Summary
피하 전임상 모델에서 환자 유래 종양을 활용하여 새로운 치료법, 예측 바이오 마커의 발견 및 약제 내성 경로의 효능을 연구 할 수있는 좋은 방법입니다. 이 모델은 신약 개발 과정에서 임상 시험에 앞서 많은 신규 항암 요법의 운명을 결정하는데 중요하다.
Introduction
대장 암 (CRC)는 미국에서 암 사망에 크게 기여. 2015 년, 49,700 사망 1 CRC의 예상 132,700 새로운 사례가 있었다. 국소 질환 환자의 예후가 우수하지만, 고급 질환 환자는 신규 치료법의 개발이 중요한 우선 순위 결정, 불량한 결과를 갖는다. 치료 화학 요법이 질병에 배포 된 새로운 생물학적 제제의 기준에도 불구하고, 전체 생존 만 증분 증가하고있다. 따라서,이 질병에서 종양 성장을 촉진 관련된 드라이버 경로를 이해하는데 상당한 노력이 존재한다. 암 게놈 아틀라스 네트워크는 최근 다수의 주요 CRC의 이상 조절에 관여하고 포함하는 경로 확인했습니다 : WNT를, 포스 3- 키나제 (PI3K), RAS, 변형 성장 인자 β (TGF-β의)와 TP53 2. 함께 조사는 오티 설명과 함께CRC 성장을 강화할 그녀의 경로를 크게이 환자군 3-5 생존을 개선하기위한 새로운 치료법의 개발을 촉발 하였다. 종양 치료제 개발에 활용 전임상 모델은 이러한 신규 한 화합물의 임상 적 활성을 예측하는 과정이 필수적이었다.
다양한 전임상 모델은 신약 개발 과정에서 사용되어왔다. 전임상 트랜스 제닉 동물 모델 및 세포주 크게 때문에 인간 종양의 복잡도를 반영하기 위해 자신의 무능력을, 신규 종양 치료법의 임상 적 활성을 결정하는데 성공적이지 않은 불멸화 것을 고려하면, 환자 유래의 종양 이종 이식 (PDTX) 모델이 확립되었다. 이 모델의 가장 큰 장점은 종양 이질성은 그대로 유지하고 밀접하게 원래 환자 종양 6-9의 분자 특성과 clonality을 반영하는 것입니다. PDTX 모델은 생체 내에서 우수한을 제공전임상 플랫폼은 새로운 에이전트, 약물 내성 경로, 조합 전략, 암 줄기 세포 생물학 (10)을 공부한다.
PDTX 공정의 일반적인 개요는도 1에 도시되어있다. 또한, 병원에서 시작 그 초과 종양 조직이 일부 연구에 사용될 수 있도록 환자 동의. 다음으로, 수술로 종양의 조각은 병리학 자에 의해 싫어할하고 연구 인력으로 운반 할 미디어에 넣어. 바로 그 후, 종양의 단면은 작은 조각으로 절단하고, 면역 결핍 마우스의 피하에 이식. 종양 성장 후에는 종양 (10)을 유지하기 위해 다른 세대의 마우스로 계대된다. 전형적으로, F3 생성 후에 종양은 신규 화합물 및 / 또는 조합 치료를 평가 치료 연구로 확장 될 수있다. 활용하여 차세대 서열 (엑솜 서열, RNA 서열과 SNP 어레이) 가능성 예측 바이오 마커 발견하다특정 치료에서 효과를 유도 할 수있다 환자의 선택에 도움 에디션.
1) 단일 에이전트로 또는 조합하여 새로운 치료법의 효능을 평가하고 2) 이전에 임상 시험에 대한 민감도 또는 저항의 예측 바이오 마커를 식별 : PDTX 모델을 사용하는 무엇보다 중요한 목표로합니다. 이 논문에서, 우리는 CRC PDTX 은행의 개시 및 유지 보수 방법론을 제공하고 신약 개발의 발견이 모델의 장점과 한계를 제공합니다.
CRC를 PDTX 모델 프로토콜의 그림 1. 개요. 환자 유래의 종양은 수술받은 즉시 피하 무 흉선 누드 마우스에 주입된다. 종양이 성장하면 그것은 다음 세대로 확장하고 결국 치료 연구에 확장됩니다. 치료 RESPONSE를을 평가하고 예측 바이오 마커는. 환자 선택에 도움을 수 식별 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Protocol
윤리 정책 : 환자 유래 대장 선암 종양 표본이 콜로라도 여러 임상 시험 심사위원회 (08-0439)에 의해 승인 된 프로토콜에 따라 콜로라도 병원의 대학에서 환자 동의에서 얻었다. 모든 동물의 작업은 콜로라도 덴버 기관 동물 관리 및 사용위원회의 대학에 의해 승인 동물 프로토콜에 따라 수행 하였다 (IACUC, 프로토콜 # 51412 (06) 1E와 96813 (04) 1E).
