Summary
Используя опухоли пациента, полученных в подкожный доклинической модели является отличным способом для изучения эффективности новых методов лечения, открытие предиктивного биомаркеров и путей лекарственной устойчивостью. Эта модель, в процессе разработки лекарственных средств, имеет важное значение в определении судьбы многих новых видов лечения противоопухолевыми до клинического исследования.
Introduction
Колоректальный рак (CRC) является существенным фактором смерти от рака в Соединенных Штатах. В 2015 году насчитывалось 132,700 новых случаев КПР с 49,700 смертей 1. Хотя прогноз у пациентов с локализованным заболеванием превосходна, у пациентов с прогрессирующим заболеванием имеют плохие результаты, делая это основным приоритетом в разработке новых видов лечения. Несмотря на стандарт медицинской помощи химиотерапевтических препаратов и новых биопрепаратов, которые развернуты против этого заболевания, наблюдается лишь постепенное увеличение общей выживаемости. Соответственно, существует значительное усилие в понимании путей водителей, участвующих в обеспечении роста опухоли при этом заболевании. Атлас генома рака Сеть недавно выявила многочисленные основные пути , которые вовлечены в CRC дерегуляции и включают: WNT, фосфоинозитидного 3-киназы (PI3K) РАН, трансформирующий фактор роста β (TGF - β) и TP53 2. Вместе с исследованиями с описанием OTее пути , которые потенцируют рост в КПР зажгли развитие новых методов лечения , направленных на существенное улучшение выживаемости в этой популяции пациентов 3-5. Использу доклинические модели развития онкологической наркотиков имели важнейшее значение в этом процессе в прогнозировании клинической активности этих новых соединений.
Различные доклинические модели были использованы в процессе разработки лекарственных средств. Учитывая, что доклинические трансгенные животные модели и увековечены клеточные линии были неудачны в определении клинической активности новых онкологических терапии, в основном из-за их неспособности отразить сложность человеческих опухолей, были созданы пациента происхождения опухоли ксенотрансплантата (PDTX) модели. Самым большим преимуществом этой модели является то , что опухоль гетерогенность остается неповрежденным и точно отражает молекулярные характеристики и клональности от инициирующего опухоли пациента 6-9. Модели PDTX обеспечивают превосходную в естественных условияхдоклинические платформа для изучения новых агентов, путей лекарственной устойчивости, комбинационные стратегии и биологии стволовых клеток рака 10.
Общий обзор процесса PDTX показан на рисунке 1. Она начинается в клинике, по обоюдному согласию пациентов , чтобы некоторые из их избыточной ткани опухоли , которые будут использоваться для этого исследования. Далее, во время операции, часть опухоли грязными патологоанатомом и положить в средствах массовой информации, которые будут перевезены в научных кадров. Сразу же после этого, участок опухоли нарезают на мелкие кусочки и трансплантировали в иммунодефицитных мышей подкожно. После того , как опухоль растет, она пассируют в разных поколений мышей с целью поддержания опухоли 10. Как правило, после F3 поколения опухоль может быть расширена в исследовании лечения, где новые соединения и / или комбинационные терапии оцениваются. Использу Next Gen Seq (ExoME Seq, Секвенирование РНК и SNP массив) потенциальные прогностические биомаркеры обнаружитье изд, которые помогают в отборе пациентов, которые могут получить выгоду от конкретного лечения.
Общие цели использования моделей PDTX заключаются в следующем: 1) оценить эффективность новых методов лечения как монотерапии или в комбинации и 2) определить прогностические биомаркеры чувствительности или устойчивости до клинического исследования. В этой рукописи, мы предлагаем методологию в инициации и поддержании банка CRC PDTX и обеспечивают преимущества и недостатки этой модели в открытии разработки лекарственных средств.
Рисунок 1. Обзор типового протокола CRC PDTX. Пациент получен опухоль , полученная от операции и сразу же вводили в бестимусных голых мышей подкожно. После того, как опухоль растет она раскрывается в последующих поколениях, и в конечном итоге расширить для исследований лечения. Лечение RespoNSES оцениваются и прогностические биомаркеры идентифицированы , которые могут помочь в отборе пациентов. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Заявление по этике: Пациент полученные образцы опухоли ободочной аденокарциномы были получены от пациентов, соглашаясь в Университете Колорадо больницы в соответствии с протоколом, утвержденным Советом Колорадо Multiple Institutional Review (08-0439). Все для животных работа была выполнена в соответствии с протоколами животных, утвержденных в университете Колорадо Денвер Institutional уходу и использованию животных комитета (IACUC, Протокол № 51412 (06) 1E и 96813 (04) 1E).
1. Прием и подготовка крови больных
- Соберите 1 - 2 мл крови в пробирку для разделения крови / клеток, содержащей цитрат натрия (фазы трубки включены являются плазма, лимфоцитами и моноцитами полоса, градиент плотности жидкости, гель барьер, и эритроциты и нейтрофилы). Внимание, следовать рекомендациям крови Борне Возбудитель с кровью или ткани.
