетки; и (4) 'чешуйчатый' верхний слой, состоящий из липидов.
- Выполните все Subsequent шаги в холодном помещении (4 ° С). Удалить как большая часть верхнего '' чешуйчатым липидного слоя, как это возможно с использованием 1 мл пипетку и выбросьте. Используйте 10 мл серологические пипетки, чтобы восстановить большую часть желтого, прозрачного слоя.
- Восстановить последние несколько мл этого слоя с использованием 1 мл пипетки, чтобы не потревожить нижние два слоя. Из 40 г сырого осадка клеток, приблизительно 48 мл среднего слоя, как правило, извлекают и 8 мл липидного слоя удаляют / отбрасывают.
Примечание: Поток Очистка на колонке весьма затруднено наличием липидов, которые также могут привести к снижению качества комплекса, обсуждается ниже.
2. Колонка очистки Шаг 1: IgG хроматографии
- Смола Уравновешивание и Binding
- Подготовить 300 мкл IgG сефарозой суспензии 40 г клеточного осадка. Отрежьте конец наконечника пипетки 1 мл для облегчения пипетирования суспензии. Мытье / уравновешивания смоле IgG три раза, каждый раз 5 мл IgGD150 Buffeг (10 мМ Трис-HCl, рН 8,0; 150 мМ NaCl, 150 мМ KCl, 1 мМ MgCl 2, 5 мМ имидазола, рН 8, 0,1% об / об NP-40; 1 мМ ДТТ, ингибитор протеазы таблетка на 50 объем мл).
- Спин для осаждения при 160 мкг (4 ° С) между стирок и удалить супернатант.
- Поворотом смолы IgG с средней фазой надосадочной жидкости, и два мини-таблетки ингибитора протеазы на 40 г клеток, с помощью соответствующего поворотного устройства, в течение 2 ч (4 ° C). Это IgG партия раствора.
- Приготовьте два 10 мл поли-Prep колонки для использования разрезанием конец колонки, чтобы произвести плоский срез. Чтобы ускорить упаковку и промывки колонки самотеком, нагрузка максимум 200 мкл упакованной IgG смолы или ~ 25 мл указанного IgG пакетного раствора на 10 мл колонку.
- Налейте IgG пакетное раствор в колонку и позволяют оседать под действием силы тяжести. Если седиментация занимает больше времени, чем 30 мин, то, скорее всего, было липидный загрязнение при восстановлении средней фазы из центрифуги т. и массовые рассылки
- Промыть насадочной колонны с четырьмя последовательными 10 мл объемами IgGD150 буфера.
- Подготовить 300 мкл IgG сефарозой суспензии 40 г клеточного осадка. Отрежьте конец наконечника пипетки 1 мл для облегчения пипетирования суспензии. Мытье / уравновешивания смоле IgG три раза, каждый раз 5 мл IgGD150 Buffeг (10 мМ Трис-HCl, рН 8,0; 150 мМ NaCl, 150 мМ KCl, 1 мМ MgCl 2, 5 мМ имидазола, рН 8, 0,1% об / об NP-40; 1 мМ ДТТ, ингибитор протеазы таблетка на 50 объем мл).
- На колонке TEV Расщепление
- Уплотнение из нижней части колонны и добавьте 1 мл IgGD150 буфера и 100 мкл TEV протеазы (0,6 мг / мл запаса, мутантный вариант S219V ТэВ собственного производства). Уплотнение верхней части колонны, и перемешивают в течение 20 мин (18 ° C) с использованием теплового смесителя, встряхивая при 750 оборотах в минуту. Ресуспендируют смолы и снова перемешать в течение 20 минут, повторите еще раз, в общей сложности 1 ч инкубации.
Примечание: Очень важно, чтобы сохранить время инкубации до минимума. - Возвращает колонку до 4 ° С и элюции белка / комплекса под действием силы тяжести. Элюции мертвую объем с дополнительным 200 мкл IgGD150 буфера.
