Biology

טיהור של מכלולי Native לחקר מבני בשיטת תג טנדם זיקה

Published: July 27, 2016 doi: 10.3791/54389

Clarisse van der Feltz¹, Daniel Pomeranz Krummel^1,2

¹Department of Biochemistry, Brandeis University, ²Winship Cancer Institute, Emory University School of Medicine

Abstract

גישות טיהור זיקה הצליחו לבודד מתחמי יליד לאפיון proteomic. ההטרוגניות מבנית ומידה של ההטרוגניות הלחנה של קומפלקס בדרך כלל לא לעכב את ההתקדמות בביצוע מחקרים כאלה. לעומת זאת, קומפלקס המיועד אפיון מבניים צריך להיטהר בתוך מדינה שהיא גם בעלי הרכב הומוגני מבחינה מבנית כמו גם בריכוז גבוה מהנדרש עבור חקר החלבונים. לאחרונה, חלה התקדמות משמעותית ביישום של מיקרוסקופיה אלקטרונית לקביעת מבנה של קומפלקסי macromolecular גדולים. זה הגביר עניין גישות לטהר מתחמי יליד באיכות מספקת וכמות לקביעה מבנית על ידי מיקרוסקופי אלקטרונים. טיהור זיקה טנדם (TAP) השיטה בצורה מיטבית כדי לחלץ ולטהר 18-למקטע, ~ 0.8 הרכבה ribonucleoprotein מד"א שמרים ניצני (שמר האפייה)

Introduction

תהליכים תאיים גדולים רבים מבוצעים על ידי קומפלקסי חלבונים גדולים החלבון-RNA ^1. צוואר בקבוק משמעותי לעריכת מחקרי biophysical והמבניים של קומפלקסים כאלה הוא מקבל אותם באיכות מתאימה (כלומר, הומוגניות) ותמורת ריכוז מתאים. בידוד קומפלקס ממקור ילידים יש יתרונות רבים, כולל שמירת שינויים שלאחר תעתיק ו / או translational רלוונטיים של יחידות משנה וביטוח הרכבה מורכבת ראויה. עם זאת, מתחמי הסלולר גדולים הם בדרך כלל נוכח בתא לעבר מספר נמוך עותק ואת הטיהור חייבת להיות יעילה להתרחש בתנאים פיסיולוגיים ליד מנת לשמור על שלמות מורכבת נשמרה. טיהור קומפלקס ממקור איקריוטיים מאתגרת במיוחד ולא יכול להיות כלכלי מונע. לכן, אסטרטגיות או שיטות שאינן יעילים להניב מורכבים הומוגנית הן מאוד רצויות.

אסטרטגיה כי כברמוצלח לטיהור מתחמי יליד מתאי איקריוטיים לאפיון הראשוני שלהם הוא טיהור זיקת טנדם ^2,3 השיטה (TAP). שיטת TAP בתחילה תוכננה כדי לטהר חלבון יליד מן שמרי ניצנים (cerevisiae ס) בקומפלקס עם אינטראקצית גורם (ים) ^2. שיטת TAP מנוצלת שני תגים, כל תג התמזג במקביל לאותו רצף גן מקודדי חלבונים. התגים נבחרו כדי לאזן צורך חזק וסלקטיבי מחייב שרף זיקה עם רצון לשמור כולה במזג אוויר פתרון פיזיולוגי. איזון זה משמש כדי לשמר אינטראקציה יציבה (ים) של החלבון מתויג עם אינטראקצית גורם (ים) לאפיון שלאחר טיהור. תג TAP משולב genomically הוצב בסוף (C-terminal) של גן מקודדי חלבונים וכלל רצף קידוד calmodulin מחייב פפטיד (CBP) ואחריו חלבון - תוספת של קצת יותר מ -20 kDa אל מתויג חֶלְבּוֹן. CBP הוא קצר, 26 חומצות אמינו, ומוכר על ידי ~ 17 kDa חלבון calmodulin (CAM) בנוכחות של סידן עם K _D בסדר גודל של 10 ^-9 M ^4. תג החלבון גדול, מורכב משתי חזרות של 58 שאריות עם מקשר קצר בין החזרות. כל חוזרות חומצה 58 אמינו הוא מוכר על ידי אימונוגלובולין G (IgG) עם ^-8 M ⁵ 10 K _D ~. בין שני אלה תגים התאגד אתר הכרת פרוטאז TEV, גידול endopeptidase מנגיף הטבק Etch ^6,7. כמו באיור 1, בשלב זיקה הראשון של שיטת TAP מתויג חלבון מאוגד שרף IgG דרך א חלבון החלבון מתויג הוא eluted ידי על מחשוף טור על תוספת של פרוטאז TEV, אתר ספציפי ביקוע בין את שני התגים. זהו צעד הכרחי כאינטראקציה של IgG ו- A החלבון הוא חזק מאוד והוא יכול להיות רק מוטרד כראוי בתנאי פתרון denaturing. בהעדר Protein תג, החלבון הוא כבול שרף CAM בנוכחות סידן eluted משרף זה עם תוספת של EGTA chelator מתכת יון (חומצה tetraacetic אתילן גליקול) (איור 1).

זמן קצר לאחר כניסתה של שיטת TAP, היא שימשה במחקר בקנה מידה גדול כדי ליצור "מפה" של יחסי הגומלין המורכבים ב ס cerevisiae ^8. חשוב לציין, כתוצאה ממאמץ זה המסגרת כולו שמר-TAP Tagged להרחיב קריאה (ORF) ספרייה וכן TAP פרט מתויג ORFs ⁹ זמינים ממקור מסחרי. לכן, אפשר להשיג כל זן שמרים עם חלבון מתויג לכל מורכבות שמרים. השיטה TAP גם דירבן שינויים או וריאציות של תג TAP, כולל: השימוש בו לטיהור מתחמי מ איקריוטיים אחרים, כמו גם תאים חיידקיים ^10,11; העיצוב של "תג לפצל", שבה החלבון ו CBP מונחים על חלבונים שונים ^12; ואת taGS השתנה, כדי להתאים את הצורך של החוקר, כגון רגישות של המתחם כדי Ca ^{2 +} או EGTA ^13.