Примечание: МНПК и плазма могут быть использованы для будущих исследований, которые могут включать в себя: сравнение зародышевую генетические вариации с опухолевыми мутаций, изолируя циркуляциейОпухолевые клетки Тинг, оценивающие клетки свободной ДНК (cfDNA), исследующих белков и микроРНК и др. - Центрифуга трубки разделения / клеток крови при 2500 мкг в течение 15 мин, без тормоза при комнатной температуре.
- Сбор мононуклеарных клеток периферической крови (МНПК в лимфоцитов и моноцитов полосы трубки) и помещают в 1,5 мл микроцентрифужных трубки (ясный, автоклавируемого, ДНКазы, РНКазы и пирогена), и заполнить в верхней части трубки с стерильным фосфатно-буферном Физиологический раствор (PBS).
- Центрифуга при 2300 х г в течение 3 мин при комнатной температуре с образованием гранул МНПК в нижней части трубы. Затем, осторожно удалите супернатант. Добавляют 1 мл стерильной PBS мыть осадок и центрифуге при 3000 мкг в течение 30 секунд, а затем удалить супернатант.
- Используйте пипетку для сбора плазмы из трубки разделения крови / клеток (в плазменной фазе трубки) в 1,5 мл стерильной криогенной флаконе (ДНКазы и РНКазы, ни ДНК человека, эндотоксинов) и поставить плазму и осадок из ВКПМ-х в -80 ° C Freezer для хранения.
2. Прием и подготовка пациента опухоли Образец
- Подготовьте либо RPMI или DMEM носители с 1: 100 (10%) пенициллина-стрептомицина и незаменимых аминокислот, 1: 1000 (1%) Plasmocin, и 10% инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки (полная среда) и добавить 20 - 25 мл в стерильную чашку сбора для образца опухоли.
- Получить образец опухоли в стерильную чашку, содержащую полную среду на льду или держать при температуре 4 ° С.
Примечание: Образец опухоли представляет собой фрагмент избыточной опухолевой ткани пациента, который удаляется хирургом, обрабатывается патологоанатомом, и помещают в стерильную чашку сбора с полной средой. Внимание, следовать рекомендациям крови Борне Возбудитель с кровью или ткани. Кроме того, в идеале, чтобы ввести пять мышей, опухоль должна быть примерно 1 cm³. - Принесите образец опухоли в виварии для введения в иммунодефицитом мышей.
Примечание: Лучше всего, чтобы обработать образец опухоли как можно скорее.- В ламинарном потоке, поместить образец опухоли в стерильную пластиковую режущим блюдо из чашки опухоли. Используйте автоклавированы-маленькие ножницы и пинцет, чтобы нарезать на 10 - 12 приблизительно 3 х 3 х 3 мм кусочки и поместить в автоклавного 1,5 мл микроцентрифужных трубки, заполненной 300 мкл желатинового раствора смеси белков. Хранить трубку на льду.
- В качестве первоочередной задачи вводят опухоли в мышей, но если есть какие-либо опухоли осталось, собирать флеш заморожен флаконов (FF), фиксированных формалином и залитых в парафин (FFPE) чашки, и пузырек жизнеспособной опухоли.
- Для FF, собирают небольшие кусочки тканей опухоли из стерильной криогенной флакон для дальнейшего анализа, таких как белок, РНК или выделения ДНК. Поместите FF сразу в жидкий азот дьюаре и хранить долгосрочные в -80 ° C морозильнике.
- Для FFPE, если есть достаточно опухоли, место 3 небольшие кусочки в 10 мл 10% -ного формалина чашки и обрабатывать в парафиновых блоков, как только опухоль была в формалине в течение по крайней мере 24 часов.
Примечание: 24 часа в сутки основанот наших предложений гистологии жиле 11. - Наконец, поместите оставшуюся опухоль в криогенной трубе. Сделать жизнеспособных средств массовой информации путем добавления 10% диметилсульфоксида (ДМСО) в полной среде. Затем добавляют 1 мл в криогенном пробирку и хранить на льду. Примечание: Не держать на льду в течение длительных периодов времени.
- Вырезать любую оставшуюся опухоль на мелкие кусочки, которые в идеале будет достаточно для 10 опухолей для введения в 5 мышей в будущем. Затем поместите жизнеспособную трубку опухоли на льду, пока он не может быть помещен в морозильной контейнер изопропиловый спирт (медленно замораживает опухоль на 1 ° C, в то время) и положить в -80 ° C морозильнике, чтобы гарантировать, что опухоли не умирают во время замораживание процесса.
Примечание: Для длительного хранения опухоли удаляются (через 2 - 3 дня) и помещают в большой жидкий дьюаре азота. Пожалуйста, обратите внимание, что жизнеспособные трубы не следует допускать, чтобы растопить, если оно не выводили, чтобы ввести в организм мышей.