- Уплотнение из нижней части колонны и добавьте 1 мл IgGD150 буфера и 100 мкл TEV протеазы (0,6 мг / мл запаса, мутантный вариант S219V ТэВ собственного производства). Уплотнение верхней части колонны, и перемешивают в течение 20 мин (18 ° C) с использованием теплового смесителя, встряхивая при 750 оборотах в минуту. Ресуспендируют смолы и снова перемешать в течение 20 минут, повторите еще раз, в общей сложности 1 ч инкубации.
3. Колонна очистки Шаг 2: Кальмодулин Affinity хроматографии
- Смола Уравновешивание и Binding
- Подготовьте 200 мкл кальмодулин сродства смолы на 40 г клетокгранул. Промыть Смолу трижды, каждый раз 5 мл Кальмодулин связывающем буфере (10 мМ Трис-HCl, рН 8,0; 150 мМ NaCl, 10 мМ KCl, 1 мМ MgCl 2, 5 мМ имидазола, рН 8, 2 мМ CaCl 2; 0,1 % об / об NP-40, 10 мМ β-меркаптоэтанол), центрифугирование при 160 х г (4 ° C), чтобы осадить для каждой промывки.
- К каждому 1 мл IgG элюат, добавьте 3 объема кальмодулин буфера для связывания. Для поддержания постоянного уровня кальция, добавляют CaCl 2 и β-меркаптоэтанола , чтобы учесть отсутствие этих составляющих в элюирование IgG. Конечные концентрации должны быть 2 мМ CaCl 2 и 10 мМ β-меркаптоэтанола.
- Добавить образец в смоле кальмодулин и связываются в течение 1 ч (4 ° C) с использованием трубки ротатора.
- Упаковка и элюирования из кальмодулин смолы
- Приготовить 2 мл поли-Prep колонку на 100 мкл суспензии кальмодулин путем разрезания конец колонки, чтобы создать плоскую отверстие. Максимально допустимая нагрузка не более 100 мкл суспензии кальмодулин за соlumn, чтобы свести к минимуму количество смолы образец приходит в контакт с во время элюции.
- Упаковать колонку под действием силы тяжести и мыть смолы в колонку три раза 5 мл кальмодулин связывающем буфере.
- Элюции белка с добавлением 200 мкл кальмодулин элюции буфера (10 мМ Трис-HCl, рН 8,0; 150 мМ NaCl, 10 мМ KCl, 1 мМ MgCl 2, 5 мМ имидазола, рН 8,0; 4 мМ EGTA, pH 8,0; 0,08% V / об NP-40, 10 мМ β-меркаптоэтанол). Повторите шесть раз добавлением 200 мкл буфера для элюции кальмодулин.
- Для ELUTIONS от 1 до 3, нанесите громкость на колонку и соберите элюат немедленно. Для элюирования 4, уплотнение в нижней части колонны и инкубировать с элюирующего буфера в течение 2,5 мин, а затем распечатывает и позволяют вымывается под действием силы тяжести. Для элюции 5, инкубировать в течение 5 мин, а затем распечатывает и элюции. Для элюирования 6, инкубировать в течение 10 мин, а затем распечатывает и элюции.
Примечание: Целостность комплекса может варьироваться от ELUTIONS / фракции (см репрезентативные результаты раздел) <./ Li> - Диализировать ELUTIONS 2 до 6 индивидуально в течение ночи с использованием соответствующего метода микро диализа. Диализировать фракций против диализного буфера (10 мМ Трис-HCl, рН 8,0; 150 мМ NaCl, 10 мМ KCl, 1 мМ MgCl 2, 5 мМ имидазола, рН 8, 10 мМ β-меркаптоэтанол).
Примечание: NP-40 не проходит заметно, если вообще, через диализную мембрану.
4. После очистки Анализы для оценки качества комплекса
- Родные гель и окрашиванием серебром
- Подготовьте 4 - 16% сборного нативный гель для анализа комплекса в соответствии с инструкциями производителя. Используйте соответствующий стандартный молекулярный вес белка и нагрузки 15 мкл каждого из Диализированный Кальмодулин элюирования / фракций на гель.
- Electrophorese геля при 150 В в течение приблизительно 3 ч (4 ° C).
- Silver окрашивает гель для оценки качества каждого из шести ELUTIONS. В качестве альтернативы, использовать столь же чувствительный рекламный роликфлуоресцентный краситель (ы). На данном этапе, концентрация комплекса, скорее всего, ниже уровня обнаружения для окрашивания кумасси синим.
