Abstract
approches de purification d'affinité ont réussi à isoler des complexes indigènes pour la caractérisation protéomique. hétérogénéité structurelle et un degré d'hétérogénéité de la composition d'un complexe ne gênent généralement pas les progrès accomplis dans la réalisation de telles études. En revanche, un complexe destiné à la caractérisation structurale doit être purifié dans un état qui est à la fois de composition et de structure homogène ainsi qu'à une concentration plus élevée que celle requise pour la protéomique. Récemment, il y a eu des avancées significatives dans l'application de la microscopie électronique pour la détermination de structure de grands complexes macromoléculaires. Cela a accru l'intérêt dans les approches pour purifier des complexes indigènes de qualité et en quantité suffisante pour la détermination structurale par microscopie électronique. La méthode Tandem Affinity Purification (TAP) a été optimisé pour extraire et purifier une 18 sous-unité, ~ 0,8 MDa ribonucléoprotéine ensemble de levure bourgeonnante (Saccharomyces cerevisiae)
Introduction
De nombreux processus cellulaires majeurs sont réalisées par grandes protéines et protéines complexes ARN-1. Un goulot d' étranglement important pour la réalisation d' études biophysiques et structurelles de ces complexes est leur obtention d'une qualité appropriée (c. -à- homogénéité) et à une concentration appropriée. Isoler un complexe à partir d'une source naturelle présente de nombreux avantages, notamment en conservant les modifications post-transcriptionnel et / ou traductionnelles pertinentes des sous-unités et assurer l'assemblage complexe approprié. Cependant, de grands complexes cellulaires sont souvent présents dans une cellule à un faible nombre de copies et la purification doivent être hautement efficace et se produire dans des conditions physiologiques proches pour assurer l'intégrité complexe est maintenue. Purifier un complexe d'une source eucaryote est particulièrement difficile et peut être financièrement prohibitif. Ainsi, les stratégies ou les méthodes qui sont efficaces et donnent un complexe homogène sont très recherchés.
Une stratégie qui a étésuccès dans la purification des complexes natifs à partir de cellules eucaryotes pour leur caractérisation initiale est la méthode Tandem Affinity Purification (TAP) 2,3. La méthode TAP a été initialement conçu pour purifier une protéine native de la levure bourgeonnante (S. cerevisiae) dans un complexe avec l' interaction facteur (s) 2. Le procédé utilisé TAP deux étiquettes, chaque étiquette fusionnée en tandem à la même séquence de gène codant pour la protéine. Les étiquettes ont été choisies de manière à équilibrer le besoin pour une liaison étanche et sélective sur une résine d'affinité avec un désir de maintenir des conditions proches de la solution physiologique. Cet équilibre permet de préserver l'interaction stable (s) de la protéine marquée avec l'interaction facteur (s) pour la post-purification de caractérisation. L'étiquette TAP génomiquement intégré est placé à l'extrémité (C-terminale) d'un gène codant pour une protéine et est composée d'une séquence codant pour un calmoduline de liaison du peptide (PFC), suivie par la protéine A - une addition d'un peu plus de 20 kDa à la tagged protéine. CBP est courte, 26 acides aminés, et reconnues par la protéine de 17 kDa ~ calmoduline (CaM) , en présence de calcium avec un Kd de l'ordre de 10 -9 M 4. La balise protéine A est plus grand, composé de deux répétitions de 58 résidus avec un court lieur entre les répétitions. Chaque répétition d'acides aminés 58 est reconnu par l' immunoglobuline G (IgG) avec un Kd ~ 10 ~ 8 M 5. Entre ces deux balises a été incorporé un site de reconnaissance pour la protéase TEV, une endopeptidase du virus Tobacco Etch 6,7. Comme cela est illustré sur la figure 1, dans la première étape d'affinité du procédé TAP protéine marquée est liée à une résine d' IgG via la protéine A. La protéine marquée est éluée par sur une colonne de clivage lors de l'addition de la protéase TEV, spécifique au site de clivage entre les deux balises. Ceci est une étape nécessaire que l'interaction de l'IgG et la protéine A est très forte et ne peut être perturbée de manière adéquate sous des conditions de dénaturation de la solution. Faute d'un PrUne étiquette otein, la protéine est liée à la résine CaM en présence de calcium et on l' élue de cette résine avec addition de l'EGTA chélateur d'ions métalliques (éthylène glycol d'acide tétra - acétique) (figure 1).
Peu après l'introduction de la méthode TAP, il a été utilisé dans une étude à grande échelle pour générer une «carte» des interactions complexes dans S. 8 cerevisiae. Il est important, comme une conséquence de cet effort tout un cadre de levure TAP Tagged lecture ouvert (ORF) bibliothèque ainsi que TAP individuels marqués ORFs 9 sont disponibles à partir d' une source commerciale. Ainsi, on peut obtenir toute souche de levure avec une protéine étiquetée pour chaque complexe de levure. La méthode TAP a également stimulé des modifications ou des variations de la balise TAP, y compris: son utilisation pour la purification des complexes provenant d' autres eucaryotes, ainsi que des cellules bactériennes 10,11; la conception d'un "tag diviser", dans lequel la protéine A et CBP sont placés sur différentes protéines 12; et tags changés, de manière à tenir compte de la nécessité de l'enquêteur, telles que la sensibilité du complexe Ca2 + EGTA ou 13.
