Abstract
Affinitetsreningsmetoder har varit framgångsrika i att isolera infödda komplex för proteomik karakterisering. Strukturell heterogenitet och en grad av kompositions heterogenitet en komplex brukar inte hindra framsteg i att genomföra sådana studier. Däremot bör en komplex avsedd för strukturell karakterisering renas i ett tillstånd som är både sin sammansättning och strukturellt homogen samt vid en högre koncentration än vad som krävs för proteomik. På senare tid har det skett betydande framsteg i tillämpningen av elektronmikroskopi för strukturbestämning av stora makromolekylära komplex. Detta har ökat intresset för metoder att rena infödda komplex av tillräcklig kvalitet och kvantitet för strukturbestämning av elektronmikroskopi. Metoden Tandem Affinity Purification (TAP) har optimerats för att extrahera och rena ett 18-subenhet, ~ 0,8 MDa ribonukleoprotein enheten från knoppande jäst (Saccharomyces cerevisiae)
Introduction
Många stora cellulära processer utförs av stora protein- och protein-RNA-komplex 1. En betydande flaskhals att bedriva biofysikaliska och strukturella studier av sådana komplex är att få dem en lämplig kvalitet (dvs homogenitet) och vid en lämplig koncentration. Isolering av en komplex från en nativ källa har många fördelar, bland annat att behålla relevanta post-transkriptionella och / eller translationella modifieringar av subenheter och försäkring korrekt komplex montering. Men stora cellulära komplex är ofta närvarande i en cell på ett lågt kopietal och reningen måste vara effektiv och ske under nära fysiologiska förhållanden för att säkerställa komplexa integritet upprätthålls. Rening av ett komplex av en eukaryot källa är särskilt utmanande och kan vara ekonomiskt oöverkomliga. Således är strategier och metoder som är effektiva och ger en homogen komplex mycket önskvärt.
En strategi som har varitframgångsrika i att rena infödda komplex från eukaryota celler för deras första karakterisering är Tandem Affinity Purification (TAP) metoden 2,3. TAP-metoden var ursprungligen utformades för att rena ett nativt protein från knoppande jäst (S. cerevisiae) i komplex med samverkande faktor (er) 2. TAP-metod som användes två taggar, varvid varje tagg fuserad i tandem till samma proteinkodande gensekvensen. Taggarna valdes så att balansera ett behov av stram och selektiv bindning till en affinitets harts med en önskan att bibehålla nära fysiologiska betingelser lösning. Denna balans tjänar till att bevara stabil interaktion (er) av det märkta proteinet med samverkande faktor (er) för post-rening karakterisering. Den genomiskt inkorporerade TAP-taggen placerades vid änden (C-terminala) av ett protein-kodande genen och bestod av en sekvens som kodar för en Calmodulin-bindande peptid (CBP) följt av protein A - en tillsats av drygt 20 kDa till den taggade protein. CBP är kort, 26 aminosyror, och erkänns av ~ 17 kDa protein Calmodulin (CAM) i närvaro av kalcium med en K D i storleksordningen 10 -9 M 4. Protein En tagg är större, som består av två upprepningar av 58 rester med en kort linker mellan upprepningarna. Varje 58 aminosyror upprepning är erkänd av immunglobulin G (IgG) med ett Kd ~ 10 -8 M 5. Mellan dessa två taggar införlivades ett igenkänningsställe för TEV-proteas, ett endopeptidas från tobaks Etch Virus 6,7. Såsom illustreras i figur 1, i det första affinitetssteget enligt förfarandet TAP taggade proteinet är bundet till en IgG-matrisen via protein A. Den märkta proteinet elueras genom på kolonn klyvning vid tillsats av TEV-proteas, platsspecifikt klyvning mellan de två taggar. Detta är ett nödvändigt steg som interaktionen av IgG och protein A är mycket stark och kan endast vara tillräckligt störs under denaturerande betingelser lösning. I brist på en Protein En tagg proteinet bundet till CAM harts i närvaro av kalcium och elueras från detta harts med tillsats av metalljoner kela EGTA (etylenglykol-tetraättiksyra) (Figur 1).
Strax efter det att införandet av den TAP-metoden, användes den i en storskalig studie för att generera en "karta" av komplexa interaktioner i S. cerevisiae 8. Viktigare, som en följd av detta arbete en hel jäst-TAP taggade öppen läsram (ORF) bibliotek samt individuell TAP taggade ORF 9 är tillgängliga från en kommersiell källa. Sålunda kan man erhålla varje jäststam med ett märkt protein för någon jäst komplex. TAP metoden sporrade också modifieringar eller varianter av TAP-taggen, inklusive: dess användning för rening av komplex från andra eukaryota liksom bakterieceller 10,11; utformningen av en "split tag", vari protein A och CBP är placerade på olika proteiner 12; och TAgs ändrats, så att tillgodose behovet av utredaren, såsom känslighet av komplexet till Ca2 + eller EGTA 13.