1. 받기 및 환자 혈액을 준비
- 한 수집 -이 구연산 나트륨을 함유하는 혈액 / 세포 분리 튜브에서 혈액 ㎖ (플라즈마, 림프구 및 단핵구 밴드 밀도 구배 유체, 겔 차단 및 적혈구 및 호중구가 포함 된 튜브 상이다). 주의, 혈액이나 조직과 혈액 매개 병원체의 지침을 따르십시오.
참고 : PBMC를 플라즈마를 포함 할 수있다 미래 연구에 사용될 수 있습니다 : 종양 돌연변이와 생식 세포 유전 적 변이를 비교, circula를 분리등 무 세포 DNA (cfDNA) 검사 단백질 마이크로 RNA, 평가 팅 종양 세포. - RT 없음 브레이크 15 분 동안 2,500 XG에서 혈액 / 세포 분리 튜브를 원심 분리기.
- 말초 혈액 단핵 세포를 (림프구 및 튜브의 단핵구 대역에서 PBMC를)를 수집하고 1.5 ml의 microcentrifuge 관 (일반, 오토 클레이브, DNase의,의 RNase 및 발열 무료)에 넣어 멸균 인산 완충와 튜브의 상단에 기입 식염수 (PBS).
- RT에서 3 분 동안 2300 × g으로 원심 분리 튜브의 하단의 한 PBMC 펠릿을 형성 하였다. 다음, 조심스럽게 뜨는을 제거합니다. 30 초 동안 3,000 XG에 펠렛 원심 분리기를 씻어 멸균 PBS 1 ML을 추가 한 다음 상층 액을 제거합니다.
- 1.5 ml의 멸균 극저온 유리 병에 (튜브의 플라즈마 단계에서) 혈액 / 세포 분리 튜브에서 플라즈마를 수집하는 피펫을 사용하여 (DNase의와의 RNase 무료, 아니 인간의 DNA, 내 독소 무료) 및로 PMBC의의 플라즈마와 펠렛을 넣어 -80 ° C (F)저장 Freezer (냉동실).
2. 받기 및 환자 종양 샘플 준비
- 준비 RPMI 또는 DMEM 미디어 1 다음 중 하나 페니실린 - 스트렙토 마이신 및 비 필수 아미노산의 100 (10 %), 1 : 1000 (1 %) Plasmocin, 10 % 불 활성화 태아 소 혈청 (전체 미디어) 및 추가 20-25 종양 표본에 대한 멸균 컬렉션 컵 ml의.
- 얼음에 완전한 미디어를 포함하는 살균 컵에 종양 샘플을 검색하거나 4 ℃에서 보관하십시오.
주 : 종양 샘플, 외과 의사에 의해 제거 병리학 자에 의해 처리하고, 완전한 미디어 무균 수거 컵에 배치되어 과잉 환자 종양 조직의 한 조각이다. 주의, 혈액이나 조직과 혈액 매개 병원체의 지침을 따르십시오. 또한, 이상적으로 다섯 마우스를 주입, 종양은 약 1 ㎤의해야합니다. - 면역 저하 쥐에 주입 동물 시설에 종양 샘플을 가져와.
주 : 최대한 빨리 종양 샘플을 처리하는 것이 최상이다.- 층류 후드에서 종양 컵에서 멸균 플라스틱 가공 접시에 종양 샘플을 놓는다. 젤라틴 단백질 혼합 용액 300 ㎕를 가득 멸균 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 12 약 3 × 3 × 3mm 조각과 배치 - 10로 절단하는 오토 클레이브 - 작은 가위와 집게를 사용합니다. 얼음에 튜브를 유지합니다.
- 우선 순위로 마우스에 종양을 주입하지만, 남아있는 종양이 존재하는 경우, 플래시 냉동 바이알 (FF), 포르말린 고정 파라핀 포함 (FFPE) 컵 및 실행 가능한 종양 병을 수집합니다.
- FF를 들어, 단백질, RNA 또는 DNA 분리와 같은 추가 분석을 위해 멸균 저온 유리 병에서 종양 조직의 작은 조각을 수집합니다. 액체 질소 듀어에 즉시 FF를 배치하고 장기 보관 -80 C의 냉동고 °.
- FFPE 들어 충분한 종양, 위 종양, 적어도 24 시간 동안 포르말린되면 파라핀 블록에 10 ml의 10 % 포르말린 컵 프로세스로 3 작은 조각이됩니다.