ההתקדמות שחלה באחרונה בשני המכשור ומתודולוגיה הובילו להתקדמות משמעותית ביישום של מיקרוסקופיה אלקטרונית (EM) לקביעת מבנה, שהובילו גבוהה, ליד תמונות ברזולוציה אטומית של מתחמי macromolecular ^14. החלטת ההשגה של קומפלקס א"מ, לעומת זאת, נותרת מותנית באיכות של המתחם נחקר. מחקר זה נצל את גישת תג TAP לטהר מ ס cerevisiae מספר U1 snRNP, א-למקטע 18 (~ 0.8 מד"א) מורכב ribonucleoprotein נמוך עותק מספר כי הוא חלק ^15,16 הספלייסוזום. מספר הצעדים ננקט כדי לטהר מורכב זה כזה שזה הומוגנית של ריכוז נאות. בעיות פוטנציאליות נתקלו בשלבים שונים של הטיהור מתוארות ואסטרטגיות נלקחו להתגבר challenges הדגיש. לפי הערכה ואופטימיזציה צעדים בזהירות הטיהור, U1 snRNP מטוהר הוא באיכות ובבית בכמות שנכנסה כתם שלילי אלקטרוני cryo מיקרוסקופיה (cryo-EM) מחקרים. פרוטוקול שיטת TAP אופטימיזציה עבור טיהור של מתחמי מקורית עבור מחקרים מבניים מתואר במסמך זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הערה: הפרוטוקול הבא תוכנן עבור טיהור של קומפלקס מ 4 ליטר של תרבית תאים, כ 40 גרם משקל רטוב של תאים. ברגע מוכן, הכל צריכים להיות מאוחסן המאגרים ב 4 ° C בשימוש בתוך חודש של ההכנה שלהם. מעכבי פרוטאז סוכן צמצום מתווספים רק כדי מאגרים רק לפני השימוש.