- Вырезать любую оставшуюся опухоль на мелкие кусочки, которые в идеале будет достаточно для 10 опухолей для введения в 5 мышей в будущем. Затем поместите жизнеспособную трубку опухоли на льду, пока он не может быть помещен в морозильной контейнер изопропиловый спирт (медленно замораживает опухоль на 1 ° C, в то время) и положить в -80 ° C морозильнике, чтобы гарантировать, что опухоли не умирают во время замораживание процесса.
3.Инъекции пациента производный ксенотрансплантатов
- Используйте пять 6 - 8 недель летний мужчина и / или женского пола бестимусных голых мышей (Т-клеточный дефицит) для каждого отдельного пациента, полученной опухоли. Вводят в общей сложности 10 опухолей (2 инъекции на мышь) подкожно (SQ).
Примечание: Исходный опухоли человека обозначается как F0, а затем один раз вводили мышам следующее поколение F1. Кроме того, используйте автоклавированы пинцет, ножницы и троакаров для каждого уникального эксплантов. - Нагрузка куски опухоли из желатинового раствора белка смесь в автоклавах, 12 г троакаров и гарантировать, что опухоль полностью проталкивают в троакар.
- В стерильном ламинарном проточном боксе, поместите 5 мышей в коробку анестезии, который подключен к изофлурановым анестезии машина (запущенная на начальной ставке 5% изофлуран, 3 - 4% кислорода, и 2 - 3% изофлуран для поддержания анестезии) и угольный фильтр (поглощает избыток газа).
Примечание: опытный специалист должен быть в состоянии выполнить всю процедуруклетка из 5 мышей в течение примерно 5 мин общей (примерно 30 сек на мышь). Поэтому дополнительная тепловая поддержка и глаз смазки вообще не используется. Для менее опытных людей или во время тренировок, настоятельно рекомендуется, чтобы отдельные лица либо выполнить процедуру на менее животных в одно время и / или использовать согревающий колодки / глаз смазки во время процедуры, если животные будут наркозом дольше, чем 5 мин. Методика основана на стандартах IACUC в нашем университете.
- В стерильном ламинарном проточном боксе, поместите 5 мышей в коробку анестезии, который подключен к изофлурановым анестезии машина (запущенная на начальной ставке 5% изофлуран, 3 - 4% кислорода, и 2 - 3% изофлуран для поддержания анестезии) и угольный фильтр (поглощает избыток газа).
- Сожмите палец ноги мыши, чтобы гарантировать мышь больше не реагирует, а затем взять мышь из Isoflurane коробки. Поместите курсор на чистую поле, чтобы придать опухоли на область шеи со средним спинным и сдвинув вниз троакар подкожно, пока область задней поверхности не будет достигнуто с автоклавного 12 G троакаров.
- Deliver один опухоли подкожно в каждую сторону флангом мыши. Пережатие опухоль, когда троакар вытягивается, гарантируя, что опухоль находится в требуемой области фланговых. GElatinous протеиновую смесь затвердевает температуры тела мыши и герметизирует опухоль в течение приблизительно 1 недели, чтобы помочь опухоль расти и закрепить ее на SQ соединительной ткани. Поражение производится троакара не больше, чем 4 мм, и нет необходимости закрывать кожу с помощью скоб.
Примечание: Наши ветеринары определяется не закрытия не требуется на основе очень небольшого размера поражения, быстрое время заживления (область шеи средний спинной уменьшает любое напряжение кожи или груминг поражения), никакие инфекции отмечалось, и тщательное наблюдение за животными в течение этого периода времени ,
- Deliver один опухоли подкожно в каждую сторону флангом мыши. Пережатие опухоль, когда троакар вытягивается, гарантируя, что опухоль находится в требуемой области фланговых. GElatinous протеиновую смесь затвердевает температуры тела мыши и герметизирует опухоль в течение приблизительно 1 недели, чтобы помочь опухоль расти и закрепить ее на SQ соединительной ткани. Поражение производится троакара не больше, чем 4 мм, и нет необходимости закрывать кожу с помощью скоб.
- Перед тем как мышь полностью просыпаются инъекционные мелоксикама 2 мг / кг SQ (обезболивающее) от места инъекции опухоли. Далее, поместите курсор в клетку и монитор, пока мышь не бодрствует и перемещение.
Примечание: Не оставляйте без присмотра животных восстанавливается до полного бодрствования. Дозировка Мелоксикам основано на стандартах IACUC в нашем университете.- Затем повторите ту же процедуру с 4оставшихся мышей и контролировать свое дыхание.
Примечание: Обратите внимание, что это очень быстрая процедура и мышей просыпаются очень скоро после того, как мелоксикам инъекции, но регулировать Isoflurane по мере необходимости. Каждый раз, когда мышь вынимают, убавьте Isoflurane. Мелоксикам будет длиться 24 ч и поражения от троакаров будет полностью заживают в течение 1 недели.
- Затем повторите ту же процедуру с 4оставшихся мышей и контролировать свое дыхание.
4. Ведение пациентов производный опухолевого ксенотрансплантата банка
- Мониторинг роста и здоровья мышей не реже одного раза в неделю. Используйте таблицу (или другой системы слежения), чтобы отслеживать размеры опухоли, опухоли поколения, дату инъекции опухоли и здоровье мышей.