참고 : 24 시간을 기반으로우리의 조직학 코어의 제안 11 끕니다. - 마지막으로, 극저온 튜브에 남아있는 종양을 배치합니다. 미디어를 완료하는 데 10 % 디메틸 설폭 사이드 (DMSO)를 추가하여 가능한 미디어를 확인합니다. 다음으로, 극저온 튜브에 1 ml에 추가하고 얼음에 저장합니다. 주 : 오랜 시간 동안 얼음에 보관하지 마십시오.
- 10 종양이 향후 5 생쥐에 주입하는 이상적으로 충분합니다 작은 조각으로 남은 종양을 잘라. 이를 이소 프로필 알코올 냉동 컨테이너 (천천히 한번에 종양 1 °의 C를 정지)에 넣고, -80 ° C에 냉동 투입 될 때까지이어서, 종양이 중 다이되지 않도록 얼음 생존 종양 튜브를 배치 동결 과정.
주 : 장기 저장을 위해 종양을 제거한다 (이 후 - 삼일) 큰 액체 질소 듀어 넣고. 가능한 튜브는 마우스에 주입 추출되지 않는 한 해동 할 수 없습니다 것을 유의하시기 바랍니다.
- 10 종양이 향후 5 생쥐에 주입하는 이상적으로 충분합니다 작은 조각으로 남은 종양을 잘라. 이를 이소 프로필 알코올 냉동 컨테이너 (천천히 한번에 종양 1 °의 C를 정지)에 넣고, -80 ° C에 냉동 투입 될 때까지이어서, 종양이 중 다이되지 않도록 얼음 생존 종양 튜브를 배치 동결 과정.
삼.환자 유래 종양 이종 이식의 주입
- 각 개별 환자 유래의 종양 8 회 오래 된 남성 및 / 또는 여성 무 흉선 누드 마우스 (부족 T 세포) - 오 (6)을 사용합니다. 10 종양의 총 (마우스 당 2 주사) 피하 (SQ)를 주입한다.
주 : 원래 인간 종양 F0로 지정하고 한번 차세대 F1 인 쥐에 주입된다. 또한, 각각의 고유 한 이식편에 대한 멸균 된 집게, 가위, 및 트로 카를 사용합니다. - 멸균 12 G의 트로 카를로 젤라틴 단백질 혼합 용액에서 종양의로드 조각은 종양이 완전히 투관침에 밀려되어 있는지 확인합니다.
- (마취의 유지를 위해 3 % 아이소 플루 란 - - 4 %의 산소 및 2 5 %의 초기 속도 아이소 플루 란에서 시작 3) 멸균 층류 후드에있어서, 이소 플루 란 마취 기계에 접속 된 마취 상자에 마우스 5 마리를 올려 숯 필터 (과잉 가스를 흡수).
참고 : 숙련 된 기술자에 전체 절차를 수행 할 수 있어야한다약 5 분 총 (마우스 당 약 30 초)에서 5 쥐의 케이지. 따라서 추가로 열 지원과 눈 윤활은 일반적으로 사용되지 않습니다. 경험이 적은 개인 또는 훈련 기간 동안, 매우 개인이 한 번에 적은 동물의 절차를 수행 및 / 또는 동물이 5 분보다 더 오래 마취 될 경우 절차를 수행하는 동안 온난화 패드 / 아이 윤활을 사용하거나하는 것이 좋습니다. 절차는 우리 대학에서 IACUC 표준을 기반으로합니다.
- (마취의 유지를 위해 3 % 아이소 플루 란 - - 4 %의 산소 및 2 5 %의 초기 속도 아이소 플루 란에서 시작 3) 멸균 층류 후드에있어서, 이소 플루 란 마취 기계에 접속 된 마취 상자에 마우스 5 마리를 올려 숯 필터 (과잉 가스를 흡수).
- 마우스가 더 이상 응답 없도록 마우스 발가락을 꼬집어 후 아이소 플루 란 상자에서 마우스를 가져 가라. 옆구리 영역은 멸균 12 G의 트로 카를에 도달 할 때까지 중간 지느러미 목 영역 아래 피하 투관침을 슬라이딩에 종양을 주입하는 깨끗한 필드에 마우스를 놓습니다.
- 마우스의 측면의 각 측면에 하나의 종양 피하을 제공합니다. 투관침은 종양 원하는 측면 영역에 남아 있음을 보장 인출 될 때 종양 핀치. GE의latinous 단백질 혼합물을 마우스의 신체 온도 경화 및 종양 성장에 도움 SQ 및 결합 조직에 고정하기 위해 약 1 주간 종양을 캡슐화한다. 투관침에 의해 병변 4mm보다 크지 않으며 스테이플 피부에 가까이 할 필요가 없다.
주 : 우리 수의사가 더 클로저가 병변의 매우 작은 크기에 기초하지 필요 결정된 짧은 치료 시간이 기간 동안, 기록없이 감염, 및 동물의 근접 모니터링 (중간 등쪽 넥 영역은 피부에 긴장이나 병변 정리 감소) .