Les progrès récents dans les deux instruments et la méthodologie ont permis des avancées significatives dans l'application de la microscopie électronique (EM) pour la détermination de la structure, qui ont conduit à haute, près des images de résolution atomiques des complexes macromoléculaires 14. La résolution obtenue d'un complexe par EM, cependant, reste subordonnée à la qualité du complexe à l'étude. Cette étude a utilisé l'approche TAP tag pour purifier de S. cerevisiae U1 snRNP, un 18 sous-unité (~ 0,8 MDa) complexe ribonucléoprotéine faible nombre de copies qui fait partie de l'épissage 15,16. Un certain nombre de mesures ont été prises pour purifier ce complexe de telle sorte qu'il est homogène et d'une concentration adéquate. Les problèmes potentiels rencontrés à diverses étapes de la purification sont décrits et les stratégies prises pour surmonter challenges mis en évidence. Par soigneusement évaluer et d'optimiser les étapes de la purification, l'U1 snRNP purifié est d'une qualité et à une quantité appropriée pour coloration négative et électronique cryo microscopie études (cryo-EM). Un optimisé TAP méthode protocole pour la purification des complexes natifs pour des études structurales est décrit ici.
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Protocol
Remarque: Le protocole suivant a été mis au point pour la purification d'un complexe de 4 litres de culture de cellules, environ 40 g de poids humide de cellules. Une fois préparé, tous les tampons doivent être conservés à 4 ° C et utilisés dans le mois de leur préparation. les inhibiteurs de la protéase et l'agent réducteurs ne sont ajoutés aux tampons juste avant d'utiliser.
1. Préparation de l'extrait de cellules entières pour Tandem Affinity Purification
- La croissance de S. cellules cerevisiae
- Streak TAP désiré marqué S. cerevisiae souche de stockage (-80 ° C) sur une peptone dextrose de levure (YPD) de la plaque. Incuber pendant 3 - 5 jours (30 ° C), jusqu'à ce que les cellules de levure apparaissent en blanc et mousseux.
- Inoculer une série d'environ 2 mm 2 des cellules fraîches de la plaque dans 10 ml de milieu YPD dans un polypropylène tube à centrifuger conique de 50 ml. Agiter le tube à 180 tours par minute (rpm) pendant la nuit (30m ° C).
- Inoculer 2 ml de plusculture de nuit et par litre de milieu YPD dans un 2 L Erlenmeyer ou fiole conique. Agiter à 180 tours par minute (30 ° C). Surveiller la croissance des cellules à une densité optique de 600 nm (DO 600) jusqu'à la phase logarithmique tardive, DO600 de 1,8 à 2, typiquement de 20 à 24 heures.
- Récolte S. cellules cerevisiae
- récolte des cellules par centrifugation à 5 400 xg pendant 15 min (4 ° C).
- décanter rapidement le surnageant et maintenir les cellules à 4 ° C ou sur la glace.
- Suspendre chaque litre de culot de cellules avec 2 ml réfrigéré tampon de lyse (10 mM de Tris-HCl, pH 8,0, NaCl 300 mM, KCl 10 mM, EDTA 0,2 mM, pH 8,0; mM d'imidazole 5, pH 8,0; 10% de glycerol; 0,1% v NP-40 / v). Suspendre les cellules par tourbillonnement et / ou répétition pipetage utilisant un 10 ml pipettes sérologiques.
Note: L'importance de NP-40 en ce qui concerne la qualité complexe et l'analyse post-purification est discuté ci-dessous. - Transférer la suspension cellulaire dans un vide de 50 ml polypropylène tube à centrifuger conique kept sur la glace. Laver chaque flacon de centrifugeuse avec une 2 ml supplémentaires de tampon de lyse refroidi et ajouter à la suspension cellulaire dans le tube de 50 ml.
- Déterminer le poids humide du culot cellulaire en pesant le tube et en soustrayant le poids du tube vide, ainsi que le tampon de lyse ajouté.
Note: Un litre de culture cellulaire ayant une DO 600 de 1,8 est d' environ 10 g. - Créer un bain d'azote liquide dans un cône de polypropylène tube de centrifugeuse de 50 ml. Dessinez cellules en suspension dans une seringue de 5 ml. Branchez une aiguille G 16 à la seringue. Congeler la suspension cellulaire en le faisant passer à travers la seringue / aiguille pour générer des cellules "gouttelettes". Taux de congélation devrait être d'environ 1 min / ml.
- Stocker des gouttelettes de cellules congelées (-80 ° C) ou procéder à une lyse.
- Lyser des cellules et clarification Lysat
- Lyse les Les cellules de levure en utilisant un moulin à café. cellules Lyse huit à neuf fois avec 25 sec de broyage rafales, tout en agitant le cmeuleuse Offee. Avant utilisation, pré-refroidir le moulin à café avec de l'azote liquide. Tous les deux tours de broyage, ajouter une couche superficielle de l'azote liquide à la meuleuse et laisser évaporer.
- Remuer avec une spatule azote liquide refroidi au besoin pour garder les cellules de l'agglutination. Prendre des précautions pour éviter la décongélation des cellules, ce qui peut entraîner une agglutination cellulaire. Les cellules doivent apparaître comme une fine poudre blanche après la lyse. Un culot cellulaire maximale de 4 litres de culture de levure (~ 40 g) peut être broyé à la fois.
Note: Les observations concernant la méthode de lyse sont discutés ci-dessous. - Évaluer le degré de lyse des cellules en utilisant un hémocytomètre ou autre méthode de comptage des cellules. Pour fournir une analyse adéquate, prendre les échantillons suivants: (1) avant la lyse; (2) après quatre cycles de lyse; et (3) après la lyse. Pour vérifier ces échantillons, prendre une petite quantité de cellules avec une spatule réfrigérée azote liquide et dans un tube de 1,5 ml.