Примечание: Если у мышей потеряли 15% своего первоначального веса тела, низкие оценки состояния тела (≥ 2), имеют опухоли изъязвления, опухоли достигает 2000 мм 3 или всего опухоли 3000 мм 3, или болезненное (сгорбившись, холод, вялость и т.д. .) в любом случае, мышей умерщвляли через CO₂ или под наркозом с последующим смещением шейных позвонков и каквторостепенный метод. Эвтаназии с помощью анестезии и цервикальной дислокации, если сбор опухоли, в противном случае мышей умерщвляли через CO₂ и цервикальной дислокации. - Когда опухоль составляет примерно 1500-2000 мм 3 анестезию мыши , как описано выше , а затем выполнить цервикальной дислокацией эвтаназии.
- Убедитесь, что мышь не имеет никакого пульса. Акцизный опухоль SQ с автоклавного ножницами и пинцетом.
Примечание: Разрешить опухоли расти в течение до 1 года и если опухоль не виден , то эвтаназии мышей через СО 2, с последующим смещением шейных позвонков в качестве вторичного метода. - Прохождение лучший растущей опухоли в следующем поколении (он же новый набор из 5 мышей). Используйте приведенные выше инструкции, чтобы собрать 10 - 12 опухолей для прохождения, а затем собрать остатки опухоли, как также описано выше.
Примечание: Сбор многочисленных жизнеспособных труб очень важно в начале поколений (F1 - F8); Поэтому собрать несколько жизнеспособных трубок, FF трубки, и 1 FFPE за Generatиона. - Храните оставшиеся мышей до тех пор , новое поколение мышей не имеет рост опухоли приблизительно 300 мм 3. Когда остальные мыши имеют опухоли, которые являются большими, продолжают собирать, как описано выше.
- Убедитесь, что мышь не имеет никакого пульса. Акцизный опухоль SQ с автоклавного ножницами и пинцетом.
- Продолжайте прохождения опухолей и не собирают на каждом этапе до F15. На данный момент, взять жизнеспособное трубу можно скорее из жидкого азота поколения и пусть оттепели на льду и следовать опухолевые инъекционные процедуры, описанные выше.
Примечание: Опухоли, которые растут из жизнеспособных трубок занять больше времени, чтобы вырастить у мышей по сравнению с переходе от поколения к поколению, так что имейте это в виду при планировании. Если конкретная модель PDTX больше не нужен в любом проходе, не усыпить и собирать опухоли, чтобы обеспечить многочисленные жизнеспособные трубы собираются для использования в будущем.
5. Развивающее Therapeutics с пациентом производный ксенотрансплантатов
Примечание: Большинство опухолей у F3 поколения имеют хорошие кинетики роста (расти быстрее и сотрудничествоnsistent), таким образом, перейти к PDTX исследования эффективности лекарственного средства.
- Когда желаемая опухоль очень велика (1500 - 2000 мм 3), в соответствии с процедурами выше для сбора опухоли расширяться в нужное количество мышей.
- В зависимости от гипотезы тестируется определить число опухолей, необходимых на исследуемую группу.
Примечание: 1 мл раствора желатиновой смеси белков можно приблизительно подходят 30 небольших опухолей части (в зависимости от морфологии опухоли) для введения в мышей.
- В зависимости от гипотезы тестируется определить число опухолей, необходимых на исследуемую группу.
- Проверьте мышей с опухолями еженедельными и когда большинство опухолей явно мала (примерно от 50 - 300 mm³) измеряют опухоли с суппортами для определения объема опухоли. Объем опухоли = [width² (наименьшее измерение) длина х (по величине измерения)] х 0,52.
Примечание: желатиновый раствор белка смесь окружает инъецированных клеток опухоли частей в течение одной недели, а затем после того, как рост опухоли в одну неделю будет точно. - Используйте объемы опухоли в пределах от 50 - 300 mm³ и томуп в среднем левые и правые опухоли. Затем рандомизации на группы обработки 10 опухолей в каждой группе и в среднем по группе в течение нескольких чисел друг от друга. Затем сортировать мышей на группы и начать желаемое исследование лечения.
- Доза мышей с наркотиками (график в зависимости от препарата), взвешивать и измерять (опухоли) два раза в неделю. В конце исследования, эвтаназии мышей через анестезией и цервикальной дислокации и собирать опухоли для дальнейшего фармакодинамического анализа в лаборатории.
Примечание: Исследование длится в течение 30 дней, в зависимости от размера опухоли транспортного средства и здоровье мышей.
6. Организация банка PDTX
- Держите хорошо документированную форму, чтобы предотвратить повторение исследований и надлежащего использования животных.