Senaste framstegen inom både instrumentering och metoder har lett till betydande framsteg i tillämpningen av elektronmikroskopi (EM) för strukturbestämning, som har lett till hög, nära atom upplösning av makromolekylära komplex 14. Upplösningen kan erhållas av ett komplex av EM, är dock fortfarande knuten kvaliteten av komplexet under utredning. Denna studie har utnyttjat TAP taggen metod för att rena från S. cerevisiae U1 snRNP, en 18-subenhet (~ 0,8 MDA) lågt kopietal ribonukleoprotein komplex som är en del av spliceosom 15,16. Ett antal åtgärder har vidtagits för att rena detta komplex så att den är homogen och av en lämplig koncentration. Potentiella problem vid olika stadier av reningen beskrivs och strategier som vidtagits för att övervinna ChallEnges markerat. Genom att noggrant utvärdera och optimera steg i reningen, renas U1 snRNP är av en kvalitet och på en mängd lämplig för negativa fläcken och elektron kryo mikroskop (Cryo-EM) studier. En optimerad TAP metod protokoll för rening av infödda komplex för strukturella studier beskrivs häri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Obs: Följande protokoll utformades för rening av ett komplex från 4 L av cellkultur, cirka 40 g våtvikt av celler. Efter beredning bör alla buffertar lagras vid 4 ° C och användes inom en månad efter deras framställning. Reduktionsmedlet och proteasinhibitorer är endast läggas till buffertar precis före användning.
1. Framställning av hela cellextrakt för Tandem Affinity Purification
- Tillväxt av S. cerevisiae-celler
- Streak önskad TAP taggade S. cerevisiae stam från lagring (-80 ° C) på en jäst-pepton dextros (YPD) platta. Inkubera i 3 - 5 dagar (30 ° C), tills jästceller verkar vitt och fluffigt.
- Ympa en strimma av cirka 2 mm 2 av färska celler från plattan i 10 ml YPD medium i en 50 ml koniskt polypropen centrifugrör. Skaka röret vid 180 varv per minut (rpm) över natten (30m ° C).
- Ympa 2 ml av övernatt kultur per liter YPD medium i en 2 L Erlenmeyer eller E-kolv. Skaka vid 180 rpm (30 ° C). Övervakning av celltillväxt vid en optisk densitet av 600 nm (OD 600) till sen log-fas, OD600 av 1,8 till 2, typiskt 20-24 h.
- Skörde S. cerevisiae-celler
- Harvest celler genom centrifugering vid 5400 xg under 15 min (4 ° C).
- Snabbt dekantera supernatanten och hålla cellerna vid 4 ° C eller på is.
- Suspendera varje liter cellpellet med 2 ml kyld Lysis Buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 300 mM NaCl; 10 mM KCl; 0,2 mM EDTA, pH 8,0; 5 mM imidazol, pH 8,0; 10% glycerol; 0,1% v / v NP-40). Suspendera cellerna genom att snurra och / eller upprepad pipettering med hjälp av en 10 ml serologisk pipett.
Obs: Vikten av NP-40 den avser komplexa kvalitet och post-rening analys diskuteras nedan. - Överför cellsuspensionen i en tom 50 ml koniskt polypropen centrifugrör kEPT på is. Tvätta varje centrifugflaska med ytterligare 2 ml kyld Lysis Buffer och lägg till cellsuspensionen i 50 ml rör.
- Bestämma våtvikt av cellpellet genom vägning av röret och subtrahera vikten av det tomma röret såväl som den tillsatta Lysis Buffer.
Obs: En liter cellodling har en OD 600 på 1,8 är ca 10 g. - Skapa ett bad med flytande kväve i en 50 ml koniskt polypropen centrifugrör. Dra suspenderade celler i en 5 ml spruta. Ansluta en 16 G nål på sprutan. Frysa cellsuspensionen genom att den leds genom sprutan / nål för att generera cell "droppar". Hastigheten för frysning bör vara ungefär 1 min / ml.
- Lagra frysta celldroppar (-80 ° C) eller gå vidare till lys.
- Lysera celler och Lysate Förtydligande
- Lyse jästcellerna med hjälp av en kaffekvarn. Lyse celler åtta till nio gånger med 25 sek slipning skurar, medan skaka coffee grinder. Före användning, för-kyla kaffekvarnen med flytande kväve. Varje två omgångar av slipning, tillfoga ett grunt skikt av flytande kväve till kvarnen och låta den avdunsta.
- Rör om med en flytande kväve kyld spatel som behövs för att hålla celler från klumpar. Vidta försiktighet för att förhindra upptining av celler, vilket kan resultera i cellklumpning. Cellerna ska visas som ett fint vitt pulver efter lys. En maximal cellpellet från 4 L av jästkultur (~ 40 g) kan slipas samtidigt.
Obs: Anmärkningar vad gäller metod för lys diskuteras nedan. - Bedöma graden av cellys med hjälp av en hemocytometer eller alternativ cellräkning metod. För att ge en tillräcklig analys, vidta följande prover: (1) före lys; (2) efter fyra rundor av lys; och (3) efter lys. För att kontrollera dessa prover, ta en liten mängd celler med en flytande kväve kyld spatel och placera det i en 1,5 ml rör.
- När cellerna tinas, pipett 5 pl celleroch blanda med 495 pl vatten. Om 40-60% lys av celler observeras vidare till nästa steg i protokollet.
Obs: Anmärkningar vad gäller effekten av långa perioder av lys diskuteras nedan. - När tillräcklig lys observeras, lagra lyserade celler (-80 ° C) eller gå vidare till nästa steg.
- Förbereda två 50 ml koniska polypropen centrifugrör var och en med 15 ml lyseringsbuffert, inklusive 1 mM fenylmetansulfonylfluorid (PMSF), 1 mM ditiotreitol (DTT), och en kommersiellt tillgänglig blandning av proteasinhibitorer.
Obs: Om väsentlig proteolys observeras, överväga användning av ett proteas fattiga stammen. - Använd en flytande kväve kyld spatel att ösa den frusna lyserade cell pulver i de preparerade 50 ml rör. Tillsätt cell pulver / fast material stegvis till Lysis Buffer, som innehöll både ett reduktionsmedel och proteasinhibitor (er).