- Une fois que les cellules sont décongelées, pipette 5 pi de celluleset mélanger avec 495 pi d'eau. Si 40 - 60% de lyse des cellules est observée, passez à l'étape suivante dans le protocole.
Note: Observations concernant l'effet des longues périodes de lyse sont discutés ci-dessous. - , les cellules de magasin lysées Une fois la lyse adéquate est observée (-80 ° C) ou passer à l'étape suivante.
- Préparer deux 50 ml polypropylene tubes de centrifugation coniques de 15 ml chacune avec un tampon de lyse, notamment 1 mM de fluorure de phénylméthanesulfonyle (PMSF), 1 mM de dithiothréitol (DTT), et un cocktail disponible dans le commerce d'inhibiteurs de la protéase.
Remarque: Si protéolyse significative est observée, envisager l'utilisation d'une souche déficiente de la protéase. - Utilisez un azote liquide spatule réfrigérée pour ramasser la poudre congelée de cellules lysées dans les préparations tubes de 50 ml. Ajouter la poudre cellulaire / solide de façon incrémentielle à la mémoire tampon de lyse contenant à la fois un agent réducteur et d'inhibiteur (s) de protéase.
- Faire tourner les tubes de 50 ml doucement à la température ambiante de manière à fondre / dissoudre les cellules, mais aussi pour éviter la formation de bulles. UNEs la poudre cellulaire / solide se dissout, ajouter cellule supplémentaire solide / poudre.
- Remplir chacun des deux tubes de 50 ml jusqu'à ce que chacun a environ 20 g de cellules ou de toutes les cellules ajoutées. Continuer la décongélation / dissolution jusqu'à ce qu'il n'y a pas amas de cellules congelées observées dans les tubes de 50 ml. Cela devrait prendre environ 50 min.
- Centrifuger le lysat de cellules en suspension pendant 20 min à 25 000 x g (4 ° C). cellules bien-lysées peuvent présenter une petite quantité de précipité noir.
- Transférer les 50 ml de surnageant au polycarbonate tubes ultra-centrifugeuse (26,3 ml tubes utilisés) et ajouter 10 ul mM PMSF 200 à chaque tube plein.
- Centrifugeuse pendant 1 heure à 100.000 xg (4 ° C). Quatre couches doivent être visibles, de bas en haut: (1) une pastille dure claire, contenant des complexes de ribosomes; (2) une pastille riche en lipides douce; (3) une grande couche jaunâtre clair contenant la plupart des protéines et des complexes solubles de la cellule; et (4) un «écailleuse» couche supérieure constituée de lipides.
- Effectuer toutes les subsequent étapes dans une chambre froide (4 ° C). Retirez autant de la «écailleuse» couche supérieure lipidique que possible en utilisant un 1 ml pipette et le jeter. Utilisez 10 ml pipettes sérologiques pour récupérer la majeure partie de la couche jaune clair.
- Récupérer les dernières ml de cette couche à l'aide d'une pipette de 1 ml pour éviter de perturber les deux couches inférieures. De 40 g cellule humide culot, environ 48 ml de la couche du milieu est généralement récupéré et 8 ml de la couche lipidique enlevés / mis au rebut.
Note: Le débit de la colonne de purification est fortement entravée par la présence de lipides, ce qui peut également nuire à la qualité du complexe décrit ci-dessous.
2. La colonne de purification étape 1: IgG Chromatographie
- Résine équilibration et reliure
- Préparer un 300 ul d'IgG Sepharose suspension pour 40 g de culot cellulaire. Coupez l'extrémité d'une pointe de pipette 1 ml pour faciliter le pipetage la suspension. Laver / équilibrer la résine IgG trois fois, chaque fois avec 5 ml IgGD150 Buffer (10 mM de Tris-HCl, pH 8,0, NaCl 150 mM, KCl 150; 1 mM de MgCl2; mM d' imidazole 5, pH 8, 0,1% v / v de NP-40, 1 mM de DTT, un comprimé d'inhibiteur de protease par 50 volume en ml).
- Spin à culot à 160 xg (4 ° C) entre les lavages et retirer le surnageant.
- Faire tourner la résine IgG avec le surnageant de la phase médiane, et deux mini-comprimés d'inhibiteur de protease par 40 g de cellules, en utilisant un dispositif de rotation approprié, pendant 2 heures (4 ° C). Ceci est la solution du lot d'IgG.
- Préparer deux 10 ml colonnes poly-prep pour une utilisation en coupant l'extrémité de la colonne pour produire une coupe à plat. Afin d'accélérer l'emballage et le lavage de la colonne par écoulement par gravité, charger un maximum de 200 ul de résine IgG ou tassé ~ 25 ml de la solution du lot d'IgG par colonne de 10 ml.
- Verser la solution de traitement par lots d'IgG dans la colonne et laisser sédimenter par gravité. Si la sédimentation prend plus de 30 minutes, il était plus probable contamination lipidique lors de la récupération de la phase intermédiaire de la centrifugeuse tubes.
- Laver la colonne garnie de quatre successives de 10 ml volumes de IgGD150 Buffer.
- Préparer un 300 ul d'IgG Sepharose suspension pour 40 g de culot cellulaire. Coupez l'extrémité d'une pointe de pipette 1 ml pour faciliter le pipetage la suspension. Laver / équilibrer la résine IgG trois fois, chaque fois avec 5 ml IgGD150 Buffer (10 mM de Tris-HCl, pH 8,0, NaCl 150 mM, KCl 150; 1 mM de MgCl2; mM d' imidazole 5, pH 8, 0,1% v / v de NP-40, 1 mM de DTT, un comprimé d'inhibiteur de protease par 50 volume en ml).