- Дополнительные методы анализа гель
- Для обнаружения белка методом Вестерн-блоттинга, решить комплекс с помощью SDS или нативного PAGE, а затем исследовать гель для Кальмодулин связывания пептида (CBP) эпитопа с использованием TAP тега антитела в соответствии с инструкциями производителя.
- Использование конкретного флуоресцентным красителем (ы), подтверждают наличие и целостность белка и / или нуклеиновой кислоты в ТАР очищенный комплекс. Заботьтесь, что никакая спектральное перекрытие не обнаруживается между этими пятнами.
- Отрицательный Визуализация Stain электронной микроскопии
- Используйте непрерывные сетки углерода свечение разряжен при температуре от -15 мА в течение 30 секунд, в течение 30 мин комплексного применения.
- Нанесите 3 мкл TAP очищено комплекса (как правило, при концентрации 1 нМ) в сетке. Выдержите в течение одной минуты. Клякса еПЗУ стороне сетки, чтобы удалить избыток буфера.
- Промыть дважды с 20 мкл капель деионизированной воды. Side-блот между стирок.
- Применение сетки к 50 мкл отрицательного капли красителя и инкубировать в течение мин. Окрашивание с уранилацетате (2%) или уранила формиат (0,75%) рекомендуется.
Внимание: уранила соли и растворы слаборадиоактивный и содержат тяжелые металлы. К ним следует обращаться с осторожностью и все материалы, который входит в контакт с этими решениями должны удаляться с соблюдением руководящих принципов институциональных рекомендованных отходов. - Применить сетку на свежий 50 мкл капли негативного красителя, без блоттинга. Выдержите в течение мин, затем боковой блоттинга, и, наконец, воздух сухой и визуализировать.
- Крио электронной микроскопии (крио-ЭМ) Визуализация
- Выполните крио-ЭМ с TAP очищено комплексом, хотя оптимизация может быть необходимо, в соответствии с протоколом производителя.
Примечание: Наличие моющих средств при высоких концентрациях мау препятствуют прогрессу и обсуждается ниже.
- Выполните крио-ЭМ с TAP очищено комплексом, хотя оптимизация может быть необходимо, в соответствии с протоколом производителя.
5. Комплексное хранение
- Подготовка комплекса для систем хранения данных
- Концентрат комплекс, при необходимости, с использованием центробежного фильтра, имеющего соответствующую молекулярную массу отсечку для комплекса. Спин при 14000 мкг в течение 1 мин с шагом до желаемой концентрации не будет достигнута.
Примечание: концентрация НП-40 будет возрастать в концентрации во время концентрирования, поскольку она не проходит через фильтр, ни диализной мембраны. - Флэш-замерзнуть комплекс в 30 мкл аликвоты в жидком азоте или с сухим льдом охлаждают ванну этанола, а затем хранят при -80 ° С.
- Концентрат комплекс, при необходимости, с использованием центробежного фильтра, имеющего соответствующую молекулярную массу отсечку для комплекса. Спин при 14000 мкг в течение 1 мин с шагом до желаемой концентрации не будет достигнута.
- Дополнительно после очистки Удаление детергентов
Примечание: при наличии моющего средства, такие как NP-40, и при концентрации выше, чем его критической концентрации мицелл может затруднять или препятствовать прогрессу в некоторых областях применения. Последствия его удаления из протоCol, а также замену с другими добавками или сорастворителей, обсуждаются ниже. Если нет NP-40 не желательно, вариант заключается в использовании коммерческого применения для удаления, например Bio-Beads.
- Предварительно уравновешивания имеющиеся в продаже моющие средства поглощая шарики в диализного буфера. Смешайте пять шариков на 30 мкл комплекса (обычно при концентрации 10 нМ).