1. הכנת תמצית התא כולו עבור טיהור טנדם זיקה

צמיחה של ס תאי cerevisiae
1. Streak בתכנית הבדיקות הרצויות מתויגות ס זן cerevisiae מאחסון (-80 ° C) על דקסטרוז שמרים peptone צלחת (YPD). דגירה של 3 - 5 ימים (30 ° C), עד תאי שמרים להופיע לבן ורך.
2. לחסן פס של כ -2 מ"מ ² של תאים טריים מהצלחת לתוך 10 מ"ל התקשורת YPD בתוך צינור צנטריפוגות פוליפרופילן חרוטי 50 מ"ל. לנער את הצינור ב 180 סיבובים לדקה (סל"ד) לילה (30 מעלות צלזיוס).
3. לחסן 2 מ"ל של מעלתרבות הלילה לליטר מדיה YPD בתוך Erlenmeyer 2 L או בקבוק חרוטים. Shake ב 180 סל"ד (30 מעלות צלזיוס). צג צמיחת תאים על צפיפות אופטית של 600 ננומטר (OD ₆₀₀₎ עד שלב יומן מאוחר, OD ₆₀₀ של 1.8 ל 2, בדרך כלל 20 - 24 שעות.
קציר ס תאי cerevisiae
1. קציר תאים על ידי צנטריפוגה ב 5400 XG במשך 15 דקות (4 ° C).
2. במהירות למזוג supernatant ולשמור תאים ב 4 מעלות צלזיוס או על קרח.
3. להשעות כל ליטר תא גלולה עם 2 מ"ל מקורר הצפת תמוגה (10 mM Tris-HCl, pH 8.0; 300 מ"מ NaCl, 10 מ"מ KCl; 0.2 mM EDTA, pH 8.0; 5 מ"מ imidazole, pH 8.0; 10% גליצרול; 0.1% v / v NP-40). להשעות תאים על ידי מתערבל ו / או pipetting חוזרים באמצעות pipet סרולוגיות 10 מ"ל.
  הערה: חשיבותה של NP-40 כפי שהוא נוגע לאיכות וניתוחים מורכבים הטיהור פוסט נדון בהמשך.
4. מעבירים את ההשעיה תא לתוך k צינור צנטריפוגות ריק 50 מ"ל חרוטי פוליפרופילןEPT על הקרח. לשטוף כל בקבוק צנטריפוגות עם 2 מ"ל נוספים של הצפת תמוגה מקורר ולהוסיף את ההשעיה תא בצינור 50 מ"ל.
5. קבע את המשקל הרטוב של גלולת תא על ידי שקילת צינור הפחתת המשקל של השפופרת הריקה, כמו גם את מאגר תמוגה הוסיף.
  הערה: ליטר של תרבית תאים שיש OD של ₆₀₀ 1.8 הוא כ 10 גרם.
6. צור באמבט חנקן נוזלי בתוך שפופרת צנטריפוגות פוליפרופילן חרוטי 50 מ"ל. צייר תאים מושעה לתוך מזרק 5 מ"ל. חבר מחט 16 G המזרק. להקפיא את ההשעיה התא על ידי זה עובר דרך מזרק / מחט כדי ליצור תא "טיפות". שערי הקפאה צריכות להיות כ 1 דק '/ מיליליטר.
7. אחסן טיפות תא קפוא (-80 ° C) או להמשיך תמוגה.
תאי Lysate הבהרה lysing
1. Lyse התאים שמרים באמצעות מטחנת קפה. Lyse תאי שמונה עד תשע פעמים עם 25 שניות שחיקה התפרצויות, תוך טלטול גמטחנת offee. לפני השימוש, מראש לצנן את מטחנת קפה עם חנקן נוזלי. כל שני סיבובים של שחיקה, להוסיף בשכבה רדודה של חנקן נוזלי אל המטחנה ולאפשר לו להתאדות.
2. מערבבים עם מרית מקורר חנקן נוזלי לפי הצורך כדי לשמור על התאים מפני clumping. קח זהירות כדי למנוע הפשרת התאים, מה שיכול לגרום clumping התא. התאים צריכים להופיע כמו אבקה לבנה עדינה הבא תמוגה. גלולת תא מקסימלי מ 4 ליטר של תרבית שמרים (~ 40 גרם) יכולה להיות קרקע בכל פעם.
  הערה: תוכן לגבי שיטת תמוגה נדון להלן.
3. להעריך את מידת תמוגה תא באמצעות hemocytometer או שיטת ספירת תאים חלופית. כדי לספק ניתוח נאות, לקחת הדגימות הבאות: (1) לפני תמוגה; (2) לאחר ארבעה סיבובים של תמוגה; ו (3) לאחר תמוגה. כדי לבדוק דגימות אלה, לקחת כמות קטנה של תאים עם מרית ומקום מקורר חנקן נוזלי בתוך שפופרת 1.5 מ"ל.
4. לאחר התאים הם הפשירו, פיפטה 5 μl של תאיםומערבבים עם 495 מים μl. אם 40 - 60% תמוגה של תאים הוא ציין, המשך לשלב הבא בפרוטוקול.
  הערה: תוכן לגבי השפעת תקופות ארוכות של תמוגה נדונים להלן.
5. לאחר תמוגה נאותה הוא ציין, תאי lysed חנות (-80 ° C) או להמשיך לשלב הבא.
6. הכן שני צינורות צנטריפוגה פוליפרופילן חרוטי 50 מ"ל כל אחד עם 15 מ"ל הצפת תמוגה, כולל פלואוריד phenylmethanesulfonyl 1 מ"מ (PMSF), 1 מ"מ dithiothreitol (DTT), וקוקטייל זמינים מסחרית של מעכבי פרוטאז.
  הערה: אם proteolysis משמעותי הוא ציין, לשקול שימוש זן פרוטאז לקוי.
7. השתמש מרית מקורר חנקן נוזלי כדי לגרוף את האבקה התא lysed קפוא לתוך צינורות 50 מ"ל מוכן. מוסיפים את אבקת תא / מוצק באופן הדרגתי למאגר תמוגה, המכילה גם reductant ו מעכבי פרוטאז (ים).
8. סובב את הצינורות 50 מ"ל בעדינות ב RT כדי להפשיר / לפזר את התאים, אלא גם כדי למנוע בועות מ טביעה. אזה אבקת תא / להמסת מוצק, להוסיף תא נוסף / אבקת מוצק.
9. ממלאים כל אחד משני צינורות 50 מ"ל עד לכל אחד מהם יש כ 20 גרם של תאים או כל התאים הוסיף. המשך הפשרה / המסה עד שאין גושי תא קפוא שנצפו 50 מ"ל הצינורות. זה אמור לקחת בערך 50 דקות.
10. צנטריפוגה lysate התא על תנאי למשך 20 דקות ב 25,000 XG (4 ° C). ובכן-lysed תאים עשויים להפגין כמות קטנה של משקע שחור.
11. מעבירים את 50 מ"ל של supernatant כדי פוליקרבונט צינורות אולטרה צנטריפוגה (26.3 מ"ל צינורות בשימוש) ולהוסיף 10 μl 200 מ"מ PMSF על צינור אחד מלא.
12. צנטריפוגה במשך שעה 1 ב 100,000 XG (4 ° C). ארבע שכבות צריכות להיות גלויות, מלמטה למעלה: (1) גלולה ברורה קשה, המכיל מתחמי ריבוזומלי; (2) גלולת שומנים עשירים רכה; (3) שכבה צהובה-מהולה גדולה המכילה ביותר של חלבוני מתחמי המסיסים של התא; ו (4) בשכבה עליונה "קשקשים" מורכבת של שומנים.
13. בצע את כל היםצעדים ubsequent בחדר קר (4 ° C). להסיר כמה שיותר שכבת השומנים 'קשקשים' הדף ככל האפשר באמצעות pipet 1 מ"ל וזורקים. השתמש pipet 10 מיליליטר סרולוגיות להתאושש רוב ההשכבה הצהובה, ברורה.
14. שחזור הבודדים מ"ל האחרון של שכבה זו בעזרת פיפטה 1 מ"ל, כדי למנוע להפריע שתי שכבות התחתונה. מ 40 גרם גלולה תא רטוב, כ 48 מ"ל של השכבה האמצעית הוא התאושש בדרך כלל ו -8 מ"ל של השומנים שכבת הסיר / מושלך.
  הערה: זרימת טיהור טור מתעכבת מאוד על ידי הנוכחות של שומנים, היכולים גם לפגוע באיכות של המתחם, נדון בהמשך.

2. טיהור טור צעד 1: כרומטוגרפיה IgG

שרף איזון וכריכה
1. הכינו תרחיף 300 μl IgG Sepharose עבור 40 גרם של התא גלולה. חותכים את הקצה של קצה pipet 1 מ"ל כדי להקל pipetting את התערובת הדלילה. לשטוף / לאזן שרף IgG שלוש פעמים, בכל פעם עם 5 מ"ל IgGD150 Buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8.0; 150 מ"מ NaCl; 150 מ"מ KCl; 1 מ"מ MgCl _2; 5 מ"מ imidazole, pH 8; 0.1% v / v NP-40; 1 מ"מ DTT; לוח מעכב פרוטאז לכל 50 נפח מ"ל).
  1. ספין כדי גלולה ב 160 XG (4 ° C) בין הכביסות ולהסיר supernatant.
2. סובב את שרף IgG עם supernatant שלב באמצע והשני לוחות מיני פרוטאז מעכב לכל 40 גרם של תאים, באמצעות מסובבים מתאימים עבור 2 שעות (C ° 4). זהו הפתרון יצווה IgG.
3. כן שני 10 מ"ל עמודות פולי-הכנה לשימוש על ידי חיתוך בסוף הטור לייצר חתך שטוח. כדי לזרז את האריזה ושטיפה של העמודה על ידי זרימת כוח הכבידה, לטעון לכל היותר 200 μl של שרף IgG ארוז או ~ 25 מ"ל של פתרון אצווה IgG לכל 10 מ"ל העמודה.
4. יוצקים את הפתרון אצווה IgG לתוך הטור ולאפשר משקעים על ידי כוח הכבידה. אם השקיעה לוקחת יותר מ -30 דקות, שם ככל הנראה היה זיהום שומנים כאשר לשחזר את השלב האמצעי מן t צנטריפוגותubes.
5. לשטוף את העמודה הארוזה עם ארבעה כרכים רצופים 10 מיליליטר של IgGD150 הצפה.
על מחשוף TEV טור
1. חותם את החלק התחתון של העמודה ולהוסיף 1 מ"ל של IgGD150 הצפת 100 μl של פרוטאז TEV (0.6 מ"ג / מ"ל המניות, S219V גרסה מוטציה של TEV מיוצר ללא צורך במיקור חוץ). חותם את החלק העליון של העמודה ומערבבים במשך 20 דקות (18 ° C) בעזרת מערבל תרמית, רועד ב 750 סל"ד. שרף גלול ומערבב שוב במשך 20 דקות, לחזור פעם נוספת על סך של דגירת hr 1.
  הערה: זה קריטי כדי לשמור על זמן דגירה עד למינימום.
2. החזר את העמודה עד 4 ° C ו elute החלבון / מורכבות על ידי כוח הכבידה. Elute את הנפח המת עם 200 μl נוסף של IgGD150 הצפה.