- Sur la colonne TEV Décolleté
- Sceller le fond de la colonne et ajouter 1 ml de IgGD150 Buffer et 100 pi de TEV protéase (0,6 mg / stock ml, variante mutante S219V de TEV produit en interne). Sceller le haut de la colonne et mélanger pendant 20 min (18 ° C) en utilisant un mélangeur thermique, en agitant à 750 tours par minute. résine Resuspendre et mélanger à nouveau pendant 20 minutes, répéter une fois de plus pour un total de 1 heure d'incubation.
Note: Il est essentiel de garder le temps d'incubation à un minimum. - Retourner la colonne à 4 ° C et à éluer la protéine / le complexe par gravité. Eluer le volume mort avec un 200 pi supplémentaires de IgGD150 Buffer.
- Sceller le fond de la colonne et ajouter 1 ml de IgGD150 Buffer et 100 pi de TEV protéase (0,6 mg / stock ml, variante mutante S219V de TEV produit en interne). Sceller le haut de la colonne et mélanger pendant 20 min (18 ° C) en utilisant un mélangeur thermique, en agitant à 750 tours par minute. résine Resuspendre et mélanger à nouveau pendant 20 minutes, répéter une fois de plus pour un total de 1 heure d'incubation.
3. Colonne Purification Etape 2: calmoduline Chromatographie d'affinité
- Résine équilibration et reliure
- Préparer 200 pi de résine d'affinité pour la calmoduline 40 g de cellulespastille. Laver la résine à trois reprises, chaque fois avec 5 ml de calmoduline tampon de liaison (10 mM de Tris-HCl, pH 8,0, NaCl 150 mM, KCl 10 mM, MgCl2 1 mM, 5 mM d' imidazole, pH 8, 2 mM de CaCl2; 0,1 % v / v de NP-40, 10 mM de β-mercaptoéthanol), centrifuger à 160 x g (4 ° C) et un culot pour chaque lavage.
- Pour chaque 1 ml IgG éluat, ajouter 3 volumes de calmoduline Binding Buffer. Pour maintenir constant le niveau de calcium, ajouter CaCl 2 et β-mercaptoéthanol pour tenir compte de l'absence de ces constituants dans l'élution IgG. Les concentrations finales doivent être CaCl2 2 mM et 10 mM β-mercaptoéthanol.
- Ajouter l'échantillon à la résine de calmoduline et de se lier pendant 1 h (4 ° C) en utilisant un dispositif de rotation du tube.
- Emballage et élution de calmoduline Résine
- Préparer une colonne de poly-prep 2 ml par 100 ul de suspension de calmoduline en coupant l'extrémité de la colonne pour créer une ouverture plane. Charger pas plus de 100 pi de calmoduline suspension par colonne pour réduire au minimum la quantité de résine de l'échantillon entre en contact au cours de l'élution.
- Emballez la colonne par gravité et laver la résine dans la colonne trois fois avec 5 ml de calmoduline Binding Buffer.
- Éluer la protéine avec addition de 200 ul calmoduline de tampon d' élution (10 mM de Tris-HCl, pH 8,0, NaCl 150 mM, KCl 10 mM, MgCl2 1 mM; mM d' imidazole 5, pH 8,0, 4 mM d' EGTA, pH 8,0; 0,08% v / v de NP-40, 10 mM de β-mercaptoéthanol). Répéter six fois l'addition de 200 ul de tampon d'élution calmoduline.
- Pour élutions 1 à 3, appliquer le volume à la colonne et recueillir l'éluat immédiatement. Pour l'élution 4, sceller le fond de la colonne et on incube avec un tampon d'élution pendant 2,5 min, puis desceller et laisser éluer par gravité. Pour l'élution 5, incuber pendant 5 min, puis desceller et éluer. Pour l'élution 6, incuber pendant 10 min, puis desceller et éluer.
Remarque: L'intégrité du complexe peut varier entre élutions / fractions (voir la section des résultats représentatifs) <./ Li> - Dialyser élutions 2 à 6, individuellement pendant une nuit en utilisant une méthode de dialyse de micro approprié. Dialyser les fractions de dialyse contre un tampon (10 mM de Tris-HCl, pH 8,0, NaCl 150 mM, KCl 10 mM, MgCl2 1 mM, 5 mM d' imidazole, pH 8, 10 mM de β-mercaptoéthanol).
Remarque: NP-40 ne passe pas de façon appréciable, le cas échéant, à travers la membrane de dialyse.
4. Post-purification Analyses pour évaluer la qualité Complex
- Gel natif et Silver Staining
- Préparer un 4 - gel natif de 16% préfabriqué pour l'analyse du complexe selon les instructions du fabricant. Utiliser une protéine étalon de masse moléculaire appropriée et la charge 15 pi de chacune des calmoduline / élution des fractions dialysées sur le gel.
- L'électrophorèse du gel à 150 V pendant environ 3 heures (4 ° C).
- Coloration à l'argent du gel pour évaluer la qualité de chacun des six élutions. Vous pouvez également utiliser la même sensibilité commercialecolorant fluorescent (s). A ce stade, la concentration du complexe est très probablement au-dessous du niveau de détection pour la coloration au bleu de Coomassie.