- Выдержите уравновешенные бусы из стадии 5.2.1 с TAP очищенного комплекса в течение 15 минут на льду. Использование комплекса в течение нескольких часов после удаления моющего средства.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Модифицированный метод ТАР был использован для очистки от S. CEREVISIAE в U1 snRNP, в рибонуклеопротеидные комплекс 18-субъединицу. Первоначальная очистка TAP комплекса после опубликованного протокола 2,3 дали комплекс , который появился гетерогенным, мигрирующие в три полосы на окрашенных серебром родной полиакриламидном геле (Фигура 2А). Несколько раундов оптимизации метода TAP, дали комплекс , который мигрировал в первую очередь одну полосу на родном геле , указывающего более однородной сборки (рис 2А). Использование флуоресцентных красителей для окрашивания для белка и нуклеиновой кислоты, было установлено , что очищенный комплекс имел как биополимеры присутствует (рис 2б).
Очищенный комплекс также анализировали с помощью SDS - PAGE и Вестерн - блоттинга с использованием антитела ТАР тег (фиг.3А). В соответствии с Нативе результат гель, комплекс очищенный в соответствии с опубликованным протоколом выставлены протеолиза TAP меченый белок (Snu71). Количество протеолиза, однако, была значительно снижена с модификаций метода TAP. Почти все семнадцать белков в комплексе U1 snRNP были решены с помощью SDS - PAGE и идентифицированы с помощью MALDI масс - спектрометрии (рис 3B). А также родным и SDS - PAGE, комплексное качество оценивали на различных стадиях очистки с помощью отрицательного пятна электронной микроскопии (рис 4). Эти монодисперсные частицы , наблюдаемые на рис 4A и B , но отсутствует в 4С приведены примеры хорошей выборки для структурного исследования. Этот метод анализа при условии критического понимания относительно влияния изменений в метод ТАР.
Метод ТАП требует включения неионогенного детергента NP-40, и в концentration выше, что его критической концентрации мицеллообразования (ККМ). Надежность методов оценки качества комплекса , описанного в протоколе хорошо продемонстрировано в эксперименте , где поверхностно -активное вещество цвиттерионная CHAPS, глицерин или нет сорастворитель были заменены на NP-40 во всех буферов (рисунок 5). Нативным PAGE и отрицательного пятна EM, то U1 snRNP появляется наиболее гомогенными и стабильными в NP-40 с уменьшением стабильности от CHAPS до глицерина в без добавления сорастворителя. Это может быть, что дрожжи U1 snRNP имеет гидрофобную поверхность и наличие агрегации NP-40 предотвращает путем покрытия этой поверхности. К сожалению, NP-40 не может быть удален с помощью диализа и концентрирование комплекса затем концентрируют NP-40. В то время как выше NP-40-видимому, не возмущают комплекс, она негативно влияет на замораживание частицы в стекловидного льда для крио-ЭМ и крупных мицелл подобных агрегатов наблюдалось. Моющие средства, поглощающие шарики были успешно использованы для галить большинство NP-40 из образца U1 snRNP словно не воздействовать на комплекс структурно.
После очистки комплекса с изменениями , подробно описанных в протоколе, комплекс подходит как для отрицательной окраски и крио-ЭМ было получено, о чем свидетельствует изображение газона частиц и отличительные средних представительского класса (рисунок 6).