- 마우스의 측면의 각 측면에 하나의 종양 피하을 제공합니다. 투관침은 종양 원하는 측면 영역에 남아 있음을 보장 인출 될 때 종양 핀치. GE의latinous 단백질 혼합물을 마우스의 신체 온도 경화 및 종양 성장에 도움 SQ 및 결합 조직에 고정하기 위해 약 1 주간 종양을 캡슐화한다. 투관침에 의해 병변 4mm보다 크지 않으며 스테이플 피부에 가까이 할 필요가 없다.
- 마우스를 멀리 종양 주사 부위에서 완전히 깨어 분사 멜 록시 캄 2 ㎎ / ㎏ SQ (진통제)을하기 전에. 다음으로, 케이지에 마우스를 놓고 마우스가 깨어 및 이동 될 때까지 모니터링 할 수 있습니다.
참고 : 완전히 깨어 때까지 무인 동물을 회복 두지 마십시오. 멜 록시 캄의 투여 량은 우리 대학에서 IACUC 표준을 기반으로합니다.- 다음으로,도 4와 같은 절차를 반복마우스를 나머지 자신의 호흡을 모니터링 할 수 있습니다.
참고 :이 매우 빠른 절차 및 마우스 멜 록시 캄 주입 후 곧 깨어 있습니다,하지만 필요에 따라 아이소 플루 란을 조정하십시오. 마우스 취출 때마다, 아이소 플루 란 거절. 멜 록시 캄은 24 시간 지속되고 트로 카를에서 병변은 완전 일주에 치유 할 것이다.
- 다음으로,도 4와 같은 절차를 반복마우스를 나머지 자신의 호흡을 모니터링 할 수 있습니다.
환자 유래 종양 이종 이식 은행 4. 유지 보수
- 적어도 일주일에 한 번 쥐의 성장과 건강을 모니터링합니다. 종양의 크기, 종양의 생성, 종양 주입의 날짜 및 마우스의 건강을 추적하는 스프레드 시트 (또는 다른 추적 시스템)를 사용합니다.
참고 : 마우스는 15 원래 체중 %, 낮은 신체 조건 점수 (≥ 2)를 분실 한 경우, 종양 궤양, 종양은 2,000mm 3 또는 전체 종양 3,000mm 3, 웅크 (병약하고, 감기, 혼수 등을 도달했다 .) 임의의 방식에서, 마우스 CO₂ 통해 안락사 또는 경부 전위로 하였다 마취econdary 방법. 종양을 수집하고, 그렇지 않은 생쥐 CO₂ 경부 탈구를 통해 안락사 경우 마취 경추 탈구를 통해 안락사. - 종양은 위에서 설명한 후 안락사하는 자궁 경부 전위를 수행으로 약 1,500-2,000 mm 3 마취 마우스 인 경우.
- 마우스가 하트 비트가 없음을 확인합니다. 멸균 가위와 집게와 SQ 종양을 절제.
참고 : 허용 종양은 최대 1 년 성장하고 더 종양이 보이지 않는 경우 다음 두 번째 방법으로 자궁 경부 전위 다음 CO 2를 통해 쥐를 안락사합니다. - 통로 (5 마우스의 새로운 세트 일명) 다음 세대로 성장하는 종양 가장. 전달 12 종양 또한 상술 한 바와 같이 후 남은 종양을 수집 - 사용 설명서 위 (10)를 수집합니다.
참고 : 다수의 가능한 튜브를 수집하는 초기 세대 (F1 - F8)에서 매우 중요하다; 따라서 여러 가능한 튜브, FF 튜브 및 generat라는 당 1 FFPE를 수집이온. - 마우스의 새로운 세대는 약 300mm 3의 종양 성장이 때까지 남아있는 쥐를 유지합니다. 나머지 마우스 큰 종양이있는 경우, 전술 한 바와 같이 계속 수집.
- 마우스가 하트 비트가 없음을 확인합니다. 멸균 가위와 집게와 SQ 종양을 절제.
- 통로 종양에 계속 F15까지 각 단계에서 수집합니다. 이 시점에서, 액체 질소 중 가능한 초기 세대의 가능한 튜브를 타고 얼음에 해동을하게 상술 종양 주입 절차를 따르십시오.
가능한 튜브에서 성장 종양은 세대에서 세대로 전달에 비해 쥐에서 성장하는 데 시간이 더 걸릴 수 있으므로 계획 할 때 염두에 두십시오 있습니다. 특정 PDTX 모델은 더 이상 통과에 필요한 경우 안락사 않고 수많은 가능한 튜브는 장래의 사용을 위해 회수되도록하는 종양을 수집한다.