3. טור טיהור שלב 2: כרומטוגרפיה calmodulin זיקה

שרף איזון וכריכה
1. כן 200 μl של שרף זיקת calmodulin לכל 40 גרם של תאגְלוּלָה. שטפו את שרף שלוש פעמים, בכל פעם עם 5 מ"ל calmodulin חיץ מחייב (10 mM Tris-HCl, pH 8.0; 150 מ"מ NaCl, 10 מ"מ KCl; 1 מ"מ MgCl _2; imidazole 5 מ"מ, pH 8; 2 ₂ מ"מ CaCl; 0.1 NP-40 v / v%; 10 מ"מ β-mercaptoethanol), centrifuging ב 160 XG (4 מעלות צלזיוס) עד גלולה עבור כל שטיפה.
2. לכל eluate 1 מ"ל IgG, להוסיף 3 כרכים של calmodulin חיץ מחייב. כדי לשמור על רמת סידן קבוע, להוסיף CaCl ₂ ו β-mercaptoethanol כדי להסביר את חוסר המרכיבים הללו elution IgG. ריכוזים הסופי צריך להיות 2 מ"מ CaCl ₂ ו -10 מ"מ β-mercaptoethanol.
3. מוסיפים את מדגם שרף calmodulin לאגד עבור שעה 1 (4 ° C) באמצעות Rotator צינור.
אריזת משחררי משרף calmodulin
1. הכן טור פולי-prep 2 מ"ל לכל 100 סלארי calmodulin μl ידי חיתוך בסוף הטור כדי ליצור פתח שטוח. אין לטעון יותר מ -100 μl סלארי calmodulin לכל שיתוףlumn כדי למזער את הכמות של שרף המדגם בא במגע עם במהלך elution.
2. ארוז את הטור על ידי כוח הכבידה ולשטוף את שרף בטור שלוש פעמים עם 5 מ"ל מאגר כריכה calmodulin.
3. Elute חלבון עם תוספת של 200 μl calmodulin הצפת elution (10 mM Tris-HCl, pH 8.0; 150 מ"מ NaCl, 10 מ"מ KCl; 1 מ"מ MgCl _2; 5 imidazole מ"מ, pH 8.0; 4 מ"מ EGTA, pH 8.0; 0.08% v / v NP-40; 10 מ"מ β-mercaptoethanol). חזרו על התרגיל שש פעמים תוספת של 200 μl של calmodulin הצפת elution.
4. לקבלת elutions 1 עד 3, להחיל את הנפח לעמודה ולאסוף את eluate מייד. עבור elution 4, לאטום את החלק התחתון של העמודה דגירה עם חיץ elution ב -2.5 דקות ולאחר מכן unseal ולאפשר elute על ידי כוח הכבידה. עבור elution 5, דגירה במשך 5 דקות ולאחר מכן unseal ו elute. עבור elution 6, דגירה במשך 10 דקות ולאחר מכן unseal ו elute.
  הערה: השלמות של המתחם עשויה להשתנות בין elutions / שברים (ראו סעיף תוצאות נציג) <./ Li>
5. Dialyze elutions 2 עד 6 בנפרד הלילה באמצעות שיטת דיאליזת מייקרו מתאימה. Dialyze שברים נגד הצפת דיאליזה (10 mM Tris-HCl, pH 8.0; 150 מ"מ NaCl, 10 מ"מ KCl; 1 מ"מ MgCl _2; 5 מ"מ imidazole, pH 8; 10 מ"מ β-mercaptoethanol).
  הערה: NP-40 אינם עוברים באופן ניכר, אם בכלל, דרך הממברנה הדיאליזה.