Рисунок 1. Обзор Тандем аффинной очистки (TAP) метод. (А) Схема метода TAP два шага. Комплекс интереса (серый) включает в себя TAP помеченный субъединицу (черный; U1 snRNP субъединица Snu71) genomically, слитый с последовательностью, состоящей из кальмодулин Binding Пептид (CBP, зеленый), сайт распознавания для сайт-специфической протеазы TEV (синий), и два IgG области связывания белка A (Pr A , Красный). На 1-м этапе, клеточный лизат инкубируют с смолой IgG и комплекс сохраняется через его взаимодействие с белком последовательности. Комплекс освобождается от смолы путем ТРВ направленное расщепление. Во 2 - м этапе, комплекс инкубируют со смолой кальмодулин, зависимой реакции Ca 2+. Комплекс высвобождается путем добавления хелатора EGTA Ca 2+. (В) Вестерн - блот после TAP меченый белок посредством стадий очистки , показанных на (A). Образцы были взяты из клеточного лизата, после того, как 1-й ступени, и после того, как 2-й стадии способа ТАР. Реактивный белок наблюдается в клеточных лизатов мигрирует быстрее после того, как 1 - й стадии, после ТРВ протеазы расщепления и , таким образом , потери белка последовательности. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Юр 2 "SRC =" / файлы / ftp_upload / 54389 / 54389fig2.jpg "/>
Рисунок 2. Оптимизация метода TAP. (A) Silver окрашивали родной гель TAP очищают комплексов. Родной ПААГ: стандарт белка (дорожка 1); сложные очищены в соответствии с оригинальным методом TAP 3 (дорожка 2), три полосы , наблюдаемые (наконечники стрел); три последовательных элюции из той же очистки TAP следующие изменения в буфер, две полосы, наблюдаемые (размерные стрелки) (полосы 3 - 5); дальнейшие изменения метода TAP, приносящие в основном единый комплекс , мигрирующий полосу при ~ 800 кДа (дорожка 6). (В) Анализ состава очищенного комплекса путем окрашивания одного геля полосу с белка и РНК реактивных красителей. Родной ПААГ: стандарт белка (дорожка 1), окрашенном с белком флуоресцентным красителем; Комплекс визуализируют с помощью белка флуоресцентным красителем (дорожка 2), двух полос, наблюдаемых; та же полоса на дорожке 2, теперь визуализируют с помощью флуоресцентной нуклеиновой кислоты пятна (дорожка 3), наблюдаются две полосы; и флуоресцентный сигнал надлежал витражного комплекса на дорожках 2 и 3 (дорожка 4). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3. Оптимизация метода TAP. (А) Вестерн - блот - анализ улучшения комплексного качества, следуя ТАР меченый субъединица Snu71 зондировали α-TAP антителом. Несколько proteolyzed полосы видны первоначально (полоса 1) , но улучшения уменьшают количество нижних зон значительно (дорожки 2 и 3). (B) представитель SDS гель окрашивали флуоресцентным белком гель пятно. Гель устраняет 12 из 17 белковых субъединиц комплекса. Идентичность белка в полосах была создана с помощью масс - спектрометрии. Пожалуйста , нажмите здесь для просмотра крупэр версия этой фигуры.
Рисунок 4. Образец качества на этапах в методе TAP , оцененной Отрицательный Stain электронной микроскопии Оценка по отрицательным Пятно электронной микроскопии комплекса после:. (A) 1 - й шаг ТКП; (B) шаг 2 - й ТАР (C ) комплекс дестабилизируется. Масштаб бар, 125 нм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 5. Влияние на Образец качества добавок , присутствующих в TAP Метод буферами Дорожки 1 -. 4 первые четыре элюции конечного или 2 - й стадии очистки отводом Cомплекс очищенный в присутствии: (А) неионный детергент нонил phenoxypolyethoxylethanol (NP-40), анализировали с помощью нативного PAGE (сверху) и отрицательным пятна EM (внизу), (б) в цвиттерионных моющих средств 3 - [(3- холамидопропил) диметиламмонио] -1-пропансульфонатом (CHAPS), анализировали с помощью нативного PAGE (сверху) и отрицательного пятна EM (внизу); (C) глицерин, анализировали с помощью нативного PAGE (сверху) и отрицательного пятна EM (внизу); и (D) не присадка, анализировали с помощью нативного PAGE (вверху) и отрицательное пятно EM (внизу). Шкала бар, 50 нм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 6. Визуализация метода TAP Очищенный комплекс. (A) Top, представитель образ негативного красителя электронного microscoру (ЭМ) микрофотография. Наблюдаемые является газон одинаковой формы частиц два зажаты, очищают с помощью оптимизированного метода TAP. Внизу, выбор класса средних, взятых из частиц, которые подчеркивают отличительные особенности частиц. Шкала бар, 50 нм. (B) Top, представитель образ крио-ЭМ микрофотографии. Наблюдаемое являются областями более высокой контрастностью представителя частиц, увидеть две такие области в штучной упаковке. Донные, класс средние выбранных частиц, замороженных в стекловидного льда. Шкала бар, 50 нм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Метод TAP использует две метки, которые балансируют потребность в жесткой и селективное связывание с аффинной смолой с желанием поддерживать почти физиологических условиях раствора. Этот баланс служит для сохранения устойчивого взаимодействия (ов) меченого белка с взаимодействующими фактора (ов) для определения характеристик после очистки. Кроме того, индивидуальные ТАР меченый ORF, доступны из коммерческих источников, таким образом, что можно получить любой штамм дрожжей с меченый белок для любого дрожжевого комплекса. Сохранение целостности комплекса и доступности ресурса для тестирования использования различных меченых белковых субъединиц в комплексе для очистки два преимущества для использования метода TAP для очистки родного комплекса. Тем не менее, исходный протокол метод ТАР не был разработан, чтобы гарантировать, что комплекс очищенный композиционно и структурно однородным. Метод ТАР поэтому был модифицирован, как описано выше, для достижения этой цели.