- D' autres méthodes d' analyse Gel
- Pour détecter la protéine par Western blot, résoudre le complexe par SDS ou PAGE native puis sonder le gel pour l'épitope calmoduline Reliure Peptide (CBP) en utilisant un anticorps TAP d'étiquette selon les instructions du fabricant.
- Au moyen d'un colorant fluorescent spécifique (s), confirmer la présence et l'intégrité de la protéine et / ou de l'acide nucléique dans un complexe TAP purifié. Veillez à ce que pas de chevauchement spectral est détecté entre ces taches.
- Négatif Visualisation Stain Electron Microscopy
- Utiliser des grilles de carbone continues lueur déchargée à -15 mA pendant 30 secondes, à moins de 30 min d'application complexe.
- Appliquer 3 ul de complexe de robinet purifiée (typiquement à une concentration de 1 nM) sur la grille. Incuber pendant une minute. blot felon le côté de la grille pour éliminer l'excès de tampon.
- Laver deux fois avec 20 ul de gouttes d'eau déminéralisée. blot latérale entre les lavages.
- Appliquer la grille à un négatif chute de tache de 50 pi et incuber pendant une min. Coloration avec de l'acétate d'uranyle (2%) ou le formiate d'uranyle (0,75%) est recommandée.
Attention: les sels et les solutions uranyle sont faiblement radioactifs et contiennent des métaux lourds. Ceux-ci doivent être manipulés avec soin et tout le matériel qui entre en contact avec ces solutions doivent être éliminés conformément aux directives de déchets recommandées institutionnels. - Appliquer la grille à un 50 pi coloration négative goutte frais, sans buvard. Incuber pendant une minute, puis côté blot, et enfin sécher à l'air et de visualiser.
- Cryo Electron Microscopy (cryo-EM) Visualisation
- Effectuer cryo-EM avec un complexe TAP purifié, bien que l'optimisation peut être nécessaire, selon le protocole du fabricant.
Remarque: La présence de détergent à des concentrations élevées may entravent le progrès et est discuté ci-dessous.
- Effectuer cryo-EM avec un complexe TAP purifié, bien que l'optimisation peut être nécessaire, selon le protocole du fabricant.
5. Complexe de stockage
- Préparation complexe pour le stockage
- Concentrer le complexe, le cas échéant, à l'aide d'un filtre centrifuge ayant un poids moléculaire de coupure appropriée pour le complexe. Spin à 14.000 xg pendant incréments de 1 min jusqu'à ce que la concentration désirée soit atteinte.
Remarque: la concentration de NP-40 augmente la concentration au cours de la concentration, car elle ne passe pas à travers la membrane filtrante, ni dialyse. - gel flash complexe en 30 aliquotes dans l'azote liquide ou de la glace sèche refroidi bain d'éthanol puis stocker à -80 ° C.
- Concentrer le complexe, le cas échéant, à l'aide d'un filtre centrifuge ayant un poids moléculaire de coupure appropriée pour le complexe. Spin à 14.000 xg pendant incréments de 1 min jusqu'à ce que la concentration désirée soit atteinte.
- Post-Purification en option Suppression de détergent
Remarque: La présence d'un détergent tel que le NP-40 et à une concentration supérieure à celle de sa concentration micellaire critique peut gêner ou inhiber la progression pour certaines applications. Les conséquences de son retrait de la protocol ainsi que le remplacement avec d'autres additifs ou co-solvants sont discutés ci-dessous. En l'absence de NP-40 est souhaitée, une solution consiste à utiliser une application commerciale pour l'enlèvement, par exemple Bio-beads.
- Pré-Amener les disponibles dans le commerce absorbant détergentes perles dans Dialyse Buffer. Mélanger cinq perles par 30 pi de complexe (habituellement à une concentration de 10 nM).
- Incuber perles équilibrées de l'étape 5.2.1 avec TAP complexe purifié pendant 15 minutes sur la glace. Utilisez complexe en quelques heures après le retrait de détergent.
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Representative Results
Procédé TAP modifié a été utilisé pour purifier à partir de S. cerevisiae U1 snRNP, un complexe de ribonucléoprotéine 18 sous-unité. Une purification TAP initiale du complexe suivant le protocole publié 2,3- a abouti à un complexe qui est apparu hétérogène, la migration en trois bandes sur un gel coloré à l' argent de Polyacrylamide natif (Figure 2A). Plusieurs tours d'optimisation de la méthode TAP, on a obtenu un complexe qui a migré comme étant essentiellement une seule bande sur un gel natif indicatif d'un ensemble plus homogène (figure 2A). En utilisant des colorants fluorescents tacher pour les protéines et l' acide nucléique, il a été établi que le complexe purifié avait les deux biopolymères présents (figure 2B).
Le complexe purifié a été également analysée par SDS - PAGE et par Western blot en utilisant un anticorps marqueur TAP (figure 3A). Conformément aux native résultat de gel, le complexe purifié selon le protocole publié présentait protéolyse de la protéine marquée TAP (Snu71). Le montant de la protéolyse, cependant, a été significativement réduite par modification de la méthode de la TAP. La quasi - totalité des dix - sept protéines dans le complexe U1 snRNP ont été résolues par SDS - PAGE et identifié positivement par spectrométrie de masse MALDI (figure 3B). Ainsi que native et SDS - PAGE, la qualité complexe a été évalué à différents stades de la purification par microscopie électronique à coloration négative (figure 4). Les particules monodispersées observées dans la figure 4A et B , mais absents de 4C sont des exemples de bon échantillon pour l' étude structurelle. Cette méthode d'analyse a fourni un aperçu critique quant à l'impact des changements apportés à la méthode TAP.