4. ניתוח פוסט-טיהור כדי להעריך את איכות Complex

ג'ל Native וכסף מכתים
1. כן 4 - ג'ל יליד טרומי 16% לניתוח של המתחם על פי ההנחיות מהיצרן. השתמש תקן חלבון משקל מולקולרי המתאים והעומס 15 μl של כל אחד elution calmodulin dialyzed / שברים על הג'ל.
2. Electrophorese את הג'ל על 150 V כ 3 שעות (4 ° C).
3. כסף הכתם ג'ל על מנת להעריך את האיכות של כל אחד מששת elutions. לחלופין, להשתמש מסחרי רגיש באותה מידהכתם ניאון (ים). בשלב זה, את הריכוז של המתחם הוא ככל הנראה מתחת לרמה של זיהוי מכתים Coomassie כחול.
שיטות ניתוח ג'ל נוספות
1. כדי לזהות חלבון ידי המערבי סופג, לפתור את מורכבות על ידי SDS או עמוד יליד ולאחר מכן לחקור את הג'ל על calmodulin מחייב פפטיד (CBP) epitope באמצעות נוגדן תג TAP על פי הנחיות מהיצרן.
2. באמצעות כתם ניאון ספציפי (s), לאשר את הקיום ואת היושרה של חלבון ו / או חומצות גרעין במתחם מטוהר TAP. תשמור על עצמך כי אין חפיפה ספקטרלית מזוהית בין כתמים אלה.
ויזואליזציה הכתם מיקרוסקופית אלקטרונים שלילי
1. השתמש רשתות פחמן רציף הזוהר המשוחרר ב -15 mA למשך 30 שניות, תוך 30 דקות של יישום מורכב.
2. החל 3 μl של מורכבות מטוהרים TAP (בדרך כלל בריכוז של 1 ננומטר) לרשת. דגירה במשך דקה. כתם fROM בצד של הרשת על מנת להסיר עודפי חיץ.
3. שטפו פעמיים עם 20 טיפות μl של מים ללא יונים. כתם Side בין שוטף.
4. החל רשת לירידה כתם שלילית 50 μl דגירה במשך דקות. מכתים עם אצטט uranyl (2%) או formate uranyl (0.75%) מומלץ.
  זהירות: מלחים ופתרונות Uranyl הם בחולשה רדיואקטיביים ומכיל מתכות כבדות. אלה צריכים להיות מטופלים עם טיפול וכל החומר שבא במגע עם פתרונות אלה צריכים להיות מסולקים עמידים בהנחיות פסולות מומלצות מוסדיות.
5. החל רשת לירידה כתם שלילי טרי 50 μl, בלי סופג. דגירה במשך דקות, ולאחר מכן כתם בצד, ולבסוף אוויר יבשים לדמיין.
ויזואליזציה Cryo מיקרוסקופית אלקטרונים (cryo-EM)
1. בצע-EM קריו עם מורכבות מטוהרים TAP, למרות אופטימיזציה ייתכן שיהיה צורך, על פי פרוטוקול של היצרן.
  הערה: נוכחות של חומרי ניקוי ב ma ריכוזים גבוהיםy לעכב את ההתקדמות והוא נדון להלן.

5. אחסון Complex

הכנת Complex עבור אחסון
1. לרכז את המורכבות, במידת הצורך, באמצעות מסנן צנטריפוגלי בעל חתך משקל מולקולרי מתאים המורכב. ספין על 14,000 XG עבור במרווחים של 1 דק 'עד לריכוז הרצוי הוא הגיע.
  הערה: ריכוז NP-40 יגדיל בריכוז במהלך להתרכז, כפי שהוא אינו עובר דרך הממברנה המסנן ולא דיאליזה.
2. פלאש להקפיא את מורכבות 30 aliquots μl בחנקן נוזלי או קרח יבש מקורר אמבטיה אתנול ולאחר מכן לאחסן ב -80 מעלות צלזיוס.
הסרה פוסט-טיהור אופציונלית של דטרגנט

הערה: הנוכחות של סבון כגון NP-40 ו בריכוז מעל זה של ריכוז micelle הביקורתי שלה עלול לעכב או למנוע התקדמות עבור יישומים מסוימים. ההשלכות של ההסרה שלה מן פרוטוcol וכן החלפה עם תוספים אחרים או-ממס שיתוף נדון להלן. אם לא NP-40 הוא רצויים, אופציה היא להשתמש ביישום מסחרי להסרה, למשל ביו-חרוזים.

חרוזים לאזן קדם קליטת חומרי ניקוי זמינים מסחרית ב הצפת דיאליזה. מערבבים חמישה חרוזים לכל 30 μl של מורכבות (בדרך כלל 10 ריכוז ננומטר).
דגירה חרוזים equilibrated משלב 5.2.1 עם מורכבות TAP מטוהרים במשך 15 דקות על הקרח. השתמש מורכב תוך מספר שעות לאחר הסרת חומר ניקוי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

שיטת TAP שונה שמשה לטהר מ ס cerevisiae מספר U1 snRNP, תסביך ribonucleoprotein 18-למקטע. טיהור TAP ראשונית של המתחם בעקבות ^2,3 הפרוטוקול שפורסם ניב קומפלקס שהופיע הטרוגנית, נודדות כמו שלוש להקות על כסף מוכתמות ג'ל polyacrylamide ילידים (איור 2 א). סבבים רבים של אופטימיזציה של שיטת TAP, ניב מקומפלקס הגר בעיקר כלהקה יחידה על ג'ל יליד מעיד על הרכבה הומוגנית יותר (איור 2 א). באמצעות צבעי ניאון להכתים עבור חלבון וגם חומצות גרעין, נקבע כי המתחם המטוהר היה שניהם biopolymers הנוכחי (תרשים 2B).

המתחם מטוהרים גם נותח על ידי עמוד SDS ו המערבי סופג באמצעות נוגדן תג TAP (איור 3 א). בקנה אחד עם נתיve תוצאה ג'ל, במתחם מטוהרים לפי הפרוטוקול שפורסם הציג proteolysis של TAP מתויג חלבון (Snu71). כמות proteolysis, לעומת זאת, צומצם משמעותית עם שינויים של השיטה TAP. כמעט כל שבע עשרה חלבונים במתחם U1 snRNP נפתרו על ידי עמוד SDS ו זיהה בוודאות על ידי ספקטרומטריית מסה MALDI (איור 3 ב). כמו גם יליד עמוד SDS, איכות מורכבת הוערכה בשלבים שונים של הטיהור על ידי מיקרוסקופי אלקטרונים הכתמים שלילי (איור 4). חלקיקי monodispersed שנצפו איור 4 א 'וב' אך נעדרו מן 4C הם דוגמאות מדגם טוב ללימוד מבני. שיטת ניתוח זה סיפק תובנה קריטית לגבי ההשפעה של שינויים בשיטת TAP.