Различныйэтапы метода TAP были оценены, чтобы установить оптимальный подход и условия для очистки композиционный и структурный однородный комплекс. Рано важным шагом является лизис клеток. Этот шаг необходим баланс между своей стремлением к высоким выходом и , таким образом , максимального лизиса, при этом гарантируя , что полученный комплекс имеет высокое качество, т.е. однородным. Различные подходы к лизиса клеток дрожжей были изучены, в том числе с использованием бусинок с миксера, высокий явный процессор жидкости и шаровой мельницы. Использование менее дорогих кофемолке была менее эффективной, чем альтернативные методы (40 - 60% лизис), но комплекс, выделенный и очищенный появился монодисперсных в то время как некоторые из этих подходов, как представляется, либо целостности частиц возмущать или вызвать степень агрегации. В конце концов, значительное число клеток, не лизируют с тем, чтобы гарантировать, был получен высококачественный комплекс. В то время как 40 - 60% лизиса идеально подходит для дрожжей U1 snRNP, оптимизации предлагается при применении этого протокола к новый биологический комплекс.
Крайне важно, чтобы определить действия, описанные в методе, который может ускорить очистку, чтобы гарантировать, что комплексная целостность не была скомпрометирована клеточных протеаз, субъединицы диссоциации в результате разбавления, и продлен инкубации при 18 ° С во время расщепления TEV протеазы. Один простой шаг для достижения времени эффективную очистку должна была гарантировать, что липиды не переносятся с раннего лизата разъяснений, поскольку липиды препятствуют потока во время очистки тяжести. Другие шаги включали определения оптимального баланса количества смолы и столбцов размера / размеров для достижения эффективной очистки и максимального расхода. Особенно важным шагом было сократить время на расщеплении колонке с помощью TEV протеазы. Протеаза ТРВ использовали очищали в доме , чтобы обеспечить это было протеазы / нуклеазы бесплатно и при высокой концентрации 17. были использованы значительные количества TEV протеазы, чтобы получить полное расщепление в течение часа.
наблюдалась ontent "> В начальной TAP очисток протеолиза. протеолиза во время очистки может быть ограничено путем эффективной работы, добавляя батарею ингибиторов, и в том числе в высоких стирок соли очистки. Широкий спектр ингибиторов протеазы, поставляемых в течение первой половины очистки значительно улучшена стабильность TAP меченый белок и сложный характер. Кроме того, протеолиз было сведено к минимуму за счет увеличения концентрации одновалентный от 300 до 500 мМ в течение лизиса клеток и IgG стадий очистки. Даже при использовании указанных модификаций метода TAP, последовательное элюированный фракции прочь сродства смолы CBP варьировалась в степени их композиционной однородности. Таким образом, избирательное объединение фракций из второго, CBP стадии хроматографии, является оправданным.Аспект метода TAP, который получил особое внимание было значение неионогенного моющего средства NP-40 для комплексной очистки и при концентрации выше его CMC. Присутствие 4-NP0 при концентрации 0,08% или выше, имели общий положительный эффект на сложной целостности и конечный выход. Кажущаяся Благоприятный эффект (ы) NP-40 может быть частично обусловлено уменьшения неспецифических взаимодействий между смолой и комплексом. В то время как NP-40, как представляется, имеют положительный эффект во время очистки, она может быть удалена после очищения, не вызывая сложную агрегацию.