- Rotera 50 ml rör försiktigt vid RT för att tina / upplösa cellerna, men också för att förhindra bubblor från att bildas. enär cell pulver / fasta upplöses, lägga till ytterligare cell fast / pulver.
- Fyll vardera av de två 50 ml rör tills var och en har cirka 20 g celler eller alla celler tillsatta. Fortsätt upptining / upplösning tills det inte finns några frysta cellklumpar observerades i 50 ml rör. Detta bör ta cirka 50 minuter.
- Centrifugera den suspenderade cellysatet under 20 min vid 25000 xg (4 ° C). Väl-lyserade celler kan uppvisa en liten mängd av svart fällning.
- Överför 50 ml av supernatanten till polykarbonat ultra centrifugrör (26,3 ml rör som används) och tillsätt 10 pl 200 mM PMSF till varje hel rör.
- Centrifugera i en timme vid 100.000 xg (4 ° C). Fyra lager ska vara synlig, från botten till toppen: (1) en hård klar pellet, innehållande ribosomala komplex; (2) en mjuk lipidrik pellet; (3) en stor klar gul-färgade skikt som innehåller det mesta av cellens lösliga proteiner och komplex; och (4) en "fjällig" toppskikt bestående av lipider.
- Utför alla subsequent stegen i ett kallt rum (4 ° C). Ta bort så mycket av the top "fjällig" lipidskikt som möjligt med hjälp av en 1 ml pipett och släng. Använd en 10 ml serologisk pipett för att återvinna det mesta av den gula, klara skiktet.
- Återvinna de sista ml av detta skikt med hjälp av en 1 ml pipett för att undvika att störa de två nedersta lagren. Från 40 g våt cellpellet, är ungefär 48 ml av mellanskiktet typiskt återhämtat sig och 8 ml lipidskiktet avlägsnas / kasseras.
Notera: Kolonn reningsflödet är kraftigt hindras av förekomsten av lipider, vilket också kan minska kvaliteten av komplexet, som diskuteras nedan.
2. Kolumn Rening steg 1: IgG Chromatography
- Resin Jämvikts och bindning
- Förbered en 300 pl IgG Sepharose slam för 40 g cellpellet. Skära av änden av en 1 ml pipettspets för att underlätta pipettering uppslamningen. Tvätt / jämvikta IgG hartset tre gånger, varje gång med 5 ml IgGD150 Buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 150 mM NaCl; 150 mM KCl; 1 mM MgCl2; 5 mM imidazol, pH 8; 0,1% volym / volym NP-40; 1 mM DTT; en proteashämmare tablett per 50 ml volym).
- Spin till pellets vid 160 xg (4 ° C) mellan tvättar och avlägsna supernatanten.
- Rotera IgG hartset med mittfasen supernatanten och två mini tabletter proteashämmare per 40 g celler, med användning av en lämplig rotator, under 2 h (4 ° C). Detta är den IgG satslösningen.
- Förbereda två 10 ml poly-prep kolonner för användning genom att skära änden av kolonnen för att producera en platta skär. För att påskynda packning och tvättning av kolonnen med gravitationsflöde, ladda högst 200 ul packade IgG harts eller ~ 25 ml av IgG satslösning per 10 ml kolonn.
- Häll IgG satslösning i kolonnen och låt sedimentera genom gravitation. Om sedimente tar längre tid än 30 minuter, det troligen var lipid förorening när återhämtar sig mittfasen från centrifug tubes.
- Tvätta den packade kolonnen med fyra på varandra följande 10 ml volymer av IgGD150 buffert.
- Förbered en 300 pl IgG Sepharose slam för 40 g cellpellet. Skära av änden av en 1 ml pipettspets för att underlätta pipettering uppslamningen. Tvätt / jämvikta IgG hartset tre gånger, varje gång med 5 ml IgGD150 Buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 150 mM NaCl; 150 mM KCl; 1 mM MgCl2; 5 mM imidazol, pH 8; 0,1% volym / volym NP-40; 1 mM DTT; en proteashämmare tablett per 50 ml volym).
- På kolonn TEV Cleavage
- Täta botten kolonnen och tillsätt 1 ml IgGD150 buffert och 100 ul TEV proteas (0,6 mg / ml lager, muterade varianten S219V av TEV produceras internt). Försegla toppen av kolonnen och blanda under 20 min (18 ° C) med användning av en termisk bländare, skakning vid 750 rpm. Resuspendera harts och blanda igen för 20 minuter, upprepa en gång för totalt 1 timme inkubation.
Obs: Det är viktigt att hålla tiden för inkubation till ett minimum. - Återgå kolumnen till 4 ° C och eluera protein / komplexet genom tyngdkraften. Eluera död-volym med ytterligare 200 pl av IgGD150 buffert.
- Täta botten kolonnen och tillsätt 1 ml IgGD150 buffert och 100 ul TEV proteas (0,6 mg / ml lager, muterade varianten S219V av TEV produceras internt). Försegla toppen av kolonnen och blanda under 20 min (18 ° C) med användning av en termisk bländare, skakning vid 750 rpm. Resuspendera harts och blanda igen för 20 minuter, upprepa en gång för totalt 1 timme inkubation.
3. Kolumn Rening Steg 2: Calmodulin Affinitetskromatografi
- Resin Jämvikts och bindning
- Förbered 200 pl Calmodulin affinitetsharts per 40 g cellpelletera. Tvätta hartset tre gånger, varje gång med 5 ml Calmodulin Binding Buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 150 mM NaCl; 10 mM KCl; 1 mM MgCl2; 5 mM imidazol, pH 8; 2 mM CaCl2; 0,1 % v / v NP-40; 10 mM β-merkaptoetanol), centrifugering vid 160 xg (4 ° C) för att pelletera för varje tvätt.