שיטת TAP קוראה להכללת הניקוי שאינו היוני NP-40 ו בכל קונצרט כלשהוentration מעל זה של ריכוז micelle הביקורתי שלה (CMC). על חוסנו של השיטות להערכת האיכות המורכבת שתואר בפרוטוקול מודגם היטב על ידי ניסוי שבו גליצרול zwitterionic הפעיל שטח הבחורים, או שום דו-ממס החליף עבור NP-40 בכל המאגרים (איור 5). לפי דף יליד א.מ. השלילי, U1 snRNP מופיע ביותר הומוגנית ויציבת NP-40 עם ירידת יציבות מ בחורים כדי גליצרול ללא שיתוף ממס הוסיף. זה יכול להיות כי snRNP שמרים U1 יש פן הידרופובי ואת הנוכחות של צבירה מונע NP-40 על ידי ציפוי פני שטח זה. למרבה הצער, NP-40 לא ניתן להסיר על ידי דיאליזה וריכוז המתחם יהיה אז לרכז את NP-40. בעוד NP-40 הגבוהים לא נראו לטרוד את המורכבות, זה לא להשפיע לרעה על הקפאת החלקיק בקרח זגוגי עבור cryo-EM אגרגטים micelle הגדולים הדמוי נצפו. חרוזים קליטים דטרגנט שמשו בהצלחת rסר רוב NP-40 מן המדגם U1 snRNP מבלי שייראה כאילו היא להשפיע על מבנה מורכב.

בעקבות הטיהור של המתחם בשינויים המפורטים בפרוטוקול, מתחם מתאים הוא כתם שלילי קריו-EM הושג, כפי שמעיד תמונות של הדשא של חלקיקים וממוצעים בכיתת נציג ייחודי (איור 6).

באיור 1. סקירה כללית של טיהור טנדם זיקה (TAP) שיטה. (א) סכמטי של שיטת TAP שני שלבים. קומפלקס של עניין (אפור) כולל TAP מתויג למקטע (שחור; U1 snRNP למקטע Snu71) התמזגו genomically עם רצף מורכב של פפטיד כריכה calmodulin (CBP, ירוק), אתר הכרה הפרוטאז אתר ספציפי TEV (כחול), ושני IgG מחייב אזורים של חלבון (Pr , אדום). בשלב 1, lysate תא מודגרות עם שרף IgG ואת המורכבות נשמרות באמצעות האינטראקציה שלה עם חלבון רצף. המתחם הוא שוחרר מן השרף ידי מחשוף בתיווך TEV. בשלב 2, המתחם הוא מודגרות עם שרף calmodulin, תגובה תלויה Ca ^{2 +.} המתחם הוא שוחרר באמצעות תוספת של EGTA chelator Ca ^2+. (ב) כתם המערבי בעקבות TAP מתויג חלבון דרך השלבים לטיהור שמודגם (א). נלקחו דגימות של lysate התא, לאחר שלב 1, ואחרי שלב 2 של שיטה TAP. החלבון תגובתי שנצפתה lysate תא נודד מהר אחרי שלב 1, לאחר מחשוף TEV פרוטאז ובכך אובדן של חלבון רצף. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

יור 2 "src =" / files / ftp_upload / 54,389 / 54389fig2.jpg "/>
איור 2. אופטימיזציה של שיטת TAP. (א) כסף מוכתם ג'ל יליד מתחמי מטוהרים TAP. עמוד יליד: תקן חלבון (מסלול 1); מורכב מטוהרים פי שיטת ³ TAP המקורי (מסלול 2), שלוש להקות ציין (ראשי חץ); שלושה elutions רצופים מאותו טיהור TAP הבא שינויי חיץ, שתי להקות ציין (ראשי חץ) (נתיבים 3 - 5); שינויים נוספים בשיטת TAP, מניב להקה מורכבת אחת בעיקר נודד ב ~ 800 kDa (מסלול 6). (ב) ניתוח של רכב קומפלקס מטוהר על ידי צביעת נתיב ג'ל יחיד עם חלבון וגם כתמי תגובתי RNA. עמוד יליד: תקן חלבון (מסלול 1) מוכתם בכתם פלורסנט חלבון; מורכבות צילמו עם כתם פלורסנט חלבון (מסלול 2), שתי להקות נצפו; שביל אותו בנתיב 2, עכשיו צלם עם כתם פלורסנט חומצות גרעין (מסלול 3), שתי להקות נצפו; ניאון האות לאורךשכבה של מורכבות מוכתמות במסלולים 2 ו -3 (מסלול 4). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3. אופטימיזציה של שיטת TAP. (א) ניתוח כתם המערבי של שיפור איכות מורכבת, TAP הבא מתויג למקטע Snu71 ומשש עם נוגדן α-TAP. כמה להקות proteolyzed גלויות בתחילה (מסלול 1) אבל שיפורים להפחית את כמות להקות נמוכות משמעותי (נתיבים 2 ו -3). (ב) ג'ל SDS נציג מוכתם בכתם ג'ל חלבון פלואורסצנטי. ג'ל פותר 12 של 17 יחידות משנת החלבון של המתחם. זהות חלבון הלהקות הוקמה על ידי ספקטרומטריית מסה. אנא לחץ כאן כדי להציג largגרסה אה של נתון זה.

איכות איור 4. לדוגמא בשלבים בשיטת TAP מוערכת על ידי שלילי כתם מיקרוסקופי אלקטרוני הערכה על ידי מיקרוסקופי אלקטרונים הכתמים שלילי של אחרי מורכבים:. (א) שלב ^st 1 של TAP; (ב) שלב 2 ^nd של TAP; (ג ) מורכבות ערער. סרגל קנה מידה, 125 ננומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

השפעת איור 5. על איכות מדגם של תוספות הווה חוצצי שיטת TAP Lanes 1 -. 4 הם הארבעה elutions הראשון של השלב האחרון או 2 ^nd של טיהור TAP של גomplex מטוהר בנוכחות: (א) phenoxypolyethoxylethanol nonyl הניקוי שאינו יוני (NP-40), ונותח על ידי עמוד ילידים (עליון) ו א.מ. כתמים שליליים (למטה); (ב) חומר ניקוי zwitterionic 3 - [(3- cholamidopropyl) dimethylammonio] -1-propanesulfonate (פרקים), ונותח על ידי עמוד ילידים (עליונה) ואת הכתם שלילי EM (למטה); (ג) גליצרול, ונותח על ידי עמוד ילידים (עליון) ו א.מ. כתמים שלילי (למטה); ו (ד) לא תוסף, ונותחו על ידי עמוד הילידים (העליון) ואת הכתם שלילי EM (למטה). סרגל קנה מידה, 50 ננומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