Le procédé TAP prévoit l'inclusion du détergent non ionique NP-40 et à une concntration supérieure à celle de sa concentration micellaire critique (CMC). La robustesse des méthodes d'évaluation de la qualité du complexe décrit dans le protocole sont bien démontrée par une expérience où le zwitterionique CHAPS, le glycérol ou pas co-solvant ont été remplacés par NP-40 dans tous les tampons (Figure 5). Par PAGE natif et coloration négative EM, l'U1 snRNP apparaît le plus homogène et stable dans le NP-40 avec la diminution de la stabilité de CHAPS en glycérol ou pas co-solvant ajouté. Il se pourrait que la snRNP levure U1 a une face hydrophobe et la présence de NP-40 empêche l'agrégation en revêtant cette surface. Malheureusement, le NP-40 ne peut pas être éliminé par dialyse et concentration du complexe est alors concentré le NP-40. Alors que le plus élevé NP-40 ne semble pas perturber le complexe, il a un impact négatif sur le gel de la particule dans la glace vitreuse pour cryo-EM et de grands agrégats de micelles ont été observées. Détergent perles absorbantes ont été utilisés avec succès pour remove la majorité de la NP-40 de l'échantillon U1 snRNP sans paraître influer sur le complexe structurellement.
Suite à la purification du complexe avec les modifications décrites dans le protocole, un complexe approprié à la fois pour coloration négative et cryo-EM a été obtenu, comme en témoignent les images de la pelouse des particules et des moyennes de classe représentatives distinctifs (figure 6).
Figure 1. Vue d'ensemble de Tandem Affinity Purification (TAP) Méthode. (A) Représentation schématique du procédé de TAP en deux étapes. Complexe d'intérêt (gris) comprend un TAP étiqueté sous-unité (noir; U1 snRNP sous-unité Snu71) génomiquement fusionné avec une séquence composée d'un calmoduline Reliure Peptide (CBP, vert), un site de reconnaissance pour la protéase spécifique du site TEV (bleu), et deux IgG régions de la protéine A de liaison (Pr A , Rouge). Dans la première étape, le lysat cellulaire est mis en incubation avec une IgG de résine et le complexe est retenu par l'intermédiaire de son interaction avec la protéine de séquence. Le complexe est libéré de la résine par clivage TEV médiation. Dans la deuxième étape, le complexe est mis à incuber avec une résine de calmoduline, une réaction dépendante de Ca2 +. Le complexe est libéré par addition du chélateur EGTA Ca2 + (B) . Western Blot après une protéine marquée par TAP les étapes de purification illustrées dans (A). On prélève des échantillons de lysat cellulaire, après la première étape et après la deuxième étape du procédé TAP. La protéine réactive observée dans lysat cellulaire migre plus rapidement après la 1ère étape, après la protéase TEV clivage et donc la perte de la protéine Une séquence. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Figure 2. Optimisation de la méthode TAP. (A) Argent teinté gel natif de complexes TAP purifié. PAGE maternelle: protéine standard (voie 1); complexes purifiés selon la méthode TAP originale 3 (piste 2), trois bandes observées (pointes de flèches); trois élutions consécutives de la même purification de TAP suivantes modifications pour la mémoire tampon, deux bandes observées (pointes de flèches) (voies 3 - 5); d' autres modifications à la méthode de TAP, ce qui donne d' abord une seule bande complexe migrant à ~ 800 kDa (piste 6). (B) Analyse de la composition d'un complexe purifié par coloration d' une seule voie de gel avec les protéines et les ARN taches réactives. PAGE natif de: protéine standard (voie 1), teinté avec un colorant fluorescent de protéine; imagé complexe avec la protéine colorant fluorescent (piste 2), deux bandes observées; même voie dans la voie 2, actuellement imagé avec un colorant fluorescent d'acide nucléique (piste 3), deux bandes observées; et signal fluorescent surposer des complexes colorés dans les voies 2 et 3 (piste 4). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. Optimisation de la TAP Méthode. (A) d'analyse par Western blot de l' amélioration de la qualité complexe, TAP suivant étiqueté sous - unité Snu71 sondé avec l' anticorps α-TAP. Plusieurs bandes sont visibles protéolysée initialement (voie 1) , mais des améliorations réduisent la quantité de bandes inférieures sensiblement (lignes 2 et 3). (B) un gel SDS représentatif coloré avec un colorant de gel de protéine fluorescente. Gel résout 12 des 17 sous-unités protéiques du complexe. Identité de la protéine dans les bandes a été établie par spectrométrie de masse. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une largversion er de ce chiffre.