- Till varje 1 ml IgG eluat, tillsätt 3 volymer Calmodulin bindningsbuffert. För att hålla kalciumnivån är konstant, tillsätt CaCl2 och β-merkaptoetanol för att redogöra för bristen på dessa beståndsdelar i IgG eluering. Slutliga koncentrationer bör vara 2 mM CaCl2 och 10 mM β-merkaptoetanol.
- Lägg provet till Calmodulin hartset och binda under 1 h (4 ° C) med användning av ett rör rotator.
- Förpackning och eluera från Calmodulin Resin
- Bered en 2 ml poly-prep kolonn per 100 | il Calmodulin uppslamning genom att skära änden av kolonnen för att skapa en plan öppning. Fyll inte mer än 100 ^ Calmodulin slam per column för att minimera mängden av harts provet kommer i kontakt med under elueringen.
- Packa kolonnen genom tyngdkraften och tvätta hartset i kolonnen tre gånger med 5 ml Calmodulin Binding Buffer.
- Eluera protein med tillsats av 200 | j, l Calmodulin elueringsbuffert (10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 150 mM NaCl; 10 mM KCl; 1 mM MgCl2; 5 mM imidazol, pH 8,0; 4 mM EGTA, pH 8,0; 0,08% v / volym NP-40; 10 mM β-merkaptoetanol). Upprepa sex gånger tillsats av 200 pl av Calmodulin Elution Buffer.
- För elueringar 1 till 3, tillämpa volymen till kolonnen och samla upp eluatet omedelbart. För eluering 4, försegla bottnen av kolonnen och inkubera med elueringsbuffert för 2,5 min och sedan bryta förseglingen och påbörja elueringen av tyngdkraften. För eluering 5, inkubera i 5 min och sedan bryta förseglingen och eluera. För eluering 6, inkubera i 10 min och sedan bryta förseglingen och eluera.
Obs: Integriteten av komplexet kan variera mellan elueringar / fraktioner (se representativa resultat avsnittet) <./ Li> - Dialysera elueringar 2-6 individuellt över natten med hjälp av en lämplig mikrodialysmetoden. Dialysera fraktionerna mot dialysbuffert (10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 150 mM NaCl; 10 mM KCl; 1 mM MgCl2; 5 mM imidazol, pH 8; 10 mM β-merkaptoetanol).
Notera: NP-40 passerar inte nämnvärt, om alls, genom dialysmembranet.
4. Post-Renings Analyser för att bedöma komplexa Kvalitet
- Nativ gel och silverfärgning
- Förbered en 4-16% förgjutna nativ gel för analys av komplexet enligt instruktionerna från tillverkaren. Använd en lämplig molekylvikt proteinstandard och last 15 | il av var och en av de dialyserade Calmodulin elueringsstegen / fraktioner på gelén.
- Elektrofores gelén vid 150 V under ca 3 h (4 ° C).
- Silver färga gelen att bedöma kvaliteten på vart och ett av de sex elueringar. Alternativt kan du använda lika känslig affärsinformationfluorescent färgämne (n). I detta skede är mest sannolikt under nivån för detektion för Coomassie blue-färgning av koncentrationen av komplexet.
- Ytterligare gelanalys Metoder
- För att upptäcka protein genom Western blotting, lösa komplexa av SDS eller naturlig PAGE och sedan sond gelen för Calmodulin bindande peptid (CBP) epitop med hjälp av en TAP tagg antikropp enligt instruktionerna från tillverkaren.
- Användning av en specifik fluorescent färgämne (n), bekräfta närvaron och integriteten av protein och / eller nukleinsyra i ett TAP renat komplex. Se till att ingen spektral överlappning detekteras mellan dessa fläckar.
- Negativ Stain elektronmikroskopi Visualisering
- Använd kontinuerliga kol galler glöd urladdat vid -15 mA under 30 sekunder, inom 30 minuter av komplexa program.
- Applicera 3 pl av TAP renat komplex (typiskt vid en koncentration av 1 nM) till nätet. Inkubera i en minut. blot from sidan av nätet för att avlägsna överskott av buffert.
- Tvätta två gånger med 20 | il droppar av avjoniserat vatten. Sido blot mellan tvättar.
- Applicera galler till en 50 l negativ staindrop och inkubera en min. Färgning med uranylacetat (2%) eller AUC formiat (0,75%) rekommenderas.
Varning: AUC salter och lösningar är svagt radioaktivt och innehåller tungmetaller. Dessa bör hanteras med omsorg och allt material som kommer i kontakt med dessa lösningar skall kasseras efter institutionens riktlinjer rekommenderas avfall. - Applicera galler till en ny 50 pl negativ staindrop, utan läsk. Inkubera i en minut, sedan sido blot, och slutligen lufttorka och visualisera.
- Cryo elektronmikroskopi (Cryo-EM) Visualisering
- Utför Cryo-EM med TAP renat komplex, även om optimering kan vara nödvändigt, enligt tillverkarens protokoll.
Obs: Förekomst av tvättmedel vid höga koncentrationer may hindra framsteg och diskuteras nedan.
- Utför Cryo-EM med TAP renat komplex, även om optimering kan vara nödvändigt, enligt tillverkarens protokoll.
5. Komplex lagring
- Förbereda Complex för lagring
- Koncentrera de komplexa, om det behövs, med hjälp av en centrifugal filter som har en lämplig molekylvikt cut-off för komplexet. Snurra vid 14.000 xg under steg om 1 min tills önskad koncentration har nåtts.