환자 유래 종양 이종 이식 5. 발달 치료
참고 : F3 세대에서 대부분의 종양이 좋은 성장 속도론은 (더 빠르고 공동 성장이nsistent) 따라서, 약물의 효능 연구를 PDTX로 진행합니다.
- 원하는 종양이 매우 큰 경우 (1500 - 2,000mm 3), 마우스의 원하는 양으로 확장하는 종양를 수집하기 위해 위의 절차를 따르십시오.
- 상기 가정에 따라서 처리 군마다 필요한 종양의 수를 결정 시험된다.
주 : 단백질이 젤라틴 혼합액 1 ㎖를 마우스에 주입하기 위해 약 30 피트의 작은 조각 종양 (종양 형태에 의존) 할 수있다.
- 상기 가정에 따라서 처리 군마다 필요한 종양의 수를 결정 시험된다.
- 주간 종양으로 쥐를 확인 대부분의 종양은 (50 사이에 약 - 300 mm³) 눈에 띄게 작은 경우 종양 부피를 결정하는 캘리퍼스와 함께 종양을 측정한다. 종양의 부피 = [width² (최소 측정) × 길이 (최대 측정)] 0.52을 X.
주 : 단백질이 젤라틴 혼합물 용액을 일주일의 종양 성장이 정확할 것이다 후 후 일주일 동안 주입 된 종양 부분을 둘러싼 다. - 300 mm³과 - (50) 사이에 종양 볼륨을 사용하여N 좌우 종양 평균. 이어서 서로 약간 번호 내의 그룹과 그룹 당 평균 10 종양 치료 그룹으로 무작위. 다음으로, 그룹으로 마우스를 정렬하고 원하는 치료 연구를 시작한다.
- 약물 (약물에 따라 일정) 두 번 일주일에, 무게 측정 (종양)와 쥐 선량. 연구의 끝에서, 마취 및 자궁 경부 전위를 통해 쥐를 안락사와 실험실에서 미래의 약력 학적 분석을 위해 종양를 수집합니다.
참고 :이 연구는 차량 종양의 크기와 마우스의 상태에 따라 30 일 동안 지속됩니다.
PDTX 은행 6. 조직
- 연구 및 동물의 적절한 사용의 반복 방지하기 위해 잘 문서화 된 형태를 유지합니다.
참고 :이 성공적으로 PDTX 은행의 핵심입니다.- PDTX 은행의 마우스, 처리, 데이터, 병원에서 인간의 환자에서 종양을 추적하기 위해 스프레드 시트를 사용하여 무엇을 수집한다. 주 :이 냉동 액체 질소 dewars 포함뿐만 아니라, 및 FFPE 저장.
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Representative Results
CRC를 PDTX 모델과 TCGA에있는 일반적인 돌연변이의 유사점
우리는 CRC PDTX 은행에서 일반적으로 돌연변이 (KRAS, NRAS, BRAF, PIK3CA, APC, CTNNB1 및 TP53)의 비율은 CRC 환자 집단에서 볼 수있는 돌연변이 주파수를 대표했다 여부를 조사 하였다. 도 2A (TCGA) 및 B (CRC PDTX 뱅크)에 도시 된 바와 같이, 이들 유전자의 돌연변이의 빈도는 TCGA (N = 276 명) 및 CRC PDTX 뱅크 (N = 59 CRC 환자)와 매우 유사 하였다. 23 %의 차이가 관찰되었다 관찰함으로써 가장 큰 차이점은, APC 유전자에 있었다. 이러한 결과는 CRC 환자 집단에서 관찰 된 일반적인 돌연변이가 잘 CRC PDTX 모델에서 표현하는 것이 좋습니다.
다른 치료 간 반응의 안정성의 평가세대
이 CRC PDTX 모델에서, 우리는 치료 효과가 다른 세대 간의 차이가 없었다 여부를 결정하기 위해 출발했다. 종양은 무 흉선 누드 마우스에 확장되었다 (10 종양 / 그룹) 및 세툭시 맙 (0.4 mg을 두 번 주당 / 마우스 IP) 및 이리노테칸으로 치료 에이전트의 표준의 효능을 조사 하였다 (/ kg IP는 일주일에 한 번 15 mg)을 두 개의 분리 된 세대에서 4 고유의 CRC PDTX 모델. 도 3a 및 B, CRC026 (F3)에 도시 된 바와 같이, CRC010 (F6)을 치료 민감성을 나타내 동안 세툭 치료에 더욱 내성이 있었다. 이러한 CRC 이식편은 다른 세대로 처리했을 때 유사한 결과가 관찰되었다; CRC026 (F9)는 저항했고 CRC010 (F7)는 세툭시 맙에 민감했다. PDTX 모델 이리노테칸의 효능을 결정하기 위해, 우리는 2 CRC PDTX 모델에서 종양 성장에 대한 치료 효과를 조사 하였다. CRC098 (F8)는 이리노테칸 치료에 저항하는 동안, CRC036 (F5)의 감도 (도 3c 및 D)를 나타낸다. 세툭으로 관찰 한 바와 같이, 이들 종양의 치료 반응을 변경하지 않은 다른 세대 이리노테칸 치료; CRC098 (F12)는 저항했고 CRC036 (F10)는 이리노테칸 (그림 3C와 D)에 민감했다. 비 처리 된 종양의 성장 동역학은 세대 간 다른 경우 였지만, 이리노테칸 및 세툭의 치료 반응은 항암 요법을 평가하는데이 모델의 안정성을 나타내는 동일한 남았다.