Примечание: Это ключ к успешному PDTX банка.- Использование электронных таблиц для отслеживания опухоли от больного человека в клинике, мышам в банке PDTX, лечение, данные, и что собирается. Примечание: это включает в себя морозильная камера, Дьюара для жидкого азота, И хранение, а также FFPE.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Сходства Общих Мутации в моделях CRC PDTX и TCGA
Мы исследовали , были ли процент общих мутаций (KRAS, NRAS, BRAF, PIK3CA, APC, CTNNB1 и TP53) в банке CRC PDTX представитель частоты мутаций видели в популяции пациентов CRC. Как показано на рисунке 2А (TCGA) и B (CRC PDTX банка), частота мутаций в этих генах были очень похожи между TCGA (п = 276 пациентов) и банком CRC PDTX (п = 59 пациентов CRC). Самая большая разница наблюдалась была в гене APC в результате чего разница в 23% наблюдался. Эти результаты свидетельствуют о том, что наиболее часто встречающиеся мутации, наблюдаемые в популяции пациентов CRC хорошо представлена в модели CRC PDTX.
Оценка устойчивости лечения Ответы между различнымиПоколения
В этой модели CRC PDTX, мы установили, чтобы определить, были ли эффекты лечения похожи между разными поколениями. Опухоли были расширены в бестимусных голых мышей (10 Tumors / группа) и эффективность стандартных агентов по уходу за такими как цетуксимаб (0,4 мг / мышь IP-два раза в неделю) и иринотекана (15 мг / кг, внутрибрюшинно один раз в неделю), были рассмотрены в 4 уникальные модели CRC PDTX в двух разных поколений. Как показано на фигуре 3А и В, CRC026 (F3), более устойчив к цетуксимаба лечению, в то время как CRC010 (F6) выставлены чувствительность к лечению. Сходные результаты, когда эти CRC эксплантов были обработаны в разных поколений; CRC026 (F9) был устойчив и CRC010 (F7) был чувствителен к цетуксимаба. Для определения эффективности иринотекана в модели PDTX, мы исследовали эффекты лечения на рост опухоли в 2-х моделях CRC PDTX. В то время как CRC098 (F8) был устойчив к иринотекана лечения, CRC036 (F5) выставлены чувствительность (фиг.3С и D). Как было отмечено цетуксимабом, лечение иринотекана в разных поколениях не изменили ответа на лечение в этих опухолей; CRC098 (F12) был устойчив и CRC036 (F10) , был чувствителен к иринотекана (фиг.3С и D). Хотя кинетика роста необработанных опухолей иногда отличается от поколения к поколению, ответы на лечение иринотекана и цетуксимаба остались теми же, что свидетельствует о стабильности этой модели в оценке противораковые терапии.
Исследование стромы компонента в модели CRC PDTX
Далее, мы были заинтересованы в определении, если компонент стромы в рамках этой модели эксплантов CRC состояла из человека и / или мыши клеток, полученных. Мы использовали двухцветными Cot-1 FISH анализ, который состоял из мышиCot-1 ДНК (зеленая флуорофор) и человеческой Cot-1 ДНК (красный флуорофор) , чтобы определить , мыши и клетки человека в 10 отдельных эксплантов CRC между F0 и F1 поколений 25. Как показано на фиг.4А, в поколении F1 человеческой стромы заменяется стромы мыши, так как опухоли человека в настоящее время в окружении всех стромы мыши. Эти результаты были очевидны во всех 10 эксплантов CRC, которые были подвергнуты Cot-1 FISH между F0 и F1 поколений. В дополнение к Cot-1 FISH, мы исследовали уровни белка мышиного и человеческого HGF и лигандов VEGF в F0 и F1 поколений с помощью мыши и человека для этих ELISAs лигандов. Как показано на рисунке 4В и С, в то время как все человеческое происходит HGF в генерации F0 заменяется HGF мыши в поколении F1, VEGF - лиганд состоял из как человека и мыши в поколении F1. Вместе эти эксперименты позволяют предположить, что в модели мыши CRC PDTX, что строма мыши обгоняет человеческую стромы гое поколение F1 и лиганды, секретируемые могут изменяться по отношению к тому, полученных человеком и / или мыши.