Obs: NP-40 koncentration kommer att öka i koncentration under koncentrera, eftersom det inte passerar genom filtret eller dialysmembranet. - Flash frysa komplexet i 30 | il alikvoter i flytande kväve eller torris kyld etanol-bad och sedan lagra vid -80 ° C.
- Koncentrera de komplexa, om det behövs, med hjälp av en centrifugal filter som har en lämplig molekylvikt cut-off för komplexet. Snurra vid 14.000 xg under steg om 1 min tills önskad koncentration har nåtts.
- Tillval Efter Rening Borttagning av tvättmedel
Obs: Närvaron av ett rengöringsmedel såsom NP-40 och vid en koncentration som ligger över dess kritiska micellkoncentration kan hindra eller hämma utvecklingen för vissa tillämpningar. Konsekvenserna av dess avlägsnande från protocol liksom ersättning med andra tillsatser eller samlösningsmedel diskuteras nedan. Om ingen NP-40 önskas, är ett alternativ att använda en kommersiell tillämpning för att avlägsna, till exempel Bio-pärlor.
- Pre-jämvikt kommersiellt tillgängliga tvättmedel absorberande pärlor i dialysbuffert. Blanda fem pärlor per 30 pl komplex (vanligtvis vid 10 nM koncentration).
- Inkubera jämviktade pärlor från steg 5.2.1 med TAP renat komplex under 15 minuter på is. Använd komplex inom några timmar efter avlägsnande av tvättmedel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En modifierad TAP metod användes för att rena från S. cerevisiae U1 snRNP, en 18-subenhet ribonukleoprotein komplex. En initial TAP rening av komplexet efter det publicerade protokollet 2,3 gav ett komplex som visades heterogena, migrerar som tre band på en silverfärgad nativ polyakrylamidgel (figur 2A). Multipla omgångar av optimering av TAP metoden, gav ett komplex som migrerade som i första hand ett enda band på en nativ gel som indikerar en mer homogen aggregat (Figur 2A). Användning av fluorescerande färgämnen för att färga både protein och nukleinsyra, konstaterades att det renade komplexet hade både biopolymerer närvarande (figur 2B).
Den renade komplex analyserades också genom SDS PAGE och Western blotting med användning av en TAP tag-antikropp (figur 3A). Förenliga med de native gel följd komplexet renas enligt det publicerade protokollet uppvisade proteolys av TAP taggade proteinet (Snu71). Mängden proteolys emellertid reducerades signifikant med modifieringar av den TAP-metoden. Nästan alla av de sjutton proteinerna i U1 snRNP komplex upplöstes genom SDS PAGE och identifierats av MALDI masspektrometri (Figur 3B). Liksom nativ och SDS PAGE, var komplexa kvalitet granskas på olika stadier av rening genom negativ fläck elektronmikroskopi (Figur 4). De monodispersa partiklar observerades i figur 4A och B men frånvarande från 4C är exempel på bra prov för strukturell studie. Denna analysmetod tillhandahålls kritisk insikt om effekterna av förändringar i TAP-metoden.
TAP-metodanrop för införande av den icke-joniska detergenten NP-40 och vid en koncentration över den hos dess kritiska micellkoncentration (CMC). Tillförlitligheten av dessa metoder för att bedöma kvaliteten på komplexet beskrivs i protokollet är väl demonstreras genom ett experiment där zwitterjoniskt ytaktivt CHAPS, glycerol eller ingen samlösningsmedel ersatte NP-40 i alla buffertar (Figur 5). Med naturlig PAGE och negativa fläcken EM visas U1 snRNP mest homogen och stabil i NP-40 med minskande stabilitet från CHAPS till glycerol ingen samlösningsmedel tillsätts. Det kan vara att jästen U1 snRNP har en hydrofob yta och närvaron av NP-40 förhindrar aggregation genom att belägga denna yta. Olyckligtvis kan NP-40 inte avlägsnas genom dialys och koncentrering av komplexet kommer sedan koncentrera NP-40. Medan den högre NP-40 inte verkar störa komplexet gjorde det inverka negativt frysning av partikeln i glaskroppen is för Cryo-EM och stora micelliknande aggregat observerades. Diskmedel absorberande pärlor användes framgångsrikt för att rEFlytta majoriteten av NP-40 från U1 snRNP provet utan ser ut att påverka komplexa strukturellt.
Efter rening av komplexet med de ändringar som anges i protokollet, ett komplex som lämpar sig för både negativ fläck och Cryo-EM erhölls, vilket framgår av bilder av gräsmattan av partiklar och distinkta representativa klass medelvärden (Figur 6).