Наконец, важное значение для оптимизации метода TAP для структурного исследования были несколько взаимодополняющих анализы, используемые для оценки целостности и однородности комплекса. К их числу относятся рассеяние света, ДСН и нативный PAGE зондировали с использованием антитела TAP помощью Вестерн-блоттинга и / или окрашенных с помощью флуоресцентных красителей, а также с использованием негативного красителя электронной микроскопии. Изменения, внесенные в методе TAP здесь подробно описано, получали однородный комплекс в достаточном количестве для электронной микроскопии. Дополнительные изменения, возможно, должны быть сделаны к методу ТАР для других комплексов, в частности, сдерживатьmination важность NP-40.
Таким образом, способ очистки ТАР может быть успешно использованы для очистки макромолекулярных комплексов из эукариотической источника соответствующего качества для структурного исследования. Мы установили подходящий подход для очистки S. CEREVISIAE U1 snRNP и детализируют шаги, а также обоснование для многих из этих изменений. Для других комплексов, мы полагаем, что следователь аналогичным образом изучить шаги в протоколе, который может получением достаточного количества и качества комплекса. Шаги, которые должны быть рассмотрены, включают лизис клеток, соль и аддитивного типа и концентрации, включая моющие средства, а также чувствительность комплекса с кальцием и хелатор металла EGTA. Кроме того, она имеет решающее значение для долгосрочных исследований, что комплекс может быть замораживать и оттаивать без нарушения структуры. Важно то, что необходимо иметь несколько альтернативных способов для анализа структуры комплекса во время и после очистки. Роднойй SDS PAGE, отрицательные пятна EM, и рассеяние света служили нам хорошо в нашем исследовании, как лучше очистить однородный комплекс с использованием метода TAP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| S. cerevisiae TAP tagged strain | Open Biosystems | YSC1177 | This is the primary yeast strain used to develop the TAP protocol. Its background is S288C: ATCC 201388: MATa, his3Δ1, leu2Δ0, met15Δ0, ura3Δ0, SNU71::TAP::HIS3MX6 |
| Coffee grinder | Mr. Coffee | IDS77 | Used for cell lysis |
| Hemocytometer, Bright Line | Hausser Scientific | 3120 | Used to assess cell lysis |
| JA 9.100 centrifuge rotor | Beckman Coulter, Inc. | Used to harvest the yeast cells | |
| JA 20 fixed-angle centrifuge rotor | Beckman Coulter, Inc. | Used to clear the cell extract of non-soluble cellular material | |
| Ti 60 fixed-angle centrifuge rotor | Beckman Coulter, Inc. | Used to further clear the soluble cell extract | |
| Thermomixer | Eppendorf | R5355 | Temperature controlled shaker |
| Novex gel system | Thermo Fisher Scientific | ||
| IgG resin | GE Healthcare | 17-0969-01 | Sepharose 6 fast flow |
| Calmodulin resin | Agilent Technologies, Inc. | 214303 | Affinity resin |
| Protease inhibitor cocktail, mini tablets | Sigma Aldrich | 589297 | Mini cOmplete ultra EDTA-free tablets |
| Protease inhibitor cocktail, large tablets | Sigma Aldrich | 5892953 | cOmplete ultra EDTA-free tablets |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | Dissolved in isopropanol | ||
| 2 ml Bio-spin column | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 7326008 | Used to pack and wash the Calmodulin resin |
| 10 ml poly-prep column | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 7311550 | Used to pack and wash the IgG resin |
| Precast native PAGE Bis-Tris gels | Life Technologies | BN1002 | Novex NativePAGE Bis-Tris 4 - 16% precast polyacrylamide gels |
| NativeMark protein standard | Thermo Fisher Scientific | LC0725 | Unstained protein standard used for native PAGE. Load 7.5 μl for a silver stained gel and 5 μl for a SYPRO Ruby stained gel |
| Precast SDS PAGE Bis-Tris gels | Life Technologies | NP0321 | Novex Nu-PAGE Bis-Tris 4 - 12% precast polyacrylamide gels |
| PageRuler protein standard | Thermo Fisher Scientific | 26614 | Unstained protein standard used for Western blotting |
| SDS running buffer | Life Technologies | NP0001 | 1x NuPAGE MOPS SDS Buffer |
| TAP antibody | Thermo Fisher Scientific | CAB1001 | Primary antibody against CBP tag |
| Secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | 31341 | Goat anti-rabbit alkaline phosphatase conjugated |
| BCIP/NBT | Thermo Fisher Scientific | 34042 | 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate/nitro blue tetrazolium |
| Dialaysis units | Thermo Fisher Scientific | 88401 | Slide-A-Lyzer mini dialysis units |
| Centrifugal filter units, 100kDa MWCO | EMD Millipore | UFC5100008 | Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-100 membrane |
| Detergent absorbing beads | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 1523920 | Bio-bead SM-2 absorbants |
| SYBR Green II | Thermo Fisher Scientific | S-7564 | Flourescent dye for nucleic acid staining, when detecting with SYPRO Ruby present, use excitation wavelength of 488 nm and emission wavelength of 532 nm |
| SYPRO Ruby | Molecular Probes | S-12000 | Flourescent dye for protein staining, when detecting with SYBR Green II present, use excitation wavelength of 457 nm and emission wavelength of 670 nm |
| Copper grids | Electron Microscopy Sciences | G400-CP |
References
- Gavin, A. C., et al. Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes. Nature. 415 (6868), 141-147 (2002).