Рисунок 2. Сравнение распространенных мутаций в CRC PDTX Банка и TCGA. Мы наблюдали очень близкие частоты мутаций между TCGA (A) и модели CRC PDTX (B) по отношению к KRAS, NRAS, BRAF, PIK3CA, CTNNB1 и TP53 . Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3. Влияние цетуксимаба и иринотекана Лечение на рост опухоли. (A) CRC026 отображается сопротивление цетуксимаба при оценованные в F3 и F9 поколений и (В) CRC010 выставлены чувствительность к цетуксимаба в поколениях F6 и F7. (С) CRC098 показал устойчивость к иринотекана в поколениях F8 и F12, в то время как (D) CRC036 был чувствителен к иринотекана в F5 и F10 поколений. Каждая точка данных представляет в среднем 10 опухолей в каждой группе лечения. Мышей обрабатывали цетуксимаба (100 мкл IP 400 мкг / мышь) два раза в неделю и иринотекана (100 мкл IP 20 мг / кг) вводили внутривенно один раз в неделю. Данные приведены как среднее значение ± SEM. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4. Оценка мыши и опухолевой клетки компоненты в F0 и F1 поколений. (A) Dual-сOlor FISH для человека раскладушка-1 ДНК (красный) и мыши раскладушка-1 ДНК (зеленая) использовалась для исследования различий между опухолями в поколении F0 и F1. Человеческой стромы (F0) заменяется стромы мыши (F1) в CRC098 и CR174 (масштаб = 20x). Некротические клетки были идентифицированы путем уменьшенный или отсутствие DAPI интеркаляции и красной флуоресценции. Исследование мыши и человека HGF и экспрессии лиганда VEGF с помощью ELISA (мыши и человека ELISAs) между F0 и F1. (Б) Человеческий HGF был заменен мыши в поколении F1 и (С) человека и мыши СЭФР были очевидны в поколении F1 (пикограмм / миллилитр [пг / мл]). Данные приведены как среднее значение ± SEM. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Платформа открытия препарата PDTX предлагает улучшенную модель к недостаткам других доклинических моделей, которые являются ненадежными при прогнозировании клинической активности новых соединений. Важно отметить, что опухоли в этой модели являются биологически стабильными, сохраняют метастатический потенциал, и демонстрируют аналогичную отзывчивость наркотиков из поколения в поколение. В этой модели опухоли пациента происходит впрыскивают в бестимусных голых мышей, пассируют, а затем использовать в терапевтических оценки. Есть несколько важных шагов для успешного PDTX банка, которые включают: 1) сплоченную клиническая команда для выявления пациентов / согласия и для удаления и кассовых опухолевой ткани для модели PDTX и 2) сильной исследовательской группы с отличной лабораторией и животных технического навыки для инъекций опухолей, организацию и поддержание банка PDTX и контроль за состоянием здоровья мышей. Существенное преимущество в наших моделях PDTX впрыскивает опухоли с процедурой троакара. Альтернативный способ у.е.карман к раб опухоли, а затем ушивание или использование клипов кожи больше времени для персонала, требует большего количества обезболивающих препаратов для мышей, а также контроль за зашивается или раневой подстриженными области. Процедура троакара требует меньшего количества обучения, очень быстро, мыши находятся под наркозом в течение меньшего времени, и необходимы меньше боли лекарства. Таким образом, в нашем опыте инъекционного опухолей с троакаров является лучшим методом по сравнению с альтернативными методами. Эти факторы окажут существенное влияние на общий успех банка PDTX и в процессе обнаружения наркотиков. Хотя эта модель в естественных условиях значительно более дорогостоящим , чем тестирование агентов в линии раковых клеток культур, модели PDTX предлагают более клинически значимых подход в тестировании онкологических соединений.
В банке CRC PDTX, мы получили 99 образцов опухолей, которые вводили в бестимусных голых мышей. Были 68 из 99 (68,7%) скорости отбора опухолей, которые росли у мышей и были переданы на несколько поколений. Тамнесколько причин, почему некоторые опухоли, которые мы получили не росли у мышей. Например, мы иногда получали только очень маленькие кусочки ткани, которые только позволили нам вводить в только одну мышь уменьшая шансы создания опухоли. Другой вопрос заключается в том, что время от времени мы получили ткани пациента, который был нормальным и не содержала опухолевые клетки видны на слайде H & E. Кроме того, некоторые плохое качество ткани может быть из-за приема уже некрозной опухоль, где была реакция пациента на лечение. Поэтому важно иметь надежную хирургической и патологии команды, когда кассовым опухоль. Учитывая некоторые из этих вопросов, мы смогли установить одну из крупнейших CRC PDTX банков полностью аннотированных опухолей по отношению к мутациям, экспрессии генов и клиническими характеристиками, что делает эту ценную модель для оценки новых видов лечения с конечной целью улучшения результатов лечения пациентов.
Многочисленные биологические и комбинационнаятерапии были исследованы в этой модели с целью определения эффективности, механизмов лекарственной устойчивости, а также эффекты лечения на популяции раковых стволовых клеток. Наша группа изучила эффективность многочисленных новых биологических ингибиторов Тропинка с использованием этой доклинические модели 12-18, которая предоставила ценную информацию о дальнейшей клинической разработки этих соединений. Многие из этих исследований выявили прогностические биомаркеры 12-14,17,18 , которые могут помочь в отборе пациентов в будущих клинических испытаниях. Кроме того, другие исследования дополнительно определены механизмы резистентности к лечению с использованием этой модели, которая привела к разработке рациональных комбинаций 19-24. Например, Барделли и его коллеги показали , что 19 цетуксимаб лечение индуцированной MET амплификации и Met может быть основной механизм резистентности к лечению к цетуксимаба в КПР. 19 В отдельном исследовании, Bertotti и др. 20определены Her2 в качестве мишени в CRC опухолей, которые были устойчивы к цетуксимаб. И, наконец, мы и еще одна группа показали , что лечение с помощью ингибитора пути Notch в комбинации с иринотеканом уменьшил раковых стволовых клеток и популяции опухолевых рецидивов после лечения CRC было прекращено 25,26. Вместе эти исследования демонстрируют потенциальную мощь использования моделей PDTX в процессе разработки лекарственных средств, которые могут оказывать существенное влияние на дальнейшее развитие новых соединений.