Figur 1. Översikt över Tandem Affinitetsrening (TAP) Metod. (A) Schematisk bild av den två steg TAP metod. Komplexet av intresse (grå) inkluderar en TAP taggade subenhet (svart; U1 snRNP subenhet Snu71) genomiskt sammansmält med en sekvens som består av en Calmodulin-bindande peptid (CBP, grön), ett igenkänningsställe för det ställesspecifika proteaset TEV (blått), och två IgG-bindande regionerna av protein A (Pr A , Röd). I 1: a steget, är cellysatet inkuberas med en IgG-harts och komplexet kvarhålles via sin interaktion med protein A-sekvensen. Komplexet frigörs från hartset genom TEV klyvning. I 2: a steget, är komplexet inkuberas med en Calmodulin harts, en Ca2 + beroende reaktion. Komplexet frisätts via tillsats av Ca 2 + kelator EGTA. (B) Western blöt efter en TAP taggade proteinet genom reningsstegen som illustreras i (A). Prover togs av cellysat, efter 1: a steget, och efter den 2: a steget av TAP-metoden. Den reaktivt protein observeras i cellysatet migrerar snabbare efter den 1: a steget, efter TEV proteas klyvning och därmed förlust av protein A-sekvensen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
ure 2 "src =" / filer / ftp_upload / 54.389 / 54389fig2.jpg "/>
Figur 2. Optimering av TAP Method. (A) Silver färgade nativ gel av TAP renat komplex. Nativ PAGE av: proteinstandard (bana 1); komplexa renas enligt ursprungliga TAP metod 3 (bana 2), tre band observerade (pilhuvuden); tre på varandra följande elueringar från samma TAP rening följande ändringar till buffert, två band observer (pilspetsar) (spår 3 - 5); ytterligare ändringar av TAP-metoden, vilket ger huvudsakligen en enda komplex band migrerande vid ~ 800 kDa (bana 6). (B) Analys av sammansättningen av ett renat komplex genom färgning av ett enda gel körfält med både protein och RNA-reaktiva fläckar. Nativ PAGE av: proteinstandard (bana 1) färgades med ett protein fluorescerande fläck; komplex avbildas med protein fluorescent färgämne (spår 2), två band som observeras; samma körfält i bana 2, nu avbildas med en nukleinsyra fluorescerande fläck (spår 3), två band observer; och fluorescenssignalen överlay färgade komplex i banorna 2 och 3 (spår 4). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Optimering av TAP metod. (A) Western blot-analys av förbättring i komplexa kvalitet, efter TAP taggade subenhet Snu71 sonde med α-TAP antikropp. Flera proteolyseras band är synligt från början (rad 1) men förbättringar minska mängden lägre banden avsevärt (spår 2 och 3). (B) En representativ SDS-gel färgad med ett fluorescerande protein gel stain. Gelén löser 12 av de 17 proteinsubenheter av komplexet. Identitet av protein i banden fastställdes genom masspektrometri. Klicka här för att se en larger version av denna siffra.
Figur 4. Exempel på kvalitet vid olika skeden i TAP Metod Bedöms av negativa Stain elektronmikroskopi bedömning negativ fläck elektronmikroskopi av komplexet efter. (A) 1: a steget av TAP, (B) 2: a steget TAP, (C ) komplex destabiliseras. Skala bar, 125 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Påverkan på prov kvalitet tillsatsämnen förekommer i TAP Metod Buffertar Lanes 1 -. 4 är de första fyra elueringar av den slutliga eller 2: a steget TAP rening av complex renas i närvaro av: (A) den icke-joniska detergenten nonyl phenoxypolyethoxylethanol (NP-40), analyserades med naturlig PAGE (överst) och negativ fläck EM (botten), (B) den zwitterjoniska detergenten 3 - [(3- cholamidopropyl) dimetylammonio] -1-propansulfonat (CHAPS), analyserades med naturlig PAGE (överst) och negativ fläck EM (botten), (C) glycerol, analyserad med naturlig PAGE (överst) och negativ fläck EM (botten); och (D) ingen tillsats, analyserades med naturlig PAGE (överst) och negativ fläck EM (botten). Skala bar, 50 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6. Visualisering av TAP Metod Renat Complex. (A) Top, en representativ bild av en negativ fläck elektron microscopy (EM) mikrofotografi. Observerade är en matta av liknande formade partiklar, är två inramade, renas genom den optimerade TAP metoden. Botten, ett urval av klass medelvärden tagna av de partiklar som framhäver partikel särdrag. Skala bar, 50 nm. (B) Top, en representativ bild av en Cryo-EM mikrofotografi. Observerade är områden med högre kontrast representativ för partiklar, se två sådana regioner inramade. Bottom, klass genomsnitt av utvalda partiklar frysta i glaskroppen is. Skala bar, 50 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
TAP Metoden utnyttjar två taggar som balanserar ett behov av stram och selektiv bindning till en affinitets harts med en önskan att bibehålla nära fysiologiska betingelser lösning. Denna balans tjänar till att bevara stabil interaktion (er) av det märkta proteinet med samverkande faktor (er) för post-rening karakterisering. Dessutom taggade individuell TAP ORF är tillgängliga från en kommersiell källa, så att man kan erhålla något av jäststam med ett märkt protein för någon jäst komplex. Bevara integriteten av ett komplex och tillgängligheten av en resurs för att testa användningen av olika taggade proteinsubenheter i ett komplex för rening är två fördelar för användning av TAP metod för att rena ett nativt komplex. Emellertid var den ursprungliga TAP metoden protokollet inte utformats för att säkerställa att komplexet renas sin sammansättning och strukturellt homogen. TAP metoden har därför ändrats, som beskrivs ovan, för att uppnå detta mål.
Olikasteg i TAP metod bedömdes för att fastställa den optimala lösningen och villkor för att rena en sammansättning och strukturell homogen komplex. En tidig kritiska steget är cellys. Detta steg kräver en balans mellan en önskan om en hög avkastning och därmed maximal lys, medan försäkra att det erhållna komplexet är av hög kvalitet, det vill säga homogen. Olika metoder för lysering jästceller undersöktes, bland annat med hjälp en pärla-visp, hög ren vätska processor och kulkvarn. Användning av billigare kaffekvarn var mindre effektiv än de alternativa metoder (40-60% lys), men den komplexa isolerade och renade verkade monodispersa medan flera av dessa metoder föreföll antingen RUBBA partikel integritet eller orsaka vissa aggregering. I slutändan var ett stort antal celler inte lyserades för att säkerställa hög kvalitet komplex erhölls. Medan 40-60% lys är idealisk för jäst U1 snRNP, är optimering föreslås vid tillämpningen av detta protokoll till en ny biologisk komplex.