ויזואליזציה איור 6. שיטת TAP מטוהרת מורכבת. (א) למעלה, תמונה מייצגת של microsco אלקטרונים כתם שלילימיקרוסקופ py (EM). לנצפה הוא דשא של חלקיקים בעלי עיצוב דומה, שתיים התאגרפו, מטוהר בשיטת TAP המותאמת. תחתון, מבחר של ממוצעים בכיתה הנלקחים של החלקיקים המדגישים תכונות הבחנת חלקיקים. סרגל קנה מידה, 50 ננומטר. (ב) למעלה, תמונה מייצגת של מיקרוסקופ קריו-EM. נצפים הם אזורים של נציג ניגודיות גבוה של חלקיקים, לראות שני אזורים כגון התאגרף. ממוצעים תחתונים, בכיתה של חלקיקים נבחרים קפוא בקרח זגוגית. סרגל קנה מידה, 50 ננומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

השיטה TAP מנצל שני תגים לאזן צורך חזק וסלקטיבי מחייב שרף זיקה עם רצון לשמור כולה במזג אוויר פתרון פיזיולוגי. איזון זה משמש כדי לשמר אינטראקציה יציבה (ים) של החלבון מתויג עם אינטראקצית גורם (ים) לאפיון שלאחר טיהור. בנוסף, TAP הפרט מתויג ORFs זמין ממקור מסחרי, כך שאף אחד יכול להשיג כל זן שמרים עם חלבון מתויג לכל מורכבות שמרים. שמירה על שלמות קומפלקס ואת הזמינות של משאבים כדי לבדוק שימוש של יחידות משנת חלבון מתויגות שונות במתחם לטיהור שני יתרונות עבור ניצול שיטת TAP לטיהור קומפלקס ילידים. עם זאת, פרוטוקול שיטת TAP המקורי לא המציא כדי להבטיח כי מטוהרי המתחם בעלי רכב מבני הומוגנית. שיטת TAP ולכן שונתה, כמפורט לעיל, כדי להשיג מטרה זו.

שׁוֹנִיםשלבים בשיטת TAP הוערכו להקים את הגישה האופטימלית ותנאים לטהר הלחנה ומורכבת הומוגנית מבני. צעד קריטי בשלב מוקדם הוא תמוגה התא. שלב זה דורש איזון בין הרצון של אחד עבור תשואה גבוהה ובכך תמוגה מקסימלית, בעוד הם מבטיחים מורכב המתקבל הוא באיכות גבוהה, כלומר, הומוגנית. גישות שונות בתאי שמרים lysing נחקרו, לרבות באמצעות א-מקצף חרוז, מעבד נוזל טהור גבוהה, ואת טחנת הכדור. שימוש מטחנת הקפה היקר פחות היה פחות יעיל מאשר השיטות החלופיות (40 - 60% תמוגה), אבל במתחם מבודד ומטוהר הופיע monodisperse בעוד מספר הגישות הללו נראים טוהר מידות חלקיקים לטרוד או לגרום מידה מסוימת של צבירה. בסופו של דבר, מספר משמעותי של תאים לא היו lysed כדי להבטיח מורכבות באיכות גבוהה הושג. בעוד 40 - 60% תמוגה הוא אידיאלי עבור snRNP שמרים U1, אופטימיזציה הוא הציע בעת החלת פרוטוקול זה לחבר מורכבים ביולוגיים חדשים.

זה היה קריטי כדי לזהות את השלבים בשיטה שיכול לזרז טיהור על מנת להבטיח כי שלמות מורכבת לא נפגעה על ידי פרוטאזות הסלולר, דיסוציאציה למקטע כתוצאה מהדילול, והאריך דגירה על 18 מעלות צלזיוס במהלך מחשוף פרוטאז TEV. בצעד אחד פשוט להשיג זמן טיהור יעילה היה להבטיח כי שומנים לא לשאת מעל מן ההבהרה lysate מוקדם, מאז שומנים לעכב זרימה במהלך טיהור הכביד. צעדים אחרים כלל זיהוי איזון מיטבי של גודל / מידות שרף ועמודה כמות להשיג טיהור יעיל קצב זרימה מקסימלית. שלב קריטי במיוחד היה כדי לקצר את הזמן של על מחשוף טור ידי פרוטאז TEV. הפרוטאז TEV בשימוש היה מטוהר בבית כדי לוודא שהוא היה פרוטאז / nuclease חופשית בריכוז גבוה ^17. כמויות משמעותיות של פרוטאז TEV שימשו להשיג מחשוף להשלים בתוך פחות משעה.

ontent "> בשנת proteolysis purifications TAP הראשונית נצפה. Proteolysis במהלך הטיהור יכולה להיות מוגבל על ידי עובד ביעילות, הוספת סוללה של מעכבים, ולרבות שטיפות מלח גבוהות הטיהור. מגוון רחב של מעכבי פרוטאז שסופקו לעומת המחצית הראשונה של הטיהור שיפר מאוד את היציבות של TAP מתויג חלבון ומורכב. בנוסף, proteolysis היה ממוזער על ידי הגדלת ריכוז חד ערכי של 300 עד 500 מ"מ במהלך תמוגה התא וצעדים IgG של טיהור. אפילו עם השינויים שצוינו לעיל שיטת TAP, רצופים eluted שברי הנחה של שרף זיקת CBP מגוונות תואר ההומוגניות הלחנה. לפיכך, איגום סלקטיבית של שברים משלב כרומטוגרפיה השני, CBP, היא מוצדקת.