Несмотря на основные преимущества с использованием опухоли пациента получены при определении эффективности новых соединений, существует несколько ограничений в этой модели. Как экспериментально показано в данной работе, человеческий стромы из опухоль, исходящая (F0) заменяется стромы мыши на поколения F1 в модели CRC PDTX. В зависимости от конкретной мишени для лекарственного средства, это может быть проблемой, когда лиганды мышь не могут активировать рецептор (ы) на опухолевых клетках человека. Для instancе, мы показали , что в поколении F1, что HGF является производным от стромы мыши и исследования установили , что мыши HGF не способен функционально активировать рецептор человека , с-Met 27,28. В результате, ингибиторы С-Met не могут проявлять эффекты роста противоопухолевые в этих моделях PDTX. На самом деле, гуманизированные мышей SCID HGF были разработаны для решения этой потенциальной проблемы 28. Другим недостатком использования подкожных опухолей является невозможность изучения эффектов лечения метастатического потенциала опухолей. Использование ортотопической модели, хотя технически более сложно установить и рост опухоли изображения, вероятно, обеспечит более полное представление о влиянии лечения на метастаз. Окончательное ограничение этой модели является невозможность исследовать роль иммунной системы в потенцировать рост опухоли и ее функции в деле содействия устойчивости к лечению. Кроме того, с превосходной активностью иммунотерапии недавно продемонстрировали в клинике, с использованием immunodeficieнт мышей предотвращает исследование иммунных целевых агентов. Соответственно, гуманизированные мышиные модели были разработаны с целью устранения этих недостатков, которые могут обеспечить ценность для понимания фундаментальной роли иммунной опухолевых взаимодействий, а также позволяют для исследования иммунотерапии в сочетании с другими новыми и утвержденными соединениями.
В заключение, мы предлагаем способ по разработке и поддержании модели CRC PDTX, что имеет неоценимое значение при определении терапевтической эффективности, прогностические биомаркеры и пути лекарственной устойчивости новых противораковых агентов. Хотя эта модель присущи проблемы, полезность этой модели заключается в том, что она тесно повторяет гетерогенность опухоли исходной опухоли, которая предлагает более точную и клинически значимое исследование новых видов лечения до клинической оценки. Будущая оценка клинического воздействия в разработке лекарственных средств этой доклинической модели PDTX будет в конечном счете определяют силу этогоМодель прогнозирования клинической активности терапии при онкологических заболеваниях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI or DMEM | Corning | 10-040-CV | |
| Penicillin-Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| Non-essential Amino Acids | Corning | 25-025-CI | |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-010-CV | Thaw in -4 °C, then activate for 30 min at 60 °C water bath |
| CPT blood tube | BD vacutainer | 362761 | |
| Microcentrifuge tube | Surelock | A-7002 | |
| Phosphate-Buffered Saline | Corning | 21-040-CV | |
| Cyrogenic vials | Cyroking | C0732901 | |
| Plastic tumor cutting dish | Trueline | TR4001 | |
| Scissors | Roboz | RS-5881 | |
| Forceps | Roboz | RS-5135 | |
| Matrigel (gelatinous protein mixture) | Corning | 354234 | Store at -20 or -80 °C, then thaw on ice, do not leave at RT |
| 10% Formalin cups | Protocol | 032-059 | |
| Liquid Nitrogen Dewar Storage | Thermolyne | CY50900 | |
| Portable liquid nitrogen dewar | Nalgene | 4150-2000 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Fischer | 67-68-5 | |
| Freezing container: Mr Frosty | Nalgene | 5100-0001 | |
| Isopropyl Alcohol | Decon | 64-17-5 | |
| Trocars | Innovative Research of America | MP-182 | |
| Anesthesia machine | Patterson Veterinary | ||
| Anesthesia box | Patterson Veterinary | ||
| Isoflurane | Vet one | 1038005 | |
| F-Air Canister | Bickford Omnicon | 80120 | |
| Meloxicam | Vet one | 5182-90C | |
| Calipers | Fowler | 54-100-167 | |
| Weight scale | Ohaus | Scout Pro SP601 |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A.
- Comprehensive molecular characterization of human colon and rectal cancer. Nature. 487 (7407), 330-337 (2012).
- Arcaroli, J. J., et al. Tumours with elevated levels of the Notch and Wnt pathways exhibit efficacy to PF-03084014, a gamma-secretase inhibitor, in a preclinical colorectal explant model. Br J Cancer. 109 (3), 667-675 (2013).
- Hubbard, J., Grothey, A.
- van Es, J. H., et al. Notch/gamma-secretase inhibition turns proliferative cells in intestinal crypts and adenomas into goblet cells. Nature. 435 (7044), 959-963 (2005).