Det var viktigt att identifiera de steg i den metod som skulle kunna påskynda rening för att se till att komplexa integritet inte äventyras av cellulära proteaser, subenhet dissociation som en följd av utspädning och utökad inkubation vid 18 ° C under TEV proteas klyvning. Ett enkelt steg för att uppnå tidseffektiv rening var att säkerställa att lipider inte överföring från lysatet klargörande tidigt, eftersom lipider hindrar flödet under gravitation rening. Andra steg ingår att identifiera en optimal balans mellan mängden harts och kolumnstorlek / dimensioner för att uppnå effektiv rening och en maximal flödeshastighet. Ett särskilt kritiskt steg var att minska tiden för den kolumn klyvning av TEV proteas. TEV-proteas används renades i huset för att säkerställa att det var proteas / nukleasfritt och vid en hög koncentration 17. Betydande mängder TEV-proteas användes för att erhålla fullständig klyvning på under en timme.
INNEHÅLL "> I första TAP reningar proteolys observerades. Proteolys under rening kan begränsas genom att arbeta effektivt, lägga ett batteri av hämmare, och även i renings höga salt tvättar. Ett brett spektrum av proteashämmare som levereras under första hälften av reningen förbättrats avsevärt stabiliteten hos TAP taggade proteinet och komplexa. Dessutom var proteolys minimeras genom att öka den monovalenta koncentration av 300 till 500 mM under cellys och IgG-reningssteg. Även med de ovanstående modifieringar av TAP-metoden, successiv eluerade fraktioner bort av CBP affinitetshartset varierade i graden av kompositions homogenitet. Således selektiv sammanslagning av fraktioner från den andra, CBP kromatografisteget, är motiverad.En aspekt av TAP metod som fått särskilt fokus var vikten av den icke-joniska detergenten NP-40 för att komplexrening och vid en koncentration över dess CMC. Närvaron av NP-40 vid en koncentration av 0,08% eller högre hade en övergripande gynnsam effekt på komplexa integritet och det slutliga utbytet. Den skenbara gynnsam effekt (er) av NP-40 kan delvis bero på att minska icke-specifika interaktioner mellan harts och komplexet. Medan NP-40 verkar ha en gynnsam effekt under reningen, kan det tas bort efter rening utan att orsaka komplexa aggregering.
Slutligen, avgörande för att optimera TAP metod för strukturell studie fanns flera kompletterande analyser används för att bedöma integriteten och homogenitet av komplexet. Dessa inkluderade ljusspridning, SDS och naturlig PAGE sonderades med användning av TAP-antikropp genom Western blöt och / eller färgade med fluorescerande färgämnen, såväl som negativ fläck elektronmikroskopi. De ändringar som gjorts i TAP metoden beskriven häri, gav en homogen komplex på tillräckliga mängder för elektronmikroskopi. Ytterligare ändringar kan behöva göras för att TAP-metod för andra komplex, i synnerhet en avskräckaställandet av vikten av NP-40.
Sammanfattningsvis kan TAP-reningsmetoden användas för att framgångsrikt rena makromolekylära komplex från en eukaryot källa av lämplig kvalitet för strukturella studier. Vi har etablerat ett lämpligt tillvägagångssätt för rening av S. cerevisiae U1 snRNP och detalj de åtgärder som vidtagits samt grunden för många av dessa förändringar. För andra komplex, föreslår vi att utredaren liknande utforska stegen i protokollet, som kan ge tillräckliga mängder och kvalitet komplex. De åtgärder som bör undersökas finns cellys, salt och tillsats typ och koncentrationer, inklusive tvättmedel, och känsligheten hos komplexet till kalcium och metallkelatbildare EGTA. Vidare är det viktigt för långtidsstudier att komplexet kan frysas och tinas utan störande struktur. Viktigt bör en ha flera alternativa sätt för att analysera strukturen av komplexet under och efter rening. Native ennd SDS PAGE, negativ fläck EM, och ljusspridning har tjänat oss väl i vår undersökning om hur man bäst för att rena en homogen komplex med hjälp av TAP-metoden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| S. cerevisiae TAP tagged strain | Open Biosystems | YSC1177 | This is the primary yeast strain used to develop the TAP protocol. Its background is S288C: ATCC 201388: MATa, his3Δ1, leu2Δ0, met15Δ0, ura3Δ0, SNU71::TAP::HIS3MX6 |
| Coffee grinder | Mr. Coffee | IDS77 | Used for cell lysis |
| Hemocytometer, Bright Line | Hausser Scientific | 3120 | Used to assess cell lysis |
| JA 9.100 centrifuge rotor | Beckman Coulter, Inc. | Used to harvest the yeast cells | |
| JA 20 fixed-angle centrifuge rotor | Beckman Coulter, Inc. | Used to clear the cell extract of non-soluble cellular material | |
| Ti 60 fixed-angle centrifuge rotor | Beckman Coulter, Inc. | Used to further clear the soluble cell extract | |
| Thermomixer | Eppendorf | R5355 | Temperature controlled shaker |
| Novex gel system | Thermo Fisher Scientific | ||
| IgG resin | GE Healthcare | 17-0969-01 | Sepharose 6 fast flow |
| Calmodulin resin | Agilent Technologies, Inc. | 214303 | Affinity resin |
| Protease inhibitor cocktail, mini tablets | Sigma Aldrich | 589297 | Mini cOmplete ultra EDTA-free tablets |