CRC를 PDTX 모델의 기질 구성 요소의 조사
다음으로, 우리는이 CRC 이식편 모델 내의 기질 성분은 인간 및 / 또는 마우스 유래 세포로 구성 된 경우 결정에 관심이 있었다. 우리는 마우스로 구성 듀얼 컬러 침대-1 FISH 분석을 사용침대-1 DNA (녹색 형광)과 인간의 침대-1 DNA (적색 형광)는 마우스와 F0 및 F1 세대 25 사이에 10 별도의 CRC 외식 인간의 세포를 확인합니다. 도 4a에 도시 된 바와 같이 인간 종양 이제 모든 마우스 기질로 둘러싸여 있기 때문에, F1 세대 인간 기질은 마우스 기질로 대체된다. 이러한 연구 결과는 F0 및 F1 세대 사이에 침대-1 FISH을 실시 하였다 모든 10 CRC 외식에 분명했다. 침대 -1- FISH 외에도 이러한 리간드 마우스 및 인간을 ELISA를 사용하여 F0 및 F1 세대 마우스 및 인간 HGF 및 VEGF 리간드 단백질 수준을 조사 하였다. F0 세대에서 HGF 파생 된 모든 인간은 F1 세대에서 마우스 HGF로 대체되는 반면, 그림 (b)와 C에 표시된대로, VEGF 리간드는 F1 세대에 모두 인간과 마우스로 구성되었다. 함께이 실험은 CRC PDTX 마우스 모델에서 마우스 기질이 일에서 인간의 기질을 추월하는 것이 좋습니다전자 F1 생성 및 인간 및 / 또는 마우스가 파생되는 관련하여 다를 수 있습니다 분비 리간드.
CRC를 PDTX 은행과 TCGA에있는 일반적인 돌연변이 그림 2. 비교. 우리는 KRAS, NRAS, BRAF, PIK3CA, CTNNB1 및 TP53에 대하여 TCGA (A) 및 CRC PDTX 모델 (B) 사이에 매우 유사한 돌연변이 주파수를 관찰 . 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 종양의 성장에 세툭시 마브와 이리노테칸 치료의 효과. (A) CRC026 때 evalu cetuximab 치료에 저항을 표시F3을하고 F9 세대 ated 및 (B)는 CRC010는 F6 및 F7 세대 세툭 감도를 나타내었다. (C) (D) CRC036는 F5 이리노테칸 민감 동안 CRC098은 상기 F8과 F12 세대 이리노테칸 내성을 보였다 및 F10 세대. 각 데이터 포인트는 처리 군 당 10 종양의 평균을 나타낸다. 마우스는 일주일에 한 번 투여 한 세툭시 맙 (100 μL의 IP 400 μg의 / 마우스) 일주일에 두 번 및 이리노테칸 (20 ㎎ / ㎏ 100 μL의 IP)로 처리 하였다. 으로 표시하고 데이터 ± SEM을 의미한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4. F0 및 F1 세대에서 마우스의 평가 및 종양 세포 구성 요소. (A) 듀얼 다olor 인간의 침대-1 DNA (적색) 및 마우스 침대-1 DNA (녹색)에 대한 FISH는 F0 및 F1 세대에서 종양의 차이를 조사하기 위해 사용되었다. 인간의 기질 (F0)는 CRC098 및 CR174 (규모 = 20 배)에 마우스 기질 (F1)로 대체됩니다. 감소 또는 DAPI의 인터과 빨간색 형광의 부족으로 괴사 세포를 확인 하였다. F0 및 F1 사이의 ELISA (마우스와 인간의 ELISA를)로 마우스와 인간의 HGF와 VEGF 리간드의 발현을 조사. (B) 인간 HGF는 F1 생성 및 (C) 인간 및 마우스 VEGF 마우스로 대체했습니다는 F1 세대에서 분명했다 (피코 그램 / 밀리리터 [PG / ㎖). 으로 표시하고 데이터 ± SEM을 의미한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