- Rigaut, G., Shevchenko, A., Rutz, B., Wilm, M., Mann, M., Seraphin, B. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nature Biotechnology. 17 (10), 1030-1032 (1999).
- Puig, O., et al. The tandem affinity purification (TAP) method: A general procedure of protein complex purification. Methods. 24 (3), 218-229 (2001).
- Vaillancourt, P., Zheng, C. F., Hoang, D. Q., Breister, L. Affinity purification of recombinant proteins fused to calmodulin or to calmodulin-binding peptides. Methods Enzymol. 326, 340-362 (2000).
- Braisted, A. C., Wells, J. A. Minimizing a binding domain from protein A. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (12), 5688-5692 (1996).
- Kapust, R. B., et al. Tobacco etch virus protease: mechanism of autolysis and rational design of stable mutants with wild-type catalytic proficiency. Protein Eng. 14 (12), 993-1000 (2001).
- Nallamsetty, S., et al. Efficient site-specific processing of fusion proteins by tobacco vein mottling virus protease in vivo and in vitro. Protein Expr Purif. 38 (1), 108-115 (2004).
- Ghaemmaghami, S., et al. Global analysis of protein expression in yeast. Nature. 425 (6959), 737-741 (2003).
- Howson, R., et al. Construction, verification and experimental use of two epitope-tagged collections of budding yeast strains. Comp Funct Genomics. 6 (1-2), 2-16 (2005).
- Cox, D. M., Du, M., Guo, X., Siu, K. W., McDermott, J. C. Tandem affinity purification of protein complexes from mammalian cells. Biotechniques. 33 (2), 267-268 (2002).
- Gully, D., Moinier, D., Loiseau, L., Bouveret, E. New partners of acyl carrier protein detected in Escherichia coli by tandem affinity purification. FEBS Lett. 548 (1-3), 90-96 (2003).
- Tharun, S. Purification and analysis of the decapping activator Lsm1p-7p-Pat1p complex from yeast. Methods Enzymol. 448, 41-55 (2008).
- Xu, X., Song, Y., Li, Y., Chang, J., Zhang, H., An, L. The tandem affinity purification method: an efficient system for protein complex purification and protein interaction identification. Protein Expr Purif. 72 (2), 149-156 (2010).
- Cheng, Y., Grigorieff, N., Penczek, P. A., Walz, T. A Primer to Single-Particle Cryo-Electron Microscopy. Cell. 161 (3), 438-449 (2015).
- Gottschalk, A., et al. A comprehensive biochemical and genetic analysis of the yeast U1 snRNP reveals five novel proteins. RNA. 4 (4), 374-393 (1998).
- Neubauer, G., Gottschalk, A., Fabrizio, P., Seraphin, B., Luhrmann, R., Mann, M. Identification of the proteins of the yeast U1 small nuclear ribonucleoprotein complex by mass spectrometry. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (2), 385-390 (1997).
- Lucast, L. J., Batey, R. T., Doudna, J. A. Large-scale purification of a stable form of recombinant tobacco etch virus protease. Biotechniques. 30 (3), 544-546 (2001).