היבט של שיטת TAP שקבל דגש מיוחד היה את החשיבות של הניקוי שאינו יוני NP-40 טיהור מורכבת בריכוז מעל שלה CMC. הנוכחות של NP-40 בריכוז של 0.08% ומעלה היתה השפעה מועילה הכוללת על שלמות מורכבת לבין התשואה הסופית. ההשפעה החיובית לכאורה (הים) של NP-40 עשויה להיות בין שאר כתוצאה לצמצום אינטראקציות הלא ספציפיות בין שרף ואת המורכבות. בעוד NP-40 נראים כמי שיש לו השפעה חיובית במהלך הטיהור, שאפשר יהיה להסירו טיהור פוסט מבלי לגרום צבירה מורכבת.

לבסוף, קריטי אופטימיזציה של שיטת TAP ללימוד מבני היו כמה מבחני משלימה שבה להעריך את היושרה והומוגניות של המתחם. פיזור אור אלה כללו, SDS ו עמוד יליד נחקר באמצעות נוגדן TAP ידי כתם המערבי ו / או מוכתמים עם צבעי ניאון, כמו גם במיקרוסקופ אלקטרונים כתם שלילי. השינויים שבוצעו בשיטת TAP המפורטים כאן, ניב מורכבים הומוגנית על כמויות מספיקות עבור במיקרוסקופ אלקטרונים. שינויים נוספים עשויים צריכות להתבצע לשיטת TAP עבור מתחמי אחרים, ובפרט להרתיעmination לחשיבות NP-40.

לסיכום, שיטת טיהור TAP ניתן להשתמש בם כדי לטהר מתחמי macromolecular בהצלחה ממקור איקריוטיים באיכות מתאימה למחקר מבני. הקמנו גישה מתאימה טיהור של ס cerevisiae U1 snRNP ופרטי הצעדים שננקטו, כמו גם את הרציונל רב של שינויים אלה. עבור מתחמי אחרים, אנו ממליצים כי החוקר דומה לחקור את שלבי הפרוטוקול, אשר עשוי להניב כמויות ואיכות מורכבות נאותות. הצעדים שיש לבחון כוללים תמוגה התא, מלח וסוג כתוסף וריכוזי כולל חומרי ניקוי, ורגישות של המתחם כדי EGTA סידן ומתכת chelator. יתר על כן, קיימת חשיבות ראשונה במעלה מחקרים ארוכי טווח שמכלול אפשר להקפיא מופשר ללא מבנה מביך. חשוב לציין, צריך אחד כמה דרכים חלופיות כדי assay את המבנה של המתחם במהלך ובעקבות טיהור. ילידnd עמוד SDS, א.מ. כתמים שלילי, ופיזור האור שירתו אותנו נאמן בחקירה שלנו מהי הדרך הטובה ביותר לטהר קומפלקס הומוגנית בשיטת TAP.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
S. cerevisiae TAP tagged strain	Open Biosystems	YSC1177	This is the primary yeast strain used to develop the TAP protocol. Its background is S288C: ATCC 201388: MATa, his3Δ1, leu2Δ0, met15Δ0, ura3Δ0, SNU71::TAP::HIS3MX6
Coffee grinder	Mr. Coffee	IDS77	Used for cell lysis
Hemocytometer, Bright Line	Hausser Scientific	3120	Used to assess cell lysis
JA 9.100 centrifuge rotor	Beckman Coulter, Inc.		Used to harvest the yeast cells
JA 20 fixed-angle centrifuge rotor	Beckman Coulter, Inc.		Used to clear the cell extract of non-soluble cellular material
Ti 60 fixed-angle centrifuge rotor	Beckman Coulter, Inc.		Used to further clear the soluble cell extract
Thermomixer	Eppendorf	R5355	Temperature controlled shaker
Novex gel system	Thermo Fisher Scientific
IgG resin	GE Healthcare	17-0969-01	Sepharose 6 fast flow
Calmodulin resin	Agilent Technologies, Inc.	214303	Affinity resin
Protease inhibitor cocktail, mini tablets	Sigma Aldrich	589297	Mini cOmplete ultra EDTA-free tablets
Protease inhibitor cocktail, large tablets	Sigma Aldrich	5892953	cOmplete ultra EDTA-free tablets
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)			Dissolved in isopropanol
2 ml Bio-spin column	Bio-Rad Laboratories, Inc.	7326008	Used to pack and wash the Calmodulin resin
10 ml poly-prep column	Bio-Rad Laboratories, Inc.	7311550	Used to pack and wash the IgG resin
Precast native PAGE Bis-Tris gels	Life Technologies	BN1002	Novex NativePAGE Bis-Tris 4 - 16% precast polyacrylamide gels
NativeMark protein standard	Thermo Fisher Scientific	LC0725	Unstained protein standard used for native PAGE. Load 7.5 μl for a silver stained gel and 5 μl for a SYPRO Ruby stained gel
Precast SDS PAGE Bis-Tris gels	Life Technologies	NP0321	Novex Nu-PAGE Bis-Tris 4 - 12% precast polyacrylamide gels
PageRuler protein standard	Thermo Fisher Scientific	26614	Unstained protein standard used for Western blotting
SDS running buffer	Life Technologies	NP0001	1x NuPAGE MOPS SDS Buffer
TAP antibody	Thermo Fisher Scientific	CAB1001	Primary antibody against CBP tag
Secondary antibody	Thermo Fisher Scientific	31341	Goat anti-rabbit alkaline phosphatase conjugated
BCIP/NBT	Thermo Fisher Scientific	34042	5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate/nitro blue tetrazolium
Dialaysis units	Thermo Fisher Scientific	88401	Slide-A-Lyzer mini dialysis units
Centrifugal filter units, 100kDa MWCO	EMD Millipore	UFC5100008	Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-100 membrane
Detergent absorbing beads	Bio-Rad Laboratories, Inc.	1523920	Bio-bead SM-2 absorbants
SYBR Green II	Thermo Fisher Scientific	S-7564	Flourescent dye for nucleic acid staining, when detecting with SYPRO Ruby present, use excitation wavelength of 488 nm and emission wavelength of 532 nm
SYPRO Ruby	Molecular Probes	S-12000	Flourescent dye for protein staining, when detecting with SYBR Green II present, use excitation wavelength of 457 nm and emission wavelength of 670 nm
Copper grids	Electron Microscopy Sciences	G400-CP