PDTX 신약 개발 플랫폼은 신규 화합물의 임상 활동을 예측 신뢰할 수없는 다른 전임상 모델의 단점을 개선 모델을 제공합니다. 중요한 것은,이 모델에서 종양이 생물학적으로 안정, 전이성 잠재력을 보유하고 세대 유사한 약물 반응성을 나타낸다. 이 모델에서, 환자 유래의 종양은 무 흉선 누드 마우스에 주사 계대하고,이어서 치료의 평가에 사용된다. 등 성공적인 PDTX 은행에 대한 몇 가지 중요한 단계가 있습니다 : 1) 응집력 임상 팀 / 동의 환자를 식별하고 우수한 실험실 및 기술 동물과 함께 제거와 종양 조직의 흥행 PDTX 모델과 2) 강력한 연구 그룹에 종양 조직과 PDTX 뱅크의 유지 주입 된 마우스의 상태를 감시하기위한 기술. 우리 PDTX 모델에서 중요한 이점은 투관침 절차 종양을 주입한다. CU의 다른 방법종양 포켓 tting 후 봉합 또는 피부 클립을 사용하는 사람을 위해 소요되는 많은 시간, 더 고통 마우스에 대한 약물 치료 및 봉합이나 상처 클리핑 영역의 모니터링이 필요합니다. 투관침 절차 적은 훈련을 필요로 매우 빠르게 생쥐 적은 시간 동안 마취하에, 이하 진통제가 필요하다. 따라서, 우리의 경험이 트로 카를으로 종양을 주입에 다른 방법에 비해 가장 좋은 방법입니다. 이러한 요인은 크게 PDTX 뱅크 및 약물 발견 과정에서 전반적인 성공에 영향을 미칠 것이다. 이러한 생체 내 모델은 암 세포주 배양 에이전트 테스트보다 훨씬 더 고가이지만 PDTX 모델 테스트 종양 화합물보다 임상 적 접근법을 제공한다.
CRC를 PDTX 은행에서, 우리는 무 흉선 누드 마우스에 주입 한 99 종양 샘플을 받았습니다. 99 (68.7 % 인출 속도) 마우스에서 성장하고 여러 세대에 전달 된 종양 중 68 있었다. 그곳에우리가받은 일부 종양이 쥐에서 성장하지 않은 이유 몇 가지 이유가 있습니다. 예를 들어, 우리는 때때로 단지 우리가 종양을 확립 할 가능성을 감소시키는 하나의 마우스에 주입 할 수 조직의 매우 작은 부분을 받았다. 또 다른 문제는 항상 우리가 정상이고 H & E 슬라이드에 분명한 종양 세포를 포함하지 않은 환자의 조직을받은 것이 었습니다. 치료에 대한 환자의 응답이 어디에 또, 형편없는 조직의 품질이 이미 종양 괴사를 수신하는 것에 기인 할 수있다. 따라서, 종양 흥행 때 안정적인 외과 병리학 팀을 보유하는 것이 중요하다. 이러한 문제들을 고려할 때, 우리는 궁극적 인 목표와 새로운 치료법의 평가를 위해이 가치있는 모델을 만드는 돌연변이에 대해, 유전자 발현과 임상 적 특징을 완벽하게 주석 종양의 가장 큰 CRC PDTX 은행 중 하나를 구축 할 수 있었다 의 환자 결과를 향상시킬 수있다.
수많은 생물과 조합치료법은 암 줄기 세포 집단의 효능, 약물 내성 메카니즘뿐만 아니라 치료 효과를 결정하는 목적이 모델에서 조사되었다. 우리 그룹은 이들 화합물의 추가 임상 개발에 귀중한 통찰력을 제공하고이 전임상 모델 12-18을 사용하여 다수의 새로운 생물학적 경로 억제제의 효능을 조사했다. 이러한 연구의 대부분은 향후 임상 시험에서 환자 선택에 도움이 될 수 예측 바이오 마커 12-14,17,18을 확인했다. 또 다른 연구는 더욱 합리적인 조합 19-24의 개발을 이끌었다이 모델을 사용하여 치료 내성 메카니즘을 결정 하였다. 예를 들어, Bardelli 및 동료 (19)는 세툭시 맙 치료 MET 증폭을 유도 메트로는 별도의 연구에서 기초 CRC에 세툭시 맙에 치료 저항의 메커니즘. 19이 될 수 있다는 것을 증명, Bertotti 등. (20)세툭시 맙에 저항했다 CRC 종양의 대상으로 HER2를 확인했다. 치료는 25, 26 중단 된 후 이리노테칸은 CRC 암 줄기 세포 인구 및 종양 재발을 감소와 함께 마지막으로, 또 다른 그룹은 조합의 노치 통로 억제제와 그 치료를 보여 주었다. 함께, 이러한 연구들은 크게 신규 화합물의 발전에 영향을 미칠 수있는 약물의 개발 과정 PDTX 모델을 활용하는 잠재력을 보여준다.