- Cassidy, J. W., Caldas, C., Bruna, A. Maintaining Tumor Heterogeneity in Patient-Derived Tumor Xenografts. Cancer Res. 75 (15), 2963-2968 (2015).
- Jin, K., et al. Patient-derived human tumour tissue xenografts in immunodeficient mice: a systematic review. Clin Transl Oncol. 12 (7), 473-480 (2010).
- Julien, S., et al. Characterization of a large panel of patient-derived tumor xenografts representing the clinical heterogeneity of human colorectal cancer. Clin Cancer Res. 18 (19), 5314-5328 (2012).
- Siolas, D., Hannon, G. J. Patient-derived tumor xenografts: transforming clinical samples into mouse models. Cancer Res. 73 (17), 5315-5319 (2013).
- Tentler, J. J., et al. Patient-derived tumour xenografts as models for oncology drug development. Nat Rev Clin Oncol. 9 (6), 338-350 (2012).
- Carson, F. L. Histotechnology: A Self-Assessment Workbook. , American Society of Clinical Pathologists Press. Chicago, IL. (1996).
- Arcaroli, J. J., et al. Common PIK3CA mutants and a novel 3' UTR mutation are associated with increased sensitivity to saracatinib. Clin Cancer Res. 18 (9), 2704-2714 (2012).
- Arcaroli, J. J., et al. A NOTCH1 gene copy number gain is a prognostic indicator of worse survival and a predictive biomarker to a Notch1 targeting antibody in colorectal cancer. Int J Cancer. 138 (1), 195-205 (2016).
- Arcaroli, J. J., et al. Gene array and fluorescence in situ hybridization biomarkers of activity of saracatinib (AZD0530), a Src inhibitor, in a preclinical model of colorectal cancer. Clin Cancer Res. 16 (16), 4165-4177 (2010).
- Lieu, C. H., et al. Antitumor activity of a potent MEK inhibitor, TAK-733, against colorectal cancer cell lines and patient derived xenografts. Oncotarget. 6 (33), 34561-34572 (2015).
- Pitts, T. M., et al. Association of the epithelial-to-mesenchymal transition phenotype with responsiveness to the p21-activated kinase inhibitor, PF-3758309, in colon cancer models. Front Pharmacol. 4, 35 (2013).
- Song, E. K., et al. Potent antitumor activity of cabozantinib, a c-MET and VEGFR2 inhibitor, in a colorectal cancer patient-derived tumor explant model. Int J Cancer. 136 (8), 1967-1975 (2015).
- Tentler, J. J., et al. Identification of predictive markers of response to the MEK1/2 inhibitor selumetinib (AZD6244) in K-ras-mutated colorectal cancer. Mol Cancer Ther. 9 (12), 3351-3362 (2010).
- Bardelli, A., et al. Amplification of the MET receptor drives resistance to anti-EGFR therapies in colorectal cancer. Cancer Discov. 3 (6), 658-673 (2013).
- Bertotti, A., et al. A molecularly annotated platform of patient-derived xenografts ("xenopatients") identifies HER2 as an effective therapeutic target in cetuximab-resistant colorectal cancer. Cancer Discov. 1 (6), 508-523 (2011).
- Davis, S. L., et al. Combined inhibition of MEK and Aurora A kinase in KRAS/PIK3CA double-mutant colorectal cancer models. Front Pharmacol. 6, 120 (2015).
- Morelli, M. P., et al. Preclinical activity of the rational combination of selumetinib (AZD6244) in combination with vorinostat in KRAS-mutant colorectal cancer models. Clin Cancer Res. 18 (4), 1051-1062 (2012).
- Pitts, T. M., et al. Dual pharmacological targeting of the MAP kinase and PI3K/mTOR pathway in preclinical models of colorectal cancer. PLoS One. 9 (11), e113037 (2014).
- Spreafico, A., et al. Rational combination of a MEK inhibitor, selumetinib, and the Wnt/calcium pathway modulator, cyclosporin A, in preclinical models of colorectal cancer. Clin Cancer Res. 19 (15), 4149-4162 (2013).
- Arcaroli, J. J., et al. ALDH+ tumor-initiating cells exhibiting gain in NOTCH1 gene copy number have enhanced regrowth sensitivity to a gamma-secretase inhibitor and irinotecan in colorectal cancer. Mol Oncol. 6 (3), 370-381 (2012).
- Hoey, T., et al. DLL4 blockade inhibits tumor growth and reduces tumor-initiating cell frequency. Cell Stem Cell. 5 (2), 168-177 (2009).
- Ikebuchi, F., et al. Dissociation of c-Met phosphotyrosine sites in human cells in response to mouse hepatocyte growth factor but not human hepatocyte growth factor: the possible roles of different amino acids in different species. Cell Biochem Funct. 31 (4), 298-304 (2013).
- Zhang, Y. W., et al. Enhanced growth of human met-expressing xenografts in a new strain of immunocompromised mice transgenic for human hepatocyte growth factor/scatter factor. Oncogene. 24 (1), 101-106 (2005).