| Protease inhibitor cocktail, large tablets | Sigma Aldrich | 5892953 | cOmplete ultra EDTA-free tablets |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | Dissolved in isopropanol | ||
| 2 ml Bio-spin column | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 7326008 | Used to pack and wash the Calmodulin resin |
| 10 ml poly-prep column | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 7311550 | Used to pack and wash the IgG resin |
| Precast native PAGE Bis-Tris gels | Life Technologies | BN1002 | Novex NativePAGE Bis-Tris 4 - 16% precast polyacrylamide gels |
| NativeMark protein standard | Thermo Fisher Scientific | LC0725 | Unstained protein standard used for native PAGE. Load 7.5 μl for a silver stained gel and 5 μl for a SYPRO Ruby stained gel |
| Precast SDS PAGE Bis-Tris gels | Life Technologies | NP0321 | Novex Nu-PAGE Bis-Tris 4 - 12% precast polyacrylamide gels |
| PageRuler protein standard | Thermo Fisher Scientific | 26614 | Unstained protein standard used for Western blotting |
| SDS running buffer | Life Technologies | NP0001 | 1x NuPAGE MOPS SDS Buffer |
| TAP antibody | Thermo Fisher Scientific | CAB1001 | Primary antibody against CBP tag |
| Secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | 31341 | Goat anti-rabbit alkaline phosphatase conjugated |
| BCIP/NBT | Thermo Fisher Scientific | 34042 | 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate/nitro blue tetrazolium |
| Dialaysis units | Thermo Fisher Scientific | 88401 | Slide-A-Lyzer mini dialysis units |
| Centrifugal filter units, 100kDa MWCO | EMD Millipore | UFC5100008 | Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-100 membrane |
| Detergent absorbing beads | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 1523920 | Bio-bead SM-2 absorbants |
| SYBR Green II | Thermo Fisher Scientific | S-7564 | Flourescent dye for nucleic acid staining, when detecting with SYPRO Ruby present, use excitation wavelength of 488 nm and emission wavelength of 532 nm |
| SYPRO Ruby | Molecular Probes | S-12000 | Flourescent dye for protein staining, when detecting with SYBR Green II present, use excitation wavelength of 457 nm and emission wavelength of 670 nm |
| Copper grids | Electron Microscopy Sciences | G400-CP |
References
- Gavin, A. C., et al. Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes. Nature. 415 (6868), 141-147 (2002).
- Rigaut, G., Shevchenko, A., Rutz, B., Wilm, M., Mann, M., Seraphin, B. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nature Biotechnology. 17 (10), 1030-1032 (1999).
- Puig, O., et al. The tandem affinity purification (TAP) method: A general procedure of protein complex purification. Methods. 24 (3), 218-229 (2001).
- Vaillancourt, P., Zheng, C. F., Hoang, D. Q., Breister, L. Affinity purification of recombinant proteins fused to calmodulin or to calmodulin-binding peptides. Methods Enzymol. 326, 340-362 (2000).
- Braisted, A. C., Wells, J. A. Minimizing a binding domain from protein A. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (12), 5688-5692 (1996).
- Kapust, R. B., et al. Tobacco etch virus protease: mechanism of autolysis and rational design of stable mutants with wild-type catalytic proficiency. Protein Eng. 14 (12), 993-1000 (2001).
- Nallamsetty, S., et al. Efficient site-specific processing of fusion proteins by tobacco vein mottling virus protease in vivo and in vitro. Protein Expr Purif. 38 (1), 108-115 (2004).
- Ghaemmaghami, S., et al. Global analysis of protein expression in yeast. Nature. 425 (6959), 737-741 (2003).
- Howson, R., et al. Construction, verification and experimental use of two epitope-tagged collections of budding yeast strains. Comp Funct Genomics. 6 (1-2), 2-16 (2005).
- Cox, D. M., Du, M., Guo, X., Siu, K. W., McDermott, J. C. Tandem affinity purification of protein complexes from mammalian cells. Biotechniques. 33 (2), 267-268 (2002).
- Gully, D., Moinier, D., Loiseau, L., Bouveret, E. New partners of acyl carrier protein detected in Escherichia coli by tandem affinity purification. FEBS Lett. 548 (1-3), 90-96 (2003).
- Tharun, S. Purification and analysis of the decapping activator Lsm1p-7p-Pat1p complex from yeast. Methods Enzymol. 448, 41-55 (2008).
- Xu, X., Song, Y., Li, Y., Chang, J., Zhang, H., An, L. The tandem affinity purification method: an efficient system for protein complex purification and protein interaction identification. Protein Expr Purif. 72 (2), 149-156 (2010).
- Cheng, Y., Grigorieff, N., Penczek, P. A., Walz, T. A Primer to Single-Particle Cryo-Electron Microscopy. Cell. 161 (3), 438-449 (2015).
- Gottschalk, A., et al. A comprehensive biochemical and genetic analysis of the yeast U1 snRNP reveals five novel proteins. RNA. 4 (4), 374-393 (1998).
- Neubauer, G., Gottschalk, A., Fabrizio, P., Seraphin, B., Luhrmann, R., Mann, M. Identification of the proteins of the yeast U1 small nuclear ribonucleoprotein complex by mass spectrometry. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (2), 385-390 (1997).
- Lucast, L. J., Batey, R. T., Doudna, J. A. Large-scale purification of a stable form of recombinant tobacco etch virus protease. Biotechniques. 30 (3), 544-546 (2001).