Figure 4. Qualité de l' échantillon aux étapes de la méthode TAP Évaluée par négatif Tache Microscopie électronique d' évaluation par microscopie négative électronique à coloration du complexe résidentiel:. (A) 1 ère étape de la TAP; (B) le 2 ème étape de la TAP; (C ) complexe déstabilisé. Barre d'échelle, 125 nm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5. Impact sur la qualité des additifs présents dans TAP Méthode Tampons Sample Lanes 1 -. 4 sont les quatre premiers élutions de l'étape finale ou 2 e de la TAP purification de complex purifié en présence de: (A) le détergent non ionique nonyle phenoxypolyethoxylethanol (NP-40), analysé par PAGE native (en haut) et coloration négative EM ( en bas), (B) le détergent zwitterionique 3 - [(3- cholamidopropyl) dimethylammonio] -1-propanesulfonate (CHAPS), analysé par PAGE native (en haut) et coloration négative EM ( en bas); (C) de glycérol, analysé par PAGE native (en haut) et coloration négative EM ( en bas); et (D) sans additif, analysé par PAGE native (en haut) et coloration négative EM ( en bas). Barre d'échelle, 50 nm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 6. Visualisation de la méthode TAP Purifié Complex. (A) Top, une image représentative d'un microsco électronique à coloration négativepy (EM) micrographie. Observé une pelouse de particules de forme similaire, deux sont encadrés, purifiés par la méthode TAP optimisée. Bottom, une sélection des moyennes de classe prises des particules qui mettent en évidence les caractéristiques distinctives des particules. Barre d'échelle, 50 nm. (B) Haut, une image représentative d'une micrographie cryo-EM. Observé sont des régions de plus représentative de contraste de particules, voir deux de ces régions encadrées. moyennes de fond, classe de particules sélectionnées dans la glace vitreuse. Barre d'échelle, 50 nm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
La méthode TAP utilise deux balises qui équilibrent un besoin pour la liaison rigoureuse et sélective à une résine d'affinité avec un désir de maintenir près des conditions de solution physiologique. Cet équilibre permet de préserver l'interaction stable (s) de la protéine marquée avec l'interaction facteur (s) pour la post-purification de caractérisation. En outre, la TAP individuelle étiqueté ORFs sont disponibles à partir d'une source commerciale, de sorte que l'on peut obtenir toute souche de levure avec une protéine marquée pour tout complexe de levure. Préserver l'intégrité d'un complexe et la disponibilité d'une ressource pour tester l'utilisation de différentes sous-unités protéiques marquées dans un complexe de purification sont deux avantages pour l'utilisation de la méthode de TAP pour purifier un complexe natif. Cependant, le protocole initial de la méthode TAP n'a pas été conçu pour faire en sorte que le complexe est purifié de composition et de structure homogène. Le procédé TAP a donc été modifiée, comme indiqué ci-dessus, pour atteindre cet objectif.
Diversétapes de la méthode TAP ont été évalués pour établir l'approche et les conditions optimales pour purifier une composition complexe et homogène structurel. Une étape critique précoce est la lyse cellulaire. Cette étape nécessite un équilibre entre le désir de l' un pour un rendement élevé et une lyse donc maximale, tout en assurant que le complexe obtenu est de haute qualité, à savoir, homogène. Différentes approches de cellules de levure de lyse ont été explorées, y compris à l'aide d'un cordon-batteur, processeur de fluide à cisaillement élevé, et broyeur à boulets. L'utilisation du moulin à café moins cher était moins efficace que les méthodes alternatives (40 - 60% de lyse), mais le complexe isolé et purifié est apparu monodisperse tandis que plusieurs de ces approches semblaient soit l'intégrité des particules perturb ou de provoquer un degré d'agrégation. En fin de compte, un nombre significatif de cellules n'a pas été lysées de façon à assurer complexe de grande qualité a été obtenu. Alors que 40 - 60% de lyse est idéal pour la snRNP levure U1, l'optimisation est suggéré lors de l'application de ce protocole à un nouveau complexe biologique.
Il était essentiel d'identifier les étapes du procédé qui pourrait accélérer la purification pour garantir que l'intégrité complexe n'a pas été compromise par des protéases cellulaires, la sous-unité de dissociation par suite de la dilution, et une incubation prolongée à 18 ° C pendant la protéase TEV clivage. Une simple étape pour atteindre le temps de purification efficace est d'assurer que les lipides ne portent pas au-dessus de la clarification lysat précoce, puisque les lipides empêchent l'écoulement lors de la purification de la gravité. D'autres mesures comprenaient l'identification d'un équilibre optimal de la résine de quantité et de colonne taille / dimensions pour obtenir une purification efficace et un débit maximal. Une étape particulièrement critique était de réduire le temps de la colonne de clivage par la protéase TEV. La protéase TEV utilisé a été purifié à l' interne pour assurer qu'il était protéase / nucléase libre et à une concentration élevée 17. Des quantités importantes de TEV protéase ont été utilisés pour obtenir un clivage complet en moins d'une heure.
ontenu "> Dans initial purifications TAP protéolyse a été observée. protéolyse lors de la purification peut être limitée en travaillant efficacement, en ajoutant une batterie d'inhibiteurs, et y compris dans les lavages de sel élevé de purification. Une large gamme d'inhibiteurs de la protéase fournis au cours de la première moitié de la purification a grandement amélioré la stabilité de la TAP protéine marquée et complexe. En outre, la protéolyse est réduite au minimum en augmentant la concentration monovalent de 300 à 500 mM, lors de la lyse cellulaire et les étapes d'IgG de purification. Même avec les modifications ci-dessus à la méthode TAP, élue successivement fractions hors de la résine d'affinité CBP varient dans leur degré d'homogénéité de la composition. Ainsi, la mise en commun sélective des fractions de la seconde, le CBP étape de chromatographie, est justifiée.Un aspect de la méthode TAP qui a reçu une attention particulière a été l'importance du détergent non ionique NP-40 à une purification complexe et à une concentration supérieure à sa CMC. La présence de NP-40 à une concentration de 0,08% ou plus avaient un effet bénéfique global sur l'intégrité complexe et le rendement final. L'effet bénéfique apparent (s) de NP-40 peut être due en partie à la réduction des interactions non spécifiques entre la résine et le complexe. Bien que le NP-40 semble avoir un effet bénéfique lors de la purification, il pourrait être éliminé après l'épuration sans entraîner d'agrégation complexe.