새로운 화합물의 효능을 결정하는 환자 유래의 종양를 사용하여 주요 장점에도 불구하고,이 모델에 몇 가지 제한이 있습니다. 이 논문에서 실험적으로 도시 된 바와 같이, 원래 종양 (F0)에서 인간의 기질은 CRC PDTX 모델의 F1 세대에서 마우스 기질로 대체됩니다. 마우스 리간드는 인간 종양 세포에 대한 수용체 (들)을 활성화 할 수없는 경우, 특정 약물 표적에 따라,이 문제가 될 수있다. instanc에 대한즉, 우리는 F1 세대에서 HGF는 마우스 기질로부터 유래되고 연구는 마우스 HGF 기능적 인간 C-메치오닌 27,28 수용체를 활성화 할 수없는 것으로 판정 한 것을 보여준다. 그 결과, C-메트 억제제는 이러한 PDTX 모델에서 항 - 종양 성장에 효과를 나타낼 수 없다. 실제로, 인간화 HGF SCID 마우스는 이러한 잠재적 문제점 (28)을 해결하기 위해 개발되었다. 피하 종양을 사용하는 또 다른 단점은 종양의 전이 잠재 성 치료 효과를 연구 할 수 없다는 것이다. 더 기술적으로 어려울 가능성이 전이의 치료 효과에 더 나은 통찰력을 제공 할 것입니다, 이미지 종양 성장 구축하고 있지만, 동 소성 모델을 사용. 이 모델의 최종 한계는 종양 성장 및 치료에 대한 내성을 촉진의 기능을 증강의 면역 시스템의 역할을 조사 할 수 없다는 것이다. 또한, immunodeficie를 사용하여 최근 병원에서 증명 면역 요법의 우수한 활성과NT를 마우스 면역 대상 에이전트의 조사를 방지 할 수 있습니다. 따라서, 인간화 된 마우스 모델 면역 종양 작용의 기본적인 역할을 이해뿐만 아니라 다른 신규 승인 화합물과 함께 면역의 조사를 허용 가치를 제공 할 수있다 이러한 한계를 해결하기 위해 개발되었다.
결론적으로 개발 및 치료 효능 예측 바이오 마커 및 신규 항암제의 약물 내성 경로를 결정할 수있는 귀중한 CRC PDTX 모델을 유지 관리하는 방법을 제공한다. 이 모델은 고유의 문제를 가지고 있지만,이 모델의 유용성은 밀접 임상 평가 전에 신규 치료법의보다 정확하고 임상 적 조사를 제공 원래 종양의 종양 얼룩이 되풀이되었습니다 점이다. 이 전임상 PDTX 모델 약물 개발의 임상 효과의 미래 평가는 궁극적으로의 전력을 결정한다암 치료의 임상 활동을 예측하는 모델입니다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI or DMEM | Corning | 10-040-CV | |
| Penicillin-Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| Non-essential Amino Acids | Corning | 25-025-CI | |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-010-CV | Thaw in -4 °C, then activate for 30 min at 60 °C water bath |
| CPT blood tube | BD vacutainer | 362761 | |
| Microcentrifuge tube | Surelock | A-7002 | |
| Phosphate-Buffered Saline | Corning | 21-040-CV | |
| Cyrogenic vials | Cyroking | C0732901 | |
| Plastic tumor cutting dish | Trueline | TR4001 | |
| Scissors | Roboz | RS-5881 | |
| Forceps | Roboz | RS-5135 | |
| Matrigel (gelatinous protein mixture) | Corning | 354234 | Store at -20 or -80 °C, then thaw on ice, do not leave at RT |
| 10% Formalin cups | Protocol | 032-059 | |
| Liquid Nitrogen Dewar Storage | Thermolyne | CY50900 | |
| Portable liquid nitrogen dewar | Nalgene | 4150-2000 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Fischer | 67-68-5 | |
| Freezing container: Mr Frosty | Nalgene | 5100-0001 | |
| Isopropyl Alcohol | Decon | 64-17-5 | |
| Trocars | Innovative Research of America | MP-182 | |
| Anesthesia machine | Patterson Veterinary | ||
| Anesthesia box | Patterson Veterinary | ||
| Isoflurane | Vet one | 1038005 | |
| F-Air Canister | Bickford Omnicon | 80120 | |
| Meloxicam | Vet one | 5182-90C | |
| Calipers | Fowler | 54-100-167 | |
| Weight scale | Ohaus | Scout Pro SP601 |
References
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