Enfin, essentiel pour l'optimisation de la méthode TAP pour l'étude structurale étaient plusieurs essais complémentaires utilisés pour évaluer l'intégrité et l'homogénéité du complexe. Ces diffusion de la lumière inclus, SDS et PAGE natif sondé en utilisant l'anticorps TAP par Western blot et / ou teinté avec des colorants fluorescents, ainsi que la microscopie négative électronique à coloration. Les modifications apportées à la méthode TAP détaillé ici, on a obtenu un complexe homogène en quantité suffisante pour la microscopie électronique. peuvent nécessiter des modifications supplémentaires à apporter à la méthode TAP pour d'autres complexes, en particulier découragermination de l'importance de NP-40.
En résumé, le procédé de purification du robinet peut être utilisée pour purifier avec succès des complexes macromoléculaires à partir d'une source eucaryote, d'une qualité appropriée pour une étude structurale. Nous avons établi une approche appropriée pour la purification du S. cerevisiae U1 snRNP et détailler les mesures prises ainsi que les raisons pour beaucoup de ces changements. Pour d'autres complexes, nous suggérons que l'enquêteur explorer de façon similaire les étapes du protocole, qui peut fournir des quantités et de la qualité du complexe adéquats. Les étapes qui devraient être examinées comprennent la lyse cellulaire, le sel et le type d'additif et concentrations, y compris un détergent, et la sensibilité du complexe au calcium et chélateur métallique EGTA. En outre, il est essentiel pour les études à long terme que le complexe peut être congelé et décongelé sans perturber la structure. Surtout, il faut disposer de plusieurs voies alternatives pour analyser la structure du complexe pendant et après la purification. un Natifnd SDS-PAGE, coloration négative EM et diffusion de la lumière nous ont bien servis dans notre enquête sur la meilleure façon de purifier un complexe homogène en utilisant la méthode TAP.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| S. cerevisiae TAP tagged strain | Open Biosystems | YSC1177 | This is the primary yeast strain used to develop the TAP protocol. Its background is S288C: ATCC 201388: MATa, his3Δ1, leu2Δ0, met15Δ0, ura3Δ0, SNU71::TAP::HIS3MX6 |
| Coffee grinder | Mr. Coffee | IDS77 | Used for cell lysis |
| Hemocytometer, Bright Line | Hausser Scientific | 3120 | Used to assess cell lysis |
| JA 9.100 centrifuge rotor | Beckman Coulter, Inc. | Used to harvest the yeast cells | |
| JA 20 fixed-angle centrifuge rotor | Beckman Coulter, Inc. | Used to clear the cell extract of non-soluble cellular material | |
| Ti 60 fixed-angle centrifuge rotor | Beckman Coulter, Inc. | Used to further clear the soluble cell extract | |
| Thermomixer | Eppendorf | R5355 | Temperature controlled shaker |
| Novex gel system | Thermo Fisher Scientific | ||
| IgG resin | GE Healthcare | 17-0969-01 | Sepharose 6 fast flow |
| Calmodulin resin | Agilent Technologies, Inc. | 214303 | Affinity resin |
| Protease inhibitor cocktail, mini tablets | Sigma Aldrich | 589297 | Mini cOmplete ultra EDTA-free tablets |
| Protease inhibitor cocktail, large tablets | Sigma Aldrich | 5892953 | cOmplete ultra EDTA-free tablets |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | Dissolved in isopropanol | ||
| 2 ml Bio-spin column | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 7326008 | Used to pack and wash the Calmodulin resin |
| 10 ml poly-prep column | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 7311550 | Used to pack and wash the IgG resin |
| Precast native PAGE Bis-Tris gels | Life Technologies | BN1002 | Novex NativePAGE Bis-Tris 4 - 16% precast polyacrylamide gels |
| NativeMark protein standard | Thermo Fisher Scientific | LC0725 | Unstained protein standard used for native PAGE. Load 7.5 μl for a silver stained gel and 5 μl for a SYPRO Ruby stained gel |
| Precast SDS PAGE Bis-Tris gels | Life Technologies | NP0321 | Novex Nu-PAGE Bis-Tris 4 - 12% precast polyacrylamide gels |
| PageRuler protein standard | Thermo Fisher Scientific | 26614 | Unstained protein standard used for Western blotting |
| SDS running buffer | Life Technologies | NP0001 | 1x NuPAGE MOPS SDS Buffer |
| TAP antibody | Thermo Fisher Scientific | CAB1001 | Primary antibody against CBP tag |
| Secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | 31341 | Goat anti-rabbit alkaline phosphatase conjugated |
| BCIP/NBT | Thermo Fisher Scientific | 34042 | 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate/nitro blue tetrazolium |
| Dialaysis units | Thermo Fisher Scientific | 88401 | Slide-A-Lyzer mini dialysis units |
| Centrifugal filter units, 100kDa MWCO | EMD Millipore | UFC5100008 | Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-100 membrane |
| Detergent absorbing beads | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 1523920 | Bio-bead SM-2 absorbants |
| SYBR Green II | Thermo Fisher Scientific | S-7564 | Flourescent dye for nucleic acid staining, when detecting with SYPRO Ruby present, use excitation wavelength of 488 nm and emission wavelength of 532 nm |
| SYPRO Ruby | Molecular Probes | S-12000 | Flourescent dye for protein staining, when detecting with SYBR Green II present, use excitation wavelength of 457 nm and emission wavelength of 670 nm |
| Copper grids | Electron Microscopy Sciences | G400-CP |
References
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